UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
ESCUELA DE POSTGRADO
PROGRAMA DOCTORAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
EFECTO DEL ACIDO FOLICO EN LA FRECUENCIA
DE ALTERACIONES CROMOSOMICAS INDUCIDAS
POR DICROMATO DE POTASIO EN Vicia faba y
Mesocricetus auratus.
Tesis para optar el Grado de Doctora en Ciencias Biológicas
Mg. ZULITA ADRIANA PRIETO LARA
ASESOR: Dr. RADIGUD FERNANDEZ ROMERO
2008
A mi esposo Manuel y mi hijo Jesús, amores de mi vida.
A mi madre, como ejemplo de amor y trabajo.
En memoria de mi padre, ejemplo de superación, amor y trabajo.
A mis hermanos, amigos de siempre y apoyo constante.
Agradecimientos
A la Universidad Nacional de Trujillo y a la Escuela de Postgrado, que por intermedio de sus autoridades me brindaron su apoyo con el financiamiento económico para realizar los estudios de doctorado.
A mi asesor. Dr.Radigud Fernández Romero, por su afecto y enseñanzas en mi formación académica.
A mis alumnos: Julio León Incio, Carlos Quijano Jara, Carmen Aguilar Palmer, Roger Vallejo Rodríguez, Lilibeth Cisneros Gonzales, Sophia Mendoza Amaya y a todos, que de manera desinteresada contribuyeron en el desarrollo de la presente tesis.
A los profesores: Edgardo Polo Benites, María Cruz Briceño, Leticia Amésquita Cárdenas y a todos los profesores por su apoyo en la ejecución de la tesis.
INDICE DE TABLAS
Tabla1.Frecuencias de fases del ciclo celular en muestras aleatorias de meristemos radiculares de Vicia faba expuestos a dicromato de potasio (0.5mg/ml) durante 8h y 40h de recuperación.
Tabla 2. Valores promedios y desviación estándar de células anafase-telofases con puentes cromosómicos (ATp) a las 8h de exposición a dicromato de potasio (0.5mg/ml) y micronúcleos a las 40h de recuperación en meristemos de raíces de Vicia faba.
Tabla 3. Índices mitótico y profásico en meristemos radiculares de Vicia faba, control negativo (C ), control dicromato de potasio (DP), control ácido fólico (AF) y ácido fólico-dicromato de potasio (AF-FD) después de 8 horas de tratamiento a dicromato de potasio (0.5mg/ml) y después 40 horas de recuperación.
Tabla 4. Frecuencia de anafase-telofase con puentes cromosómicos a las 8 horas de tratamiento con dicromato de potasio 0,5mg/ml y frecuencia de micronúcleos 40 horas después de recuperación en meristemos radiculares de Vicia faba expuestos previamente con ácido fólico 5 µg/ml.
Tabla 5. Frecuencias de eritrocitos policromáticos con micronúcleos en sangre periférica de individuos de Mesocricetus auratus suplementados con ácido fólico (1µg/ml) durante 7 días
Tabla 6. Frecuencias de eritrocitos policromáticos con micronúcleos en sangre periférica de Mesocricetus auratus expuestos a ácido fólico (1µg/ml) y dicromato de potasio (50mg/Kg).
Tabla 7. Frecuencias de eritrocitos policromáticos micronucleados en
Mesocricetus auratus, después de 96 horas de tratamiento con ácido
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Esquema del diseño experimental en Vicia faba. Control = 0.0 de ácido fólico (AF) y 0.0 de dicromato de potasio (DP), AF = 5 µg/ml y DP= 0.5 mg/ml.
Figura 2. Esquema del diseño experimental, etapa 1, seguido en Mesocricetus
auratus. Acido fólico (AF=1mg/ml), Dicromato de potasio
(DP=50mg/Kg). Solución fisiológica de cloruro de sodio. Agua bidestilada estéril.
Figura 3. Esquema del diseño experimental, etapa 2, seguido en Mesocricetus
auratus. Acido fólico (AF=1mg/ml), Dicromato de potasio
(DP=50mg/Kg). Solución fisiológica de cloruro de sodio. Agua bidestilada estéril.
Figura 4. Telofases con puentes cromosómicos (Tp) en meristemos radiculares de
Vicia faba expuestos a dicromato de potasio (0.5mg/ml). a) un puente, b
y c) puentes múltiples, c) cariocinesis con variación en el tamaño nuclear.
Figura 5. Alteraciones cromosómicas en meristemos radiculares de Vicia faba expuestos a dicromato de potasio (0.5mg/ml). a) célula con núcleo lobulado y portador de un micronúcleo, b) brote nuclear. c)metafase alterada, cromosoma en anillo. d) telofase con un cromosoma rezagado. Figura 6. Micronúcleos en meristemos radiculares de Vicia faba expuestos a
dicromato de potasio (0.5mg/ml). a) metafase con micronúcleo pequeño. b) interfases con micronúcleos que difieren en la compactación.
Figura 7. Alteraciones en la segregación cromosómica en meristemos radiculares de Vicia faba expuestos a dicromato de potasio 0.5mg/ml. a y b) migración alterada y falta de condenzación cromosómica, c y d) cromosoma segregado e inicio de citocinesis, e y f) citocinesis con variación del tamaño de núcleos. Barra 10µm. A) Migración de un grupo reducido de cromosomas, B y C) Citocinesis con diferencias en el tamaño de los núcleos segregados. D) Células hijas, minicélula y célula con mayor contenido nuclear.
Figura 9. Frecuencia de puentes cromosómicos en anafase y telofases después de 8h de exposición a dicromato de potasio y micronúcleos después de 40h de recuperación a los tratamientos con ácido fólico y dicromato de potasio de meristemos radiculares de Vicia faba. C= Control negativo, F=control acido fólico (5µg/ml), D=control dicromato de potasio (0.5mg/ml) y FD= tratamiento simultáneo de ácido fólico y dicromato de potasio.
Figura 10. Eritrocitos policromáticos de sangre periférica de un individuo de
Mesocricetus auratus después de 48h de tratamiento con dicromato de
potasio (50mg/1Kg). Se indica un eritrocito policromático con un micronúcleo.
Figura 11. Eritrocitos policromáticos de sangre periférica de un individuo de
Mesocricetus auratus después de 48h de tratamiento con dicromato de
potasio (50mg/Kg). Se indica un eritrocito policromático con dos micronúcleos.
