EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS
ACUOSOS DE Pentacalia ledifolia y Pentacalia vaccinioides (Fam. Asteraceae)
SOBRE CEPAS DE Listeria monocytogenes, Pseudomonas fluorescens y Salmonella
Typhimurium.
LADY JOHANNA TOBO CORTES
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS
ACUOSOS DE Pentacalia ledifolia y Pentacalia vaccinioides (Fam. Asteraceae)
SOBRE CEPAS DE Listeria monocytogenes, Pseudomonas fluorescens y Salmonella
Typhimurium.
LADY JOHANNA TOBO CORTES
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
para optar al título de
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS
ACUOSOS DE Pentacalia ledifolia y Pentacalia vaccinioides (Fam. Asteraceae)
SOBRE CEPAS DE Listeria monocytogenes, Pseudomonas fluorescens y Salmonella
Typhimurium.
LADY JOHANNA TOBO CORTES
APROBADO
Carlos Fernando Sánchez Arcos, Bioq, M.Sc.
Director
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS
ACUOSOS DE Pentacalia ledifolia y Pentacalia vaccinioides (Fam. Asteraceae)
SOBRE CEPAS DE Listeria monocytogenes, Pseudomonas fluorescens y Salmonella
Typhimurium.
LADY JOHANNA TOBO CORTES
APROBADO
DEDICATORIA
A Dios por darme vida, el entendimiento y la fuerza necesaria para
cumplir con todas mis metas propuestas a lo largo de mi vida.
A mis padres por el esfuerzo grande para tenerme en esta gran
Universidad, además por su amor, comprensión y apoyo incondicional
frente a cada una de las dificultades y logros que he tenido en vida.
A mi hija Valentina, por ser mi motor y razón de vivir ahora y
siempre.
A mis amigos (Tana, Tati, Pipe y Diani) por brindarme el apoyo
incondicional frente a las diferentes dificultades que he tenido en mi
proceso de aprendizaje, creyendo siempre en mis capacidades para salir
adelante.
AGRADECIMIENTOS
Al profesor Carlos Sánchez por brindarme durante la realización de este trabajo, todo
su apoyo, tiempo, dedicación para alcanzar cada uno de los objetivos propuestos,
además por enseñarme parte de la materia Fitoquímica, asignatura importante para la
realización de este trabajo.
A los profesores Robles y Ricardo que me colaboraron con sus conocimientos, cada
vez que lo necesite y siempre estuvieron pendientes de la buena realización de este
trabajo.
A la profesora Gina y el profesor Alex por brindarme parte de su tiempo, para la
cuantificación proteica de los extractos y la electroforesis en gel. Enriqueciendo mis
conocimientos para el buen desarrollo de la investigación.
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN
ABSTRACT
1.INTRODUCCIÓN
3
2.MARCO TEÓRICO
4
2.1 Enfermedades transmitidas por alimentos….……….
4
2.1.1 Microorganismos asociados ………... 4
2.1.1.1 Listeria monocytogenes………..….……..….. 4
2.1.1.1.1 Generalidades…...………... 4
2.1.1.2 Pseudomonas fluorescens……….. 5
2.1.1.2.1 Generalidades……….…...
5
2.1.1.3 Salmonella Typhimurium..………..…………..………... 5
2.1.1.3.1 Generalidades………...….……….………... 5
2.2 Productos de plantas como agentes antimicrobianos………..
6
2.2.1 Principales compuestos antimicrobianos derivados de plantas….……. 6
2.2.1.1 Fenoles………..……….….. 6
2.2.1.2 Flavonas………...………..…..
7
2.2.1.3 Taninos...……….………... 7
2.2.1.4 Quinonas……….…..
8
2.2.1.5 Saponinas………...………....…… 8
2.2.1.6 Proteínas...……...…... 8
2.3 Actividad antimicrobiana del genero Pentacalia (fam: Asteraceae)……… 9
2.3.1 Pentacalia ledifolia...……….………..….…. 9
2.3.2 Pentacalia vaccinioides……….………..
10
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN………
10
3.1 Formulación del problema……….... 10
3.2 Justificación de la investigación……….……….……..
10
4. OBJETIVOS……….……… 11
4.1 Objetivo General………..….. 11
4.2 Objetivos específicos……… 11
5. MATERIALES Y MÉTODOS………..
11
5.1 Diseño de la investigación ………....
11
5.1.1 Hipótesis………... 11
5.1.1.1 Hipótesis nula.………... 12
5.1.1.2 Hipótesis alterna………... 12
5.1.2 Variables del estudio………...
12
5.2 Materiales y métodos…..………..……….. 12
5.2.1 Recolección de muestras………. 12
5
.
2.1.2 Obtención del extracto acuoso proteico a partir del género
………..
Pentacalia (fam: Asteraceae).………...
13
5.2.2 Concentración de los extractos mediante precipitación con sulfato de
………….
amonio.………..……….……….…...
13
5.2.3 Cuantificación proteica de los extractos concentrados..………. 14
5.2.4 Evaluación de la actividad antimicrobiana………. 14
5.3 Análisis estadístico……...………..….…… 15
6.
Resultados y discusión………..………...………. 15
6.1
Obtención de cepas……….,………. 15
6.2 Evaluación del extracto acuoso proteico a partir del género Pentacalia
(fam:Asteraceae).………
17
6.3 Concentración de los extractos mediante precipitación con sulfato de
amonio.……….
17
6.4 Cuantificación proteica de los extractos concentrados………. 18
6.5 Evaluación de la actividad antimicrobiana de los extractos acuosos………. 19
6.6
Análisis estadístico ANOVA………. 21
7. Conclusiones………..……….……….…………..…. 22
8. Recomendaciones……….………...….….…….….. 23
9. Referencias……….………...….………..….. 24
ÍNDICE DE FIGURAS
Pág
.
FIGURA 1.
Montaje de antibiograma Pseudomonas fluorescens en agar Tripticasa
de soya
15
FIGURA 2.
Aislamientos en agar Tripticasa de soya y coloración de Gram.
16
FIGURA 3.
Resultados
de la evaluación antimicrobiana de los extractos acuosos
proteicos de P. ledifolia y P. vaccinioides sobre las cepas de L.
monocytogenes, Pseudomonas fluorescens y
Salmonella
Typhimurium.
