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Evaluación de la actividad antimicrobiana de los extractos acuosos de Pentacalia ledifolia y Pentacalia vaccinioides (fam. asteraceae) sobre cepas de Listeria monocytogenes, Pseudomonas fluorescens y Salmonella Typhimurium

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(1)

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS

ACUOSOS DE Pentacalia ledifolia y Pentacalia vaccinioides (Fam. Asteraceae)

SOBRE CEPAS DE Listeria monocytogenes, Pseudomonas fluorescens y Salmonella

Typhimurium.

LADY JOHANNA TOBO CORTES

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

(2)

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS

ACUOSOS DE Pentacalia ledifolia y Pentacalia vaccinioides (Fam. Asteraceae)

SOBRE CEPAS DE Listeria monocytogenes, Pseudomonas fluorescens y Salmonella

Typhimurium.

LADY JOHANNA TOBO CORTES

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial

para optar al título de

MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

(3)

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946

(4)

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS

ACUOSOS DE Pentacalia ledifolia y Pentacalia vaccinioides (Fam. Asteraceae)

SOBRE CEPAS DE Listeria monocytogenes, Pseudomonas fluorescens y Salmonella

Typhimurium.

LADY JOHANNA TOBO CORTES

APROBADO

Carlos Fernando Sánchez Arcos, Bioq, M.Sc.

Director

(5)

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS

ACUOSOS DE Pentacalia ledifolia y Pentacalia vaccinioides (Fam. Asteraceae)

SOBRE CEPAS DE Listeria monocytogenes, Pseudomonas fluorescens y Salmonella

Typhimurium.

LADY JOHANNA TOBO CORTES

APROBADO

(6)

DEDICATORIA

A Dios por darme vida, el entendimiento y la fuerza necesaria para

cumplir con todas mis metas propuestas a lo largo de mi vida.

A mis padres por el esfuerzo grande para tenerme en esta gran

Universidad, además por su amor, comprensión y apoyo incondicional

frente a cada una de las dificultades y logros que he tenido en vida.

A mi hija Valentina, por ser mi motor y razón de vivir ahora y

siempre.

A mis amigos (Tana, Tati, Pipe y Diani) por brindarme el apoyo

incondicional frente a las diferentes dificultades que he tenido en mi

proceso de aprendizaje, creyendo siempre en mis capacidades para salir

adelante.

(7)

AGRADECIMIENTOS

Al profesor Carlos Sánchez por brindarme durante la realización de este trabajo, todo

su apoyo, tiempo, dedicación para alcanzar cada uno de los objetivos propuestos,

además por enseñarme parte de la materia Fitoquímica, asignatura importante para la

realización de este trabajo.

A los profesores Robles y Ricardo que me colaboraron con sus conocimientos, cada

vez que lo necesite y siempre estuvieron pendientes de la buena realización de este

trabajo.

A la profesora Gina y el profesor Alex por brindarme parte de su tiempo, para la

cuantificación proteica de los extractos y la electroforesis en gel. Enriqueciendo mis

conocimientos para el buen desarrollo de la investigación.

(8)
[image:8.612.111.491.184.729.2]

TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN

ABSTRACT

1.INTRODUCCIÓN

3

2.MARCO TEÓRICO

4

2.1 Enfermedades transmitidas por alimentos….……….

4

2.1.1 Microorganismos asociados ………... 4

2.1.1.1 Listeria monocytogenes………..….……..….. 4

2.1.1.1.1 Generalidades…...………... 4

2.1.1.2 Pseudomonas fluorescens……….. 5

2.1.1.2.1 Generalidades……….…...

5

2.1.1.3 Salmonella Typhimurium..………..…………..………... 5

2.1.1.3.1 Generalidades………...….……….………... 5

2.2 Productos de plantas como agentes antimicrobianos………..

6

2.2.1 Principales compuestos antimicrobianos derivados de plantas….……. 6

2.2.1.1 Fenoles………..……….….. 6

2.2.1.2 Flavonas………...………..…..

7

2.2.1.3 Taninos...……….………... 7

2.2.1.4 Quinonas……….…..

8

2.2.1.5 Saponinas………...………....…… 8

2.2.1.6 Proteínas...……...…... 8

2.3 Actividad antimicrobiana del genero Pentacalia (fam: Asteraceae)……… 9

2.3.1 Pentacalia ledifolia...……….………..….…. 9

2.3.2 Pentacalia vaccinioides……….………..

10

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN………

10

3.1 Formulación del problema……….... 10

3.2 Justificación de la investigación……….……….……..

10

4. OBJETIVOS……….……… 11

4.1 Objetivo General………..….. 11

4.2 Objetivos específicos……… 11

5. MATERIALES Y MÉTODOS………..

11

5.1 Diseño de la investigación ………....

11

5.1.1 Hipótesis………... 11

5.1.1.1 Hipótesis nula.………... 12

5.1.1.2 Hipótesis alterna………... 12

5.1.2 Variables del estudio………...

12

5.2 Materiales y métodos…..………..……….. 12

5.2.1 Recolección de muestras………. 12

(9)

5

.

2.1.2 Obtención del extracto acuoso proteico a partir del género

………..

Pentacalia (fam: Asteraceae).………...

13

5.2.2 Concentración de los extractos mediante precipitación con sulfato de

………….

amonio.………..……….……….…...

13

5.2.3 Cuantificación proteica de los extractos concentrados..………. 14

5.2.4 Evaluación de la actividad antimicrobiana………. 14

5.3 Análisis estadístico……...………..….…… 15

6.

Resultados y discusión………..………...………. 15

6.1

Obtención de cepas……….,………. 15

6.2 Evaluación del extracto acuoso proteico a partir del género Pentacalia

(fam:Asteraceae).………

17

6.3 Concentración de los extractos mediante precipitación con sulfato de

amonio.……….

17

6.4 Cuantificación proteica de los extractos concentrados………. 18

6.5 Evaluación de la actividad antimicrobiana de los extractos acuosos………. 19

6.6

Análisis estadístico ANOVA………. 21

7. Conclusiones………..……….……….…………..…. 22

8. Recomendaciones……….………...….….…….….. 23

9. Referencias……….………...….………..….. 24

(10)

ÍNDICE DE FIGURAS

Pág

.

FIGURA 1.

Montaje de antibiograma Pseudomonas fluorescens en agar Tripticasa

de soya

15

FIGURA 2.

Aislamientos en agar Tripticasa de soya y coloración de Gram.

16

FIGURA 3.

Resultados

de la evaluación antimicrobiana de los extractos acuosos

proteicos de P. ledifolia y P. vaccinioides sobre las cepas de L.

monocytogenes, Pseudomonas fluorescens y

Salmonella

Typhimurium.

19

FIGURA 4.

Actividad antimicrobiana de los extractos acuosos proteicos de P.

vaccinioides sobre Salmonella Typhimurium y Pseudomonas

fluorescens.