Figura 12. Placa metafásica con número poliploide de cromosomas en un individuo de Mesocricetus aratus después de 48 horas de la aplicación intraperitoneal de dicromato de potasio (50mg/Kg).
Figura 13. Placas metafásicas en médula ósea de un individuo Mesocricetus
auratus después de 48 horas de aplicación intraperitoneal de dicromato
de potasio (50mg/Kg).
Anexo, figura 1. Posible estructura del Cr(III) en unión con un nucleótido de guanina. Esta figura está citado como Fig. 6 en Arakawa et al. 2006. Carcinogenesis 27(3):639-645.
Anexo, figura 2. Modelo esquemático de la represión transcripcional del cromo. Esta figura está citada como Fig. 9 en Schnekenburger et al. 2007. Mol Cell Biol, 2007. 27(29):7089-101.
Anexo, figura 3. Metabolismo del folato. Esta figura esta citada en Fenech. 2001. Mutation Research 475 (2001): 57–67.
Anexo, figura 4. Placa metafásica de un individuo macho de Mesocricetus
auratus. 2n=44.
Anexo, figura 5. Placa metafásica de un individuo hembra de Mesocricetus
auratus. 2n=44.
Anexo, figura 6. Eritrocitos policromáticos y maduros de Mesocricetus
RESUMEN
El cromo hexavalente (Cr(VI)) es un estado biológicamente activo del cromo y está implicado con la producción de especies de oxigeno reactivo. Por las propiedades de eliminación de radicales libres y posible actividad antioxidante del acido fólico, el presente trabajo tuvo como objetivo analizar los efectos de protección del acido fólico en meristemos radiculares de Vicia faba y eritrocitos policromáticos de sangre periférica de Mesocricetus auratus expuestos a dicromato de potasio. Para lo cual, raíces secundarias de V. faba fueron tratadas con acido fólico (5µg/ml) y dicromato de potasio a 0.5mg/ml durante 8h seguido de 40h de recuperación en agua potable declorinada. En esta especie fueron evidentes alteraciones en la cariocinesis y citocinesis de las células en división y las frecuencias de alteraciones cromosómicas después de 48 horas de recuperación en el tratamiento simultáneo de ácido fólico y dicromato de potasio no presentaron diferencias con el control negativo en Vicia faba. En la evaluación con M. auratus, los individuos fueron suplementados con acido fólico durante una semana seguido de la aplicación intraperitoneal de dicromato de potasio. Después de dos días de tratamiento con dicromato de potasio, las frecuencias de micronúcleos, fueron significativamente menores en los individuos que recibieron acido fólico a diferencia de aquellos, tratados solo con dicromato de potasio. Se demostró el efecto citotóxico y genotóxico del dicromato de potasio y su interacción con el ácido fólico. El ácido fólico disminuye las frecuencias de alteraciones cromosómicas en los individuos expuestos a dicromato de potasio.
Palabras clave: Vicia faba, Mesocricetus auratus, hamster, acido folico,
ABSTRACT
Chromium hexavalent (Cr(VI)) is a biologically active state of chromium. It is involved in the production of reactive oxygen species. Free radical scavenging properties and possible antioxidant activity of folic acid have been reported, the present study examined possible protective effects of folic acid on root apical meristems of Vicia faba and polychromatic erythrocytes of
Mesocricetus auratus exposed to potassium dichromate. Secondary roots were
treated with folic acid (5µg/ml) and potassium dichromate at 0.5mg/ml during 8h and recovery in dechlorinated tap water during 40h. The individuals of M.
auratus were folic acid supplements during a week followed by the
intraperitoneal injection of potassium dichromate (50mg/Kg body weight). Alterations in the karyokinesis and cytokinesis were evident in mitosis of V.
Faba by the effect of potassium dichromate; after 48 hours of recovery in the
simultaneous treatment of folic acid and dicromato of potassium didn't present differences with the negative control. In M. Auratus, the micronuclei frequencies after two days of the potassium dichromate, one oberves diminished in the individuals that received folic acid contrary to those, alone treaties with potassium dichromate. It was demonstrated the effect citotoxic and genotoxic of the dicromato of potassium and their interaction with the folic acid. The folic acid diminishes the frequencies of cromosome alterations in the exposed individuals to dicromato of potassium.
Keywords: Vicia faba, Mesocricetus auratus, hamster, folic acid, genotoxicity,
INTRODUCCIÓN
Evidencias epidemiológicas sobre la carcinogenicidad de los cromatos en trabajadores1-3y en otros organismos expuestos4-6, han contribuido para catalogar al cromo en su estado hexavalente Cr(VI), dentro del grupo I de los carcinógenos humanos por la Internacional Agency for Research on Cancer7.
La población humana está expuesta al Cr(VI) de manera masiva y permanente debido al aumento progresivo de la contaminación ambiental a causa de emisiones industriales8-10. Una fuente importante de Cr(VI) lo constituyen los dicromatos de potasio y de sodio, que son utilizados en la industria de cromados, manufactura de pigmentos, colorantes, curtido de pieles, preparación de antisépticos, limpieza de material de vidrio de laboratorio e inclusive en vegetales11. En el Perú, no existen monitoreos de las emisiones de Cr(VI), como se realiza en otros países; las industrias, en muchos casos, trabajan de manera artesanal y no cuentan con medidas de bioseguridad suficientes.
El Cr(VI) en las formas aniónicas CrO42- , HCrO4- o Cr2O7-, dependiendo del
complicada química intracelular, múltiples blancos y vías metabólicas involucradas. Se presentan probables mecanismos de la acción del Cr(VI) a nivel intracelular (Figuras 1 y 2, anexo).
En relación a la actividad genotóxica de los cromatos particulados y solubles, el daño genético es más persistente con el cromato de plomo (particulado) comparado a los efectos del cromato de sodio (soluble), con este último, en células de fibroblastos bronquiales, los efectos del Cr(VI) decaen a las 72h luego de la primera dosis. Se reportaron espectros similares de daño cromosómico en células de epitelio bronquial expuestas a compuestos particulados y solubles24. Estudios con dicromato de potasio, el más soluble de los cromatos, demuestran su genotóxicidad en los sistemas genéticos tales como: mutaciones en bacteris, alteraciones cromosómicas en líneas célulares, micronúcleos en ratones4, alteraciones cromosómicas durante la división mitótica en Vicia faba25, mutaciones en levadura 26, micronúcleos en Procambarus clarkii27, correlación de bandas polimórficas (amplified fragment length polymorphism, AFLP) con la concentración de dicromato de potasio en Pseudokirchneriella subcapitata28, roturas cromosómicas en células de ratones29,30.
