Análisis y simulación de un reactor de lecho fijo de naringinasa inmovilizada en vidrio poroso

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(1)U N I V E R S I D A D. DE. M U R C I A. F a c u l t a d de C i e n c i a s (Químicas y Matemáticas). ANÁLISIS Y SIMULACIÓN DE UN REACTOR DE LECHO FIJO DE NARINGINASA INMOVILIZADA EN VIDRIO POROSO.. Memoria p r e s e n t a d a para o p t a r a l Grado de Doctor en. /. C i e n c i a s , Sección de Químicas.. JOSEFA BASTIDA RODRÍGUEZ MCMLXXXV.

(2) AGUSTÍN MIÑANA AZNAR, P r o f e s o r T i t u l a r , Director d e l Departamento de Química y JOSÉ LUIS IBORRA PASTOR, Catedrático Numerario , Director del Departamento de Bioquímica de l a F a c u l t a d de C i e n c i a s (Químicas y Matemáticas) de l a U n i v e r s i dad de M u r c i a .. CERTIFICAMOS :. Que esta. e l trabajo contenido en Memoria bajo e l título:. ANÁLISIS. Y. SIMULACIÓN. DE. UN. REACTOR DE LECHO FIJO DE NARINGINA SA INMOVILIZADA EN VIDRIO POROSO que para optar a l grado de Doctor en Ciencias, Sección de Químicas, p r e s e n t a D9 J o s e f a B a s t i d a Rodríguez ha s i d o r e a l i z a do en e s t o s Departamentos b a j o la dirección de l o s Doctores A n t o n i o Bódalo Santoyo y Arturo Manjón Rubio. Y. para. efectos. que. conste. a. oportunos expedimos. los el. p r e s e n t e c e r t i f i c a d o en M u r c i a , Septiembre. Agustín Miñana Aznar D i r e c t o r d e l Departamento de Química Técnica. de. 1.985. J.Luis Iborra Pastor D i r e c t o r d e l Departamento de Bioquímica.

(3) T r a b a j o presentado para o p t a r a l Grado de Doctor en C i e n c i a s , Se£ ción de Químicas.. M u r c i a , 10 de Septiembre. de. 1.985. Josefa B a s t i d a Rodriguez L i c e n c i a d a en C i e n c i a s Químicas. V i s a d o en M u r c i a a 10 de Septiembre. de I . 9 8 5. LOS DIRECTORES. A n t o n i o Bódalo Santoyo. A r t u r o Manjón Rubio. P r o f . T i t u l a r de Ingeniería. P r o f . T i t u l a r de Bioquímica. Química de l a U n i v e r s i d a d /. de l a U n i v e r s i d a d de M u r c i a. de M u r c i a ..

(4) E l presente t r a b a j o ha s i d o subvencionado, en p a r t e , por e l p r o y e c t o n^ I 5 I O / 8 2 de l a Comisión Asesora de Investigación Científica y Técnica. Asimismo, l a f i r m a n t e de l a Memoria es b e c a r i a d e l c i t a d o p r o y e c t o . También se ha r e c i b i d o una ayuda d e l Convenio C a j a de Ahorros P r o v i n c i a l - U n i v e r s i dad de M u r c i a . A ambas i n s t i t u c i o n e s se l e agradece l a s ayudas p r e s t a d a s . Parte expresan. en. esta. de. los. Memoria. resultados. han. sido. que. se. publicados. en l a s s i g u i e n t e s r e v i s t a s : Analytical v o l . 149,. Biochemistry. (1985). nS 1. Biotechnology L e t t e r s (I985) v o l . 7,. ne 7 ,. 477-483. y están p e n d i e n t e s de publicación en: Biotechnology. and. Bioengineering. Enzyme and M i c r o b i a l Technology Además, han dado l u g a r a l a s s i g u i e n t e s comunicaciones. a Congresos y Reuniones:. XI Congreso. Nacional. de l a Sociedad. Española de Bioquímica 32 Congreso Mediterráneo ría Química.. de I n g e n i e -.

(5) En primer lugar, deseo expresar mi más profundo agradecimiento a l o s Profs. Drs. Antonio Bódalo Santoyo y Arturo Manjón Rubio, d i r e c t o r e s de e s t e t r a b a j o , por l a s enseñanzas, estímulos y ayudas con l a s que me a l e n t a r o n en todo momento. Al Prof. Dr. José Luis Gómez Carrasco, mi reconocimiento por e l esfuerzo que desinteresadamente ha desplegado para l a elaboración d e l t r a b a j o . Al Pastor,. por. su. Prof.. Dr.. oportuna. José. Luis. colaboración. Iborra en. los. momentos más n e c e s a r i o s . A. la. Profa.. Gómez, por l a amistad. e. Dra.. Elisa. inestimable. Gómez. apoyo. que. siempre me ha f a c i l i t a d o . A l o s Licenciados Carmen Romero y A l f o n s o Gimeno por s u ayuda en l a realización de l a p a r t e e x p e r i m e n t a l . A Mariano T a r i y demás compañeros de l o s Departamentos de Química Técnica y Bioquímica por t a n t a s h o r a s de t r a b a j o c o m p a r t i d o . Por a l a empresa. Zoster. último,. mi. agradecimiento. S.A. y a l Centro. de. Proceso. de Datos de e s t a U n i v e r s i d a d p o r su colaboración..

(6) E l r u b o r que a f l o r a n d o , queda siempre inerme a l b r o t e d e l e s f u e r z o ya doblado, nos pone en situación de e s p e r a no r e s u e l t a . Y, por t a n t o , con l a esperanza de que e l después ha de alcanzarse. ALANO. A mi madre. A mamá-Carmen..

(7) ÍNDICE.

(8) ÍNDICE. 1.. INTRODUCCIÓN Y O B J E T I V O S. 2.. ANTECEDENTES 2.1.. La n a r i n g i n a , f l a v o n o i d e d e l amargor. responsable. en cítricos. 2.2.. Actuación de l a enzima n a r i n g i n a s a .. 2.3.. Extracción y purificación. 2.4*. Propiedades. 2.5.. Métodos de medida de l a a c t i v i d a d catalítica. 2.6.. Naringinasa. 2.7.. Difusión y reacción en s i s t e m a s. inmovilizada. enzimas i n m o v i l i z a d a s. de.

(9) 2.8.. Diseño y simulación de r e a c t o r e s en p r o c e s o s con enzimas i n m o v i l i zadas. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1.. Materiales. 3.2.. Métodos 3.2.1.. Determinación de proteína. 3.2.2.. Determinación de l a masa molec u l a r de l a n a r i n g i n a s a por HPLC. 3.2.3.. E s p e c t r o s de absorción de p-nitrofenol y p-nitrofenil-. 3.2.4.. -L-ramnósido. A b s o r t i v i d a d e s molares de nar i n g i n a y prunina. 3.2.5.. Inmovilización de n a r i n g i n a s a .. 3.2.5.1.. En d e r i v a d o s. aminoa-. rílicos 3.2.5.2.. En d e r i v a d o s aldehídicos. 3.2.5.3.. En d e r i v a d o s. tiólicos. 3.2.5.4.. En d e r i v a d o s. aminados.

(10) 3.2.6.. Medida de a c t i v i d a d enzimática 3.2.6.1.. Con p - n i t r o f e n i l - o : -L-ramnósido como sustrato. 3.2.6.2.. Con n a r i n g i n a como sustrato. 3.2.7.. Obtención de l o s v a l o r e s de conversión en un r e a c t o r t u b u l a r ... 3.2.8.. Obtención y purificación de prunina. RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DISCUSIÓN 4.1.. Cromatografía líquido-líquido de a l t a resolución de n a r i n g i n a s a . Determinación de l a masa m o l e c u l a r . C r i t e r i o de pureza. 4.2.. Métodos de medida de l a a c t i v i d a d. ü! -. -ramnosidasa de n a r i n g i n a s a 4.3.. Inmovilización y p r o p i e d a d e s de n a r i n g i n a s a i n m o v i l i z a d a. generales. 4.3.1.. Inmovilización en v i d r i o poroso.. 4.3.2.. E s t a b i l i d a d a l almacenamiento y operacional d e l derivado i n -.

(11) 4.3.3'. 4.3.4«. 4.4.. Variación de l a a c t i v i d a d con l a concentración de enzima Determinación de l a s c o n d i c i o nes óptimas de actuación de l a enzima. 110. Determinación de l o s parámetros cinéticos de n a r i n g i n a s a. 4 . 5.. 104. II8. E s t u d i o s de inhibición. 135. 4.5-1«. Inhibición por p - n i t r o f e n o l ..... 137. 4.5.2.. Inhibición por ramnosa. 139. 4.5.3'. Inhibición por g l u c o s a. 145. 4.5.3.. Inhibición por p r u n i n a. y narin-. genina 4.6.. 4.7.. Determinación de l a conversión de e q u i librio. 155. 159. R e s u l t a d o s d e l r e a c t o r de l e c h o f i j o con naringinasa inmovilizada 4.7.1.. S u s t r a t o sintético p - n i t r o f e n i l -0¿-L-ramnósido. 4.7.2.. I6I. Sustrato natural naringina. I6I 162.

(12) 5.. DESARROLLO TEÓRICO. 5.1.. 166. Difusión y reacción en partículas esfér i c a s porosas 5.1.1.. Ecuaciones d i f e r e n c i a l e s d e l proceso. 5.1.2.. F a c t o r de e f i c a c i a. 5.1.3.. Aplicación d e l modelo a procesos. 174. enzimáticos r e v e r s i b l e s , t i p o M i c h a e l i s - M e n t e n y con inhibición c o m p e t i t i v a por producto 5.1.4.. Resolución de l a ecuación d i f e rencial. 5.1.5.. 5.2.. 175. 181. R e s u l t a d o s p r o d u c i d o s por e l modelo y discusión de l o s mismos . I86. Diseño y simulación de r e a c t o r e s de l e cho f i j o para s i s t e m a s con enzimas inmov i l i z a d a s en partículas esféricas. I97. 5.2.1.. Ecuación de diseño. 197. 5.2.2.. Integración de l a ecuación de. 5.2.3.. diseño d e l r e a c t o r. 203. R e s u l t a d o s y discusión. 205.

