Estudio de la apoptosis y proliferación celular en los linfomas no hodgkinianos: valor, diagnóstico y pronóstico

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(1)Departament de Medicina Facultat de Medicina Universitat de Lleida. ESTUDIO DE LA APOPTOSIS Y PROLIFERACIÓN CELULAR EN LOS LINFOMAS NO HODGKINIANOS. VALOR DIAGNOSTICO Y PRONOSTICO.. Tesis realizada por: Josep Macià i Virgili para optar al grado de Doctor en Medicina y Cirugía Lleida, 1996..

(2) ie n. Lleida. Registre Generai. Departament de Medicina Facultat de Medicina Universitat de Lleida. ESTUDIO DE LA APOPTOSIS Y PROLIFERACIÓN CELULAR EN LOS LINFOMAS NO HODGKINIANOS. VALOR DIAGNOSTICO Y PRONOSTICO.. ii x/. Tesis realizada por: Josep Macià i Virgili para optar al grado de Doctor en Medicina y Cirugía Lleida, 1996..

(3) "... las células están programadas para suicidarse y necesitan señales de las otras células del entorno para sobrevivir...". A Begoña, David, Elena y Ignasi.

(4) Agradecimientos.. - A los Directores de esta Tesis Dr. Elias Campo y en especial al Dr. Xavi Gómez , con quien comencé la investigación en esta área y cuya ayuda ha resultado imprescindible para realizar esta tesis. - A la Universidad de Lleida bajo cuyos auspicios y soporte económico, ha sido posible realizar este trabajo. - A todas las personas que trabajan en el Servicio de Hematologia y Hemoterapia, del Hospital Universitario Arnau de Vilanova, por su paciencia y constante ayuda. - A todo el Servicio de Anatomia Patológica del Hospital Universitario Amau de Vilanova por su colaboración y soporte incondicional. - A la Sección de Proteínas del Servicio de Análisis Clínicos del Hospital Universitario Arnau de Vilanova por su cooperación en el tema de marcadores tumorales. - A mi amigo Jaume Roca Vallespí por sus consejos y estímulos..

(5) INDICE 1-Introducción 1.1.- Los linfomas no Hodgkinianos. 1 1. 1.1.1.- Clasificación histológica de los LNH. 2. 1.1.2.-Factores pronósticos en LNH. 6. 1.1.2.1.- Factores pronósticos directamente relacionados con el linfoma. 7. 1.1.2.2.- Factores relacionados con el huésped. 11. 1.1.2.3.- Factores relacionados con el tratamiento. 11. 1.2.-Apoptosis. 11. 1.2.1.-Cambios metabólicos durante la apoptosis. 14. 1.2.2.-Proliferación y apoptosis. 15. 1.3.-Oncogenes. 16. 1.3.1.-Protooncogenes con ganancia de función. 17. 1.3.2.-Genes supresores de tumores. 18. 1.3.3.- Genes reguladores de muerte celular programada. 18. 1.3.4.- Mecanismos de transformación. 19. 1.4.-Citometríadeflujo. 20. 1.4.1- Características generales de los citómetros de flujo. 22. 1.4.2.- Procesamiento de las muestras. 25. 1.4.3.- Fluorocromos y procesamiento de datos. 26. 1.4.4.- Estudio del contenido en ADN y fases del ciclo celular por citometría de flujo. 27. 1.4.5.- Estudio de la aneuploidía y del ciclo celular. 28. 1.5.- Técnicas inmunocitquímicas del estudio de la muerte y proliferación celular. 30. 1.5.1- Técnicas inmunológicas: Introducción. 30. 1.5.2.- Estudio de la proliferación celular Introducción. 30. 16.- Estudio del contenido en AON y de la proliferación celular en linfoma 2.-Hipótesis y objetivos. 31 34.