El estrés oxidativo generado con la exposición al Cr (VI) puede ser neutralizada con la suplementación de antioxidantes. Estudios en ratas reportan que Alpha tocopherol disminuye el daño oxidativo renal causada por el dicromato de potasio31; en ratones se ha demostrado que el ácido ascórbico reduce el Cr(VI) a Cr(III)32, compuestos como: thiola (2-mercaptopropionylglycine) y semillas de soya (Glycine max) han sido probadas como anticarcinógeno y antimutagénico en animales y humanos33. Por la capacidad del acido fólico en la eliminación de radicales libres que el ácido fólico tiene34,35, puede ser considerado un antioxidante potencial, con efecto neutralizante del estrés oxidativo que genera el dicromato de potasio.
reducción significativa de casos con defectos al tubo neural asociada a la administración de ácido fólico37-39. El mecanismo metabólico de folatos y otras vitaminas del grupo B, como B12, están íntimamente involucradas en la remetilación de la homocisteina (Hey), la conversión de Hey a metionina para la síntesis de S-adenosilmetionina (SAM), importante agente metilante in vivo 40,41. Estudios in vitro e in vivo en células humanas indican que la deficiencia de folatos produce elevada concentración de homocisteina, cromosomas frágiles, roturas cromosómicas, excesivo uracilo en el DNA, hipometilación del DNA y formación de micronúcleos42,43 (Figura 3, anexo).
Cuando existe deficiencia de folato, la conversión de dUMP a dTMP está reducida y durante la replicación se puede incorporar dUMP en el DNA. Estudios en células de mamíferos demuestran la asociación de elevada concentración de dUMP y roturas de DNA44. Por otro lado, la existencia de nucleótidos dUMP en el DNA induce la actividad de enzimas de reparación por escisión, donde las DNA glicosilasas rompen el enlace glucosídico produciendo los sitios apúricos o apirimídicos seguidos por la actividad de las endonucleasas que cortan el enlace fosfodiester para su resíntesis y reparación, de ocurrir de manera reiterada la probabilidad de roturas es alta45,46 (Figura 4, anexo).
En años recientes el ácido fólico ha sido utilizado de manera conjunta con dosis bajas de radiación en el tratamiento de tumores en ratas y reportaron un efecto sinérgico con una efectiva eliminación de tumores47. En conejos, después de la aplicación de ácido fólico y dicromato de potasio indican la disminución de los efectos lesivos del Cr(VI) en la morfología espermática48. Investigaciones adicionales son necesarios para conocer los efectos de la actividad del ácido fólico a nivel de células en proliferación, células germinales y frente a la inducción de daño genético expuestos a agentes genotóxicos como el dicromato de potasio.
laboriosa cuantificación de aberraciones de las estructuras cromosómicas49. Basado en el origen de los micronúcleos, ya sea por fragmentos acéntricos o cromosomas rezagados durante la segregación cromosómica en anafase, la determinación de frecuencias de micronúcleos es considerado un parámetro potencial para la evaluación de químicos que inducen alteraciones cromosómicas, estructurales o numéricas50-52. En los ensayos in vivo, en animales como el ratón, la frecuencia de eritrocitos inmaduros (RET) con micronucleos son comúnmente evaluados para determinar la genotoxicidad de compuestos químicos, debido a que en los RET se muestra los daños recientes, a diferencia de los eritrocitos maduros que conservan y acumulan los daños previos a la inducción53.
El ácido fólico ingresa a las células a través de proteínas receptoras de folatos (Folbps)54,55 y constituye uno de los micronutrientes esenciales para el crecimiento en organismos animales y el hombre, por ello, los estudios del ácido fólico en estos organismos es numerosa. No obstante, en especies vegetales como
Vicia faba, es posible evaluar los efectos del ácido fólico en células proliferativas
de meristemos radiculares, considerando la solubilidad y la permeabilidad celular del acido fólico en raíces en crecimiento. Este último, ha sido demostrado y validado como el “test de Viciafaba”, “test deAllium” u otra especie vegetal para los ensayos de citotoxicidad y genotoxicidad de múltiples sustancias químicas.
Considerando tales antecedentes el presente trabajo ha tenido como finalidad estudiar la variación de las frecuencias de alteraciones cromosómicas en Vicia
Para lo cual se consideró los objetivos siguientes:
Determinar la frecuencia de alteraciones cromosómicas en meristemos radiculares de Vicia faba expuestos a dicromato de potasio.
Estimar la variación de las frecuencias de alteraciones cromosómicas en meristemos radiculares de Vicia faba por tratamiento simultáneo de ácido fólico y dicromato de potasio.
Determinar las frecuencias de micronúcleos en eritrocitos policromáticos de sangre periférica por efecto del dicromato de potasio en Mesocricetus
auratus.
Comparar las frecuencias de micronúcleos en eritrocitos policromáticos de sangre periférica de Mesocricetus auratus expuestos a dicromato de potasio y tratamiento simultáneo con ácido fólico y dicromato de potasio.
Justificación
Con la finalidad de aportar con nuevas evidencias sobre las propiedades del ácido fólico, como un agente protector ante una exposición de un genotóxico, es importante conocer en que medida disminuye el daño genético con la administración conjunta del ácido fólico y el dicromato de potasio en las células; para lo cual, se elige una especie vegetal como Vicia faba y una especie animal,
Mesocricetus auratus para los ensayos in vivo. Vicia faba, tiene reducido número
MATERIAL Y MÉTODOS.
1. Material biológico: 1.1. Vicia faba“haba”:
Población: Meristemos radiculares de la variedad señorita
Muestra: Meristemos radiculares de 12 semillas de la variedad señorita. Unidad de análisis: el meristemo apical de una raíz.
1.2. Mesocricetus auratus “hamster”:
Población: individuos de la cepa Sirio Dorado
Muestra: 16 individuos de sexo masculino, peso en el rango de 90 a 100g, de 6 meses de edad. Los individuos fueron obtenidos de Instituto Nacional de Salud, Centro Nacional de productos Biológicos, Coordinación de Bioterio, Lima, Perú.
Unidad de análisis: un individuo 2. Material químico:
Dicromato de potasio, Sigma/Aldrich.
Acido fólico, Laboratorio Hersil S.A. comprimidos de 0.5 mg. 3. Método:
3.1.Tipo de estudio: experimental 3.1. Diseño experimental:
En Vicia faba: meristemos de raíces secundarias.