(13) 6.. CONTRASTE DEL MODELO. 6.1.. 6.2.. Estimación de d i f u s i v i d a d e s de l o s s u s t r a t o s y productos. 218. Cinética de M i c h a e l i s - M e n t e n r e v e r s i b l e : s u s t r a t o p-nitrofenil--L-ramnósido ... 220 6.2.1.. F a c t o r de e f i c a c i a. 6.2.2.. Conversión de s a l i d a d e l r e a c t o r t u b u l a r de l e c h o f i j o. 6.3«. 215. 221. 225. Cinética de M i c h a e l i s - M e n t e n con i n h i b i ción c o m p e t i t i v a p o r p r o d u c t o : s u s t r a t o naringina. 228. 6.3.1.. F a c t o r de e f i c a c i a. 229. 6.3.2.. Conversión de s a l i d a d e l r e a c t o r t u b u l a r de l e c h o f i j o. 232. 7 . CONCLUSIONES. 241. 8.. BIBLIOGRAFÍA. 249. 9.. NOMENCLATURA. 273.

(14) 10. APÉNDICES. I.. II.. III.. IV.. 280. A l g o r i t m o para l a resolución d e l s i s t e m a de ecuaciones d i f e r e n c i a l e s por e l método de Runge-Kutta. 281. Diagrama de f l u j o d e l programa de ordenador para l a obtención d e l p e r f i l de concentraciones adimensionales y e l f a c t o r de e f i c a c i a. 288. A l g o r i t m o para l a resolución de l a ecuación de diseño d e l r e a c t o r por e l método de Runge-Kutta. 2 96. Diagrama de f l u j o d e l programa de ordenador p a r a l a obtención de l o s p e r f i l e s a x i a l e s de conversión en e l r e a c t o r t u b u l a r de l e c h o f i j o. 301.

(15) 1.- I N T R O D U C C I Ó N Y O B J E T I V O S.

(16) 1.-. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS. La aplicación de enzimas en i n d u s t r i a s de procesado de cítricos es una práctica de uso c o r r i e n t e en e l d e s a r r o l l o de tecnologías avanzadas. Va d i r i g i d a fundamentalmente a increment a r l a c a l i d a d d e l producto por reducción de su amargor o v i s c o s i d a d , o b i e n a aumentar e l rendimiento en componentes extraibles de l o s mismos para su aplicación p o s t e r i o r .. Los de. compuestos. flavonoides. y. cítricos. amargos. contienen. químicamente. limonoides,. que. dos. tipos. diferentes,. afectan. de. forma. d i s t i n t a a l a c a l i d a d de l o s cítricos y sus productos. derivados.. distribuidos. en. Los todo. flavonoides el. se. fruto,. alcanzando. máxima concentración en e l a l b e d o . por. su parte,. menores jugo.. presentan. proporciones. habiéndose de. se. detectado. que su. en los. l o s cítricos. en. flavonoides,. no. en. de forma. a l sabor amargo t o t a l de un jugo cítrico.. - 2 -. su. Los l i m o n o i d e s ,. presencia. Además, c o n t r i b u y e n. encuentran. l o s sacos minoritaria.

(17) De entre l o s flavonoides, el p r i n c i p a l r e s p o n s a b l e d e l sabor amargo es l a n a r i n g i n a , y su procesado para l i m i t a r su concentración a n i v e l e s moderados se ha realizado por varias técnicas: seleccionando e l fruto, por c o n t r o l de l a presión empleada en l a extracción d e l jugo o por mezcla de diferentes zumos. En l a a c t u a l i d a d , e l uso de hidrólisis enzimática de naringina por n a r i n g i n a s a , constituye un medio de e l i m i n a r e f i c a z m e n t e e l amargor. La adición de l a n a r i n g i n a s a soluble a l o s zumos es un proceso de a l t o c o s t e que i m p l i c a , además, l a adición de componentes extraños a l o s mismos para l o g r a r l a eliminación de l a naringina, sin conseguirlo, a pesar de e l l o , ya que l a a c t i v i d a d enzimática es i n h i b i d a por l o s component e s d e l zumo así como por l o s p r o p i o s p r o d u c t o s de l a hidrólisis. Para s o l v e n t a r l o s problemas inherentes a estas d e s v e n t a j a s , l a utilización de reactores de enzimas inmovilizadas supone un gran avance en l a optimización de l o s p r o c e s o s i n d u s t r i a l e s que conducen a l a obtención de jugos cítricos no amargos. Además, l a utilización de t a l t i p o de d e r i v a d o s permitiría l a r e u t i l i z a ción del biocatalizador, así como un mejor c o n t r o l d e l proceso de desamargado, p o s i b i l i d a d e s ambas que redundarían en una disminución d e l coste g l o b a l d e l proceso.. Sin. embargo,. y. l a abundante bibliografía e x i s t e n t e aplicaciones procesos. de. las. enzimas. i n d u s t r i a l e s , algunas. -. 3. -. a. pesar. sobre. posibles. inmovilizadas de cuyas. de en. referen-.

(18) c i a s se basan en l a utilización de naringinasa inmovilizada, l a utilización de e s t o s sistemas en l a i n d u s t r i a es muy e s c a s a , debido e s e n c i a l m e n t e a l a parquedad de modelos matemáticos g e n e r a l i zados que r e p r e s e n t e n l a hipotética descripción física de t a l e s s i s t e m a s y a l a i n e x i s t e n c i a de modelos d i g i t a l e s que sean o p e r a t i v o s y tengan posibilidades de uso h a b i t u a l para e l cálculo, diseño y c o n t r o l de unidades en l a s que se d e s a r r o l l e n e s t o s t i p o s de p r o c e s o s .. Así pues, el objetivo general d e l p r e s e n t e t r a b a j o ha c o n s i s t i d o en e l análisis y simulación de un r e a c t o r de l e c h o f i j o de n a r i n g i nasa i n m o v i l i z a d a en v i d r i o poroso^ para c o n s e g u i r l o , ha s i d o n e c e s a r i o c u b r i r l o s s i g u i e n t e s objetivos particulares: 12). Proponer un método a l t e r n a t i v o para. rización de l a a c t i v i d a d. ü!-ramnosidasa. nasa haciendo uso d e l s u s t r a t o nilno. o: -L-ramnósido, existe. un método. l a caracte-. ya. que. de. sintético en. y. para d e t e r m i n a r d i c h a a c t i v i d a d de forma naringinasa. específico. Dicho. sustrato. de l a c i t a d a. p-nitrofe-. l a bibliografía. rápido, s e n s i b l e. y d e f e r e n c i a d a de l a a c t i v i d a d. naringi-. global. específica. de l a enzima. es. actividad,. económico. absolutamente y uno. de l o s. p r o d u c t o s de l a reacción hidrolítica, e l p - n i t r o f e n o l , es fácilmente c u a n t i f i c a b l e colorimétricamente, mostrando, además, una a b s o r t i v i d a d lo que. que i m p l i c a. una gran. molar. sensibilidad. se propone.. - 4 -. elevada,. d e l método.

(19) 25) Proceder a l a inmovilización de l a enzima n a r i n g i n a s a , usándose para e l l o un soporte de vidrio poroso de n a t u r a l e z a hidrofílica bien d e f i n i d a , ya que va r e c u b i e r t o por una capa de r e s i d u o s de g l i c e r i l o y cuyo tamaño de partícula es uniforme. La inmovilización se ha llevado a cabo por c u a t r o procesos d i s t i n t o s tendentes a i m p l i c a r en l a unión soporte-proteína a c u a t r o r e s i d u o s de aminoácidos d i f e r e n t e s de l a enzima con e l f i n de e s t u d i a r e l e f e c t o de l a modificación química sobre l a a c t i v i d a d d e l d e r i v a d o .. 3-) Estudiar l a influencia d e l tamaño de poro del s o p o r t e , manteniendo c o n s t a n t e e l n i v e l de modificación química de l a enzima, sobre l a a c t i v i dad d e l d e r i v a d o , siendo éste un parámetro e x t r a o r d i n a r i a m e n t e importante en e l e s t u d i o d e l comportamiento cinético de l a s enzimas inmovilizadas por l o s problemas de difusión i n t e r n a que se plantean.. 4-) de. Proceder. a. l o s derivados. l a caracterización obtenidos. frente. del al. mejor. sustrato. sintético propuesto y a l s u s t r a t o n a t u r a l n a r i n g i n a , obteniéndose. l o s parámetros. cinéticos. intrínsecos. en ambos c a s o s , así como a l e s t u d i o de l a e s t a b i l i dad. a l almacenamiento. y. operacional. último. parámetro. derivado, siendo. este. cuando. l a aplicación. se prevé. proceso c o n t i n u o .. -. 5. -. de. dicho. fundamental. d e l sistema. a. un.

(20) 52) A f i n de d e s c r i b i r cuantitativamente l a interacción de l a reacción enzimática con l a s limitaciones difusionales internas, se pretende d e s a r r o l l a r un modelo matemático para r e a c c i o n e s enzimáticas heterogéneas monosustrato, en l a s que l a enzima se encuentra i n m o v i l i z a d a en partícul a s esféricas p o r o s a s , obteniéndose l o s p e r f i l e s r a d i a l e s de concentración a d i m e n s i o n a l de. s u s t r a t o en l a partícula, a s i como e l correspondiente f a c t o r de e f i c a c i a .. 62) Formular l a ecuación de diseño de un r e a c t o r de l e c h o f i j o para e s t e t i p o de s i s t e m a s , y r e s o l v e r l a t e n i e n d o en cuenta l a variación c o n t i n u a que experimenta e l f a c t o r de e f i c a c i a a l o l a r g o d e l r e a c t o r , examinando l a i n f l u e n c i a que puedan t e n e r cambios en l o s parámetros cinéticos y de operación sobre l o s p e r f i l e s a x i a l e s de conversión.. 72) tica. Por último, proceder a l a verificación sistemáde. l o s modelos. propuestos. resultados experimentales. obtenidos. comparando. con l o s p r e d i -. chos por l o s c i t a d o s modelos en términos de sión y de f a c t o r e s de e f i c a c i a .. -. 6 -. los. conver-.