(6) 2.1.-Hipótesis. 34. 2.2.-Objetivos. 34. 3.- Material y métodos. 37. 3.1- Pacientes y variables de estudio. 37. 3.2.- Métodos y técnicas. 40. 3.2.1.-CÍtometría de flujo. 40. 3.2.2.-Inmunohistoquímica. 45. 4.-Resultados 4.1.- Estadística descriptiva univariante. 49 49. 4.1.1.- Edad y sexo. 49. 4.1.2.-Performance (ECOG). 49. 4.1.3.-Síntomas B. 50. 4.1.4.-Estadio de Ann-Arbor.... 50. 4.1.5.-Localización del tumor primario. 50. 4.1.6.- Tamaño mayor de la tumoración. 51. 4.1.7.- Grado histológico de malignidad. 51. 4.1.8.-Inmunofenotipodeltumor. 51. 4.1.9.- LDH sérica, beta-2-microglobulina sérica y alfa-TNF sérico. 52. 4.1.10.-Apoptosis. 52. 4.1.11.- Porcentaje de células en fase S. 53. 4.1.12.- Contenido en ADN. 53. 4.1.13.-Indices pronósticos. 54. 4.1.13.1- IPI edad dependiente. 54. 4.1.13.2.- IPI edad independiente. 54. 4.1.14.-Tipo de tratamiento. 54. 4.1.15.-Tolerancia al tratamiento. 55. 4.1.16.- Respuesta al tratamiento. 55. 4.1.17.-Recaída. 56. 4.1.18.- Seguimiento y supervivencia. 56. 4.2.- Estadística analítica bivariante. 57. 4.2.1.- Apoptosis y presentación clínica del LNH. 57. 4.2.2.- Proliferación y presentación clínica del LNH. 59.

(7) iii. 4.2.3.- Apoptosis, proliferación celular y masa tumoral. 61. 4.2.4.- ApoptosJs, proliferación tumoral y otros marcadores tumorales en LNH. 61. 4.2.5.- Apoptosis, proliferación e Indice Pronostico Internacional. 61. 4.2.6.-Apoptosis y evolución de la enfermedad. 62. 4.2.7.- Proliferación celular y evolución de la enfermedad. 63. 4.2.8.- Estudio de la relación entre si de las diferentes variables clínico-patológicas y evolución de la enfermedad. 63. 4.2.9.- Relación entre origen del tumor, respuesta al tratamiento y recaída. 64. 4.2.10.- Estudio estadístico Divariante de otras variables. 65. 4.3.- Estudio de series temporales: tiempo libre de enfermedad y tiempo de supervivencia. 66. 4.3.1.- Estudio de supervivencia Divariante. 66. 4.3.2.- Tiempo libre de enfermedad. 69. 4.4.-Análisis estadístico multivariante. 71. 4.4.1.- Estudio de la distribución de apoptosis en relación con grado histológico y origen del tumor. 71. 4.4.2.- Distribución del porcentaje de fase S en relación con tipo histológico y origen del tumor. 71. 4.4.3.- Distribución de apoptosis en relación con el grado histológico y la respuesta al tratamiento. 71. 4.4.4.- Relación de la fase S con la respuesta al tratamiento en los distintos tipos histológicos. 72. 4.4.5.- Estudio de la relación entre los valores de apoptosis y proliferación con los Estadios de Ann-Arbor en función del grado histológico. 72. 4.4.6.- Relación entre apoptosis y fase S. 73. 4.4.7.- Supervivencia y tiempo libre de enfermedad, estudio multivariante. 73. 4.4.8.- Predicción de la respuesta al tratamiento. 76. 4.4.9.- Ausencia de apoptosis y tiempo libre de enfermedad. 78.

(8) iv. 5.-Discusión. 79. 5.1.- Consideraciones previas sobre la serie. 79. 5.2.- Consideraciones sobre el estudio del contenido de ADN. 80. 5.3.- Consideraciones de la apoptosis. 81. 5.4.- Apoptosis y grado histológico de malignidad. 81. 5.5.-Apoptosis y localización de origen del tumor. 82. 5.6.- Proliferación celular y grado histológico. 82. 5.7.- Proliferación celular y localización de origen del tumor. 83. 5.8.- Apoptosis y fase S dentro del mismo tipo histológico según localización de origen del tumor. 83. 5.9.- Apoptosis y proliferación celular en relación con el tipo histológico. 84. 5.10.- Apoptosis y proliferación celular en relación con el origen de localización del tumor 5.11.-Marcadorestumorales en LNH:a-TNF. 85 88. 5.12.- Apoptosis y proliferación celular en relación con respuesta al tratamiento. 89. 5.13.- Resistencia a la apoptosis como mecanismo general de "drug resistance". 90. 5.14.-Binomio fase S-apoptosis. 92. 5.15.-Supervivencia y apoptosis. 92. 5.16.- Predicción de respuesta al tratamiento. 93. 6.-Resumen. 94. 7.-Conclusiones. 97. 8.-Anexo I: hoja de recogida de datos. 99. 9.- Anexo II: fotografías. 101. 10.- Anexo III: histogramas de ADN. 105. 11.-Anexo IV: base de datos. 108. 12.-Bibliografía. 115.