Los tratamientos fueron: a) Control negativo (C ), b)control ácido fólico (AF), c)control dicromato de potasio (DP) y d) tratamiento de ácido fólico y dicromato de potasio (AF-DP).
dejaron que continúen su crecimiento sin dicromato de potasio (fase de recuperación) (Figura 1). Después de 40 horas de recuperación se procedió con la segunda toma de muestra (2 a 3 raíces). Las muestras apicales de cada semilla fueron fijadas en Carnoy`s y coloreadas con Orceína acética 1% durante 30 minutos25.
Figura 1. Esquema del diseño experimental en Vicia faba. Control = 0.0 de ácido fólico (AF) y 0.0 de dicromato de potasio (DP), AF = 5 µg/ml y DP= 0.5 mg/ml.
Variables:
Variables independientes:
Concentración de ácido fólico ( 0.0 y 5 µg/ml)
Variable dependiente:
Frecuencia de alteraciones cromosómicas, evaluado a través de los indicadores:
Frecuencia de fases mitóticas
Frecuencia de anafase-telofases con puentes cromosómicos (ATp)
Frecuencia de micronúcleos (MN)
Frecuencia de cromosomas rezagados
Toma de datos: Las células fueron observadas a 1000X de magnificación
y la cuantificación se realizó de dos maneras:1) Conteo al azar de 2000 células a las 8h de tratamiento y después de 40h de recuperación, en las que se identificó células en interfase y fases mitóticas con y sin alteraciones. Se estimaron los índices de mitosis (IM), profases (IP), metafases (IM), anafases (IA) y telofases (IT); 2) Conteo de células en anafase y telofase (AT) con y sin puentes cromosómicos, aproximadamente en todo el extendido celular de cada raíz a las 8h de tratamiento. Se obtuvieron las frecuencias de anafase-telofases con puentes cromosómicos (ATp), de la siguiente manera:
%ATp= ATp/Total de células en anafase y telofase.
Se utilizaron como criterios para la identificación de micronúcleos, estructura redondeada, diámetro significativamente inferior al núcleo principal, con coloración similar y clara separación del núcleo principal (Albertini et al., 2000) y, para el registro de células con puentes cromosómicos se consideró células en anafase y telofase con conexiones cromosómicas claramente visibles.
Procesamiento estadístico: se estimaron las frecuencias de fases: índice
determinación de diferencias entre tratamientos se realizó con la prueba de análisis de varianza y la comparación de promedios de Tukey (p<0.05).
En Mesocricetus auratus “hamster”:
Obtención de individuos adultos machos de 6 meses de edad y de 90 a 100g de peso. En cada repetición se utilizaron individuos de una misma camada.
Tratamientos: control negativo (C), control acido fólico (AF), control
dicromato de potasio (DP), tratamiento conjunto: acido fólico y dicromato de potasio (AF-DP)
Diseño experimental:
Se procedió en dos etapas:
Etapa 1. Los individuos machos de cada camada fueron separados en jaulas de manera individual y administrados por vía intragástrica 1 ml de suspensión de ácido fólico (1mg/ml) cada 48 horas, durante una semana. Luego, se aplicó la primera dosis de dicromato de potasio vía intraperitoneal (50 mg/Kg) la cantidad de 0.2ml. Después de dos días se inyectó una segunda dosis de dicromato en la misma concentración y cantidad que la primera y dos días después fueron sacrificados (Figura 2). Etapa 2. Se procedió de manera similar que en la etapa 1, con la variante en la aplicación de dicromato de potasio vía intraperitoneal en una sola, y luego de 4 días se sacrificaron a los individuos (Figura 3).
Todos los individuos fueron mantenidos en iguales condiciones de manejo y alimento.
Toma de muestra
Procedimiento:
En la etapa 1: Adicionalmente a las muestras previas se tomó muestras de sangre periférica después de 2 días y luego de 4 días de tratamiento con dicromato de potasio, muestras de sangre periférica y médula ósea.
En la etapa 2: Adicionalmente a las muestras previas, se tomó muestras de sangre periférica y médula ósea a los 4 días de tratamiento con dicromato de potasio.
Obtención de la muestra
Sangre periférica: Con una aguja estéril se realizó una punción en el
extremo de la cola del individuo y con un capilar heparinizado se obtuvo dos a tres gotas de sangre y se realizó los extendidos celulares sobre láminas portaobjetos. Se fijaron en metanol absoluto y se colorearon con Giemsa 7% por 20 minutos. Luego del enjuague, las láminas secas sellaron con una gota de Entellan y lámina cubreobjeto.
Médula ósea: los individuos fueron sacrificados por dislocación cervical
previamente anestesiados. Se extrajo la médula ósea y fueron colocados en una solución de cloruro de potasio 0.075M, se realizaron suspensiones celulares con rapidez y transferidos a un tubo de centrífuga. Se mantuvo en reposo por 20 minutos a 37ºC. Se centrifugaron a 800 rpm 10 minutos, y luego de eliminar el sobrenadante se agregó el fijador, solución de metanol:ácido acético (3:1) la cantidad aproximada de 7 ml en cada tubo y se dejó en reposo por 20 minutos a 5ºC. Se realizó la suspensión celular y fue centrifugado nuevamente. Luego de eliminar el sobrenadante se agregó 1ml de fijador, se resuspendió y se dejó caer una o dos gotas sobre láminas limpias y secas. Luego de 24 horas de secado fueron coloreados con Giemsa 7% por 20 minutos56.
Variables:
Variables Independientes:
Dosis de ácido fólico (0.0 y 1mg/ml)
Variable dependiente:
Frecuencia de eritrocitos policromáticos con micronúcleos en sangre periférica.
Instrumentos de recolección de datos
Un microscopio Olympus a 1000X de magnificación. Cámara fotográfica y contador de células.
Toma de datos:
En eritrocitos policromáticos se cuantificaron 4000 células con o sin micronúcleos y se estimaron las frecuencias en cada individuo.
Figura 2. Esquema del diseño experimental, etapa 1, seguido en Mesocricetus
auratus. Acido fólico (AF=1mg/ml), Dicromato de potasio (DP=50mg/Kg).
Solución fisiológica de cloruro de sodio. Agua bidestilada estéril.
Figura 3. Esquema del diseño experimental, etapa 2, seguido en Mesocricetus
auratus. Acido fólico (AF=1mg/ml), Dicromato de potasio (DP=50mg/Kg).