(21) 2.-. ANTECEDENTES.

(22) 2.-. ANTECEDENTES. 2.1.-. LA NARINGINA, FLAVONOIDE RESPONSABLE DEL AMARGOR EN CÍTRICOS. En gran. variedad. l o s cítricos de. se. flavonoides.. encuentra. Estos. aparecen. normalmente como glicósidos y se h a l l a n distribuidos. en todos. los tejidos,. una. ampliamente. pero. en. mayor. concentración (más de un 2%) en e l albedo y fragment o s de membrana ( 1 ) .. En función d e l disacárido predominante. en. l a composición. del flavonoide,. éstos. se. d i v i d e n en dos grupos químico-taxonómicos : neohespe^ ridosas ( 2 - 0 - a - L - r a m n o p i r a n o s i l - ^ -D-glucopiranosa) y r u t i n o s a s (6-0-Q:. -L-ramnopiranosil-jQ-D-glucopira^. nosa) ( 1 ) .. Los concentración la. primera. amargas. flavonoides. que. son l a n a r i n g i n a. predomina. como a c i d a s ,. y. en pomelos mientras -. 8 -. alcanzan la. hesperidina;. y naranjas. que. la. mayor tanto. hesperidina.

(23) se encuentra. p r i n c i p a l m e n t e en n a r a n j a s ,. limones. y v a r i a s c l a s e s de mandarinas ( 2 ) .. La concentración de f l a v o n o i d e s en l o s zumos cítricos debe s e r r e d u c i d a , por dos r a z o n e s , fundamentalmente. En primer lugar, su i n s o l u b i l i d a d da l u g a r a l a aparición de depósitos c r i s t a l i n o s en l a s u p e r f i c i e de l o s equipos de procesado ( 3 ) ; y, en segundo l u g a r , algunos de e s t o s compuestos muestran un acusado sabor amargo, l o que c o n f i e r e a l o s zumos un sabor desagradable ( 4 ) .. Se la. relación. ha. estudiado. existente. entre. con. detalle. l a estructura del. disacárido d e l f l a v o n o i d e y e l amargor que c o n f i e r e a l zumo que l o posee. que la. era e l tipo. de. Así, i n i c i a l m e n t e enlace. glucosa e l factor. entre. l a ramnosa. determinante. siendo e l a g l i c o n e l modulador. se pensó y. d e l amargor,. de e s t a. ya que l a n a r i r u t i n a , isómero Qí ( 1 — ^ 6 ). propiedad, ramnoglu--. cosídico de l a n a r i n g i n a , no es amarga (5) m i e n t r a s que. l a poncirina. (un (x (1. de. l a neohesperidosa). es. ^ 2). ramnoglucósido. menos. amarga. que l a. n a r i n g i n a , llegándose por l o t a n t o a l a conclusión de. que todos. l o s 2-ramnoglucósidos. eran. amargos. y s o l o e l l o s ( 6 ) . S i n embargo, en e s t u d i o s p o s t e r i o r e s se ha confirmado que e l amargor es fundamentalmente. debido. a l enlace. (1. *-2 ),. es. decir,. no se r e q u i e r e que e l disacárido s e a un ramnoglucósido, n i tan siquiera entre poco. l a s dos. que sea. unidades. además e l t i p o. de. de -. (X. azúcar,. enlace. 9 -. ó j(3 con. e l enlace importando e l que e l.

(24) segundo azúcar se une a l e s q u e l e t o. de l a flavonona. (7,8).. La. naringina,. - j3 -glucósido) de l a 4 ' , (Figura 1), del y. sabor. 7-trihidroxiflavanona flavonoide. en l o s zumos y en l 8 5 7. fué d e s c u b i e r t a. flores. 5,. es e l p r i n c i p a l amargo. 7-(2-ramnósido-. el. responsable. jugos. cítricos,. por De Vry (9). de l o s árboles de. pomelo. que. en l a s. crecían. en. Java. A l o largo del. fruto. de. se. produce. l a concentración. del. amargor,. en. dicho. d e l proceso una. de. marcada. disminución. naringina,. dependiendo,. flavonoide,. de maduración. de. y. además. factores. por. tanto. el. contenido. tales. como e l. t i p o de f r u t o , l a estación d e l año y l a s. condiciones. de extracción y filtración d e l zumo que se obtenga (10,. 11).. Se se. encuentra. proporción el. ha en. desea. Cuando. satisfactoria,. en. se disminuye. l o s zumos. la. cítricos. tengan. ya. resultados. realizadas a ya. de. aceptación. ese. orden. que muy. niveles. muchas. han demostrado. tales niveles que un c i e r t o. grado. desagradable. de. -. naringina. s i n embargo, organolépticas. que no c o n v i e n e de. 10. del. amargor -. de. d e l orden d e l. pruebas. l a concentración. estos. una. l a concentración a. una. necesario. 0,03%, e l sabor amargo desaparece ( 1 2 ) ; los. en. siendo. un s a b o r. cítricos. naringina. a f i n de d i s m i n u i r. que. concentración c o n f i e r e. que. de. 0,07^,. del. d e l zumo. s i se. comercial. l o s zumos. media. tratamiento. niveles. determinado. se. reducir. flavonoide, considera.

(25) FIGURA 1.-. E s t r u c t u r a de l a n a r i n g i n a . 7 - ( 2-ramnósido-j(3 -glucósido ) de l a 4',5,7. trihidroxiflavanona..

(26) que r e s u l t a r e f r e s c a n t e , por l o que e l c o n t e n i d o en n a r i n g i n a de l o s zumos cítricos se s u e l e r e d u c i r i n d u s t r i a l m e n t e a l 0 , 0 5 ^ v a l o r que permite e q u i l i b r a r l a s dos propiedades deseadas para e l zumo : a u s e n c i a de amargor y f r e s c o r . Por o t r a p a r t e es conveniente poder controlar e l amargor d e l producto f i n a l s i n a f e c t a r de forma adversa otras propiedades organolépticas d e l zumo (13 ) •. Se han propuesto d i v e r s o s métodos para r e d u c i r e l n i v e l de n a r i n g i n a de l o s productos cítricos. E l primero de ellos consiste en l a extracción de d i c h o f l a v o n o i d e con carbón a c t i v o , en determinadas condiciones de pH y t e m p e r a t u r a , pero e s t e t r a t a m i e n t o no es a p l i c a b l e puesto que también se e x t r a e n o t r o s compuestos que c o n t r i b u y e n a l a c a l i d a d d e l zumo o d e r i v a d o cítrico ( 1 4 ) •. Por o t r a p a r t e , l a hidrólisis a c i d a de l a n a r i n g i n a , u t i l i z a n d o ácido clorhídrico a 90-C (15) o una mezlca de ácido fórmico- c i c l o h e x a n o l ( l 6 ) , son p r o c e d i m i e n t o s demasiado drásticos para s u aplicación práctica.. Sin ampliamente. duda. utilizado. a l g u n a , e l método. para. la. naringina,. es. la. La. utilización. de. enzimas. y se. selectivo ha. de r e d u c i r. convertido. corriente,. ya. que. en. -. 12. eliminación. hidrólisis como. medio. -. de. práctica. trabaja. de. enzimática.. los niveles una. se. la. más. en. eficaz. naringina industrial. condiciones.

(27) suaves, de. l o que. redunda. l a s propiedades. vez. e l número. conseguir. Este método fué. el. mantenimiento. d e l producto. que s i m p l i f i c a. n e c e s a r i a s para. en. final,. de. manipulaciones. e l objetivo. propuesto. en. propuesto.. Japón. y utilizar. 1955. en. y desde entonces ha s i d o o b j e t o de muchas basadas en p r o d u c i r. a la. patentes. una enzima. capaz. de h i d r o l i z a r e l componente disacárido. neohesperi-. dosa de l o s f l a v o n o i d e s , pudiendo. hidrólisis. limitarse. (1. a l enlace. ^2). azúcares c o n s t i t u y e n t e s vista. la. relación. que. exclusiva. a los. glicosídica. existente. entre. (8,9).. ACTUACIÓN DE LA ENZIMA NARINGINASA. La. naringinasa. que h i d r o l i z a l a n a r i n g i n a cada. liga. de l a p a r t e. este t i p o de e n l a c e y e l amargor. 2.2.-. esta. una de e l l a s. diferente. y. una. en dos e t a p a s ,. c a t a l i z a d a por una. de l a enzima-;. -ramnosidasa (E C. es. así. enzima siendo. actividad. l a actividad. OL -. 3.2.1.40) hidroliza l a naringi(7-. na. a ramnosa. prunina. 4',. 5,7-trihidroxiflavanona) ,. j8 -glucósido. de l a. producto. este. último que es s u s t r a t o de l a a c t i v i d a d jQ-glucosida sa y Un. 3.2.1.21). (EC. naringenina esquema. l a Figura. de. que. lo. degrada. a. glucosa. (4',5,7-trihidroxiflavanona) l a reacción. 2.. -. 13. -. se. representa. en.

(28) NARIN&iNA. ALFA-RAMNOSIDASA ( o¿-1—^2 ). PRUNINA. RAMNOSA. CHjOH. • 0 ^. OH. OH. OH. BETA-GLUCOSJDASA ( /9- 1—7' ). GLUCOSA CH^OH. NARINGENINA. —Ov OH OH ÓH FIGURA 2.-. Hidrólisis enzimática de l a n a r i n g i n a ..