19
FIGURA 4.
Actividad antimicrobiana de los extractos acuosos proteicos de P.
vaccinioides sobre Salmonella Typhimurium y Pseudomonas
fluorescens.
ÍNDICE DE TABLAS
Pág
.
Tabla 1.
Grupos quimicos mas importantes con actividad antimicrobiana obtenidos
de plantas
7
Tabla 2.
Determinación del % de saturación con sulfato de amonio.
17
Tabla 3.
Cuantificación Total proteica Bradford en placa.
18
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1.
Resultados de actividad antimicrobiana
Pág.
RESUMEN
Se evaluó la actividad antimicrobiana de los extractos acuosos proteicos disueltos en
H
2O desionizada y en un Buffer Tris HCl a pH de 7, obtenidos a partir de hojas de
Pentacalia ledifolia y Pentacalia vaccinioides, contra dos bacterias Gram-negativas:
Salmonella
Typhimurium y Pseudomonas fluorescens y una Gram-positiva:
Listeria
monocytogenes, utilizando el método de “difusión en agar, medio Tripticasa de Soya”.
En los cuatro extractos obtenidos a partir de las dos especies de Pentacalia, se
cuantifico la proteína Total presente en cada proceso de extracción y concentración,
por medio de la Técnica de Bradford modificado, en placas de Elisa, a 620nm en un
Lector de Microplaca. Los resultados evidenciaron la presencia de proteína en los
extractos y el aumento de la misma después de la precipitación con sulfato de amonio.
Los resultados de inhibición reportaron que L.monocytogenes fue resistente frente a
los extractos, por el contrario, tanto Pseudomonas fluorescens y Salmonella
typhimurium, reportaron sensibilidad frente a los cuatro extractos, siendo los extractos
de Pentacalia vaccinioides los que presentaron mayor actividad antimicrobiana.
ABSTRACT
The antimicrobial activity of the protein aqueous extracts obtained from the leaves of
Pentacalia ledifolia and Pentacalia vaccinioides, dissolved in deionised H
2O and in a
Tris-HCl Buffer to pH of 7 was assessed, ,against two Gram-negative bacteria:
Salmonella Typhimurium and Pseudomonas fluorescens and a Gram-positive: Listeria
monocytogenes, using the method of "dissemination in agar, Trypticase Soy Broth"
In the four extracts obtained from the two species of Pentacalia, the total protein
present in each extraction and concentration process was quantified, by the Bradford
Technique ajusted, in plates of Elisa, 620nm, in a reader of Microplate. The results
showed the presence of protein in the extracts and the increase in the same after the
precipitation with ammonium sulphate. The results of the inhibition showing that L.
monocytogenes was resistant to the extracts, by contrast, both Pseudomonas
fluorescens and Salmonella typhimurium reported sensitivity to the four extracts, being
the extracts of Pentacalia vaccinioides which evidenced greater antimicrobial activity.
The data were assessed statistically by means of ANOVA test (variance analysis),
which determined that there are statistically significant differences between the
average values of the inhibition halos, with a value alpha of 0.05 and therefore it rejects
the non-existence of antimicrobial activity of the protein aqueous extracts.
3
1. INTRODUCCIÓN
El mundo natural ha ofrecido una riqueza de productos de origen vegetal, algunos de
los cuales han sido explorados por el hombre, en diferentes campos de la
investigación. Entre ellos, los extractos naturales han sido utilizados desde la
antigüedad para el control de muchas enfermedades (Larrahondo, 2001).
De los vegetales se pueden obtener extractos para muchos y diversos fines; entre
ellos para la protección de la planta contra plagas, enfermedades e inclusive de la
invasión de otras plantas y microorganismos. Estas cualidades de protección se ven
reflejadas en propiedades: antisépticas, antifúngicas, antibacterianas entre otras. Los
extractos naturales se obtienen directamente de las plantas y no sufren
transformaciones posteriores, por ello su rendimiento es bajo y continúan siendo
costosos. Se extraen de las partes no leñosas de las plantas, en especial de las hojas,
mediante diferentes métodos: extrusión, destilación por arrastre con vapor de agua
(más usada a nivel comercial), extracción con solventes volátiles, enflourage
(generalmente para extractos de flores) y con fluidos supercríticos (Goñi, 2008).
Recientemente se ha generado un gran interés por lo natural y lo orgánico lo que ha
favorecido la producción y estudio de extractos vegetales, ya que al ser de origen
natural se espera que tengan un mínimo o ningún riesgo para el ser humano.
Pentacalia
, un género de la familia
Asteraceae
, se caracterizan por ser arbustos
abundantes y encontramos algunos autóctonos de los páramos andinos colombianos
presentes a altitudes entre los 2.500-3.800 m.s.n.m., aunque no se les conoce algún
uso medicinal, son considerados ricos en la producción de metabolitos secundarios
como flavonoides y terpenos, presentes en algunas de sus especies (Torrenegra
et al
.,
2000). Estos componentes han sido altamente estudiados y con frecuencia han
expuesto actividad antimicrobiana.
La utilidad de estos extractos vegetales constituye una alternativa innovadora y eficaz,
para el control de calidad de alimentos en almacenamiento. Los alimentos pueden
transmitir patologías de origen microbiano, esto ha sido considerado uno de los
mayores problemas de salud en el mundo. Debido a que el consumo de alimentos y/o
agua es un riesgo potencial permanente para la salud de la población en general.
Por lo anterior, en este trabajo se evaluó la presencia de actividad antimicrobiana de
4
Salmonella
Typhimurium
y Pseudomonas fluorescens
;
siendo
las dos primeras muy
reconocidas como bacterias patógenas, responsables de generar enfermedades
tramitadas por alimentos (ETA), mientras que la última, es considerada un alterador
proteolítico y lipolítico de la industria de alimentos. El valor de la actividad
antimicrobiana se calculó mediante la interpretación de cada uno de los halos
generados por las cepas en estudio.