RESULTADOS
En Vicia faba:
Efecto del dicromato de potasio: A nivel mitótico:
En los meristemos radiculares de Vicia faba expuestas a dicromato de potasio a 0.5mg/ml durante 8h, el índice mitótico promedio fue de 1.93±0.06% comparado con 7.88±2.37% en el control, significativamente disminuida p<0.05. Después de 40h de recuperación, contrariamente a los resultados anteriores, el índice profásico y el índice mitótico estuvieron incrementados en el tratamiento con dicromato de potasio, siendo sus valores promedios: 8,27±1.32% y 13.11±1,81% y del control, 4.44±2.18% y 8.01±3.27%, respectivamente (p<0.05) (Tabla 1).
En relación al daño cromosómico, a las 8h de exposición directa al dicromato de potasio se observó alteraciones durante la división mitótica, tales como: telofases con puentes cromosómicos (ATp), variando de uno a más puentes (Figura 4), anafase-telofases con cromosomas rezagados, deformaciones nucleares, cromosoma en anillo, metafases con ubicación desordenada al plano ecuatorial, micronúcleos, brote nuclear “buds nuclear, descondenzación de la cromatina (Figura 5). Los micronúcleos se observaron en las diferentes fases del ciclo celular, con variación de tamaños y compactación (Figura 6). En la figura 7, se muestra la migración de un reducido grupo de cromosomas a un polo; cromosoma segregado, conexión de cromatina entre los dos grupos separados, inicio de citocinesis y variación de tamaños de los núcleos segregados.
(Tabla 2). Sin embargo, cuando se evaluó ATp aleatoriamente, se registró 0.05±0.07% de 2095 células en promedio, valor no significativo comparado con el control. Después de 40h de recuperación, se cuantificó micronúcleos (MN), ATp y ATrz en muestras elegidas al azar de todo el extendido celular y se encontró 1.98±0.88% de MN (p<0.05), las demás alteraciones no presentaron diferencias significativas (p>0.05) (Tabla 2).
Se observó variación en las frecuencias de alteraciones cromosómicas entre semillas por efecto del dicromato y una relación entre la frecuencia de ATp a las 8h con la frecuencia de MN a las 40h de recuperación, a mayor porcentaje de ATp a las 8h menor porcentaje de MN a las 40h de recuperación.
Efecto del acido fólico y del tratamiento simultáneo con ácido fólico y dicromato de potasio.
El índice mitótico en el tratamiento con ácido fólico fue de 10.43±1.64%, mientras que en el control fue de 7.75±1.79% (p<0.05). Al comparar los índices profásicos entre si, se observó similar diferencia. Después de 40h de recuperación – sin ácido fólico y sin dicromato de potasio - no hubo diferencias significativas en el índice mitótico entre todos los tratamientos, aún cuando los valores promedios están aumentadas (Tabla 3, figura 8).
Con respecto a las frecuencias de anafase-telofase con puentes cromosómicos (ATp), en el tratamiento con ácido fólico–dicromato de potasio se registró disminución en promedio de 34.39±20.64% a 17.76±11.84%. La frecuencia de MN después de 40 horas de recuperación, por efecto del ácido fólico disminuyó notablemente; los valores no fueron diferentes con las registradas en el control (p<0.05) (Tabla 4, figura 9).
algunos meristemos, particularmente en uno, se registró un incremento significativo de células con segregación y compactación cromosómica incompleta como se muestra en la figura 7.b, inclusive mayor que en el tratamiento con dicromato de potasio.
En Mesocricetus auratus:
Mesocricetus auratus se distingue por tener 2n = 44 cromosomas el
cromosoma X metacéntrico de mayor tamaño que el resto de cromosomas (Anexo, figuras 1 y 2). Los eritrocitos policromáticos en sangre periférica fueron fácilmente diferenciables de los eritrocitos maduros (Anexo, figura 3). En las figuras 10 y 11, se muestran eritrocitos policromáticos micronucleados.
Las frecuencias de micronúcleos en los eritrocitos policromáticos de sangre periférica de los individuos suplementados con ácido fólico por una semana, no mostraron diferencias con aquellos que no recibieron dicho tratamiento (Tabla 5). Sin embargo en el tratamiento con dicromato de potasio las frecuencias de micronúcleos se incrementaron hasta 12,41±0,41 ‰
a las 48 h después de la dosis intraperitoneal, y a las 96 h se observó notablemente disminuida, aún cuando los individuos recibieron una segunda dosis de dicromato de potasio. En los individuos suplementados previamente con ácido fólico se observaron frecuencias de MN sin variación significativa con respecto al control negativo a las 48h y 96h después del tratamiento con dicromato de potasio en la primera y segunda dosis (Tabla 6).
Figura 4. Telofases con puentes cromosómicos (Tp) en meristemos radiculares de
Vicia faba expuestos a dicromato de potasio (0.5mg/ml). a) un puente, b y c)
Figura 5. Alteraciones cromosómicas en meristemos radiculares de Vicia
faba expuestos a dicromato de potasio (0.5mg/ml). a) célula con núcleo
C F D FD C F D FD 0 2 4 6 8 10 12 14 16
40h
8h
Tratamientos
F
re
c
u
e
n
c
ia
(
%
)
IM IPFigura 8. Índices mitótico y profásico en meristemos radiculares de Vicia
faba Control negativo ( C), ácido fólico (F), dicromato de potasio (D) y
C F D FD C F D FD 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Micronúcleos
(MN) 40h
Puentes Cromosomicos
(ATp) 8h
F
re
c
u
e
n
c
ia
(
%
)
Tabla 1. Frecuencias de fases del ciclo celular en muestras aleatorias de meristemos radiculares de Vicia faba expuestos a dicromato de potasio 0.5mg/ml durante 8h y 40h de recuperación.
__________________________________________________________________________________________ Horas Tratamiento Interfase Mitosis (índice de fases)
%
IM IP IMt IA IT
x± DE x± DE x± DE x± DE x± DE x± DE
__________________________________________________________________________________________
8 Control 92.12± 2.37 7.75 ± 1.79 4.76 ± 0.45 1.20 ± 0.94 0.68 ± 0.35 1.25 ± 0.45 Cr2K2O7 98.07*± 0.06 2,69*± 2,09 1.56**± 1.23 0.10 ± 0.00 0.09 ± 0.07 0.31± 0.10
40 Control 91.99 ± 3.67 8.01 ± 3.27 4.44 ± 2.18 1.19 ± 0.56 0.90±0.41 1.48 ± 0.85 Cr2K2O7 86.89 ± 1.81 13.11*±1.81 8.27* ±1.32 2.09 ± 0.84 0.91±0.36 1.85 ±0.20
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ n= 2000 células por ápice de raíz.