(11)

ÍNDICE DE TABLAS

Pág

.

Tabla 1.

Grupos quimicos mas importantes con actividad antimicrobiana obtenidos

de plantas

7

Tabla 2.

Determinación del % de saturación con sulfato de amonio.

17

Tabla 3.

Cuantificación Total proteica Bradford en placa.

18

(12)

ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo 1.

Resultados de actividad antimicrobiana

Pág.

(13)

RESUMEN

Se evaluó la actividad antimicrobiana de los extractos acuosos proteicos disueltos en

H

2

O desionizada y en un Buffer Tris HCl a pH de 7, obtenidos a partir de hojas de

Pentacalia ledifolia y Pentacalia vaccinioides, contra dos bacterias Gram-negativas:

Salmonella

Typhimurium y Pseudomonas fluorescens y una Gram-positiva:

Listeria

monocytogenes, utilizando el método de “difusión en agar, medio Tripticasa de Soya”.

En los cuatro extractos obtenidos a partir de las dos especies de Pentacalia, se

cuantifico la proteína Total presente en cada proceso de extracción y concentración,

por medio de la Técnica de Bradford modificado, en placas de Elisa, a 620nm en un

Lector de Microplaca. Los resultados evidenciaron la presencia de proteína en los

extractos y el aumento de la misma después de la precipitación con sulfato de amonio.

Los resultados de inhibición reportaron que L.monocytogenes fue resistente frente a

los extractos, por el contrario, tanto Pseudomonas fluorescens y Salmonella

typhimurium, reportaron sensibilidad frente a los cuatro extractos, siendo los extractos

de Pentacalia vaccinioides los que presentaron mayor actividad antimicrobiana.

(14)

ABSTRACT

The antimicrobial activity of the protein aqueous extracts obtained from the leaves of

Pentacalia ledifolia and Pentacalia vaccinioides, dissolved in deionised H

2

O and in a

Tris-HCl Buffer to pH of 7 was assessed, ,against two Gram-negative bacteria:

Salmonella Typhimurium and Pseudomonas fluorescens and a Gram-positive: Listeria

monocytogenes, using the method of "dissemination in agar, Trypticase Soy Broth"

In the four extracts obtained from the two species of Pentacalia, the total protein

present in each extraction and concentration process was quantified, by the Bradford

Technique ajusted, in plates of Elisa, 620nm, in a reader of Microplate. The results

showed the presence of protein in the extracts and the increase in the same after the

precipitation with ammonium sulphate. The results of the inhibition showing that L.

monocytogenes was resistant to the extracts, by contrast, both Pseudomonas

fluorescens and Salmonella typhimurium reported sensitivity to the four extracts, being

the extracts of Pentacalia vaccinioides which evidenced greater antimicrobial activity.

The data were assessed statistically by means of ANOVA test (variance analysis),

which determined that there are statistically significant differences between the

average values of the inhibition halos, with a value alpha of 0.05 and therefore it rejects

the non-existence of antimicrobial activity of the protein aqueous extracts.

(15)

3

1. INTRODUCCIÓN

El mundo natural ha ofrecido una riqueza de productos de origen vegetal, algunos de

los cuales han sido explorados por el hombre, en diferentes campos de la

investigación. Entre ellos, los extractos naturales han sido utilizados desde la

antigüedad para el control de muchas enfermedades (Larrahondo, 2001).

De los vegetales se pueden obtener extractos para muchos y diversos fines; entre

ellos para la protección de la planta contra plagas, enfermedades e inclusive de la

invasión de otras plantas y microorganismos. Estas cualidades de protección se ven

reflejadas en propiedades: antisépticas, antifúngicas, antibacterianas entre otras. Los

extractos naturales se obtienen directamente de las plantas y no sufren

transformaciones posteriores, por ello su rendimiento es bajo y continúan siendo

costosos. Se extraen de las partes no leñosas de las plantas, en especial de las hojas,

mediante diferentes métodos: extrusión, destilación por arrastre con vapor de agua

(más usada a nivel comercial), extracción con solventes volátiles, enflourage

(generalmente para extractos de flores) y con fluidos supercríticos (Goñi, 2008).

Recientemente se ha generado un gran interés por lo natural y lo orgánico lo que ha

favorecido la producción y estudio de extractos vegetales, ya que al ser de origen

natural se espera que tengan un mínimo o ningún riesgo para el ser humano.

Pentacalia

, un género de la familia

Asteraceae

, se caracterizan por ser arbustos

abundantes y encontramos algunos autóctonos de los páramos andinos colombianos

presentes a altitudes entre los 2.500-3.800 m.s.n.m., aunque no se les conoce algún

uso medicinal, son considerados ricos en la producción de metabolitos secundarios

como flavonoides y terpenos, presentes en algunas de sus especies (Torrenegra

et al

.,

2000). Estos componentes han sido altamente estudiados y con frecuencia han

expuesto actividad antimicrobiana.

La utilidad de estos extractos vegetales constituye una alternativa innovadora y eficaz,

para el control de calidad de alimentos en almacenamiento. Los alimentos pueden

transmitir patologías de origen microbiano, esto ha sido considerado uno de los

mayores problemas de salud en el mundo. Debido a que el consumo de alimentos y/o

agua es un riesgo potencial permanente para la salud de la población en general.

Por lo anterior, en este trabajo se evaluó la presencia de actividad antimicrobiana de

(16)

4

Salmonella

Typhimurium

y Pseudomonas fluorescens

;

siendo

las dos primeras muy

reconocidas como bacterias patógenas, responsables de generar enfermedades

tramitadas por alimentos (ETA), mientras que la última, es considerada un alterador

proteolítico y lipolítico de la industria de alimentos. El valor de la actividad

antimicrobiana se calculó mediante la interpretación de cada uno de los halos

generados por las cepas en estudio.

2. MARCO TEÓRICO

2.1 Enfermedades trasmitidas por alimentos

Las Enfermedades Transmitidas por Alimentos

(ETA)

son aquellas que se originan por

la ingestión de alimentos infectados con agentes contaminantes en cantidades

suficientes para afectar la salud del consumidor. Sean sólidos naturales, preparados, o

bebidas simples como el agua, los alimentos pueden originar dolencias provocadas

por patógenos, tales como bacterias, virus, hongos, parásitos o componentes

químicos, que se encuentran en su interior (Tomado de:www.panalimentos.org).

Las enfermedades de origen alimentario, se pueden presentar en cualquier lugar,

predominando aquellos donde se practican malos hábitos higiénicos y/o sanitarios y en

lugares en condiciones de hacinamiento. Constituyen una causa importante, de

mortalidad en países industrializados y en vía de desarrollo y en estos últimos, son

causa frecuente de mortalidad (Vásquez de Plata, 2003).