2. MARCO TEÓRICO
2.1 Enfermedades trasmitidas por alimentos
Las Enfermedades Transmitidas por Alimentos
(ETA)
son aquellas que se originan por
la ingestión de alimentos infectados con agentes contaminantes en cantidades
suficientes para afectar la salud del consumidor. Sean sólidos naturales, preparados, o
bebidas simples como el agua, los alimentos pueden originar dolencias provocadas
por patógenos, tales como bacterias, virus, hongos, parásitos o componentes
químicos, que se encuentran en su interior (Tomado de:www.panalimentos.org).
Las enfermedades de origen alimentario, se pueden presentar en cualquier lugar,
predominando aquellos donde se practican malos hábitos higiénicos y/o sanitarios y en
lugares en condiciones de hacinamiento. Constituyen una causa importante, de
mortalidad en países industrializados y en vía de desarrollo y en estos últimos, son
causa frecuente de mortalidad (Vásquez de Plata, 2003).
2.1.1 Microorganismos asociados
2.1.1.1
Listeria monocytogenes
2.1.1.1.1 Generalidades
Listeria monocytogenes
es un bacilo
Gram
positivo, aerobio, psicrótrofo, halo tolerante,
no móvil, no esporulado, responsable de la mayor parte de las infecciones por
Listeria
que afectan al hombre. En animales,
L. monocytogenes
es responsable de la mayoría
de las infecciones, pero en ovejas el
10–15% de los casos de septicemia listérica se
deben a
L. ivanovii
. (Manual de la OIE.2004).
L. monocytogenes
es una bacteria ampliamente difundida en la naturaleza. Su
presencia en los alimentos está determinada por su extensa distribución en el
ambiente – tierra, aguas servidas, materia fecal, vegetación, ensilados y entorno de la
producción de alimentos, lo que confiere una importante oportunidad para
5
Una de las enfermedades más importantes de transmisión por alimentos producida por
este microorganismo es la listeriosis, las manifestaciones de la enfermedad en el
hombre comprenden septicemia, meningitis (o meningoencefalitis) y encefalitis,
habitualmente precedidas de síntomas parecidos a los de la gripe, incluida la fiebre.
En mujeres gestantes, las infecciones intrauterinas o cervicales pueden provocar
abortos espontáneos o nacidos muertos. También se ha asociado
L. monocytogenes
con manifestaciones gastrointestinales acompañadas de fiebre. Aunque la morbilidad
de la listeriosis es relativamente baja, la mortalidad de la enfermedad
sistémica/encefalítica puede ser muy alta, con valores cercanos al 30%. Los ancianos,
las mujeres gestantes, los recién nacidos y los individuos inmunocomprometidos se
consideran de alto riesgo de contraer la enfermedad. (Manual de la OIE.2004)
2.1.1.2
Pseudomonas fluorescens
2.1.1.2.1 Generalidades
Pseudomonas fluorescens
, es la especie bacteriana Psicrotrófica que con mayor
frecuencia se encuentras en las leches en refrigeración (Costa
et al
, 2002).
Pseudomonas constituye uno de los grupos más complejos, son cosmopolitas y su
ubicuidad les permite colonizar cualquier sustrato imaginable, son colonizadoras de las
raíces de las plantas hasta casi formar una simbiosis, son capaces de poner en forma
asimilable el hierro, imprescindible en la función clorofílica vegetal, algunas tienen un
marcado carácter antagonista frente a otros microorganismos.
Pseudomonas
fluorescentes
es una bacteria que posee células en forma de varillas rectas o
ligeramente curvadas, Gram negativa y móvil mediante uno o varios flagelos polares,
aerobio
.
Se describe como una bacteria asociada al fotoplano y a la rizósfera, si la
bacteria es introducida en la semilla o material de siembra, puede controlar
enfermedades patogénicas del suelo y promover el crecimiento al suprimir otros
organismos dañinos (Botero & Aránzazu, 1999)
2.1.1.3
Salmonella
Typhimurium
2.1.1.3.1
Generalidades
Se han descrito brotes por
Salmonella
Typhimurium
en distintos países, transmitidos a
través de alimentos procesados, como huevos y leche pasteurizada, alimentos crudos
como leche, lechugas o por transmisión a través de manipuladores de alimentos. En
países como México ha llegado a ser el serotipo más identificado. (Barroso el at,
6
Salmonella
Typhimurium causa serias enfermedades en niños e individuos
inmunocomprometidos, a menudo resultando en infecciones sistémicas. La dosis
infecciosa de
Salmonella s
pp es bastante amplia y puede variar desde 10
6hasta 10
9cfu/g (Bhunia, 2008 publicado por: Alemany De Jesús, 2009). Este microorganismo es
uno de los causantes de salmonelosis en seres humanos y animales, esta enfermedad
genera síntomas como diarrea, fiebre, dolor de cabeza, nauseas, dolor de abdomen,
vomito y con menor frecuencia sangrado en las heces. (León
et al.,
2004)
2.2
Productos de plantas como agentes antimicrobianos
Desde la antigüedad el hombre ha utilizado las plantas para el tratamiento de
infecciones y enfermedades comunes y algunas de estas medicinas tradicionales
siguen siendo parte del tratamiento habitual de diversas enfermedades. Los
componentes químicos y los extractos naturales mostraron interés a partir de la ciencia
moderna. (Domingo & López., 2003)
2.2.1 Principales compuestos antimicrobianos derivados de plantas
No todos los componentes químicos elaborados por la planta poseen igual interés para
la Fitoquímica. Los denominados principios activos son frecuentemente alcaloides o
heterósidos. Otros grupos, como los glúcidos, grasas y proteínas, presentan
importancia dietética y muchos como los almidones y las gomas, se emplean en
técnica farmacéutica, aunque carecen de presentar acción farmacológica. Las plantas
originan una gran cantidad de compuestos secundarios como protección contra
ataques microbianos e insectos, muchos de estos compuestos se han utilizado de
forma pura o extractos vegetales como alimento o aplicaciones médicas para el
hombre (Lizcano & Vergara, 2008).
Las plantas tienen una capacidad ilimitada de sintetizar compuestos, la mayoría
relacionados con el fenol y sus derivados los compuestos más estudiados extraídos de
las plantas se muestran en la Tabla 1.