(29) Se ha demostrado que l a p r u n i n a es aproximadamente tres veces menos amarga que l a n a r i n g i n a ( 1 2 ) ; e l l o hace que para l o g r a r e l desamargado de un zumo, no haya necesidad de degradar l a n a r i n g i n a por completo a n a r i n g e n i na , proceso que es más l e n t o en su conjunto y que además puede dar l u g a r a l a formación de un p r e c i p i t a d o en e l zumo de c r i s t a l e s de naringenina^ dada su i n s o l u b i l i d a d en medio acuoso. Así pues, es s u f i c i e n t e l a a c t i v i dad 0!-ramnosidasa para proceder a l desamargado de zumos. La enzima empleada para e l l o puede s e r l a misma que se e n c u e n t r a en l o s zumos recién o b t e n i d o s , o l a que se puede a d i c i o n a r en e l caso de que c a r e z c a n de e l l a o se desee a c e l e r a r e l p r o c e s o . De c u a l q u i e r forma, tanto s i l a enzima se encuentra ya en e l zumo, como s i es exógena, es n e c e s a r i o c a r a c t e r i z a r adecuadamente e l n i v e l de a c t i v i d a d cí -ramnosidasa que p r e s e n t a , a f i n de c o n t r o l a r l a extensión de l a hidrólisis de n a r i n g i n a a p r u n i n a y obtener así un zumo con l a s características organolépticas deseadas.. -. 15. -.

(30) 2.3.-. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN. E l enorme interés práctico que presenta l a hidrólisis enzimática de l o s component e s amargos de l o s productos cítricos, r e q u i e r e d i s p o n e r de una preparación enzimática p u r i f i c a d a y l i b r e de enzimas contaminantes.. La naringinasa es una enzima que no se encuentra en abundancia en l a n a t u r a l e za. De hecho, no se ha detectado su p r e s e n c i a en e l r e i n o a n i m a l , m i e n t r a s que en e l v e g e t a l tan sólo se ha detectado en cítricos (en l a región comprendida e n t r e e l f l a v e d o y e l albedo d e l pomelo), en l a s s e m i l l a s de a p i o (17? l 8 ) , y en l a s hojas d e l árbol C i t r u s decumana ( 1 9 ) . S i n embargo, e l a i s l a m i e n t o y purificación de l a a c t i v i d a d h i d r o l i z a n t e de n a r i n g i n a de l a s dos últimas f u e n t e s condujo a una preparación que era capaz de h i d r o l i z a r l a n a r i n g i n a a n a r i n g e n i n a y e l disacárido i n t a c t o , debiendo pues c o n s i d e r a r se d i c h a enzima como una j8-glucosidasa, y no realmente como n a r i n g i n a s a , ya que no estaba presente l a a c t i v i d a d a - r a m n o s i d a s a .. Dado que l a s c a n t i d a d e s. extraibles. de l a enzima n a r i n g i n a s a de f u e n t e s de o r i g e n veg e t a l son muy pequeñas, fué e v i d e n t e desde un p r i ^ mer momento^ que se n e c e s i t a b a o t r a f u e n t e. distinta. capaz de p r o d u c i r l a enzima en c a n t i d a d e s. suficien. -. 16. -.

(31) t e s para su aplicación práctica. Por e l l o , cuando se encontró que una preparación c o m e r c i a l de enzimas pécticos de o r i g e n fúngico denominada P e c t i n o l 100-D (de Rohm and Haas Co.), e r a capaz de hidrolizar completamente l a naringina en disolución acuosa a ramnosa, g l u c o s a y n a r i n g e n i n a (19), l o s e s t u d i o s sobre obtención de enzimas de o r i g e n fúngico, se d i r i g i e r o n h a c i a e l a i s l a miento, purificación y comercialización de nuevas p r e p a r a c i o n e s enzimáticas de n a r i n g i n a s a . E f e c t i v a mente, ciertos cultivos de microorganismos, principalmente d e l reino Fungi, han r e s u l t a d o s e r l a s mejores f u e n t e s de n a r i n g i n a s a . En e l l o s , se induce l a síntesis de l a enzima haciéndolos c r e c e r en un medio de c u l t i v o que c o n t i e n e n a r i n g i na, pudiéndose r e a l i z a r e s t e proceso a escala i n d u s t r i a l . Es así como se han obtenido muchas p r e p a r a c i o n e s enzimáticas de n a r i n g i n a s a : " N a r i n g i nasa C" ( 2 0 ) , "Kumitanase" de A s p e r g i l l u s n i g e r ( 7 , 1 1 , 2 1 - 2 5 ) , " S o l a s e " de C o n i o t h y r i u m diplodiella o "Sankyo Naringinase" de A s p e r g i l l u s u s a m i i mut. s h i r o u s a m i i ( 2 6 ) .. La purificación de l a preparación enzimática a u t i l i z a r , t a n t o p a r a ción completa de l a enzima, ción práctica consecuente, en. l a obtención. preparaciones enzimas porque. una c a r a c t e r i z a -. como para. es una etapa. de l a enzima.. En. enzimáticas s u e l e n. pécticas, reducen. que pueden. que se ponen. considerablemente. complejo. romper. que mantiene -. e l sistema a 17. decisiva. este. tipo. estar. d e l zumo; s i n embargo su p r e s e n c i a ya. l a aplica-. de. presentes manifiesto. l a viscosidad no es. deseable. hidrocoloidal. l o s componentes -. de. del.

(32) zumo en suspensión, por l o que e l procedimiento más u s u a l para l a obtención de una preparación enzimática s a t i s f a c t o r i a i n c l u y e l a separación de e s t a s enzimas contaminantes. En primer l u g a r se s e l e c c i o n a e l c u l t i v o que p r e s e n t a l a mayor a c t i v i d a d n a r i n g i n a s a , que se hace c r e c e r en un medio con n u t r i e n t e s adecuados para l a producción de l a enzima, ya que e s t a no es s i n t e t i z a d a por e l microorganismo en c o n d i c i o n e s normales. Seguidamente, se efectúa una purificación p a r c i a l por t r a t a m i e n t o de l o s e x t r a c t o s d e l c u l t i v o con alcohol para precipitar l a s proteínas, para a continuación f i l t r a r y s e c a r e l p r e c i p i t a d o p r o t e i c o o b t e n i d o con a i r e ( 2 0 ) . La eliminación de l a s enzimas pécticas se r e a l i z a por d i f e r e n c i a de s o l u b i l i d a d de l a s g l i c o s i d a s a s y p e c t i n a s a s en disolución alcohólica (27) o p o r inactivación d i f e r e n c i a l de l a s p e c t i n a s a s a pH 8 y 37~C ( 2 8 ) . En líneas g e n e r a l e s éste es e l t r a t a m i e n t o para conseguir una preparación enzimática, aunque puede d i f e r i r l i g e r a m e n t e según l a fuente de p a r t i d a . S i n embargo, en ningún caso se e s p e c i f i c a en l a bibliografía e l c r i t e r i o para determinar l a pureza de l a s n a r i n g i n a s a s así o b t e n i d a s , empleándose normalmente e s t a s p r e p a r a c i o n e s en l o s ensayos analíticos.. -. 18. -.

(33) 2.4.-. PROPIEDADES. Una vez que ha s i d o o b t e n i d a una preparación enzimática de n a r i n g i n a s a y antes de su aplicación práctica en e l desamargado de cítricos y sus d e r i v a d o s , se r e q u i e r e un conocimiento previo de l a s características m o l e c u l a r e s y cinéticas de l a enzima. S i n embargo, en l a bibliografía d i s p o n i b l e no se ha encontrado una caracterización completa de l a n a r i n g i n a s a en s e n t i d o e s t r i c t o , s i n o mas bien estudios de l a s c o n d i c i o n e s óptimas de actuación de l a enzima para l l e g a r a un grado de liidrólisis de l a n a r i n g i n a satisfactorio para eliminar e l amargor d e l zumo. Tan sólo en un caso, e x i s t e una r e f e r e n c i a bibliográfica que menciona l a separación, mediante técnicas electrocromatográficas ( 2 9 ) , de l a s dos a c t i v i d a d e s enzimáticas de l a n a r i n g i n a s a . Puesto que d i c h a s a c t i v i d a d e s se d e t e r m i n a r o n en f r a c c i o n e s a s o c i a d a s a dos bandas de proteína d i f e r e n t e s , es o b v i o d e d u c i r , que l a naringinasa contiene como mínimo dos tipos de cadenas polipeptídicas diferentes. S i n embargo^ en d i c h o t r a b a j o no se llegó a ninguna conclusión en ese a s p e c t o , dedicándose l o s a u t o r e s t a n sólo a ensayar la idoneidad de d i f e r e n t e s ramnósidos, glucósidos y ramnoglucós i d o s de f l a v a n o n a s como s u s t r a t o s para cada una de l a s a c t i v i d a d e s . En t a l e s condiciones l a a c t i v i d a d Q!-ramnosidasa se expresó p r e f e r e n t e mente frente a l o s ramnoglucósidos, siendo muy b a j a cuando l a ramnosa se halló unida d i r e c t a mente a l aglicón ( 2 9 ) .. -. 19. -.