2.1.1 Microorganismos asociados

2.1.1.1

Listeria monocytogenes

2.1.1.1.1 Generalidades

Listeria monocytogenes

es un bacilo

Gram

positivo, aerobio, psicrótrofo, halo tolerante,

no móvil, no esporulado, responsable de la mayor parte de las infecciones por

Listeria

que afectan al hombre. En animales,

L. monocytogenes

es responsable de la mayoría

de las infecciones, pero en ovejas el

10–15% de los casos de septicemia listérica se

deben a

L. ivanovii

. (Manual de la OIE.2004).

L. monocytogenes

es una bacteria ampliamente difundida en la naturaleza. Su

presencia en los alimentos está determinada por su extensa distribución en el

ambiente – tierra, aguas servidas, materia fecal, vegetación, ensilados y entorno de la

producción de alimentos, lo que confiere una importante oportunidad para

(17)

5

Una de las enfermedades más importantes de transmisión por alimentos producida por

este microorganismo es la listeriosis, las manifestaciones de la enfermedad en el

hombre comprenden septicemia, meningitis (o meningoencefalitis) y encefalitis,

habitualmente precedidas de síntomas parecidos a los de la gripe, incluida la fiebre.

En mujeres gestantes, las infecciones intrauterinas o cervicales pueden provocar

abortos espontáneos o nacidos muertos. También se ha asociado

L. monocytogenes

con manifestaciones gastrointestinales acompañadas de fiebre. Aunque la morbilidad

de la listeriosis es relativamente baja, la mortalidad de la enfermedad

sistémica/encefalítica puede ser muy alta, con valores cercanos al 30%. Los ancianos,

las mujeres gestantes, los recién nacidos y los individuos inmunocomprometidos se

consideran de alto riesgo de contraer la enfermedad. (Manual de la OIE.2004)

2.1.1.2

Pseudomonas fluorescens

2.1.1.2.1 Generalidades

Pseudomonas fluorescens

, es la especie bacteriana Psicrotrófica que con mayor

frecuencia se encuentras en las leches en refrigeración (Costa

et al

, 2002).

Pseudomonas constituye uno de los grupos más complejos, son cosmopolitas y su

ubicuidad les permite colonizar cualquier sustrato imaginable, son colonizadoras de las

raíces de las plantas hasta casi formar una simbiosis, son capaces de poner en forma

asimilable el hierro, imprescindible en la función clorofílica vegetal, algunas tienen un

marcado carácter antagonista frente a otros microorganismos.

Pseudomonas

fluorescentes

es una bacteria que posee células en forma de varillas rectas o

ligeramente curvadas, Gram negativa y móvil mediante uno o varios flagelos polares,

aerobio

.

Se describe como una bacteria asociada al fotoplano y a la rizósfera, si la

bacteria es introducida en la semilla o material de siembra, puede controlar

enfermedades patogénicas del suelo y promover el crecimiento al suprimir otros

organismos dañinos (Botero & Aránzazu, 1999)

2.1.1.3

Salmonella

Typhimurium

2.1.1.3.1

Generalidades

Se han descrito brotes por

Salmonella

Typhimurium

en distintos países, transmitidos a

través de alimentos procesados, como huevos y leche pasteurizada, alimentos crudos

como leche, lechugas o por transmisión a través de manipuladores de alimentos. En

países como México ha llegado a ser el serotipo más identificado. (Barroso el at,

(18)

6

Salmonella

Typhimurium causa serias enfermedades en niños e individuos

inmunocomprometidos, a menudo resultando en infecciones sistémicas. La dosis

infecciosa de

Salmonella s

pp es bastante amplia y puede variar desde 10

6

hasta 10

9

cfu/g (Bhunia, 2008 publicado por: Alemany De Jesús, 2009). Este microorganismo es

uno de los causantes de salmonelosis en seres humanos y animales, esta enfermedad

genera síntomas como diarrea, fiebre, dolor de cabeza, nauseas, dolor de abdomen,

vomito y con menor frecuencia sangrado en las heces. (León

et al.,

2004)

2.2

Productos de plantas como agentes antimicrobianos

Desde la antigüedad el hombre ha utilizado las plantas para el tratamiento de

infecciones y enfermedades comunes y algunas de estas medicinas tradicionales

siguen siendo parte del tratamiento habitual de diversas enfermedades. Los

componentes químicos y los extractos naturales mostraron interés a partir de la ciencia

moderna. (Domingo & López., 2003)

2.2.1 Principales compuestos antimicrobianos derivados de plantas

No todos los componentes químicos elaborados por la planta poseen igual interés para

la Fitoquímica. Los denominados principios activos son frecuentemente alcaloides o

heterósidos. Otros grupos, como los glúcidos, grasas y proteínas, presentan

importancia dietética y muchos como los almidones y las gomas, se emplean en

técnica farmacéutica, aunque carecen de presentar acción farmacológica. Las plantas

originan una gran cantidad de compuestos secundarios como protección contra

ataques microbianos e insectos, muchos de estos compuestos se han utilizado de

forma pura o extractos vegetales como alimento o aplicaciones médicas para el

hombre (Lizcano & Vergara, 2008).

Las plantas tienen una capacidad ilimitada de sintetizar compuestos, la mayoría

relacionados con el fenol y sus derivados los compuestos más estudiados extraídos de

las plantas se muestran en la Tabla 1.

2.2.1.1 Fenoles

Los fenoles tienen una actividad fisiológica marcada porque poseen propiedades

antisépticas y antihelmínticas como los polifenoles, utilizadas a lo largo de los años en

tratamientos de infecciones urinarias. Los mecanismos de estas sustancias parecen

estar relacionadas con la inhibición enzimática por los compuestos oxidados,

posiblemente mediante reacciones de grupos sulfihidrilo o por interacciones no

(19)

7

Entre los fenoles encontrados en estado libre se encuentran constituyentes importante

de las esencias como el timol, el carbacrol, el eugenol y el chavicol. Muchos de los

fenoles se encuentran en estado de éter oxidado en las esencias, como el estragol, la

[image:19.612.105.538.183.341.2]

miristicina, el apiol y el atenol (Carey, 2003).

Tabla 1. Grupos quimicos mas importantes con actividad antimicrobiana obtenidos de plantas.

Fuente:

Domingo & López., 2003

2.2.1.2 Flavonas

Las flavonas son estructuras fenólicas que contienen un grupo carbonilo. Constituye la

familia más amplia de fenoles naturales. Su actividad frente a los microorganismos

probablemente se debe a que forman complejos con las proteínas solubles y

extracelulares y con las células de la pared bacteriana, de forma similar q las

quinonas. Mención especial merecen las catequinas, presentes en el té verde, las

cuales ejercen actividad frente a

Vibrio cholerae

O1,

Streptococcus mutan

s,

Shigella

y

otros microorganismos. Otros flavonoides tienen en general actividad antiviral.