2.2.1.1 Fenoles
Los fenoles tienen una actividad fisiológica marcada porque poseen propiedades
antisépticas y antihelmínticas como los polifenoles, utilizadas a lo largo de los años en
tratamientos de infecciones urinarias. Los mecanismos de estas sustancias parecen
estar relacionadas con la inhibición enzimática por los compuestos oxidados,
posiblemente mediante reacciones de grupos sulfihidrilo o por interacciones no
7
Entre los fenoles encontrados en estado libre se encuentran constituyentes importante
de las esencias como el timol, el carbacrol, el eugenol y el chavicol. Muchos de los
fenoles se encuentran en estado de éter oxidado en las esencias, como el estragol, la
[image:19.612.105.538.183.341.2]miristicina, el apiol y el atenol (Carey, 2003).
Tabla 1. Grupos quimicos mas importantes con actividad antimicrobiana obtenidos de plantas.
Fuente:
Domingo & López., 2003
2.2.1.2 Flavonas
Las flavonas son estructuras fenólicas que contienen un grupo carbonilo. Constituye la
familia más amplia de fenoles naturales. Su actividad frente a los microorganismos
probablemente se debe a que forman complejos con las proteínas solubles y
extracelulares y con las células de la pared bacteriana, de forma similar q las
quinonas. Mención especial merecen las catequinas, presentes en el té verde, las
cuales ejercen actividad frente a
Vibrio cholerae
O1,
Streptococcus mutan
s,
Shigella
y
otros microorganismos. Otros flavonoides tienen en general actividad antiviral.
(Lizcano & Vergara, 2008)
2.2.1.3 Taninos
El término tanino se ha empleado para denominar ciertas sustancias presentes en
extractos vegetales capaces de combinarse con proteínas de la piel animal, evitando
su putrefacción y convirtiéndolas en cuero. Constituyen un grupo de sustancias
fenólicas poliméricas y se pueden dividir en, hidrolizables y condensados en función
de que puedan o no ser hidrolizados. Se han descrito más de 30 taninos que pueden
inhibir hongos y bacterias. Un ejemplo es el tanino presente en el eucalipto
8
2.2.1.4 Quinonas
Las quinonas son anillos aromáticos con dos funciones ceto. Son ubicuas en la
naturaleza y causantes del color marrón que se produce en las frutas cuando son
dañadas. Poseen una alta reactividad, formando complejos con los aminoácidos
hidrofílicos de las proteínas, la mayoría de las veces inactivando la proteína y
anulando su función. Debido a esto, el potencial antimicrobiano de este grupo es
amplio. Un ejemplo es la hipericina, una antraquinona aislada de la planta de San Juan
(
Hyperricum perforatum
), antiguamente utilizada como antidepresivo (Domingo &
López., 2003).
2.2.1.5 Saponinas
Las saponinas se caracterizan por presentar enlaces glucósidos y/o ester entre una
genina poco polar y restos glucídicos. Presentan actividad para formar espuma en
soluciones acuosas y por hemolisar los glóbulos rojos. Son los componentes
principales de varios extractos de plantas, tiene actividad antiprotozoaria. Las
saponinas se unen el colesterol y otros esteroles de la membrana celular de los
protozoos causando su inestabilidad, lisis y muerte celular. Pero algunas saponinas
esteroides han mostrado diversas actividades biológicas (antimicrobiana, citotóxica,
antitumoral, ictiotóxica, molusquicida, insecticida, antihelmíntica, expectorante,
diurética, cardiovascular, antiinflamatoria, anti-úlcera, espermicida, analgésica,
antipirética, sedante, antifertilidad, antihepatotóxica, hemolítica, antimicótica, etc.)
fundamentalmente se han constituido desde hace bastante tiempo, como precursores
únicos de muchos medicamentos esteroides tales como hormonas sexuales,
corticoides, contraceptivos orales y diuréticos. (Lizcano & Vergara, 2008).
2.2.1.6 Proteínas
Las proteínas son polímeros lineales de
α
aminoácidos, unidos por enlaces peptídico,
tienen amplia variabilidad estructural y funcional. Las proteínas son biomoléculas
formadas básicamente por carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno. Pueden además
contener azufre y en algunos tipos de proteínas, fósforo, hierro, magnesio y cobre
entre otros elementos. (Yábar, 2005). Debido a su gran tamaño, cuando estas
moléculas se dispersan en un solvente adecuado, forman soluciones coloidales, con
características que las distinguen de las soluciones de moléculas más pequeñas.
La organización de una proteína viene definida por cuatro niveles estructurales
9
estructura cuaternaria. Cada una de estas estructuras informa de la disposición de la
anterior en el espacio. Y se pueden clasificar según su función, su composición, y su
conformación. Las funciones que cumplen son muy variables; las más destacadas son,
estructurales, enzimáticas, hormonales, reguladoras, defensivas, de transporte y de
reserva, entre otras (Prescott, 2004).
En los últimos años un creciente número de péptidos antimicrobianos han sido
aislados a partir de extractos vegetales, los péptidos aislados de
las semillas de
Mirabilis jalapa
se dividieron en seis clases y mostraron actividad
antimicrobiana. Recientemente se ha tenido cada vez más claro que los péptidos
cumplen un papel importante en la protección de las plantas y contra infección
microbiana estos resultados son de gran importancia para la ingeniería genética
microbiana (Carvalho
et al
., 2000).
2.3
Actividad antimicrobiana del género
Pentacalia
(fam:
Asteraceae
)
El género
Pentacalia
ha sido poco estudiado y se han reportado en la literatura los
estudios en
P. ephiphytica, P. andicola, P. firmipes, P. corymbosa y P. archieri
de las
cuales se aislaron nerolidol, humuleno, farneseno, curcumeno, saltaleno, germacreno
D, varios cadinenos, cicloartenol, friedelina y 5-metoxieugenol (Torrenegra
et al.
,
2000).
Muchas familias de plantas como las
Myrtaceae, Asteraceae
y
Piperaceae
son bien
conocidas por tener principios como los terpenoides y grupos de amidas que tienen
efecto antialimentario, repelente e insecticida que inhibe el desarrollo y el crecimiento
de muchos insectos del orden
Lepidóptera
(Celis
et al
., 2008). La familia mejor
representada al igual que en otras regiones de alta montaña del país es
Asteraceae
, la
más numerosa en especies de plantas dicotiledóneas con 1100 géneros y 25000
especies (Sánchez
et al.