(34) Fuera de e s t a r e f e r e n c i a bibliográfica, l a n a r i n g i n a s a parece comportarse como una única e s p e c i e f r e n t e a l o s p r o c e d i m i e n t o s de purificación empleados normalmente ( p r e c i p i t a ción con s u l f a t o amónico o e t a n o l ) , no habiéndose tampoco r e f e r e n c i a d o l a p o s i b i l i d a d existente de que se separen l a s dos a c t i v i d a d e s a l añadir urea o i n c u b a r a temperaturas de SO^C, t r a t a m i e n t o s ambos usualmente empleados en l a s p r e p a r a c i o nes enzimáticas de n a r i n g i n a s a para eliminar l a s a c t i v i d a d e s asociadas a enzimas pécticas (20, 22, 23, 26, 3 0 ) .. Asimismo, tampoco e x i s t e n r e f e r e n c i a s bibliográficas en cuanto a tamaño m o l e c u l a r , punto isoeléctrico, e x i s t e n c i a de subunidades, o información relacionada con l a e s t r u c t u r a de l a proteína ( e s p e c t r o s UV-Vis, o de f l u o r e s c e n c i a , extinción de f l u o r e s c e n c i a , e t c . ) , o con los aminoácidos que p u d i e r a n participar en e l c e n t r o catalítico.. En catalíticas. de. cuanto l a enzima. a. las. es. necesario. que, en l a mayoría de l o s c a s o s , nes. cinéticas. método. se. de Davis. han. se discutirá más a d e l a n t e. decir. l a s determinacio-. realizado. (31). Este. propiedades. siguiendo. método, t a l y. en e l apartado. el como. corres-. p o n d i e n t e , no p e r m i t e d i f e r e n c i a r. entre. y prunina,. respectivamente,. de las. s u s t r a t o y producto,. l a actividad medidas. de. a-ramnosidasa, actividad. - 20 -. por. naringina l o que. referenciadas. son.

(35) un r e f l e j o de l a d i f e r e n c i a e n t r e e l contenido de n a r i n g i n a más prunina y e l de n a r i n g e n i n a en e l medio de reacción. De i g u a l forma, l a determinación de grupos r e d u c t o r e s como medida de l a a c t i v i d a d enzimática ( 3 2 , 33) refleja una mezcla de l a s dos a c t i v i d a d e s enzimáticas presentes en l a n a r i n g i n a s a , ya que e l método colorimétrico de Nelson-Somogyi no d i f e r e n c i a e n t r e ramnosa y g l u c o s a ( 2 2 , 2 3 ) .. Teniendo en cuenta e s t o s c o n d i cionamientos, l o s datos de l a bibliografía pueden servir para situar aproximadamente las condiciones óptimas para l a expresión de l a a c t i v i d a d de l a enzima así como para establecer, igualmente de forma aproximada, sus parámetros cinéticos. Así, por ejemplo, l a enzima extraída de l a s e m i l l a de apio h i d r o l i za l a naringina " in v i t r o " a pH 7 y 37^0 (17), condiciones que d i f i e r e n b a s t a n t e de l a s encontradas para l a mayoría de l a s prepara^ clones enzimáticas referenciadas : rangos de pH óptimos de 3>5 a 5 > 0 , y de temperatura de. 502. a. 602C. ( 10,. 19,. 20,. 34).. Tal. sucede. para l a n a r i n g i n a s a o b t e n i d a a p a r t i r de Coniot h y r i u m d i p l o d i e l l a que muestra unas c o n d i c i o n e s óptimas que están dentro d e l rango citado : pH 4 j 2 y temperaturas e n t r e 6 0 y 6 5 2 C , a l i g u a l que para l o s estudios r e a l i z a d o s con l a enzima de A s p e r g i l l u s n i g e r , en l o s c u a l e s se o b t u v i e r o n v a l o r e s semejantes (22-25, 35). La c o n s t a n c i a de e s t o s valores se mantuvo también en e l único caso r e f e r e n c i a d o de s e p a r a -. - 21 -.

(36) ción de l a s dos a c t i v i d a d e s de l a n a r i n g i n a s a por electrocromatográfxa (29); se determinó en t a l caso un pH óptimo de 4^5 y una temperatura óptima de ÓO^C para l a a c t i v i d a d O!-ramnosidasa, y un pH de 4^7 y temperatura óptima de 58-C para l a a c t i v i d a d j3-glucosidasa .. Por otra parte, mientras que e x i s t e n m u l t i t u d de r e f e r e n c i a s bibliográficas sobre e l e f e c t o d e l pH d e l medio y de l a tem p e r a t u r a de reacción sobre l a a c t i v i d a d enzimática de l a n a r i n g i n a s a , es muy escasa l a i n f o r m a ción d i s p o n i b l e sobre l a variación de l a a c t i v i dad enzimática con l a c a n t i d a d de enzima, e l p e r i o d o de incubación óptimo o l a e s t a b i l i d a d a l almacenamiento, y n u l a r e s p e c t o a l efecto de l a f u e r z a iónica sobre l a expresión de l a actividad de l a n a r i n g i n a s a .. Por. lo. que. se. refiere. parámetros cinéticos de l a enzima l a parquedad y d i v e r s i d a d. de datos. cos;. que. además,. estos. hay. p r e c a u c i o n e s ya que han s i d o Por ejemplo, se han p u b l i c a d o entre. 35),. mientras. para. velocidad. en de. cuenta pureza. que. 0,64. máxima. v a l o r e s de. y. es. diferente. -. 22. aún. como. 2,20. -. empleando. cada. constansustrato (22-24,. mM de. mayor.. de enzima en. con. de l a s o c a s i o n e s .. l a dispersión. que l a f u e n t e es. bibliográfi-. analizarlos. t e de M i c h a e l i s f r e n t e a n a r i n g i n a comprendidas. es m a n i f i e s t a. obtenidos. e l método Davis en l a mayoría. a los. valores Teniendo. y el. grado. caso,. tales.

(37) r e s u l t a d o s no son de extrañar. Así, para n a r i n ginasa extraída y p u r i f i c a d a de un cultivo de Aspergillus niger, l a actividad máxima c a l c u l a d a fué de 74 U/mg (22, 23), mientras que una preparación c o m e r c i a l de n a r i n g i n a s a de l a misma fuente d i o 78 U/g ( 2 4 ) ; l a p u r i f i c a ción por cromatografía en DEAE-Sephadex y precipitación por a l c o h o l de d i c h a preparación comercial, hizo s u b i r l a a c t i v i d a d hasta 375 U/mg ( 2 4 ) .. Por o t r a p a r t e , cuando se ha hecho a c t u a r l a enzima n a r i n g i n a s a sobre l a n a r i n g i n a - " p r e s e n t e en un jugo o zumo de cítrico, l a o b s e r v a ción g e n e r a l r e a l i z a d a es que se produce un descenso de. l a a c t i v i d a d enzimática. Teniendo. el. interés c o m e r c i a l. algunos efecto. autores de. de l a enzima. han. tratado. ciertos. l o s zumos. Sin. embargo, en l a mayoría. estudio. constantes. sobre. ya o. que. tipos. no. de. se. de. enzimática.. l o s casos,. citan. (26,. 35). valores Así,. y. l a actividad naringinasa,. sacarosa. (25). aunque. otros. o. son. no. e l caso d e l c i t r a t o , ser. claramente. dependiente. 23. -. En. i n h i b i d o r parece. d e l pH. realizó l a medida de a c t i v i d a d ( 1 9 ,. -. sacarosa (25).. inhibidores. e l efecto. (19,. sorbitol. que l a f r u c t o s a ,. málico. de por. e l citrato. a u t o r e s han p u b l i c a d o ácido. el. puramente. inhibición. que. el. particulares. (20, 24, 25),. glucosa. fructosa. inhiben. estudiar. l a actividad. se ha p u b l i c a d o. 25, 26, 35), (26),. de. se ha r e s t r i n g i d o a l aspecto. cualitativo, ejemplo,. naringinasa,. componentes. de. en cuenta. a l que 24,. 35)•. se.

(38) En cuanto a l a s e s p e c i e s que p a r t i c i p a n en l a p r o p i a reacción enzimática, l a ramnosa aparece como un inhibidor poco potente (19, 35) o muy potente ( 3 6 ) dependiendo de l a preparación enzimática u t i l i z a d a , m i e n t r a s que t a n t o l a p r u n i n a ( 3 6 ) como l a n a r i n g e n i n a (19) parecen t e n e r poco e f e c t o i n h i b i d o r sobre l a a c t i v i d a d de l a n a r i n g i n a s a .. Mientras que l a mayoría de l o s i n v e s t i g a d o r e s se han centrado en l a c a r a c t e rización y e s t u d i o de l a s propiedades de l a n a r i n g i n a s a " i n v i t r o " , o t r o s se han dedicado a l e s t u d i o fisiológico de l o s cambios d e l f r u t o con l a disminución d e l contenido de n a r i n g i n a . Así, se ha e s t u d i a d o ( 3 7 , 38) l a p o s i b i l i d a d de desamargar e l f r u t o "in situ", inoculándolo con naringinasa, prestándose tambie'n atención a l o s cambios en e l aroma y t e x t u r a d e l mismo que acompañan d i c h o t r a t a miento. S i n embargo e s t a técnica ha tenido poca aceptación y raramente es u t i l i z a d a en l a práctica.. -. 24. -.

(39) 2.5.-. MÉTODOS DE MEDIDA DE LA ACTIVIDAD. CATALÍTICA. La medida de la actividad n a r i n g i n a s a i m p l i c a l a determinación i n d i v i d u a l i zada de l a s a c t i v i d a d e s Oí-ramnosidasa y j g - g l u c o s i dasa, y l a cuantificación de l a contribución de cada una de e l l a s a l a a c t i v i d a d global de l a enzima. Este es un hecho que h a b i t u a l m e n t e no se e s p e c i f i c a en l a bibliografía cuando se h a b l a de l a a c t i v i d a d n a r i n g i n a s a .. La actividad O! -ramnosidasa se puede d e t e r m i n a r s i g u i e n d o l a desaparición de n a r i n g i n a , o l a aparición de p r u n i n a o ramnosa en e l medio ( s i se emplea e l s u s t r a t o n a t u r a l n a r i n g i n a ) , m i e n t r a s que l a a c t i v i d a d j3-glucosidasa se podría seguir a través de la desaparición de p r u n i n a o aparición de g l u c o s a y n a r i n g e n i n a , s i n embargo, para esta última a c t i v i d a d se ha recurrido frecuentemente a l uso de sustratos sintéticos, tipo salicina ( f e n i l - j(3 -0-glucopiranósido) u o - n i t r o f e n i l - jQ -D-glucopiranósido.. El. seguimiento. de. l a actividad. OL -ramnosidasa. la. aparición. ramnosa. de. cabo mediante e l uso de adicional, permite de. la. seguir. ramnosa. se un. ramnosa la. a. través. podría sistema. llevar. aparición. la. a que. producción. acoplada. NADH ( 3 9 ) . La mayor d e s v e n t a j a d e l método. - 25 -. de. enzimático. deshidrogenasa,. fotométricamente. por. exclusivo. de. estriba.