(9) 1.-INTRODUCCIÓN.. 1.1.- Linfornas no Hodgkinianos. Los linfomas no Hodgkinianos (LNH) son una compleja proliferación neoplásica a partir del tejido linfoide y que a diferencia de la enfermedad de Hodgkin, referida a una sola entidad, agrupan a más de una docena de procesos. Sin embargo, entre los LNH se puede constatar cada vez más que cada uno tienen particularidades clínicas y biológicas que les confieren personalidad. Esto es fruto de los avances en el conocimiento, sobre todo del comportamiento celular, en estas enfermedades y que en los últimos 20 años han forzado cambios en su terminología y clasificación, lo cual a su vez puede afectar cualquier estudio y/o análisis1 a realizar tanto desde el punto de vista de epidemiología, como de vigilancia o en definitiva de los resultados finales de pronóstico y/o tratamiento. La explosión de la inmunología desarrolla desde 1962 la disociación de respuesta inmunológica entre células B y T, y llega al completo reconocimiento del gen de una inmunoglobulina por recombinación en 19782. Estos avances, en esta década y media, confieren a los síndromes linfoproliferativos una inesperada heterogeneidad al realizar inmunofenotipaje. Con el paso del tiempo, el descubrimiento de nuevos antígenos (Ags), identificados como moléculas con funciones importantes, va añadiendo más diversificación. Los avances en la citogenètica, la hibridación y la aplicación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la identificación de algunos oncogenes importantes, como el Bcl-2 en los LNH foliculares, va añadiendo complejidad a los diferentes subtipos de LNH. El National Cáncer Institute (NCI), ha publicado recientemente la incidencia de LNH, en un periodo de tiempo que va desde 1973 hasta 1988, encontrando un significativo incremento, cercano al 50%, en el diagnóstico de la enfermedad. El tipo que con más frecuencia se diagnosticó, acercándose al 30% de todos los LNH, corresponde al LNH difuso de célula grande1.. \f-A-.

(10) El incremento en LNH de alto grado de malignidad como el inmunoblástico y el de célula pequeña no hendida en la década de los 80, corresponde sin duda a la aparición del síndrome de inmunodeficiencia adquirida. Globalmente se atribuye como factores que incrementan el riesgo de padecer LNH la exposición de agentes ambientales (herbicidas y colorantes) pero no se ha podido identificar el grado de contribución. Por otra parte, llama poderosamente la atención el incremento que se encuentra en la incidencia del llamado LNH extranodal que constituye un 26% de todos los LNH registrados entre 1983 a 1987 por el NCI1, atribuyéndose a que con los nuevos métodos de identificación inmunológicos y genética probablemente se reclasifican como neoplasias monoclonales de estirpe B procesos extranodales que hubieran sido catalogados como seudolinfomas.. 1.1.1.- Clasificación histológica en los LNH. La primera clasificación importante de los LNH corresponde a Rappaport3 en 1966, quién basándose en el origen celular de la neoplasia, su morfología, tamaño así como en la arquitectura nodular o difusa del ganglio, los subdividia en cinco tipos histológicos: linfocitos bien diferenciados, pobremente diferenciados, mixto linfocítico-histiocítico, histiocítico e indiferenciado (ver Tabla I). Esta clasificación ha sido ampliamente utilizada y confirmada por múltiples estudios clínico patológicos4 así como ha sido probada su significación pronostica y terapéutica durante un periodo de unos 15 años5. Sin embargo, la clasificación de Rappaport tiene dos inconvenientes importantes: por una parte el llamado "linfoma histiocítico" ya que su posterior caracterización inmunológica muestra un origen linfoide, y por otra, algunos subgrupos de LNH no pueden ser incluidos en la clasificación como sucede con el linfoma de Burkitt, el linfoblástico y algunos linfomas T cutáneos. Tabla I: Clasificación de Rappaport. Patrón nodular o difuso Linfocítico bien diferenciado Linfocítico pobremente diferenciado Mixto Histiocítico Indiferenciado.