, 2007).
2.3.1
Pentacalia ledifolia
Es considerado como un arbusto de hasta 1.5 m de alto, con olor a trementina. Tallos
con cicatrices de las hojas. Hojas simples, alternas, aciculares, con la margen entera y
totalmente revoluta. Inflorescencia terminal y corimbiforme, sobrepasando las hojas.
Capítulos discoides, con todas las flores hermafroditas, tubulares, de color amarillo y
fragantes. Fruto en aquenio, obovoide y con pappus blanco (García
et al
., 2006).
Se conoce con los nombres comunes de Güiesquin, Hierba santa, Hierba cana,
10
los páramos de Venezuela. En Colombia se encuentra en los departamentos de
Cundinamarca, Boyacá, Meta, Norte de Santander y Santander. Presenta una
floración de julio a agosto y de diciembre a enero (Pedraza
et al
., 2004).
2.3.2
Pentacalia vaccinioides
También es considerado como un arbusto de hasta 5m de alto, bastante ramificado y
con olor a trementina. Ramas frecuentemente fasciculadas y con cicatrices foliares.
Hojas simples, alternas, ascendentes obovadas, glabras, coriáceas y con la margen
entera. Inflorescencia terminal, en corimbos. Capítulos discoides, largamente
pedunculados, con el involucro acampanado. Flores de 24-56 por capitulo, todas
hermafroditas, tubulares, amarillas y fragantes. Fruto en aquenio, cilíndrico y con
pappus blanco. (García
et al
., 2006).
Se conoce con los nombres comunes Tangue (Santander), Chilquilla menuda o Hierba
de paramo (Cauca). Esta especie está registrada en los páramos de Colombia,
Ecuador y Venezuela. En Colombia está presente en las tres cordilleras, se encuentra
con frecuencia en matorrales y bordes de carreteras (Pedraza
et al.,
2004).
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
3.1 Formulación del problema
¿Tendrán actividad antimicrobiana los extractos acuosos proteicos, obtenidos a partir
de las especies
Pentacalia ledifolia y Pentacalia vaccinioides
contra los
microorganismos
Listeria monocytogenes, Pseudomonas fluorescens y Salmonella
Typhimurium?
3.2 Justificación de la investigación
La mayoría de las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) son de origen
microbiano, estos microorganismos patógenos tienen un impacto importante en la
salud de la población. El consumo de alimentos contaminados con microorganismos
como
L. monocytogenes, Pseudomonas fluorescens y Salmonella
Typhimurium ha
generado que cada vez mas investigaciones se inclinen, a desarrollar agentes que
ataquen la viabilidad de estos microorganismos. En este momento se conocen muchas
sustancias de origen natural, para el control e inhibición de los microorganismos con el
fin de preservar los alimentos y así evitar el uso de aditivos químicos. De acuerdo con
esto, se reconoció la necesidad de someter estos extractos acuosos a pruebas o
11
Mediante esta investigación se evaluó la presencia de actividad antimicrobiana de los
extractos acuosos proteicos de
Pentacalia ledifolia y Pentacalia vaccinioides
(Fam:
Asteraceae
) realizando el estudio “in vitro” frente a cepas de
Listeria monocytogenes,
Salmonella
Typhimurium
y Pseudomonas fluorescens.
Con los resultados obtenidos se
determino la resistencia (R) o sensibilidad (S) de las bacterias frente a los extractos,
para que puedan ser implementados en el tratamiento de enfermedades transmitidas
por alimentos (ETA).
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
Evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos acuosos proteicos de
Pentacalia
ledifolia y Pentacalia vaccinioides (Fam. Asteraceae)
sobre cepas de
Listeria
monocytogenes, Pseudomonas fluorescens y Salmonella
Typhimurium.
4.2 Objetivos específicos
Obtener los extractos acuosos de
Pentacalia ledifolia y Pentacalia vaccinioides
(Fam. Asteraceae)
.
Llevar a cabo una caracterización proteica de los diferentes extractos acuosos
vegetales obtenidos de
Pentacalia ledifolia y Pentacalia vaccinioides (Fam.
Asteraceae)
Evaluar la actividad bactericida de los extractos acuosos obtenidos
Pentacalia
ledifolia y Pentacalia vaccinioides (Fam. Asteraceae), sobre Listeria
monocytogenes, Salmonella
Typhimurium
y Pseudomonas fluorescens
en
medio de cultivo.
Determinar la concentración mínim
a inhibitoria (CMI) de los extractos de
Pentacalia ledifolia y Pentacalia vaccinioides (Fam. Asteraceae), que presenten
mayor inhibición ante las cepas de Listeria monocytogenes, Salmonella
Typhimurium
y Pseudomonas fluorescens
.
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 Diseño de la investigación
12
5.1.1.1 Hipótesis nula
Los extractos obtenidos de las especies
Pentacalia ledifolia
y
Pentacalia
vaccinioides no
presentan halo de inhibición frente a las cepas
Listeria
monocytogenes, Salmonella
Typhimurium
y Pseudomonas fluorescens
.
Ho: µ =
0
5.1.1.2 Hipótesis alterna
Los extractos obtenidos de las especies
Pentacalia ledifolia
y
Pentacalia
vaccinioides
presentan halo de inhibición frente a las cepas
Listeria
monocytogenes, Salmonella
Typhimurium
y Pseudomonas fluorescens
.
Hi: µ
≠
0
5.1.2 Variables del estudio
Las variables que se utilizaron en el presente trabajo de grado contribuyeron a
determinar aquellas especies que tienen propiedades antimicrobianas.
Dependiente:
Tamaño de Halo de inhibición medido en mm.
Independiente:
Tipo de microorganismo y tipo de extracto.
5.2 Materiales y métodos
5.2.1 Recolección de muestras
Las muestras vegetales de las especies
Pentacalia ledifolia y Pentacalia vaccinioides.