(40) , así en e l elevado c o s t e d e l c o f a c t o r NAD de emplear como e l o r i g i n a d o por l a n e c e s i d a d una enzima a d i c i o n a l , por l o que su uso no está estudiado.. Sin embargo, e l método más ampliamente u t i l i z a d o en l a determinación de l a a c t i v i d a d n a r i n g i n a s a es e l propuesto por Davis (3l)j o algunas de sus modificaciones ( 4 0 , 4 1 ) . E l método Davis se basa en l a formación de un producto c o l o r e a d o cuando r e a c c i o n a n a r i n g i n a con d i e t i l e n g l i c o l en un medio fuertemente a l c a l i no. Dicha coloración se puede medir fotométricament e a 410 nm y su i n t e n s i d a d es p r o p o r c i o n a l a l contenido en n a r i n g i n a de l a muestra. La naringenina, producto final de l a a c t i v i d a d hidrolítica de n a r i n g i n a s a , desarrolla mucho menos c o l o r en l a s mismas c o n d i c i o n e s , por l o que según D a v i s , es p o s i b l e s e g u i r e l curso de l a hidrólisis de n a r i n g i n a por comparación del c o l o r con l a s c u r v a s estándar preparadas a p a r t i r d e l ramnoglucósido y d e l aglicón a un temperatur a dada. S i n embargo, o t r a s muchas s u s t a n c i a s i n t e r f i e r e n dando e l mismo c o l o r , t a l e s como flavonas, flavonoles, c i t r a l , f u r f u r a l , geraniol, etc., e incluso e l producto de la primera a c t i v i d a d de n a r i n g i n a s a , p r u n i n a , por l o que e l t e s t de Davis no es un método f i a b l e para l a caracterización de l a a c t i v i d a d 01 -ramno s i d a s a , ya que l o s r e s u l t a d o s que se o b t i e n e n r e f l e j a n l a desaparición de n a r i n g i n a y prun i n a de forma c o n j u n t a . E s t a limitación, que es importante p o r cuanto lo que se mide es un reflejo de la actividad global de. - 26 -.

(41) n a r i n g i n a s a , y específicamente de l a a c t i v i d a d j8 - g l u c o s i d a s a , ya que e s t a a c t i v i d a d es l a l i m i t a n t e de v e l o c i d a d en e l proceso de hidrólisis t o t a l , ha s i d o c o n s i d e r a d a desde hace mucho tiempo (20) como una c l a r a d e s v e n t a j a d e l método de Davis en su aplicación a l a determinación de l a actividad naringinasa, y curiosamente es e l método que más se ha empleado y aún se s i g u e empleando para t a l f i n .. La. i n t e r f e r e n c i a de l a p r u n i n a se ha e l i m i n a d o mediante extracción s e l e c t i v a de este componente en a c e t a t o de e t i l o (40), aplicándose p o s t e r i o r m e n t e e l test de Davis a l a mezcla de reacción a s i t r a t a d a . S i n embargo, e l problema s i g u e siendo e l mismo, por cuanto s o l o se mide l a a c t i v i d a d g l o b a l de l a n a r i n g i n a s a .. Para han. aparecido. solventar. diversas. estos. problemas,. alternativas. basadas. e s e n c i a l m e n t e en l a separación de l o s componentes de. l a reacción. (29,. 42,. los. 43). productos. de. Davis,. para. cada. por cromatografía. de. y. posterior. c u a n t i f icación. separados,. ahora uno. ya de. bien. por. s i n ninguna. capa el. fina de. método. interferencia. l o s flavonoides,. bien. por. e s p e c t r o f otometría a 280 ntn ^ o por f l u o r o d e n s i t o metría, que mide de. fluorescencia. directamente. las. en e l cromatograma. intensidades (36).. Pero. t o d o s e l l o s son métodos muy l a b o r i o s o s y c o m p l i c a dos,. s i n dejar. tediosas. aún. de e s t a r son. las - 27. sujetos técnicas -. a. error.. que. Más. implican.

(42) dos experimentos c o n s e c u t i v o s para l a obtención de un único valor de actividad enzimática, como l a combinación d e l método clásico de Davis y l a determinación d e l c o n t e n i d o en aldohexosas l i b e r a d a s en l a reacción con o - a m i n o d i f e n i l o (32,. 33).. Sin duda alguna, e l método mas p r e c i s o de l o s que actualmente se emplean para cuantificar e l contenido en naringina de cítricos y demás productos d e r i v a d o s , es l a cromatografía líquido-líquido de a l t a r e s o l u ción (IIPLC), pero su gran problema es e l elevado c o s t e económico que implica su utilización. Fué en 1974 (44) cuando se publicó l a p r i m e r a aplicación práctica de HPLC en análisis de f l a v o n o i d e s . En e s t e método es e s e n c i a l e l uso d e l e l u y e n t e adecuado; l o s primeros u t i l i z a d o s f u e r o n mezclas metanol-ácido acético-agua ( 3 0 : 5 : 6 5 V/V) sobre una columna de C^g adecuada para l a resolución de e s t o s f l a v o n o i d e s . P o s t e r i o r m e n t e , se ha r e a l i z a d o una modificación de e s t e método ( 4 5 ) , u t i l i z a n d o una columna /x Boundapak Cj^g y como e l u y e n t e una mezcla a g u a - a c e t o n i t r i l o ( 8 0 : 2 0 , V/V); de e s t a manera se o b t i e n e n v a l o r e s para l a concentración de n a r i n g i n a en e l pomelo y sus d e r i v a d o s , que son aproximadamente e l d o b l e de l a s encontradas u t i l i z a n d o elTmétodo D a v i s . Actualmente, t o d a s l a s r e f e r e n c i a s b i b l i o - g r a f i c a s que se encuentran a c e r c a de l a c u a n t i f i c a ción de n a r i n g i n a y o t r o s f l a v o n o i d e s en zumos y d e r i v a d o s cítricos, hacen uso de l a técnica de cr£ matografía líquida de a l t a resolución ( 4 6 - 5 3 ) -. - 28 -.

(43) 2.6.-. NARINGINASA INMOVILIZADA. La adición de preparaciones c o m e r c i a l e s de n a r i n g i n a s a a zumos y jugos cítricos para proceder a s u desamargado, p l a n t e a algunos problemas. En p r i m e r l u g a r , e l producto final se encuentra contaminado por l o s p r o p i o s componentes de l a preparación enzimática, p e c t i n a s a s principalmente; e l l o , y l a inhibición de l a a c t i v i d a d enzimática por l o s p r o p i o s productos de l a reacción, así como por l o s componentes d e l medio de reacción, supone un c o s t o a d i c i o n a l a l uso de n a r i n g i n a s a en forma soluble para e l desamargado de zumos y demás d e r i v a d o s cítricos.. La. inmovilización. de l a enzima. en s o p o r t e s sólidos por e n l a c e s físicos o químicos o bien. su retención por medio. o un medio poroso permitiría si. no. todas,. A pesar referencias son. sobre. una. membrana. solventar. l a s desventajas. e l uso de l a enzima s o l u b l e. de. algunas,. mencionadas. para. (54).. de e l l o ,. inmovilización. relativamente recientes.. l a s primeras de. En 1971. naringinasa se. publicó. e l primer artículo sobre l a obtención de d e r i v a d o s insolubles enzima. en. agua. se inmovilizó. de. naringinasa. (55).. La. por oclusión en copolímeros. -. 29. -.

(44) de anhídrido maleico con d i s t i n t o s etilenos s u s t i t u i d o s y hexametilendiamina. Los d e r i v a d o s inmovilizados mostraron una disminución de l a a c t i v i d a d enzimática d e l 55-85^ como consecuenc i a de l a inmovilización y además perdían e l 90% de l a a c t i v i d a d cuando actuaban de forma c o n t i n u a sobre zumos de cítricos. En l o s c i n c o años p o s t e r i o r e s se han patentado distintos s i s t e m a s de n a r i n g i n a s a i n m o v i l i z a d a para desamargar zumos de pomelo con poco rendimiento (5Ó59) debido t a n t o a l a b a j a a c t i v i d a d y e s t a b i l i d a d de l o s d e r i v a d o s obtenidos como a l hecho de que l a n a r i n g i n a se adsorbía a l o s s o p o r t e s usados.. Los mejores resultados se han o b t e n i d o cuando se ha i n m o v i l i z a d o n a r i n g i n a s a b i e n por adsorción en DEAE-Sephadex (22), o en t a n i n o - a m i n o h e x i l c e l u l o s a (23), o b i e n por unión c o v a l e n t e a v i d r i o poroso con g l u t a r a l d e h i d o (24) o a q u i t i n a usando g l u t a r a l d e h i d o y b o r o h i druro sódico ( 3 5 ) .. Todos e s t o s d e r i v a d o s dos. presentaron. cuando de. buena. actuaron. naringina;. estabilidad. sobre. amarga. jugos usada. s i n embargo,. de N a t s u d a i d a i , comúnmente. operacional. disoluciones dicha. decreció drásticamente cuando sobre. inmoviliza-. estabilidad. se l e s h i z o variedad. para. acuosas. de. actuar naranja. l a obtención. de. zumos. De t o d a s formas, e l mejor de l o s d e r i v a d o s de. naringinasa. obtenidos. - 30. se d i o. -. cuando. se.