(11) Tabla II: Clasificación de Kiel.. bajo grado inmunofenotipo B LLC Leucemia Prolifocítica Crónica Tricoleucemia Linfoplasmocítico (citoide) Inmunocitoma Plasmocítico Centroblástico-centrocítico Centrocítico Alto grado inmunofenotipo B Centroblástico Inmunoblástico Anaplasico KÌ-1+ Burkitt Linfoblástico. ¡nmunofenotipo T LLC Leucèmia Prolifocítica Crònica Micosis Fungoide Sezary Lennert. Angioinmunoblastico (AILD) LNH de la zona T Pleomórfico (célula pequeña) inmunofenotipo T Pleomórfico Inmunoblástico Anaplásico KÍ-1+ Linfoblástico. Desde 1974 hasta 1982, con la descripción de nuevas entidades clinicopatológicas y con el auge en el conocimiento del sistema inmune y su relación con la proliferación linfoide aparecen diversas clasificaciones. Algunas son propuestas basadas sólo en criterios morfológicos como la clasificación de Dorfman6, mientras otras intentan conjugar tanto criterios morfológicos como inmunológicos como es la de Lukes-Collins7 y la primera de Lennert8, también conocida como clasificación de Kiel. En esta clasificación se incluyen algunas entidades como la leucosis linfática crónica, así como el inmunocitoma, separando el (inforna de Burkitt y el (inforna linfoblástico que adquieren entidad propia. A diferencia de las clasificaciones más morfológicas, aquí no se concede protagonismo al tipo "arquitectónico" que adquiere la infiltración de nodular o difuso. Posteriormente en 1988 se realiza una revisión y puesta al día de esta clasificación9, separando el inmunofenotipo B y T, y siendo el resto de criterios predominantemente morfológicos; y aflora una nueva entidad el linfoma anaplásico KÍ-1+ incluido tanto en el inmunofenotipo B como en el T, como puede observarse en la Tabla II..

(12) Tabla III: Clasificación de la Working Formulation Bajo A.- Linfocito pequeño (LLC, plasmocitoide)) B.- Folicular predominio centrocito C.- Folicular mixto (centrocito pequeño y grande) Intermedio D.- Folicular predominio célula grande E.- Centrocítico difuso. F.- Difuso mixto (célula pequeña y grande.) G.- Difuso célula grande (hendida y no hendida) Alto grado H.- Inmunoblástico. I.- Linfoblástico. J.- Burkitt. Miscelánea Compuesto Micosis fungoide Histiocítico Plasmocitoma extramedular Inclasificable Otros Finalmente es conveniente reseñar que bajo los auspicios del NCI y mediante un estudio internacional conducido entre cuatro centros de referencia, se intenta agrupar 1175 casos de LNH en base a datos clínicos e histológicos. Los expertos proponen una clasificación10 simple y uniformemente aceptada y conocida como "Working Formulation for Clinical Usage" (WF) (ver tabla III). Su extensión y aceptación fue muy importante tanto en Estados Unidos como en Europa siendo incluso, hoy por hoy, la utilizada para comunicaciones científicas internacionales. Sin embargo, también presenta algunas dificultades como por ejemplo el encaje de algunas entidades de célula T frecuentes en algunas áreas geográficas como el Japón, así como definir la posición exacta dentro de la clasificación de la WF de algunas entidades más recientemente descritas. Pero sobre todo el aumento en los conocimientos de la implicación de algunos oncogenes bien definidos en algunos linfoproliferativos no queda recogido en esta clasificación y motiva desconfort sobre todo en los anatomopatólogos para.