Pertenecientes a la familia
Asteraceae
se recolectaron en el páramo de “Choachí”, al
Sureste de la Ciudad de Bogotá, a una altitud de (3.115 m.s.n.m.); la muestra se tomo
en óptimo estado fitosanitario y de desarrollo vegetativo, el material fue secado a
temperatura ambiente, posteriormente se realizó una separación de hojas y flores,
para utilizar como muestra total, las hojas pertenecientes a cada especie. Cada una de
las muestras se trituraron en un molino eléctrico (tamiz 0.3 cm). Un ejemplar de cada
especie vegetal fue evaluado por el Herbario de la Pontificia Universidad Javeriana de
la ciudad de Bogotá D.C.
5.2.1.1
Obtención de las cepas
13
5.2.1.2 Obtención del extracto acuoso proteico a partir del género
Pentacalia (fam:
Asteraceae
)
Los extractos acuosos proteicos de las especies
Pentacalia ledifolia y Pentacalia
vaccinioides
se prepararon mediante el proceso de maceración en frio, en una
proporción 1:3, material vegetal – bencina de petróleo, la extracción se realizó durante
24 horas a temperatura ambiente, esto con el fin de separar la fase lipídica contenida
en el extracto acuoso. El producto se filtró y con ayuda del rotaevaporador se recuperó
la bencina de petróleo residual, se dejó secar el material vegetal a temperatura
ambiente y luego se dividió en dos partes iguales para continuar con el proceso de
maceración en frio, en una proporción 1:3, en dos medios: agua desionizada o Buffer
Tris HCl a pH de 7. Esto se preparó en frascos de vidrio, de capacidad de un galón,
estériles a temperatura ambiente con agitación suave durante 24 horas, para obtener
el extracto acuoso proteico. El material se filtro para separar el material vegetal
residual. A partir del extracto acuoso se realizó una extracción liquido–liquido con
bencina de petróleo en un embudo de decantación, para separar la fase lipídica
remanente contenida en el extracto acuoso. Los cuatro extractos generados por las
dos especies, se filtraron utilizando un poro de 0.45µm, con el fin de eliminar cualquier
interferencia por la presencia de un hongo encontrado en el material vegetal
desechado.
5.2.2 Concentración de los extractos mediante precipitación con sulfato de
amonio.
Se precipitaron las proteínas de los extractos acuosos mediante la técnica conocida
como “salting-out” o precipitación con sulfato de amonio, según la metodología
propuesta por Harris y Angal, 1994. Se tomaron seis alícuotas de 20 ml del extracto
acuoso de
Pentacalia ledifolia
tanto en solución con Buffer Tris HCL como con H
2O
desionizada, refrigerando a 4ºC. Después se calcularon los gramos de sulfato de
amonio necesarios para obtener un 20, 30, 40, 50, 60 y 70% de saturación, se
adiciono poco a poco el sulfato de amonio para cada alícuota revolviendo durante una
hora a 4ºC. Posteriormente se centrifugo cada alícuota a 3000 rpm durante 40
minutos, se retiro el sobrenadante y los pellets obtenidos fueron resuspendidos en 2ml
de Buffer Tris HCL o H
2O desionizada según fuera el caso, para así obtener los
14
5.2.3 Cuantificación proteica de los extractos concentrados.
La cuantificación proteica total de los extractos utilizados, se realizo por medio de la
técnica de Bradford modificada, que se elaboro en placas de Elisa. El montaje de la
placa se efectúo adicionando 20 µL de cada uno de los extractos por duplicado,
utilizando los pozos consecutivamente, posteriormente se elaboro dos curvas de
calibración, utilizando seroalbúmina bovina 0.15M con Buffer Tris HCl y agua
desionizada. Todas las muestras fueron sometidas a la acción de 200µL de reactivo de
Bradford (0.01% Coomasie Blue G-250, 4.75% Etanol, 85% H
3PO
4) luego se
homogenizo y se dejo 15minutos de reposo. Finalmente se evaluó la concentración del
compuesto coloreado midiendo a 620nm en un Lector de Microplaca - Anthos 2020
versión 2.0.5. Los resultados se expresan como Proteína (mg/ml) en la Tabla 3.
5.2.4 Evaluación de la actividad antimicrobiana
La actividad de los extractos acuosos concentrados y diluidos se realizo, de acuerdo al
método de difusión en agar (Ponce
et al
., 2008). Las cepas de
Listeria
monocytogenes, Pseudomonas fluorescens y Salmonella
Typhimurium
se recuperaron
en medio Tripticasa de Soya (TS) (Figura 2a, 2c y 2e). Se preparó la suspensión de
cada una de las cepas en solución salina al 0.85%, de acuerdo al tubo 0.5 del Patrón
de Mac Farland, posteriormente se inocularon 0.1 ml de las suspensiones en cajas de
Petri con medio Tripticasa de soya y se sembraron masivamente. Cada caja contenía
un disco de papel Whatman No 3 (5mm), impregnado con 10µl de Extracto acuoso
proteico de
Pentacalia ledifolia
en solución de H
2O desionizada, un disco con 10µl del
Extracto acuoso proteico de
Pentacalia ledifolia
en solución Tris HCL, un disco con
10µl por cada Extracto diluido a una concentración 1/2, un disco como control positivo
(Ciprofloxacina(CIP) y Imipenem (IPM) para
Pseudomonas fluorencens
; (CIP) y
NorFloxacina (NOR) para
Salmonella
Typhimurium; (CIP) y Gentamicina (CN) para
Listeria monocytogenes
), un disco como control negativo con 10µl de solución salina al
0.85%. El montaje de cada una de las cajas se ve ilustrada en la Figura 1. De cada
ensayo se realizaron 10 repeticiones. Las placas correspondientes a
Listeria
monocytogenes
y
Salmonella
Typhimurium se incubaron a 37+/-2ºC por 24 horas, y
las placas con
Pseudomonas fluorescens
se dejaron a temperatura ambiente por 24
horas. Terminado el tiempo de incubación se midieron los halos de inhibición frente a
los microorganismos. Se considera como positivo cuando el halo supera 1 mm de
inhibición (Kalemba, 2003).
15
Figura 1. Montaje de antibiograma Pseudomonas fluorescens en agar Tripticasa de Soya Los números representan la ubicación consecutiva de los discos control positivo, negativo y los diferentes extractos acuosos
proteicos, como se muestra en la Tabla 4.