(45) usó como soporte tanino-aminohexilcelulosa. E l d e r i v a d o obtenido permitió desamargar I6OO t o n e l a d a s de jugo de N a t s u d a i d a i durante un mes, usándose para t a l f i n un r e a c t o r de l e c h o f i j o con 50 kg de d e r i v a d o i n m o v i l i z a d o .. La disminución de l a a c t i v i d a d observada cuando se u t i l i z a n a r i n g i n a s a i n m o v i l i zada para desamargar zumos cítricos, se debe probablemente a una o v a r i a s de l a s causas s i g u i e n t e s : contaminación física d e l c a t a l i z a d o r , inhibición de l a enzima por algunos compuestos p r e s e n t e s en e l zumo ( p o r ejemplo citrato o g l u c o s a ) o por l a desorción de l a enzima d e l s o p o r t e . Últimamente, e s t e problema de pérdida de enzima se ha s o l v e n t a d o ocluyendo l a enzima en membranas de f i b r a s huecas polisulfónicas anisotrópicas ( I 3 j 6 0 ) , siendo l o s r e s u l t a d o s o b t e n i d o s , a n i v e l de l a b o r a t o r i o , muy esperanzadores.. En de. naringinasa. anteriormente, a. l a enzima. general,. en se. los ha. por. pH. por una. óptimo. de. de. actuación. l a estabilidad. Michaelis. consecuencia. de. no. lO-lS^C y. la. mostró. todos. actividad,. alterado,. en l a. de dos. en. veces. La. 31. -. superior. constante. los. y. temperatura. casos. inmovilización,. -. respecto. ampliación d e l. resultó. térmica.. disminuyó. mencionados. caracterizado,. soluble,. un incremento. óptima en. su. inmovilización. soportes. rango de pH en e l que l a enzima aunque. la. de como. variando.

(46) e n t r e 0^48 y 0 , 8 6 mM para e l s u s t r a t o n a r i n g i n a .. Como ya se ha d i c h o , l a c a r a c t e rística más importante d e l uso de l o s d e r i v a d o s de naringinasa inmovilizada descritos en l a bibliografía, r e s i d e en l a pérdida brusca de actividad operacional a l actuar sobre zumos naturales o r e c o n s t i t u i d o s . Es, por tanto, necesario obtener d e r i v a d o s inmovilizados que aseguren l a unión de l a enzima al soporte a través d e l s u f i c i e n t e número de e n l a c e s coval e n t e s de t a l forma que se m i n i m i c e l a pérdida de enzima y, a l a v e z , permitan mantener l a conformación n a t i v a de l a misma con l a s u f i c i e n t e f l e x i b i l i d a d como para p e r m i t i r l a acción catalítica.. 2.1.-. DIFUSIÓN Y REACCIÓN EN SISTEMAS DE ENZIMAS INMOVILIZADAS. La s i m i l i t u d fenomenológica de l o s sistemas. catalíticos heterogéneos. en. ingeniería. química ( 6 l , 62) con l o s b i o c a t a l i z a d o r e s. inmovi-. l i z a d o s en biotecnología ( 6 3 - 6 5 ) ha s i d o i m p o r t a n te. cara. de. estos. los. a l desarrollo últimos.. factores. cinético. es. del. El. interés. que i n f l u y e n en debido. a l uso. biocatalizadores inmovilizados con. fines. análisis su. en. cinético investigar. comportamiento. creciente. de. los. (células y enzimas). analíticos. y. sintéticos. -. 32. -. (66,. 67)..

(47) Hay que hacer n o t a r , que l o s e s t u d i o s de enzimas inmovilizadas son importantes^ además, para comprender e l comportamiento " i n vivo " de c i e r t a s enzimas, dado que muchas de e l l a s actúan embebidas en membranas o adosadas a partículas s u b c e l u l a r e s . Así, con e l a u x i l i o de modelos s i m p l e s en l o s c u a l e s l a s enzimas están a t r a p a d a s en, o a d h e r i d a s a , s o p o r t e s sintéticos o membranas es p o s i b l e d e s c r i b i r y e s t u d i a r fenómenos s i m i l a r e s a l o s que t i e n e n l u g a r en s i s t e m a s n a t u r a l e s (68,. 69).. La velocidad de conversión del s u s t r a t o por enzimas inmovilizadas tanto en s i s t e m a s n a t u r a l e s como a r t i f i c i a l e s , depende de l a v e l o c i d a d de t r a n s f e r e n c i a d e l s u s t r a t o h a s t a e l i n t e r i o r de l a partícula biocatalítica donde se encuentran l o c a l i z a d a s l a s moléculas de enzima; y l a v e l o c i d a d así observada y medida, puede s e r c o n s i d e r a b l e m e n t e d i s t i n t a a l a v e l o c i dad correspondiente a l a misma c a n t i d a d de enzima pero en d i s o l u c i o n e s homogéneas. Además, cuando una enzima está u n i d a a un s o p o r t e sólido, e l modelo cinético d e l proceso también puede cambiar c o n s i d e r a b l e m e n t e , l o que conduce a cambios en l o s v a l o r e s de l o s parámetros cinéticos K.,vV.,.^ . La ecuación cinética M ^ MAX s i s t e m a s es difícil de o b t e n e r , complicado. cuantificar. real. de. ya que. parámetros. tales resulta. tales. como. cambios en l a conformación de l a misma provocados por. la. que. rodea. modificación. química^. a l a molécula. estéricos de l a m a t r i z , sobre. l a acción. de enzima, efectos. catalítica,. difusión i n t e r n a y e x t e r n a . -. microambiente. 33. -. impedimentos. d e l microentorno o. efectos. de l a.

(48) Por ello, los parámetros cinéticos observados son sólo e f e c t i v o s , s i e n d o r e f l e j a d o s a s u vez por e l uso de c o n s t a n t e s cinéticas aparentes K y V .. Al. considerar una reacción catalizada por enzimas inmovilizadas, hay que t e n e r en cuenta, fundamentalmente, tres etapas a través de l a s c u a l e s e l sustrato se c o n v i e r t e en p r o d u c t o . En primer lugar, e l s u s t r a t o que se encuentra en e l seno de l a disolución e x t e r n a a l a partícula de d e r i v a d o , debe ser transportado hasta la superficie d e l s o p o r t e donde se encuentra inmovilizada l a enzima. A continuación, e l s u s t r a t o debe d i f u n d i r s e a través de l o s poros de l a partícula, p a r a , f i n a l m e n t e s e r c o n v e r t i d o enzimáticamente en p r o d u c t o . E l p r o d u c t o así formado, deberá d i f u n d i r s e a su vez h a s t a l a s u p e r f i c i e e x t e r i o r del soporte, siendo entonces transportado h a s t a e l seno de l a disolución ( 7 0 ) .. Si inmovilizada de a. sólo. la en. enzima la. la. externa;. superficie. encuentra. superficie. l a partícula, únicamente l a difusión. se. existe. s i , por. catalíticamente. s i t u a d a también en e l i n t e r i o r. exterior resistencia. el. contrario,. activa. está. de l a partícula,. l a v e l o c i d a d de conversión puede. estar. limitada. i n d i s t i n t a m e n t e por una r e s i s t e n c i a a l a difusión e x t e r n a ^ por una (71)'. Estos. interna. fenómenos,. -. Oj i n c l u s o ^ por muchas. 34. -. veces,. no. ambas son.

(49) r e c o n o c i d o s por l o s i n v e s t i g a d o r e s , pudiendo causar marcadas d i f e r e n c i a s en l a medida de propiedades cinéticas que todos e l l o s r e a l i c e n .. M i e n t r a s que l a s l i m i t a c i o n e s d i f u s i o n a l e s e x t e r n a s son frecuentemente pequeñas y pueden hacerse despreciables mediante una e f i c i e n t e mezcla d e l seno de l a disolución, e l efecto de l a difusión i n t e r n a soV^re e l comportamiento cinético de l a s enzimas i n m o v i l i zadas en un s o p o r t e poroso puede s e r muy s i g n i f i c a t i v o . A menudo, l a mejor manera de r e d u c i r experimentalmente las limitaciones difusionales internas, consiste en disminuir el tamaño de l a s partículas d e l s o p o r t e o l a a c t i v i d a d del derivado inmovilizado. Así, l a i n f l u e n c i a de l a difusión i n t e r n a se ha demostrado v a r i a n d o e l espesor de una película de i i o l i a c r i l a m i d a (72) y membranas de colodión ( 7 3 ) o e l diámetro de l o s poros de partículas de vidrio (74) y Sephadex ( 7 5 ) , que se han usado como s o p o r t e s de l a s enzimas. En c o n c o r d a n c i a con l a teoría, un aumento en l a longitud característica, determina l a correspondiente disminución en e l f a c t o r de e f i c a c i a . S i n embargo, en algunos c a s o s , e s t a s a l t e r n a t i v a s no son c o n v e n i e n t e s o posibles, y es p r e f e r i b l e entonces usar técnicas que permitan c a l c u l a r l a s constantes cinéticas intrínsecas a p a r t i r de datos o b t e n i d o s en condiciones de limitaciones difusionales internas.. -. 35. -.