(Lizcano & Vergara, 2008)

2.2.1.3 Taninos

El término tanino se ha empleado para denominar ciertas sustancias presentes en

extractos vegetales capaces de combinarse con proteínas de la piel animal, evitando

su putrefacción y convirtiéndolas en cuero. Constituyen un grupo de sustancias

fenólicas poliméricas y se pueden dividir en, hidrolizables y condensados en función

de que puedan o no ser hidrolizados. Se han descrito más de 30 taninos que pueden

inhibir hongos y bacterias. Un ejemplo es el tanino presente en el eucalipto

(20)

8

2.2.1.4 Quinonas

Las quinonas son anillos aromáticos con dos funciones ceto. Son ubicuas en la

naturaleza y causantes del color marrón que se produce en las frutas cuando son

dañadas. Poseen una alta reactividad, formando complejos con los aminoácidos

hidrofílicos de las proteínas, la mayoría de las veces inactivando la proteína y

anulando su función. Debido a esto, el potencial antimicrobiano de este grupo es

amplio. Un ejemplo es la hipericina, una antraquinona aislada de la planta de San Juan

(

Hyperricum perforatum

), antiguamente utilizada como antidepresivo (Domingo &

López., 2003).

2.2.1.5 Saponinas

Las saponinas se caracterizan por presentar enlaces glucósidos y/o ester entre una

genina poco polar y restos glucídicos. Presentan actividad para formar espuma en

soluciones acuosas y por hemolisar los glóbulos rojos. Son los componentes

principales de varios extractos de plantas, tiene actividad antiprotozoaria. Las

saponinas se unen el colesterol y otros esteroles de la membrana celular de los

protozoos causando su inestabilidad, lisis y muerte celular. Pero algunas saponinas

esteroides han mostrado diversas actividades biológicas (antimicrobiana, citotóxica,

antitumoral, ictiotóxica, molusquicida, insecticida, antihelmíntica, expectorante,

diurética, cardiovascular, antiinflamatoria, anti-úlcera, espermicida, analgésica,

antipirética, sedante, antifertilidad, antihepatotóxica, hemolítica, antimicótica, etc.)

fundamentalmente se han constituido desde hace bastante tiempo, como precursores

únicos de muchos medicamentos esteroides tales como hormonas sexuales,

corticoides, contraceptivos orales y diuréticos. (Lizcano & Vergara, 2008).

2.2.1.6 Proteínas

Las proteínas son polímeros lineales de

α

aminoácidos, unidos por enlaces peptídico,

tienen amplia variabilidad estructural y funcional. Las proteínas son biomoléculas

formadas básicamente por carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno. Pueden además

contener azufre y en algunos tipos de proteínas, fósforo, hierro, magnesio y cobre

entre otros elementos. (Yábar, 2005). Debido a su gran tamaño, cuando estas

moléculas se dispersan en un solvente adecuado, forman soluciones coloidales, con

características que las distinguen de las soluciones de moléculas más pequeñas.

La organización de una proteína viene definida por cuatro niveles estructurales

(21)

9

estructura cuaternaria. Cada una de estas estructuras informa de la disposición de la

anterior en el espacio. Y se pueden clasificar según su función, su composición, y su

conformación. Las funciones que cumplen son muy variables; las más destacadas son,

estructurales, enzimáticas, hormonales, reguladoras, defensivas, de transporte y de

reserva, entre otras (Prescott, 2004).

En los últimos años un creciente número de péptidos antimicrobianos han sido

aislados a partir de extractos vegetales, los péptidos aislados de

las semillas de

Mirabilis jalapa

se dividieron en seis clases y mostraron actividad

antimicrobiana. Recientemente se ha tenido cada vez más claro que los péptidos

cumplen un papel importante en la protección de las plantas y contra infección

microbiana estos resultados son de gran importancia para la ingeniería genética

microbiana (Carvalho

et al

., 2000).

2.3

Actividad antimicrobiana del género

Pentacalia

(fam:

Asteraceae

)

El género

Pentacalia

ha sido poco estudiado y se han reportado en la literatura los

estudios en

P. ephiphytica, P. andicola, P. firmipes, P. corymbosa y P. archieri

de las

cuales se aislaron nerolidol, humuleno, farneseno, curcumeno, saltaleno, germacreno

D, varios cadinenos, cicloartenol, friedelina y 5-metoxieugenol (Torrenegra

et al.

,

2000).

Muchas familias de plantas como las

Myrtaceae, Asteraceae

y

Piperaceae

son bien

conocidas por tener principios como los terpenoides y grupos de amidas que tienen

efecto antialimentario, repelente e insecticida que inhibe el desarrollo y el crecimiento

de muchos insectos del orden

Lepidóptera

(Celis

et al

., 2008). La familia mejor

representada al igual que en otras regiones de alta montaña del país es

Asteraceae

, la

más numerosa en especies de plantas dicotiledóneas con 1100 géneros y 25000

especies (Sánchez

et al.

, 2007).

2.3.1

Pentacalia ledifolia

Es considerado como un arbusto de hasta 1.5 m de alto, con olor a trementina. Tallos

con cicatrices de las hojas. Hojas simples, alternas, aciculares, con la margen entera y

totalmente revoluta. Inflorescencia terminal y corimbiforme, sobrepasando las hojas.

Capítulos discoides, con todas las flores hermafroditas, tubulares, de color amarillo y

fragantes. Fruto en aquenio, obovoide y con pappus blanco (García

et al

., 2006).

Se conoce con los nombres comunes de Güiesquin, Hierba santa, Hierba cana,

(22)

10

los páramos de Venezuela. En Colombia se encuentra en los departamentos de

Cundinamarca, Boyacá, Meta, Norte de Santander y Santander. Presenta una

floración de julio a agosto y de diciembre a enero (Pedraza

et al

., 2004).

2.3.2

Pentacalia vaccinioides

También es considerado como un arbusto de hasta 5m de alto, bastante ramificado y

con olor a trementina. Ramas frecuentemente fasciculadas y con cicatrices foliares.

Hojas simples, alternas, ascendentes obovadas, glabras, coriáceas y con la margen

entera. Inflorescencia terminal, en corimbos. Capítulos discoides, largamente

pedunculados, con el involucro acampanado. Flores de 24-56 por capitulo, todas

hermafroditas, tubulares, amarillas y fragantes. Fruto en aquenio, cilíndrico y con

pappus blanco. (García

et al

., 2006).

Se conoce con los nombres comunes Tangue (Santander), Chilquilla menuda o Hierba

de paramo (Cauca). Esta especie está registrada en los páramos de Colombia,

Ecuador y Venezuela. En Colombia está presente en las tres cordilleras, se encuentra

con frecuencia en matorrales y bordes de carreteras (Pedraza

et al.,

2004).

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

3.1 Formulación del problema

¿Tendrán actividad antimicrobiana los extractos acuosos proteicos, obtenidos a partir

de las especies

Pentacalia ledifolia y Pentacalia vaccinioides

contra los

microorganismos

Listeria monocytogenes, Pseudomonas fluorescens y Salmonella

Typhimurium?