(13) poder clasificar con más precisión estas entidades. Como fruto de esta situación nace la llamada clasificación REAL11. Tabla IV: Clasificación REAL. Neoplasia célula B. Precursor de célula B. - Leucemia Linfoma B linfoblástico precursor B periféricas. - LLC/Leucemia prolinfocítica/Linfoma linfocito pequeño - Linfoplasmocitoide(inmunocitoma) - Células del manto. - Centrofolicular - Zona B marginal - Extranodal (bajo grado MALT) - Nodal (células B monocitoides) - Esplénico de la zona marginal (linfocitos vellosos) - Tricoleucemia. - Plasmocitoma/mieloma. - Difuso célula grande (Subtipo: Mediastinico primario de célula B grande) - Burkitt. - LNH Alto grado de célula B tipo Burkitt-like. Neoplasias de células T y Natural Killer. Precursor de célula T. - Leucemia/Linfoma Linfoblástico T Precursor T periféricos y NK. - LLC/Prolinfocítica T - Leucemia linfocitos granulares. - Micosis Fungoide/Sezary. - Linfomas T periféricos ( Subtipos: Paniculititis subcutánea y linfoma to T- hepatoesplénico) - Angioinmunoblástico T - Angiocéntrico. - Intestinal célula T (enteropatía) - Linfoma leucemia célula T adulto (HTLV-I+) - Anaplásico célula grande (T y nulo) - Anaplásico, Hodgkin-like Esta nueva propuesta de clasificación "The Revised EuropeanAmerican Classification of Lymphoid Neoplasms" no contiene ningún criterio clínico pronóstico y solamente incorpora el listado de diagnósticos de enfermedades linfoproliferativas reconocidas en un orden lógico y con la suficiente flexibilidad para que quepan las distintas entidades. Los criterios.

(14) 6. seguidos para realizarla son: datos clínicos, morfología, inmunofenotipo y genotipo. También se contemplan algunas entidades "nodales" y "extranodales" tal y como se muestra en la Tabla IV. Esta nueva clasificación aceptada por anatomopatólogos no parece que vaya a gozar del favor desde el punto de vista clínico, después sobre todo de tener hábito en el manejo de la WF, en base de la cual se obtiene una información pronostica estimable para establecer una estrategia terapéutica. Por todo ello quizás sea prudente esperar para poder hacer una valoración definitiva de esta reciente clasificación. 1.1.2.- Factores pronósticos en LNH. Dadas las particularidades de esta enfermedad, que. sugieren. entidades distintas y con diferentes grados de agresividad clínica, parece razonable adecuar a los mismos la actitud terapéutica. Además, la aparición de nuevos tratamientos con intención curativa de la enfermedad hacen crecer los esfuerzos para poder vaticinar con la máxima precisión cuál será la evolución de la enfermedad en cada caso. En definitiva, existe una preocupación creciente por investigar los factores pronósticos en el momento del diagnóstico y con los elementos clínicos y biológicos disponibles en ese momento. El primer problema es la gran cantidad de parámetros a los que se les ha atribuido valor pronóstico y por tanto es preciso realizar un cribaje para seleccionar aquellos que realmente puedan tener relevancia. Así por ejemplo, el nivel de albúmina en suero, la hipercalcemia o la presencia de anemia severa al diagnóstico no resultan relevantes desde el punto de vista de pronosticar evolución posterior en series amplias de enfermos afectos de LNH12. Por el contrario, en pacientes con LNH de grado intermedio o alto de malignidad tiene significación la edad, el valor en suero de la ß-2-microglobulina y posteriormente la respuesta inicial al tratamiento12. Sin embargo, al intentar agrupar los distintos parámetros pronósticos pre-tratamiento parece razonable. hacerlo de la. siguiente manera: parámetros relacionados con la enfermedad propiamente dicha, parámetros dependientes del huésped y de la enfermedad y su habilidad para tolerar el tratamiento, y parámetros relacionados específicamente con el tratamiento a administrar..

(15) 1.1.2.1.- Factores pronósticos directamente relacionados con el (inforna: Parece claro en este sentido que es importante la "cantidad de tumor" en el momento del diagnóstico. Desde hace más de una década la manera de calcular este aspecto es la aplicación de los estadios de Ann-Arbor diseñados para enfermedad de Hodgkin13. En este contexto se diseñan estrategias de tratamiento para valorar su evolución posterior14. Pronto se observa que en un grupo de enfermos clasificados como de grado intermedio de malignidad el estadiaje de Ann-Arbor discrimina pobremente entre estadios III y IV12. Además existen otros problemas añadidos: por una parte, la presencia de "bulky" tumor, valorado como tumor medido con un diámetro superior a 7 o 10 cm según los grupos, es un claro factor adverso, muy probablemente por la dificultad de penetración de la quimioterapia; por otra, la presencia de afectación de áreas extranodales tiene también connotaciones negativas.. En base a estos dos aspectos, una institución como MD Anderson construye su propio modelo pronóstico basado en la carga tumoral por "áreas extensas" de enfermedad15. Consideran un área extensa aquella nodal o extranodal de diámetro superior a 7 cm y la presencia de afectaciones extranodales y el número de áreas afectadas. Establecen tres grados de carga tumoral baja alta e intermedia que se correlaciona con la supervivencia. Sin embargo el manejo con todos estos parámetros no siempre resulta en series históricas de llamados LNH indiferenciades o histiocíticos16 o bien en los LNH de bajo grado o cuando se contempla la localización extranodal17. La confirmación reciente del esquema terapéutico CHOP18 como una de las mejores alternativas de tratamiento en los LNH de intermedio y alto grado de malignidad y la aparición de resultados positivos19 con la utilización de estrategias que incluyen trasplante de médula ósea, impulsan un esfuerzo final a la búsqueda de un modelo internacional pronóstico que permita predecir el porcentaje de respuesta con el tratamiento de elección a cinco años. Así aparece el IPI, índice pronóstico internacional para el LNH en base a 3273 pacientes con LNH de grado alto e intermedio de malignidad, recogidos antes de recibir tratamiento20'21. Para constituir dicho índice se han tomado aquellas variables clínicas y biológicas que han resultado significativas para el pronóstico:.