(50) En estas condiciones, se han propuesto métodos de cálculo para d e t e r m i n a r l o s v a l o r e s intrínsecos de v e l o c i d a d máxima y c o n s t a n t e de M i c h a e l i s , métodos que han s i d o r e c o p i l a d o s por algunos autores (65). Debido a l a c o m p l e j i d a d d e l t r a t a m i e n t o matemático, no r e s u l t a sorprendente que todos e s t o s métodos p r e s e n t e n d i f i c u l t a d e s cuando se p r e t e n den a p l i c a r . Uno de l o s casos ( 7 6 ) , por ejemplo, se cumple sólo s i l a representación de l o s datos e x p e r i m e n t a l e s por l o s métodos gráficos estándar conduce a l i n e a s r e c t a s , resultado que no siempre se puede a l c a n z a r ( 7 7 , 78). En o t r a s o c a s i o n e s ( 7 9 ) , se puede d e t e r m i n a r l a v e l o c i d a d máxima intrínseca, sólo s i p r e v i a mente se conoce l a constante de M i c h a e l i s intrínseca.. Los empleados los a. (77,. 78,. métodos 80,. 8l). que l a v e l o c i d a d máxima. e l e v a r l a concentración. seno. de. l a disolución. más son. comunmente aquellos. se e s t i m a de. sustrato. hasta. niveles. en. en base en e l a. los. que l a enzima i n m o v i l i z a d a se e n c u e n t r a s a t u r a d a , independientemene de l a s l i m i t a c i o n e s les.. Obviamente,. este. difusiona-. procedimiento. presenta. d i f i c u l t a d e s de a p l i c a b i l i d a d. cuando. con. insolubles. sustratos. relativamente. enzimas que p r e s e n t a n un v a l o r Adicionalmente,. para. se t r a b a j a elevado.. la. , estas. determinar. de puntos e x p e r i m e n t a l e s a b a j a s sustrato,. en. cuyo. caso. -. 36. elevado. concentraciones. las. -. con. de K'^^. técnicas r e q u i e r e n d i s p o n e r de un número de. o. limitaciones.

(51) difusionales son n o t a b l e s . El de e s t a condición se h a l l a además experimentalmente, ya que las de reacción observadas en e s t a s son pequeñas y por l o t a n t o d i f a ' c i l e s nar .. cumplimiento dificultado velocidades condiciones de d e t e r m i -. Otra p o s i b i l i d a d para evaluar l o s parámetros cinéticos intrínsecos estriba en p a r t i r de datos experimentales obtenidos operando en un r e a c t o r i n t e g r a l , es decir, con una conversión de salida elevada s i n necesidad de r e c i c l o , abarcando un rango l o s u f i c i e n t e m e n t e amplio de caudales y c o n c e n t r a c i o n e s de s u s t r a t o . S i n embargo es n e c e s a r i o d i s p o n e r de un modelo de diseño d e l r e a c t o r que considere adecuadamente la interacción e x i s t e n t e e n t r e l a reacción y l a difusión i n t e r n a . Este método se basa en minimizar l a suma de l o s cuadrados de l a s d i f e r e n c i a s e x i s t e n t e s e n t r e l a s p r e d i c c i o n e s d e l modelo y l o s resultados experimentales, según una función de l a forma :. O" =. fc. (X.i (.model) ^ H^ -. X.X (exp) ,. (1). '. donde X. , \ es l a conversión p r e d i c h a por e l 1 (model) modelo, X^^^^ ^ es l a o b t e n i d a experimentalmente y. n. es e l número de experimentos. r e a l i z a d o s . La. s e r i e de v a l o r e s de l o s parámetros cinéticos que. - 37 -.

(52) minimizan l a función (j es c o n s i d e r a d a estadísticamente l a mejor ( 6 5 ) .. como. Los e f e c t o s de l a t r a n s f e r e n c i a de m a t e r i a dentro de una e s t r u c t u r a porosa f u e r o n a n a l i z a d o s c u a n t i t a t i v a m e n t e por p r i m e r a vez por T h i e l e en Estados Unidos, Damkohler en Alemania y Z e l d o v i t c h en R u s i a , en e l p e r i o d o comprendido e n t r e l o s años 1937 y 1939 (82). E l r e s u l t a d o más i m p o r t a n t e de e s t o s análisis es l a descripción cuantitativa del factor que determina l a e f i c a c i a de un c a t a l i z a d o r . E l f a c t o r de e f i c a c i a , generalmente denominado 1] , se d e f i n e como l a relación e n t r e l a v e l o c i dad de reacción r e a l observada y l a que se mediría en a u s e n c i a de e f e c t o s d i f u s i o n a l e s . Este parámetro se emplea normalmente para d e t e r m i n a r s i l a s r e a c c i o n e s químicas o bioquímicas que usan c a t a l i z a d o r e s que se encuentran en un s o p o r t e sólido poroso, se h a l l a n l i m i t a d a s por difusión en e l poro y/o en l a partícula.. Los modelos de enzimas i n m o v i l i zadas que se han usado p a r a d e s c r i b i r vamente con. l a interacción. l a difusión. usualmente, o. a. a. partículas. de l a reacción. interna. una. cuantitati-. se. membrana. han. restringido,. porosa (85),. esféricas. química. (83,. 84),. conteniendo. una enzima d i s t r i b u i d a uniformemente. A f o r t u n a d a mente,. estos. modelos. pueden. a partículas de d i f e r e n t e s formas. irregulares,. geometrías. siempre. -. 38. generalizarse. -. que. e. incluso. se. defina.

(53) correctamente los. l a longitud. mismos ( 8 6 ) . E n. característica. tales. casos,. se. de. plantea. una ecuación d i f e r e n c i a l no l i n e a l , que únicamente. tiene. soluciones. analíticas. en. l o s casos. límite de cinéticas de orden cero y uno, o b t e n i e n dose. l a s siguientes. expresiones. para. e l factor. de e f i c a c i a en ambos casos (74) : Cinética de primer orden :. 1 =. 0. \ tanh 0. 0. Cinética de orden c e r o :. = 1. V=. 1. s i. - PI. 0 ^ A/Ó^ 0. si. >Y. 6/^'. donde :. D e f f . K' M. ^SR. -. 39. -.

(54) 1/2 (1+ p^) -. Bajo ecuaciones. estos. obtenidas. de. reacción. de. sustrato. a. para. bajas. supuestos,. las. l a velocidad. y. altas. global. concentraciones. son^ e s e n c i a l m e n t e ,. las. mismas. que l a s formuladas en l a bibliografía de i n g e n i e (87-91)•. ría química. Sin se. desea. cinética propuesto. analizar del. tipo. embargo, el. cuando. completo. de. Michaelis-Menten,. expresiones. de d e s a r r o l l o s. rango. para. en s e r i e. analíticas (92,. 93),. se en. la han. forma. aunque. estos. r e s u l t a d o s son de v a l o r l i m i t a d o en l a práctica. De hecho y muy. frecuentemente,. l a s ecuaciones. d i f e r e n c i a l e s que se o b t i e n e n han s i d o mediante. cálculo. numérico,. y. l o s resultados. presentados en términos de c a n t i d a d e s n a l e s de modo que l a interacción. resueltas adimensio-. de l a difusión. i n t e r n a con l a reacción química v i e n e. caracteri-. zada por módulos a d i m e n s i o n a l e s . Algunos a u t o r e s , han. definido. una. función. (76, los. e s t o s módulos de manera de. l a concentración. 8 4 ) , mientras. que. en. módulos se han hecho -. 40. otros. depender, -. de. que. sean. sustrato. tratamientos solamente,.

(55) de. parámetros. cinéticos. y. de. transporte. (94. -97).. La mayoría de l o s i n v e s t i g a d o r e s han r e s u e l t o e l problema de reacción química con limitaciones difusionales internas en e l caso de que l a reacción enzimática obedezca a una cinética d e l t i p o M i c h a e l i s - M e n t e n s i m p l e . En e s t o s casos l o s r e s u l t a d o s se p r e s e n t a n , normalmente, en forma de c u r v a s g e n e r a l i z a d a s d e l f a c t o r de e f i c a c i a f r e n t e a dos módulos adimensionales que engloban l a s constantes cinéticas intrínsecas, l a d i f u s i v i d a d efectiva y l a concentración de s u s t r a t o ( 8 4 , 9 8 ) .. El factor de eficacia es e l parámetro cuya determinación p r e s e n t a mayores d i f i c u l t a d e s , s i b i e n en algunos casos d e t e r m i n a dos se ha r e c u r r i d o a soluciones ingeniosas o p a r t i c u l a r e s para su obtención. Por ejemplo, Moo-Young y Kobayashi (84) han o b t e n i d o una expresión para e l f a c t o r de e f i c a c i a , en función de l o s que se pueden d e d u c i r en l o s casos límite de cinéticas de orden c e r o y uno, d i c h a expresión adopta l a s i g u i e n t e forma :. ''o. *.

(56) donde:. f a c t o r de e f i c a c i a p a r a cinética de orden c e r o . I. f a c t o r de e f i c a c i a p a r a cinética de primer orden.. Este método aproximado simplifica e l cálculo de l o s f a c t o r e s de e f i c a c i a para cinéticas d e l t i p o M i c h a e l i s - M e n t e n s i m p l e , puesto que e v i t a e l uso de métodos numéricos de resolución y, según sus a u t o r e s , p r o p o r c i o n a v a l o r e s de 7] que no se desvían de forma o s t e n s i b l e con l o s o b t e n i d o s mediante l a resolución de l a ecuación d i f e r e n c i a l por cálculo numérico. Los r e s u l t a d o s de l a s s i m u l a c i o n e s de o t r o s a u t o r e s p e r m i t e n obtener l o s p e r f i l e s de concentración en e l i n t e r i o r de l a s partículas de c a t a l i z a d o r ( 9 9 ) .. Sin sistemas una. bioquímicos. cinética. son de gran más c o m p l e j a s. embargo, pueden. del tipo. y. aunque. caracterizarse. Michaelis-Menten. importancia otros tipos tales. muchos por. simple,. de cinéticas. como a q u e l l a s que c o n s i d e r a n. inhibición por s u s t r a t o , por p r o d u c t o s o r e a c c i o n e s r e v e r s i b l e s . En e s t o s casos l a ecución que d e s c r i b e l a interacción la por. difusión. interna. tiene. de. diferencial. l a reacción. con. que r e s o l v e r s e también. métodos numéricos más o. menos. sofisticados,. y l o s módulos a d i m e n s i o n a l e s d e f i n i d o s se c o m p l i c a n más que en e l caso de l a cinética M i c h a e l i a n a .. - 42. -.