5.3 Análisis estadístico
Se determino por medio de la prueba ANOVA (Análisis de varianza) La existencia o no
de diferencias significativas entre los diámetros de los halos de inhibición, reportados
en la evaluación antimicrobiana de los extractos acuosos proteicos
Pentacalia ledifolia
y
Pentacalia vaccinioides
frente a las cepas
Listeria monocytogenes, Salmonella
Typhimurium
y Pseudomonas fluorescens
.
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Obtención de las cepas.
Las cepas utilizadas en el estudio se conservaron en medio Tripticasa de soya con la
temperatura optima de crecimiento para cada microorganismo, siendo para
L.
monocytogenes
y
Salmonella
Typhimurium 37+/-2ºC, y para
Pseudomonas
fluorescens
temperatura ambiente.
En la Figura 2 se muestran los resultados de pureza y viabilidad de las cepas durante
el estudio, en las cuales se obtuvieron las morfologías de cada unas de las cepas
coincidiendo con lo reportado por Pozo
et al
., 2006, en el caso de la morfología de
Salmonella
Typhimurium (Figura 2b), se observaron bacilos
Gram
-negativos.
Posteriormente en el caso de la morfología de
Pseudomonas fluorescens
(Figura 2d),
se observaron células en forma de varillas rectas o ligeramente curvadas,
16
Las imágenes corresponden: (a-b) Salmonella Typhimurium (c-d) Pseudomonas fluorescens y (e-f) L.monocytogenes.Figura 2. Aislamientos en agar Tripticasa de soya y coloración de Gram.
Finalmente concordando con lo reportado en el Manual de la OIE.2004 para
L.
monocytogenes
(Figura 2f), corresponde a bacilos Gram-positivos, no móvil, en
algunos casos en forma de Y o V. Lo anterior demuestra que el banco de células es un
cultivo microbiano puro, homogéneo; almacenado bajo condiciones que mantienen su
viabilidad y pureza observadas mediante características morfológicas de cada cepa.
a.
b.
c.
d.
17
6.2 Evaluación del extracto acuoso proteico a partir del género Pentacalia
(fam:
Asteraceae
).
En cada uno de los extractos acuosos proteicos del género
Pentacalia
, se consiguió,
un volumen de 600ml, los cuales se conservaron en elermeyers de 1000ml. Las
cualidades físicas de los extractos mostraron una coloración café oscuro, por la
posible oxidación de los diferentes componentes del material vegetal, ya que el mismo
color se presento en el material vegetal desechado.
Los extractos acuosos de
Pentacalia ledifolia
presentaron menos viscosidad que los
extractos de
Pentacalia vaccinioides,
ya que estos últimos tenían un exudado viscoso,
el cual fue eliminado cuando se realizo la precipitación con sulfato de amonio. Todos
los extractos al ser filtrados con un filtro de 0.45µm, se elimino la interferencia de un
hongo que aun no ha sido identificado y se cree que proviene del sitio de recolección
de las muestras, la correcta eliminación de este se evidencio sembrando 0.1ml de
cada uno de los extractos en medio YPG (Extracto de levadura, Peptona y glucosa) el
cual no mostro crecimiento, que podría ser un interferente importante para los
resultados de la actividad antimicrobiana de los extractos.
[image:29.612.160.454.458.718.2]6.3 Concentración de los extractos mediante precipitación con sulfato de
amonio.
Tabla 2. Determinación del % de saturación con sulfato de amonio
Concentración proteica
mg/ml
Extracto utilizado % de
saturación
dilución concentrada
P. ledifolia Buffer Tris HCL 20 0,0855
30 0,3233
40 0,3624
50 0,6881
60 0,2516
70 0,2891
P. ledifolia H2O desionizada 20 0,0708
30 0,3717
40 0,0000
50 0,1246
60 0,2435
70 0,1490
P. ledifolia Buffer Tris HCL sin precipitar
0,0627
P. ledifolia H2O desionizada sin precipitar
18
La cuantificación proteica del ensayo de precipitación con sulfato de amonio para la
determinación del mejor porcentaje de saturación mostro que a concentraciones del 30
y 50% de saturación con sulfato de amonio, se obtuvo una mayor precipitación de
proteína para los extractos en H
2O desionizada y Buffer Tris HCl respectivamente. Por
lo anterior se precipitaron 400ml de cada uno de los extractos acuosos de
Pentacalia
ledifolia y Pentacalia vaccinioides
tanto en H
2O desionizada y Buffer Tris HCl con estos
porcentajes de saturación que presentaron la mejor precipitación de proteínas, las
proteínas precipitadas en cada extracto fueron posteriormente resuspendidas en 6ml
de H
2O desionizada o Buffer Tris HCL respectivamente, obteniéndose de esta forma
dos extractos acuosos proteicos concentrados para cada una de las especies.
6.4 Cuantificación proteica de los extractos concentrados.
En la Tabla No. 3. Se presenta el resumen de los datos obtenidos para la proteína total
cuantificada en las etapas de: extracción inicial por maceración en frio, precipitación
con sulfato de amonio, y sobrenadante después de la precipitación tanto para
Pentacalia ledifolia como para Pentacalia vaccinioides
en H
2O desionizada y Buffer
Tris HCl.
Tabla 3. Cuantificación Total proteica Bradford en placa.
[ ], Solución concentrada; Dil ½, Dilución ½
Como se puede observar, en el proceso de obtención de los extractos acuosos
proteicos de las especies
Pentacalia ledifolia
y
Pentacalia vaccinioides
se logra
obtener una concentración de proteína apreciable, siendo mayor para.
Pentacalia
vaccinioides
en solución con Buffer Tris HCl. Las soluciones disueltas en solución
Buffer Tris HCl, presentan mejor rendimiento, esto indica que la recuperación de las
proteínas es más efectiva utilizando como solución base Buffer Tris HCl.