3.2 Justificación de la investigación

La mayoría de las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) son de origen

microbiano, estos microorganismos patógenos tienen un impacto importante en la

salud de la población. El consumo de alimentos contaminados con microorganismos

como

L. monocytogenes, Pseudomonas fluorescens y Salmonella

Typhimurium ha

generado que cada vez mas investigaciones se inclinen, a desarrollar agentes que

ataquen la viabilidad de estos microorganismos. En este momento se conocen muchas

sustancias de origen natural, para el control e inhibición de los microorganismos con el

fin de preservar los alimentos y así evitar el uso de aditivos químicos. De acuerdo con

esto, se reconoció la necesidad de someter estos extractos acuosos a pruebas o

(23)

11

Mediante esta investigación se evaluó la presencia de actividad antimicrobiana de los

extractos acuosos proteicos de

Pentacalia ledifolia y Pentacalia vaccinioides

(Fam:

Asteraceae

) realizando el estudio “in vitro” frente a cepas de

Listeria monocytogenes,

Salmonella

Typhimurium

y Pseudomonas fluorescens.

Con los resultados obtenidos se

determino la resistencia (R) o sensibilidad (S) de las bacterias frente a los extractos,

para que puedan ser implementados en el tratamiento de enfermedades transmitidas

por alimentos (ETA).

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo general

Evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos acuosos proteicos de

Pentacalia

ledifolia y Pentacalia vaccinioides (Fam. Asteraceae)

sobre cepas de

Listeria

monocytogenes, Pseudomonas fluorescens y Salmonella

Typhimurium.

4.2 Objetivos específicos

Obtener los extractos acuosos de

Pentacalia ledifolia y Pentacalia vaccinioides

(Fam. Asteraceae)

.

Llevar a cabo una caracterización proteica de los diferentes extractos acuosos

vegetales obtenidos de

Pentacalia ledifolia y Pentacalia vaccinioides (Fam.

Asteraceae)

Evaluar la actividad bactericida de los extractos acuosos obtenidos

Pentacalia

ledifolia y Pentacalia vaccinioides (Fam. Asteraceae), sobre Listeria

monocytogenes, Salmonella

Typhimurium

y Pseudomonas fluorescens

en

medio de cultivo.

Determinar la concentración mínim

a inhibitoria (CMI) de los extractos de

Pentacalia ledifolia y Pentacalia vaccinioides (Fam. Asteraceae), que presenten

mayor inhibición ante las cepas de Listeria monocytogenes, Salmonella

Typhimurium

y Pseudomonas fluorescens

.

5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1  Diseño de la investigación

(24)

12

5.1.1.1 Hipótesis nula

Los extractos obtenidos de las especies

Pentacalia ledifolia

y

Pentacalia

vaccinioides no

presentan halo de inhibición frente a las cepas

Listeria

monocytogenes, Salmonella

Typhimurium

y Pseudomonas fluorescens

.

Ho: µ =

0

5.1.1.2 Hipótesis alterna

Los extractos obtenidos de las especies

Pentacalia ledifolia

y

Pentacalia

vaccinioides

presentan halo de inhibición frente a las cepas

Listeria

monocytogenes, Salmonella

Typhimurium

y Pseudomonas fluorescens

.

Hi: µ

0

5.1.2 Variables del estudio

Las variables que se utilizaron en el presente trabajo de grado contribuyeron a

determinar aquellas especies que tienen propiedades antimicrobianas.

Dependiente:

Tamaño de Halo de inhibición medido en mm.

Independiente:

Tipo de microorganismo y tipo de extracto.

5.2 Materiales y métodos

5.2.1 Recolección de muestras

Las muestras vegetales de las especies

Pentacalia ledifolia y Pentacalia vaccinioides.

Pertenecientes a la familia

Asteraceae

se recolectaron en el páramo de “Choachí”, al

Sureste de la Ciudad de Bogotá, a una altitud de (3.115 m.s.n.m.); la muestra se tomo

en óptimo estado fitosanitario y de desarrollo vegetativo, el material fue secado a

temperatura ambiente, posteriormente se realizó una separación de hojas y flores,

para utilizar como muestra total, las hojas pertenecientes a cada especie. Cada una de

las muestras se trituraron en un molino eléctrico (tamiz 0.3 cm). Un ejemplar de cada

especie vegetal fue evaluado por el Herbario de la Pontificia Universidad Javeriana de

la ciudad de Bogotá D.C.

5.2.1.1

Obtención de las cepas

(25)

13

5.2.1.2 Obtención del extracto acuoso proteico a partir del género

Pentacalia (fam:

Asteraceae

)

Los extractos acuosos proteicos de las especies

Pentacalia ledifolia y Pentacalia

vaccinioides

se prepararon mediante el proceso de maceración en frio, en una

proporción 1:3, material vegetal – bencina de petróleo, la extracción se realizó durante

24 horas a temperatura ambiente, esto con el fin de separar la fase lipídica contenida

en el extracto acuoso. El producto se filtró y con ayuda del rotaevaporador se recuperó

la bencina de petróleo residual, se dejó secar el material vegetal a temperatura

ambiente y luego se dividió en dos partes iguales para continuar con el proceso de

maceración en frio, en una proporción 1:3, en dos medios: agua desionizada o Buffer

Tris HCl a pH de 7. Esto se preparó en frascos de vidrio, de capacidad de un galón,

estériles a temperatura ambiente con agitación suave durante 24 horas, para obtener

el extracto acuoso proteico. El material se filtro para separar el material vegetal

residual. A partir del extracto acuoso se realizó una extracción liquido–liquido con

bencina de petróleo en un embudo de decantación, para separar la fase lipídica

remanente contenida en el extracto acuoso. Los cuatro extractos generados por las

dos especies, se filtraron utilizando un poro de 0.45µm, con el fin de eliminar cualquier

interferencia por la presencia de un hongo encontrado en el material vegetal

desechado.

5.2.2 Concentración de los extractos mediante precipitación con sulfato de

amonio.

Se precipitaron las proteínas de los extractos acuosos mediante la técnica conocida

como “salting-out” o precipitación con sulfato de amonio, según la metodología

propuesta por Harris y Angal, 1994. Se tomaron seis alícuotas de 20 ml del extracto

acuoso de

Pentacalia ledifolia

tanto en solución con Buffer Tris HCL como con H

2

O

desionizada, refrigerando a 4ºC. Después se calcularon los gramos de sulfato de

amonio necesarios para obtener un 20, 30, 40, 50, 60 y 70% de saturación, se

adiciono poco a poco el sulfato de amonio para cada alícuota revolviendo durante una

hora a 4ºC. Posteriormente se centrifugo cada alícuota a 3000 rpm durante 40

minutos, se retiro el sobrenadante y los pellets obtenidos fueron resuspendidos en 2ml

de Buffer Tris HCL o H

2

O desionizada según fuera el caso, para así obtener los

(26)

14

5.2.3 Cuantificación proteica de los extractos concentrados.

La cuantificación proteica total de los extractos utilizados, se realizo por medio de la

técnica de Bradford modificada, que se elaboro en placas de Elisa. El montaje de la

placa se efectúo adicionando 20 µL de cada uno de los extractos por duplicado,

utilizando los pozos consecutivamente, posteriormente se elaboro dos curvas de

calibración, utilizando seroalbúmina bovina 0.15M con Buffer Tris HCl y agua

desionizada. Todas las muestras fueron sometidas a la acción de 200µL de reactivo de

Bradford (0.01% Coomasie Blue G-250, 4.75% Etanol, 85% H

3

PO

4

) luego se

homogenizo y se dejo 15minutos de reposo. Finalmente se evaluó la concentración del

compuesto coloreado midiendo a 620nm en un Lector de Microplaca - Anthos 2020

versión 2.0.5. Los resultados se expresan como Proteína (mg/ml) en la Tabla 3.