(16) - Edad: la edad superior a 60 años marca una inflexión en el pronóstico. - Estadio clínico-patológico: solo resultan significativos los estadios agrupados como "precoces" agrupando estadio l-ll y "avanzados" agrupando III y IV. - El performance: medido al diagnóstico por el ECOG agrupando un buen "performance estatus" como O y 1 vs los demás, es decir igual o superior a 2. - El valor de LDH: expresado como ratio entre el valor del paciente dividido por el valor normal máximo, estableciendo el corte en un ratio igual o inferior a uno. - El número de localizaciones extranodales cuyo corte es una o menos localizaciones extranodales vs más de una localization. Con todo ello se establece una puntuación que es: entre O a 1 Bajo riesgo; 2 riesgo bajo-intermedio; 3 riesgo alto-intermedio y de 4 a 5 Alto riesgo. En cualquier caso en esta extensa revisión retrospectiva estos grupos de riesgo establecen claramente el límite deseado de predicción de supervivencia inferior al 50% con el tratamiento estándar y por tanto permite seleccionar candidatos a terapia alternativa. En algunos trabajos posteriores se enfatiza el valor de la LDH en la significación pronostica porque al parecer se correlaciona tanto con la masa tumoral como con el grado de proliferación tumoral22. Aunque Shipp21 insinúa que este modelo aplicado a grado alto e intermedio de malignidad también puede ser aplicado a bajo grado, y es en un trabajo posterior23 donde se demuestra perfectamente aplicable el mismo modelo descrito anteriormente, con lo cual resulta para la totalidad de los LNH. El poder incluir a los bajos grados tiene un valor añadido al aparecer también nuevas estrategias para su tratamiento24'25. En cualquier caso no hay que olvidar otros parámetros biológicos que aislados se les ha encontrado significación predicava. Así, el hecho que inicialmente esté o no invadida la médula ósea y aparezca una leucocitosis superior al 20000, para algunos autores confiere una corta supervivencia26. Por otra parte, en el modelo del IPI no se pudo incluir, por insuficiente número de pacientes20, el valor de un marcador clásico en linfoproliferativos como es la ß-2-microglobulina, al que se imputa la más estrecha correlación con la masa tumoral12. Aunque hay que tener presente la interferencia que puede suponer la insuficiencia renal y el hecho de que puede no normalizarse con la.