Así mismo la concentración de estos extractos, precipitados con sulfato de amonio nos
devela un proceso bastante eficiente, sin embargo la evidencia de proteína en los
sobrenadantes después de la precipitación, demuestra que no hay una recuperación
total de proteínas en los extractos, y por lo tanto se debe afinar aun más el proceso de
saturación con sulfato de amonio. Además mediante este proceso se registraron
Cuantificación proteica de los extractos mg/mlPROCESO
DEL EXTRACTO P. ledifoliaHCL Tris
P. ledifolia H2 O desionizada
P. vaccinioides Tris HCL
P. vaccinioides H2 O desionizada [ ] Dil ½ [ ] Dil ½ [ ] Dil ½ [ ] Dil ½ Extracto acuoso
total 0.2172 0.3622 0.3651 0.5614 1.1117 0.6681 1.0064 0.9942 Precipitación con
sulfato de amonio 0.7719 1.2597 0.7070 1.07504 1.1420 1.3866 1.0447 1.2755 Sobrenadante del
precipitado con sulfato de amonio
19
diferencias considerables en la cantidad de proteína total obtenida en los extractos
acuosos de
Pentacalia ledifolia
y
Pentacalia vaccinioides
siendo de esta ultima donde
se obtuvo una mayor recuperación de proteína. Esto pudo haberse debido porque esta
especie se encontraba con un tiempo de recolección más cercano, al iniciar los
ensayos.
6.5 Evaluación de la actividad antimicrobiana de los extractos acuosos
proteicos.
En la Figura 3 se observan los resultados del diámetro de inhibición obtenidos por los
[image:31.612.155.454.281.601.2]extracto acuoso proteicos de
P. ledifolia y P. vaccinioides
, sobre las cepas de
Salmonella
Typhimurium,
Pseudomonas fluorescens
y
L. monocytogenes.
Figura 3. Resultados de la evaluación antimicrobiana de los extractos acuosos proteicos de P. ledifolia y
P. vaccinioides sobre las cepas de L. monocytogenes, Pseudomonas fluorescens y Salmonella
Typhimurium.Los tratamientos están enumerados: 1 y 7 discos control positivo (CIP) y (NOR) para Salmonella typhimurium ; (CIP) y (IPM) para Pseudomonas fluorescens; (CIP) y (CN) para L. monocytogenes); 2 y 8 discos control negativo con 10µl de solución salina al 0.85%; 3 y 9 discos impregnados con 10µl de Extracto acuoso proteico de P. ledifolia y P. vaccinioides en solución de H2O
desionisada respectivamente; 4 y 10 discos con 10µl del Extracto acuoso proteico de P. ledifolia y P. vaccinioides en solución Tris HCL respectivamente, 5 y11 discos impregnados con 10µl de Extracto acuoso proteico de P. ledifolia y P. vaccinioides en solución de H2O
20
.Salmonella typhimurium
generó sensibilidad frente a los extractos, siendo las
soluciones de
P. ledifolia
y
P. vaccinioides
concentradas en H
2O desionizada quienes
presentaron un mayor poder de inhibición con halos promedio de 2.0 mm y 2.2 mm
respectivamente; Los resultados estadísticos arrojaron una mayor confianza en los
datos obtenidos por los extractos de
P. vaccinioides
Pseudomonas fluorescens
presento también sensibilidad frente a los extractos
acuosos proteicos, siendo las soluciones de
P. ledifolia
y
P. vaccinioides
concentradas
en H
2O desionizada quienes presentaron un mayor poder de inhibición con halos
promedio de 2.2 mm en las dos especies, mostrando mayor confianza en los datos
obtenidos por los extractos de
P. vaccinioides
[image:32.612.103.527.384.557.2]La evidencia de halo generada por los extractos de
Pentacalia vaccinioides
frente a las
cepas de Salmonella Typhimurium y
Pseudomonas fluorescens
se muestra en la
Figura 4.
a.
b.
Las imágenes corresponden: (a) Salmonella Typhimurium y (b) Pseudomonas fluorescens.
Figura 4. Actividad antimicrobiana de los extractos acuosos proteicos de P. vaccinioides sobre
Salmonella Typhimurium y Pseudomonas fluorescens.
El efecto inhibitorio producido por los extractos acuosos de las especies de Pentacalia
frente a las baterías
Gram
-negativas, puede ser debido a que los péptidos presentes
en estos, impidieron la síntesis de pectidoglicano de membrana de estas bacterias,
produciendo así su muerte por lisis celular. Otra posibilidad puede ser que los péptidos
presentes en los extractos pudieron entrar en contacto con proteínas del exterior como
21
algunos péptidos podrían de este modo haber entrado e inhibido la síntesis de
distintas proteínas necesarias para duplicación celular.(Cabrera et al., 2007).
Listeria monocytogenes
, no se presentó ningún efecto antimicrobiano con ninguno de
los extractos de
P. ledifolia
y
P. vaccinioides
. Lo anterior demuestra que la bacteria
posee diferentes mecanismos para eludir el efecto tóxico de estos extractos,
generando protección contra las proteínas disueltas en los extractos acuosos. O bien
que no había ocurrencia de ningún péptido o proteína que presentara algún efecto
nocivo para estas cepas. Una de las causas de la resistencia puede deberse a la
composición de la pared celular, ya que las bacterias Gram-positivas contienen una
capa gruesa de peptidoglicano que contiene ácidos teicóicos y ácido teicurónico, que
generan protección contra compuestos químicos de los desinfectantes. Además que
varios de los estudios realizados sobre resistencia antimicrobiana en
Listeria s
pp.,
muestran claramente que el material genético implicado en la adaptación evolutiva a
corto plazo puede ser transferido exitosamente a
Listeria
s
pp., y otras bacterias
Gram-positivas evolutivamente relacionadas, como
Enterococcus s
pp (Ruiz
et al
.,2008).
6.6 Análisis estadístico ANOVA
La evaluación estadística por medio de la prueba ANOVA (Análisis de varianza),
determino que existen diferencias estadísticamente significativas entre los valores
promedio de los halos de inhibición con un alfa de 0.05 y por lo tanto se rechaza la no
existencia de actividad antimicrobiana de los extractos acuosos proteicos. Lo anterior
concluyó comparando el valor critico de F (1.460) y el F calculado es de 3709.703 por
[image:33.612.101.516.560.690.2]tanto se rechaza la Ho si Fc (F calculado )
Ft (valor critico de F ).
Tabla 4. Valores estadísticos prueba ANOVA (Análisis de varianza).