5.2.4 Evaluación de la actividad antimicrobiana

La actividad de los extractos acuosos concentrados y diluidos se realizo, de acuerdo al

método de difusión en agar (Ponce

et al

., 2008). Las cepas de

Listeria

monocytogenes, Pseudomonas fluorescens y Salmonella

Typhimurium

se recuperaron

en medio Tripticasa de Soya (TS) (Figura 2a, 2c y 2e). Se preparó la suspensión de

cada una de las cepas en solución salina al 0.85%, de acuerdo al tubo 0.5 del Patrón

de Mac Farland, posteriormente se inocularon 0.1 ml de las suspensiones en cajas de

Petri con medio Tripticasa de soya y se sembraron masivamente. Cada caja contenía

un disco de papel Whatman No 3 (5mm), impregnado con 10µl de Extracto acuoso

proteico de

Pentacalia ledifolia

en solución de H

2

O desionizada, un disco con 10µl del

Extracto acuoso proteico de

Pentacalia ledifolia

en solución Tris HCL, un disco con

10µl por cada Extracto diluido a una concentración 1/2, un disco como control positivo

(Ciprofloxacina(CIP) y Imipenem (IPM) para

Pseudomonas fluorencens

; (CIP) y

NorFloxacina (NOR) para

Salmonella

Typhimurium; (CIP) y Gentamicina (CN) para

Listeria monocytogenes

), un disco como control negativo con 10µl de solución salina al

0.85%. El montaje de cada una de las cajas se ve ilustrada en la Figura 1. De cada

ensayo se realizaron 10 repeticiones. Las placas correspondientes a

Listeria

monocytogenes

y

Salmonella

Typhimurium se incubaron a 37+/-2ºC por 24 horas, y

las placas con

Pseudomonas fluorescens

se dejaron a temperatura ambiente por 24

horas. Terminado el tiempo de incubación se midieron los halos de inhibición frente a

los microorganismos. Se considera como positivo cuando el halo supera 1 mm de

inhibición (Kalemba, 2003).

(27)
[image:27.612.205.416.65.225.2]

15

Figura 1. Montaje de antibiograma Pseudomonas fluorescens en agar Tripticasa de Soya Los números representan la ubicación consecutiva de los discos control positivo, negativo y los diferentes extractos acuosos

proteicos, como se muestra en la Tabla 4.

5.3 Análisis estadístico

Se determino por medio de la prueba ANOVA (Análisis de varianza) La existencia o no

de diferencias significativas entre los diámetros de los halos de inhibición, reportados

en la evaluación antimicrobiana de los extractos acuosos proteicos

Pentacalia ledifolia

y

Pentacalia vaccinioides

frente a las cepas

Listeria monocytogenes, Salmonella

Typhimurium

y Pseudomonas fluorescens

.

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1 Obtención de las cepas.

Las cepas utilizadas en el estudio se conservaron en medio Tripticasa de soya con la

temperatura optima de crecimiento para cada microorganismo, siendo para

L.

monocytogenes

y

Salmonella

Typhimurium 37+/-2ºC, y para

Pseudomonas

fluorescens

temperatura ambiente.

En la Figura 2 se muestran los resultados de pureza y viabilidad de las cepas durante

el estudio, en las cuales se obtuvieron las morfologías de cada unas de las cepas

coincidiendo con lo reportado por Pozo

et al

., 2006, en el caso de la morfología de

Salmonella

Typhimurium (Figura 2b), se observaron bacilos

Gram

-negativos.

Posteriormente en el caso de la morfología de

Pseudomonas fluorescens

(Figura 2d),

se observaron células en forma de varillas rectas o ligeramente curvadas,

(28)
[image:28.612.105.512.69.542.2]

16

Las imágenes corresponden: (a-b) Salmonella Typhimurium (c-d) Pseudomonas fluorescens y (e-f) L.monocytogenes.

Figura 2. Aislamientos en agar Tripticasa de soya y coloración de Gram.

Finalmente concordando con lo reportado en el Manual de la OIE.2004 para

L.

monocytogenes

(Figura 2f), corresponde a bacilos Gram-positivos, no móvil, en

algunos casos en forma de Y o V. Lo anterior demuestra que el banco de células es un

cultivo microbiano puro, homogéneo; almacenado bajo condiciones que mantienen su

viabilidad y pureza observadas mediante características morfológicas de cada cepa.

a.

b.

c.

d.

(29)

17

6.2 Evaluación del extracto acuoso proteico a partir del género Pentacalia

(fam:

Asteraceae

).

En cada uno de los extractos acuosos proteicos del género

Pentacalia

, se consiguió,

un volumen de 600ml, los cuales se conservaron en elermeyers de 1000ml. Las

cualidades físicas de los extractos mostraron una coloración café oscuro, por la

posible oxidación de los diferentes componentes del material vegetal, ya que el mismo

color se presento en el material vegetal desechado.

Los extractos acuosos de

Pentacalia ledifolia

presentaron menos viscosidad que los

extractos de

Pentacalia vaccinioides,

ya que estos últimos tenían un exudado viscoso,

el cual fue eliminado cuando se realizo la precipitación con sulfato de amonio. Todos

los extractos al ser filtrados con un filtro de 0.45µm, se elimino la interferencia de un

hongo que aun no ha sido identificado y se cree que proviene del sitio de recolección

de las muestras, la correcta eliminación de este se evidencio sembrando 0.1ml de

cada uno de los extractos en medio YPG (Extracto de levadura, Peptona y glucosa) el

cual no mostro crecimiento, que podría ser un interferente importante para los

resultados de la actividad antimicrobiana de los extractos.

[image:29.612.160.454.458.718.2]

6.3 Concentración de los extractos mediante precipitación con sulfato de

amonio.