* p<0.05 ** p<0.01
Tabla 2. Valores promedios y desviación estándar de células anafase-telofases con puentes cromosómicos (ATp) a las 8h de exposición a dicromato de potasio 0.5mg/ml y micronúcleos (MN) a las 40h de recuperación en meristemos de raíces de Vicia faba.
___________________________________________________________________________________ Tratamiento 8h de exposición 40 h de recuperación
AT (Nº total) %ATp Nº células %MN
x± DE x± DE x± DE x± DE
____________________________________________________________________________________
Control 357.67± 89.51 0.09 ± 0.16 2073 ±49.96 0.00 ±0.00 Cr2K2O7 29.86 ±34.43 34.39**±20.64 2057 ±31.93 1.98*±0.88 ____________________________________________________________________________________
Tabla 3. Índices mitótico y profásico en meristemos radiculares de Vicia faba, Control negativo (C ), control dicromato de potasio (D), control ácido fólico (F) y ácido fólico-dicromato de potasio (FD) a las 8 horas de tratamiento y después 40 horas de recuperación.
_________________________________________________ Horas Tratamiento IM IP
x± DE x± DE
__________________________ _______________________
8 C 7,75 ± 1,79 4,76 ± 0,45
F 10,43*± 1,64 6,25± 0,94
D 2,78*± 1,67 2,17*±1,32
FD 3,39 ± 2,11 2,22*± 1,20
40 C 8,01 ± 3,27 4.44 ± 2,18
F 9,34 ± 2,28 5,51 ± 1,69
D 13,11* ± 1,81 8,27* ±1,32
FD 10,26 ± 2,60 5,88 ± 1,93
__________________________________________________________________________________
Tabla 4. Frecuencia de anafase-telofase con puentes cromosómicos a las 8 horas de tratamiento con dicromato de potasio 0,5 mg/ml y frecuencia de micronúcleos 40 horas de recuperación en meristemos radiculares de
Vicia fabaexpuestos previamente con ácido fólico 5 µg/ml.
Tratamiento ATp 8h
x± DE
MN % 40h
x± DE
Control 0,09 ± 0,16 0,00 ± 0,00
Acido fólico 0,40 ± 0,70 0,06 ± 0,08
Dicromato de potasio 34,39 *± 20,64 1,98* ± 0,88
Acido fólico + dicromato de potasio 17,76* ± 11,84 0,22 ± 0,39
Figura 10. Eritrocitos policromáticos de sangre periférica de un individuo de
Mesocricetus auratus después de 48h de tratamiento con dicromato de potasio
Figura 11. Eritrocitos policromáticos de sangre periférica de un individuo de
Mesocricetus auratus después de 48h de tratamiento con dicromato de potasio
Figura 10. Placas metafásicas en médula ósea de un individuo
Mesocricetus auratus expuesto a dicromato de potasio (50mg/Kg, vía
Tabla 5. Frecuencias de eritrocitos policromáticos con micronucleos en sangre periférica de individuos de Mesocricetus auratus suplementados con ácido fólico. ___________________________________________________________
Tratamientos N° RET MN
______________________________ N° ‰ x ±SD ___________________________________________________________ Control 4066 18 4,43 3,62 ± 1,09
4200 21 5,00
4041 14 3,46
4440 13 2,93
4374 10 2,29
Acido fólico 4576 21 4,59 3,83 ± 1,34
4161 17 4,09
4141 8 1,93
4631 25 5,40
4139 13 3,14
___________________________________________________________ p>0.05
Tabla 6 . Frecuencia de eritrocitos policromáticos con micronúcleos en sangre periférica de
Mesocricetus auratus expuestos a ácido fólico (1μg/ml) y dicromato de potasio (50mg/Kg).
______________________________________________________________________ Tratamiento Antes de DP Después de 48h de DP Después de 96h de DP
MN ‰ MN ‰ MN ‰
X ± DE
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
Tabla 7. Frecuencias de eritrocitos policromáticos micronucleados en
Mesocricetus auratus después de 96 horas de tratamiento con ácido fólico
(AF=1μg/ml) y dicromato de potasio (DP=50mg/Kg). _____________________________________ Tratamientos MN después de 96 h de DP
‰ x ± DE
_____________________________________ Control 2,95 ± 0,73
DP 6,77 ± 0,25 AF + DP 4,67 ± 1,55 AF 4,81 ± 0,86
_____________________________________
CONTROL 4,89 5,25 ±1,06 3,24
DP 6,19 12,41 ± 0,41 6,31
AF + DP 7,00 6,38 ± 0,70 6,34
DISCUSIÓN
Efecto del dicromato de potasio
La reducción del índice mitótico en meristemos de raíces en Vicia faba expuestas 8h a dicromato de potasio revela su efecto citotóxico y la presencia de fases mitóticas, indica que la disminución de la actividad proliferativa por efecto del Cr(VI) se habría producido principalmente, en el estado de interfase. Uno de los mecanismos que explican la acción del Cr(VI) en la inhibición del ciclo celular en la fase G1 es por activación de la proteína p2157,58 y de otros genes implicados con la regulación del ciclo celular y/o apoptosis, como consecuencia del incremento de la proteína p53 inducida por los radicales .OH generados de la reacción de Fenton - H2O2+ Cr(V)-30.
Respecto a los índices de fases del proceso mitótico después de 40h de recuperación, el aumento significativo del índice profásico, sería indicador del desbloqueo celular en interfase. Por la ausencia de dicromato de potasio en el medio de crecimiento radicular después de 8h de tratamiento, el nivel del Cr(VI) intracelular estaría disminuida produciendo la desactivación de genes como la p21, activación de genes inhibidos, que produjeron el detenimiento del ciclo celular en interfase. El incremento de profases, podría explicarse también por la alteración de la expresión de genes que controlan el paso de G2 a mitosis. Los reportes del efecto del Cr(VI) sostienen que el evento primario en la disrupción de la expresión génica es la formación del complejo nuclear Cr(III)-DNA en las regiones promotoras produciendo represión transcripcional59.
uno o más puentes cromosómicos probablemente tomarían la vía apoptósica o tardarían más en continuar el proceso proliferativo.
Las diferencias registradas en respuesta al Cr(VI) en las poblaciones celulares existentes en cada meristemo radicular entre semillas y dentro de cada semilla, expuestas a una misma concentración de dicromato de potasio, serían indicadores de que, no todo el DNA celular está igualmente expuesto, por tanto dependerá en gran medida de su estado funcional y de los efectos aleatorios que produciría el Cr(VI) en el DNA expuesto, existiendo mayor probabilidad de daño genético en las secuencias de DNA con elevada actividad de replicación y transcripción. Estudios en cultivos celulares de fibroblastos encontraron diferencias en el fenotipo celular y en los patrones de expresión de genes dentro de la misma población celular expuestas al Cr(VI) del Na2CrO4, aislándose células susceptibles
y resistentes al Cr(VI), éstas últimas, mostraron resistencia a la apoptosis, potencial de crecimiento incrementado y expresión de genes alterados a diferencia de las células susceptibles al Cr(VI)60.
La variación en el tamaño y grado de compactación de los micronúcleos, se debería al tipo de cromatina existente en ellos, en MN menos condensados existiría eucromatina y hetecromatina y en los MN más pequeños y de mayor compactación, principalmente heterocromatina. Observaciones ultraestructurales en embriones de Triticum aestivum y Pennisetum glaucum revelaron una correlación positiva entre el tamaño de MN y la proporción de eucromatina y heterocromatina, MN grandes contienen mayor proporción de eucromatina61. Probablemente, MN grandes son consecuencia de efectos aneugénicos, asociados al tamaño del cromosoma rezagado (Anexo, figura, 4).
Las células en anafase-telofase con puentes múltiples se habrían originado por alteraciones en la compactación cromosómica, los cromosomas descondensados “pegajosos” se mantendrían unidos durante la segregación cromosómica,
material genético sería tal que la probabilidad de recuperación de estas células sería escasa. Los mecanismos que explican la alteración en la condensación cromosómica por efecto del cromo no se conocen. 19,59reportan cambios conformaciones a nivel de nucleosomas por efecto del Cr(III) que impiden el inicio de la transcripción.
Por otro lado, la cariocinesis asimétrica mostrada por efecto del Cr(VI) derivado del dicromato de potasio tanto en células somáticas como en células meióticas, serían indicadores de alteraciones en el complejo de proteínas implicados en los procesos de condensación cromosómica, lo cual ocurre, paralelo a la formación de la banda pre-profásica, importante para la ubicación sincrónica del conjunto de cinetocoros al huso acromático y segregación cromosómica equitativa. De acuerdo a las configuraciones adoptadas en la segregación cromosómica por efecto del Cr(VI) en los meristemos de raíz de vicia faba, se propone una explicación de la presencia de minicélulas, como consecuencia de la segregación incompleta y no equitativa del conjunto de cromosomas, falta de condensación cromosómica, asincronía en el progreso acromático y compactación cromosómica, generándose la citocinesis con una fisión obligada de los cromosomas o con la segregación de uno o mas cromosomas, resultando dos células hijas con núcleos notoriamente distintas, una minicélula y otra, con un exceso de material genético. En la figura 4A. Inicio de la migración de un grupo reducido de cromosomas, 4B y 4C. Citocinesis con variación del contenido nuclear, y en 4D. Minicélula. Un mecanismo alternativo, al origen de un microcito.
De todas las alteraciones registradas durante la mitosis por efecto del dicromato de potasio en Vicia faba, a las 8 horas de tratamiento, las células AT con puentes cromosómicos del total de telofases fueron significativamente altas comparada a los ATp evaluadas al azar y a las 40 horas de recuperación después de la exposición al dicromato de potasio, la alteración mas frecuente fue la presencia de MN. Consideramos estos dos parámetros altamente sensibles para ensayos de genotoxicidad. Este método de evaluación tiene ventajas de ser factible de que la cuantificación sea realizada por más de un observador, mayor objetividad, disminución del error de muestreo, facilidad en la toma de datos y resultados comparables en diferentes laboratorios. No habiéndose encontrado publicaciones similares al respecto.
En Mesocricetus auratus (2n=44), el incremento de micronúcleos en eritrocitos policromáticos de sangre periférica como consecuencia del dicromato de potasio revelaría su efecto clastogénico y/o aneugénico, que habría ocurrido a nivel proliferativo en las células precursoras de los eritrocitos en médula ósea. Las frecuencias de MN a los 2 días se diferencian significativamente del control y a los 4 días después de la aplicación de dicromato de potasio, no difieren entre los tratamientos e inclusive en aquellos individuos que recibieron una segunda dosis, vía intraperitoneal. Esta tendencia de disminución de las frecuencias de MN fueron registrados en eritrocitos de sangre periférica de Oreochromis niloticus expuestos de manera permanente a una solución de dicromato de potasio62. Los mecanismos que expliquen dichos cambios no se reportan. Probablemente se activan genes de reparación y adaptación al stress oxidativo generado por el dicromato de potasio implicados en la mantención de la dinámica proliferativa, diferenciación de las células madres a eritroblastos, estos, luego de la enucleación a eritrocitos poli cromáticos, y traslado a sangre periférica hasta su maduración a eritrocitos. Este ultimo proceso, implicaría un tiempo de 1 a 2 dias63.
significativo por efecto de la administración intraperitoneal de dicromato de potasio en madres gestantes y en sangre periférica de fetos provenientes de madres gestantes con tratamiento intraperitonial de dicromato de potasio, registraron 12,60 ‰ de MN en eritrocitos policromáticos; en ratones
suplementados vía oral, por periodos prolongados no mostraron diferencias significativas con el control en la frecuencia de micronúcleos 64. Sin embargo, con el test del cometa demostraron la presencia de fracturas cromosómicas por efecto del dicromato de potasio administrados por via oral en ratones65, esto indicaría mayor sensibilidad del test del cometa en la detección de genotoxicidad.
La frecuencia basal de micronúcleos en eritrocitos policromáticos de sangre periférica de Mesocricetus auratus (3,62‰±1,09), fue un promedio superior al basal, registrado en eritrocitos policromáticos en ratón (1.29‰), y de similar tendencia al incremento de micronúcleos por efecto de dicromato de potasio.
La presencia de células poliploides después de 4 días de la aplicación del dicromato de potasio, podría deberse a la asincronía en la segregación cromosómica en anafase, como la observada con frecuencia en meristemos de
Vicia faba. En meristemos radiculares de esta especie se observaron varios casos
de citocinesis seguido de una cariocinesis no equitativa, es decir: reducido numero de cromosomas e inclusive un cromosoma en un polo y en el otro, mayor numero de cromosomas.