Tabla 2. Determinación del % de saturación con sulfato de amonio

Concentración proteica

mg/ml

Extracto utilizado % de

saturación

dilución concentrada

P. ledifolia Buffer Tris HCL 20 0,0855

30 0,3233

40 0,3624

50 0,6881

60 0,2516

70 0,2891

P. ledifolia H2O desionizada 20 0,0708

30 0,3717

40 0,0000

50 0,1246

60 0,2435

70 0,1490

P. ledifolia Buffer Tris HCL sin precipitar

0,0627

P. ledifolia H2O desionizada sin precipitar

(30)

18

La cuantificación proteica del ensayo de precipitación con sulfato de amonio para la

determinación del mejor porcentaje de saturación mostro que a concentraciones del 30

y 50% de saturación con sulfato de amonio, se obtuvo una mayor precipitación de

proteína para los extractos en H

2

O desionizada y Buffer Tris HCl respectivamente. Por

lo anterior se precipitaron 400ml de cada uno de los extractos acuosos de

Pentacalia

ledifolia y Pentacalia vaccinioides

tanto en H

2

O desionizada y Buffer Tris HCl con estos

porcentajes de saturación que presentaron la mejor precipitación de proteínas, las

proteínas precipitadas en cada extracto fueron posteriormente resuspendidas en 6ml

de H

2

O desionizada o Buffer Tris HCL respectivamente, obteniéndose de esta forma

dos extractos acuosos proteicos concentrados para cada una de las especies.

6.4 Cuantificación proteica de los extractos concentrados.

En la Tabla No. 3. Se presenta el resumen de los datos obtenidos para la proteína total

cuantificada en las etapas de: extracción inicial por maceración en frio, precipitación

con sulfato de amonio, y sobrenadante después de la precipitación tanto para

Pentacalia ledifolia como para Pentacalia vaccinioides

en H

2

O desionizada y Buffer

Tris HCl.

Tabla 3. Cuantificación Total proteica Bradford en placa.

[ ], Solución concentrada; Dil ½, Dilución ½

Como se puede observar, en el proceso de obtención de los extractos acuosos

proteicos de las especies

Pentacalia ledifolia

y

Pentacalia vaccinioides

se logra

obtener una concentración de proteína apreciable, siendo mayor para.

Pentacalia

vaccinioides

en solución con Buffer Tris HCl. Las soluciones disueltas en solución

Buffer Tris HCl, presentan mejor rendimiento, esto indica que la recuperación de las

proteínas es más efectiva utilizando como solución base Buffer Tris HCl.

Así mismo la concentración de estos extractos, precipitados con sulfato de amonio nos

devela un proceso bastante eficiente, sin embargo la evidencia de proteína en los

sobrenadantes después de la precipitación, demuestra que no hay una recuperación

total de proteínas en los extractos, y por lo tanto se debe afinar aun más el proceso de

saturación con sulfato de amonio. Además mediante este proceso se registraron

Cuantificación proteica de los extractos mg/ml

PROCESO

DEL EXTRACTO P. ledifoliaHCL Tris

P. ledifolia H2 O desionizada

P. vaccinioides Tris HCL

P. vaccinioides H2 O desionizada [ ] Dil ½ [ ] Dil ½ [ ] Dil ½ [ ] Dil ½ Extracto acuoso

total 0.2172 0.3622 0.3651 0.5614 1.1117 0.6681 1.0064 0.9942 Precipitación con

sulfato de amonio 0.7719 1.2597 0.7070 1.07504 1.1420 1.3866 1.0447 1.2755 Sobrenadante del

precipitado con sulfato de amonio

(31)

19

diferencias considerables en la cantidad de proteína total obtenida en los extractos

acuosos de

Pentacalia ledifolia

y

Pentacalia vaccinioides

siendo de esta ultima donde

se obtuvo una mayor recuperación de proteína. Esto pudo haberse debido porque esta

especie se encontraba con un tiempo de recolección más cercano, al iniciar los

ensayos.

6.5 Evaluación de la actividad antimicrobiana de los extractos acuosos

proteicos.

En la Figura 3 se observan los resultados del diámetro de inhibición obtenidos por los

[image:31.612.155.454.281.601.2]

extracto acuoso proteicos de

P. ledifolia y P. vaccinioides

, sobre las cepas de

Salmonella

Typhimurium,

Pseudomonas fluorescens

y

L. monocytogenes.

Figura 3. Resultados de la evaluación antimicrobiana de los extractos acuosos proteicos de P. ledifolia y

P. vaccinioides sobre las cepas de L. monocytogenes, Pseudomonas fluorescens y Salmonella

Typhimurium.Los tratamientos están enumerados: 1 y 7 discos control positivo (CIP) y (NOR) para Salmonella typhimurium ; (CIP) y (IPM) para Pseudomonas fluorescens; (CIP) y (CN) para L. monocytogenes); 2 y 8 discos control negativo con 10µl de solución salina al 0.85%; 3 y 9 discos impregnados con 10µl de Extracto acuoso proteico de P. ledifolia y P. vaccinioides en solución de H2O

desionisada respectivamente; 4 y 10 discos con 10µl del Extracto acuoso proteico de P. ledifolia y P. vaccinioides en solución Tris HCL respectivamente, 5 y11 discos impregnados con 10µl de Extracto acuoso proteico de P. ledifolia y P. vaccinioides en solución de H2O

(32)

20

.

Salmonella typhimurium

generó sensibilidad frente a los extractos, siendo las

soluciones de

P. ledifolia

y

P. vaccinioides

concentradas en H

2

O desionizada quienes

presentaron un mayor poder de inhibición con halos promedio de 2.0 mm y 2.2 mm

respectivamente; Los resultados estadísticos arrojaron una mayor confianza en los

datos obtenidos por los extractos de

P. vaccinioides

Pseudomonas fluorescens

presento también sensibilidad frente a los extractos

acuosos proteicos, siendo las soluciones de

P. ledifolia

y

P. vaccinioides

concentradas

en H

2

O desionizada quienes presentaron un mayor poder de inhibición con halos

promedio de 2.2 mm en las dos especies, mostrando mayor confianza en los datos

obtenidos por los extractos de

P. vaccinioides

[image:32.612.103.527.384.557.2]

La evidencia de halo generada por los extractos de

Pentacalia vaccinioides

frente a las

cepas de Salmonella Typhimurium y

Pseudomonas fluorescens

se muestra en la

Figura 4.

a.

b.

Las imágenes corresponden: (a) Salmonella Typhimurium y (b) Pseudomonas fluorescens.

Figura 4. Actividad antimicrobiana de los extractos acuosos proteicos de P. vaccinioides sobre

Salmonella Typhimurium y Pseudomonas fluorescens.

El efecto inhibitorio producido por los extractos acuosos de las especies de Pentacalia

frente a las baterías

Gram

-negativas, puede ser debido a que los péptidos presentes

en estos, impidieron la síntesis de pectidoglicano de membrana de estas bacterias,

produciendo así su muerte por lisis celular. Otra posibilidad puede ser que los péptidos

presentes en los extractos pudieron entrar en contacto con proteínas del exterior como

(33)

21

algunos péptidos podrían de este modo haber entrado e inhibido la síntesis de

distintas proteínas necesarias para duplicación celular.(Cabrera et al., 2007).

Listeria monocytogenes

, no se presentó ningún efecto antimicrobiano con ninguno de

los extractos de

P. ledifolia

y

P. vaccinioides

. Lo anterior demuestra que la bacteria

posee diferentes mecanismos para eludir el efecto tóxico de estos extractos,

generando protección contra las proteínas disueltas en los extractos acuosos. O bien

que no había ocurrencia de ningún péptido o proteína que presentara algún efecto

nocivo para estas cepas. Una de las causas de la resistencia puede deberse a la

composición de la pared celular, ya que las bacterias Gram-positivas contienen una

capa gruesa de peptidoglicano que contiene ácidos teicóicos y ácido teicurónico, que

generan protección contra compuestos químicos de los desinfectantes. Además que

varios de los estudios realizados sobre resistencia antimicrobiana en

Listeria s

pp.,

muestran claramente que el material genético implicado en la adaptación evolutiva a

corto plazo puede ser transferido exitosamente a

Listeria

s

pp., y otras bacterias

Gram-positivas evolutivamente relacionadas, como

Enterococcus s

pp (Ruiz

et al

.,2008).

6.6 Análisis estadístico ANOVA

La evaluación estadística por medio de la prueba ANOVA (Análisis de varianza),

determino que existen diferencias estadísticamente significativas entre los valores

promedio de los halos de inhibición con un alfa de 0.05 y por lo tanto se rechaza la no

existencia de actividad antimicrobiana de los extractos acuosos proteicos. Lo anterior

concluyó comparando el valor critico de F (1.460) y el F calculado es de 3709.703 por

[image:33.612.101.516.560.690.2]

tanto se rechaza la Ho si Fc (F calculado )

Ft (valor critico de F ).

Tabla 4. Valores estadísticos prueba ANOVA (Análisis de varianza).

ANÁLISIS

 

DE

 

VARIANZA

 

Origen

 

de

 

las

 

variaciones

 

Suma

 

de

 

cuadrados

 

Grados

 

de

 

libertad

 

Promedio

 

de

 

los

 

cuadrados

 

F

 

Proba

bilidad

 

Valor

 

crítico

 

para

 

F

 

Entre

 

grupos

 

24004,29722

 

35

685,8370635

3709,703

0

 

1,460

Dentro

 

de

 

los

 

grupos

 

59,9

 

324

 

0,184876543

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

(34)

22

7. CONCLUSIONES

Se obtuvieron satisfactoriamente los extractos acuosos proteicos de

Pentacalia ledifolia y Pentacalia vaccinioides

(Fam.

Asteraceae

) a través

de la metodología propuesta en este proyecto.l

La cuantificación de la proteína total de los extractos acuosos obtenidos de

las especies de

Pentacalia

a través de la técnica de Bradford modificada es

muy útil para poder hacer un seguimiento de las etapas de extracción y

purificación.

Los extractos generados de la especie

P. vacinoides

presentaron una

mayor confianza en los resultados de inhibición, así generando en el

estudio el mayor halo de inhibición con un promedio de 2.2mm, esto pudo

evidenciarse porque la recuperación de las proteínas fue más efectiva al

utilizar como solución base Buffer Tris HCl.

Los resultados obtenidos de los extractos acuosos proteicos sobre las

cepas de

Pseudomonas

fluorescens

y

Salmonella

Typhimurium

,

aceptan

la

hipótesis alterna (

Hi:

µ

0) ya que se encontró diferencias

estadísticamente significativas entre los valores promedio de los halos de

inhibición con un alfa de 0.05.

Los extractos acuosos proteicos de

Pentacalia ledifolia

y

Pentacalia

vaccinioides

, mostraron que no son efectivos para inhibir a

L.

monocytogenes.

Se

encontró

que

L. monocytogenes

es resistente a los extractos acuosos

proteicos, lo que permite inferir que este microorganismo posee

mecanismos de resistencia. O que los extractos no poseen péptidos o

proteínas que generen inhibición en esta especie.

El halo de inhibición formado durante las pruebas antimicrobianas es

aceptable para las cepas de

Pseudomonas

fluorescens

y

Salmonella

Typhimurium, reportado un promedio de mayor de 1.0 mm. Para la

(35)

23

inhibición sea mayor y que el extracto este más concentrado, por tal motivo

no se pudo evaluar la CMI para las cepas que reportaron inhibición.

8. RECOMENDACION

ES

Se recomienda optimizar la precipitación de proteínas, realizada por

medio de la

técnica (salting-out) con sulfato de amonio, para cada extracto

acuoso, tanto en solución de H

2

O desionizada o Buffer Tris HCL, y de este

modo lograr recuperar las proteínas que aun están presentes en el

sobrenadante generado después de la precipitación.

Se debe tener en cuenta que los extractos pueden estar sufriendo procesos

oxidación en todo el proceso de extracción. Para disminuir esta reacción se

recomienda la utilización de recipientes oscuro

s

para todo el proceso de

obtención de los extractos y también para el mantenimiento de los mismos,

con el deseo de que no se vean afectadas las cualidades antimicrobianas

de los extractos y disminuir el tono oscuro de la coloración, para así

eliminar posibles interferentes en la cuantificación proteica por la técnica de

Bradford.

Como paso a seguir dentro de este proceso de extracción y purificación de

las proteínas de las especies de

Pentacalia

se sugiere realizar una Diálisis

de cada uno de los extractos, para eliminar el sulfato de amonio que puede

interferir con los resultados del estudio, además esto podría mejorar la

actividad antimicrobiana de las proteínas frente a las bacterias

Gram

negativas.

Igualmente se recomienda llevar a cabo una caracterización electroforéti

ca

para

ver los perfiles proteicos que presenten las diferentes etapas de

extracción y purificación con el fin de llevar un control adicional a la

cuantificación con Bradford.

Con respecto a la contaminación fúngica se debe determinar si el hongo

encontrado también tiene poder antimicrobiano frente a las cepas del

estudio, realizando pruebas de interacción (Técnica de Gauze) Márquez et

(36)

24

Las bacterias Gram-negativas utilizadas en este estudio, son de gran

importancia en la en la inocuidad de la industria de alimentos, por lo tanto

es indispensable hallar compuestos naturales que inhiban el crecimiento

de estas bacterias en alimentos de consumo diario, ya que presentan

riesgo para la salud humana y el deterioro de materias primas en la

industria (Barroso et al., 2008).

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essential oils .

Current Medical Chemistry

. Poland, 10 pág. 813-829.

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Tabla 1. Grupos quimicos mas importantes con actividad antimicrobiana obtenidos de plantas
Figura 1. Montaje de antibiograma representan la ubicación consecutiva de los discos  control positivo,  negativo y los diferentes  Pseudomonas fluorescens en agar Tripticasa de Soya  Los números extractos acuosos proteicos, como se muestra en la Tabla 4
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