Efecto del acido fólico
El impacto de micronutrientes como el acido fólico y vitamina B12 en la estabilidad del genoma han sido estudiados. Encuentran significativa correlación entre la deficiencia de folatos y alta frecuencia de micronúcleos y brotes nucleares
“nuclear buds” en linfocitos in Vitro 66,67. Los estudios del DNA en
la presencia de micronúcleos con fragmentos cromosómicos terminales acéntricos y micronúcleos con cromosomas completos, como consecuencia de roturas cromosómicas explicadas por la incorporación de uracilo en la estructura del DNA68,69. De estas evidencias concluyeron que los folatos tienen efecto protector del DNA tanto en las alteraciones de estructura como en el número cromosómico69.
Los resultados del presente trabajo en meristemos radiculares de Vicia faba, registraron un incremento de células con cariocinesis no equitativa, efecto sinérgico en el daño cromosómico en el tratamiento simultáneo con dicromático de potasio a las 8 horas de exposición. Sin embargo a las 40 horas de recuperación reveló una disminución significativa de micronúcleos y alteraciones cromosómicas comparada con los efectos del dicromato de potasio sin acido fólico. Así mismo, se demostró el incremento del índice mitótico de la población meristemática de raíces en Vicia faba expuestas solo a acido fólico durante dos días. De ello, se puede postular que el acido fólico estaría implicado en la activación de los procesos de transcripción relacionados a la replicación y división celular, lo que aumentaría la vulnerabilidad del tejido meristemático frente a genotóxicos como el dicromato de potasio, y la probabilidad de recuperación de estas células estarían disminuidas y por tanto serían eliminadas por efecto del proceso apoptósico.
Los valores promedios de la frecuencia de micronúcleos en eritrocitos policromáticos de M. auratus en los individuos tratados con dicromato de potasio en ausencia de acido fólico fueron mayores comparados con aquellos, que recibieron dosis de 1µg de ácido fólico por cada 100 g de peso durante una semana. La suplementacion con acido fólico no produjo aumento de las frecuencias de micronúcleos en eritrocitos policromáticos de M. auratus.
radiación después de 2 a 3 días de tratamiento con folato, hecho que no fue posible por la terapia convencional -solo con radiación- para inducir apoptosis o necrosis de células neoplásicas y promover la reducción del tamaño del tumor47. Otros trabajos con aplicación conjunta de acido fólico y dicromato de potasio reportaron disminución de las frecuencias de alteraciones en la morfología de espermatozoides en conejos debido a la actividad antioxidante del acido fólico48. Elevada frecuencia de eritrocitos micronucleados han sido registrados en pacientes con diabetes mellitus y con la suplementación de acido fólico reportan su disminución a diferencia de lo que ocurren en ratas70, la reducción de eritrocitos micronucleados por efecto del acido fólico reportaron en conejos con diabetes inducido previamente71.
Los folatos además de reducir las cantidades de homocisteina en el plasma72, estarían implicados en el control del ciclo celular. En cultivo de líneas celulares de epitelio de colon con bajo contenido de folato, se demuestra la inhibición del progreso del ciclo celular a través de los puntos de control y apoptosis a causa de la activación de proteínas de reparación del DNA como la ATM (ataxia
telangiectasia mutated)73,74. Esta proteína a su vez induce el aumento de la proteína p53, vía Chk2, el cual estimula la transcripción de p21 y bloquea el ciclo por inhibición de CDK/ciclina E 75. En ratas, reportaron roturas del DNA en el gen p53 en individuos carentes de folatos y la falta de regulación de la urokinasa76, enzima importante en la remodelación de proteasas (ECM), migración celular, proliferación celular y su asociación con el cáncer77. Si la concentración de urokinasa está elevada en tumores primarios es un indicador de metástasis y mal pronóstico en pacientes con cáncer de mama78,79. No es claro como el folato afecta los niveles de transcripción de la urokinasa.
PROPUESTA
Numerosas investigaciones han demostrado que la deficiencia de folatos produce roturas cromosómicas por la incorporación de uracilo en lugar de timina. La fortificación de alimentos con ácido fólico a menudo 400µg/día ha disminuido la incidencia de enfermedades al tubo neural, en la curación de algunas formas de anemia megaloblástica. Debido a su participación en la síntesis de DNA, así como en regulación epigenética de la expresión génica y en la regulación de la proliferación celular se asocia con la prevención de cáncer. No obstante la suplementación en pacientes con lesiones precancerosas en dosis elevada puede contribuir a un progreso mas acelerado al cáncer. De allí la importancia de mayores estudios en la dosificación de acido fólico.
Fue evidente el incremento del índice mitótico en la población meristemática de raíces de Vicia faba por efecto del ácido fólico y la magnificación del daño cromosómico en el tratamiento de manera conjunta con dicromato de potasio por 8 horas y una disminución significativa de alteraciones cromosómicas después de 40 horas de continuo crecimiento radicular sin dicromato de potasio, lo que no sucedió con el tratamiento con sólo dicromato de potasio, las frecuencias de daño genético fue significativa tanto a las 8h de tratamiento como después de 40h de la fase de recuperación. Estos resultados apoyan a recientes investigaciones, sobre la utilización conjunta de ácido fólico y radiación o quimioterapia en el tratamiento del cáncer.
CONCLUSIONES
La frecuencia de anafase-telofases con puentes cromosómicos después de 8 horas de tratamiento con dicromato de potasio en meristemos radiculares de Vicia faba fue de 34.39%.
La frecuencia de micronúcleos después de 40 horas de recuperación al tratamiento con dicromato de potasio en meristemos radiculares de Vicia
faba fue de 1.98%.
La frecuencia de micronúcleos en eritrocitos policromaticos en
Mesocricetus auratus fuede 6.77 ‰después de la aplicación de dicromato de potasio, significativamente mayor que la frecuencia registrada en el control(2,95 ‰)a las 48 horas.
La actividad proliferativa fue incrementada en meristemos radiculares de
Vicia faba por efecto del ácido fólico.
Después de 7 días de tratamiento con ácido fólico no generó incrementos en las frecuencias de micronúcleos en eritrocitos policromáticos de
Mesocricetus auratus
La disminución del daño cromosómico por efecto del acido fólico fue demostrada en meristemos radiculares de Vicia faba y en eritrocitos policromáticos de sangre periférica de Mesocricetus auratus.
Se demostró el efecto genotóxico del dicromato de potasio en Vicia faba y
Mesocricetus auratus.
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