(17) remisión completa del proceso (RC) e incrementarse discretamente con la recidiva12, se ha constatado, en la determinación al diagnóstico, una muy buena correlación con la LDH e incluso con un nuevo y prometedor marcador tumoral, como puede ser el valor de a-TNF en suero27. Desde ensayos iniciales estudiando el valor de la ß-2-microglobulina en el manejo de los linfoproliferativos28 han discurrido un número muy elevado de estudios demostrando su valor pronóstico29, de tal manera que ha permitido incluso establecer un modelo basándose en el valor inicial de LDH y ß-2microglobulina30, llegándose a realizar valoraciones tras 10 años de supervivencia31. Directamente relacionado con el tumor, por no decir exclusivamente, están. tanto. su. capacidad. proliferativa. como. algunas. alteraciones. cromosómicas12 que regulan el crecimiento tumoral. En definitiva se trata de valorar la cinética celular tumoral en el momento del diagnóstico y ver que correlación puede tener con la supervivencia o incluso con la respuesta esperable al tratamiento. Utilizando el Ki-67 como marcador de Ag nuclear de proliferación, algunos autores encuentran que en LNH difuso de célula grande, valores superiores al 60% de Ki-67 es un factor estadísticamente significativo e independiente, de mal pronóstico aunque no predice respuesta al tratamiento32. Por otra parte el estudio del ciclo celular pone de manifiesto que el tiempo de transición entre las diferentes fases del mismo es muy variable entre los distintos subgrupos de tipos histológicos de LNH33. Otros grupos también han confirmado el valor pronóstico de la cuantificación del Ki-67 aunque interpretan el 80% como un alto índice de proliferación y encuentran en estos tan sólo un 18% de supervivencia al cabo de un año34. Por otra parte, el estudio del contenido en DNA, sobretodo la proporción de células tumorales en fase S también muestra una buena correlación con el tipo histológico y con la supervivencia. Es interesante constatar que en los LNH de célula B parece claro que un 4,5% o menos de fase S significa una mayor supervivencia, pero el conjunto de células T, no neoplásicas, también juegan un papel y si su fase S es superior al 14,5% se ha publicado35 una mejor supervivencia..

(18) 10. Otra experiencia en un grupo de 490 pacientes la fase S se correlaciona de forma excelente con el grado histológico y con la supervivencia, incluso con significación independiente del IPI, excepto si los pacientes reciben tratamiento poliquimioterápico, como si este modificara las expectativas de supervivencia36. Últimamente se ha realizado un esfuerzo importante en la búsqueda de alteraciones cromosómicas que por una parte pudieran tipificar algún tipo de LNH y por otra tuviera significación pronostica. Así por ejemplo, queda bien establecido que en más de un 75% de los LNH tipo folicular presentan la t(14; 18)(q32; q21) aunque no se puede correlacionar con ningún tipo de resultados clínicos37. Aunque en algunos casos, que pueden a llegar a suponer un 10% de los LNH foliculares, la presencia de roturas cromosómicas (más de 6) y metafases anormales tienen una supervivencia más acortada y alteraciones 6q23-26 o 17p se correlacionan con transformación a tipos histológicos más agresivos, no existen datos contundentes sobre su valor pronóstico. En el punto de ruptura de la t(14; 18) existe un protooncogen denominado Bcl-2, que se encuentra en mitocondrias y parece alargar la supervivencia de la célula por bloquear la muerte celular programada o apoptosis. Se ha estudiado muy extensamente el reordenamiento Bcl-2 en diferentes neoplasias hematologicas38 y especialmente en el LNH. Es interesante constatar aquí un hallazgo bastante reciente en relación con el Bcl-2 y es que la frecuencia de la traslocación aumenta con la edad de forma que en bazos de individuos de más de 61 años puede llegar a ser 40 veces más frecuente y 13 veces si se estudia en sangre periférica39. También se ha encontrado, en la presencia o ausencia del Ag HLA-DR de los leucocitos de pacientes afectos de LNH, un valor prédictive40. Aunque la proliferación celular del LNH ha sido exhaustivamente estudiada y para algunos tiene un papel muy importante en la valoración de la enfermedad41 existen actitudes críticas42 al respecto. Nuestro grupo43, en estudios previos, ha encontrado. una buena correlación,. del. estudio. retrospectivo en material parafinado, tanto con los tipos histológicos como con la supervivencia, tanto por estudio de fase S por citometría de flujo, como por.

(19) 11 estudio inmunohistoquímico de Ki-67. Igualmente y en la misma serie44 al estudiar otro Ag de proliferación como es el PCNA con el Ac monoclonal PC10 se correlaciona bien con los otros marcadores de proliferación. De forma relativamente reciente, adquiere interés el estudio de la apoptosis y su correlación con la proliferación celular y su valor pronóstico45, que encuentran como adverso cuando existe un aumento significativo. También parece bien establecido que el mecanismo por el cual el Bcl-2 reprime la apoptosis en las células linfomatosas se produce por un mecanismo de regulación del calcio en el retículo endoplásmico46. 1.1.2.2.- Factores relacionados con el huésped: en el momento del debut de la enfermedad tiene una importancia extraordinaria establecer el "performance status" con alguna escala objetiva ya que parece jugar un papel decisivo en el pronóstico incluso mayor que la presencia o ausencia de síntomas B12. En relación con los síntomas constitucionales parece razonable que tenga distinto valor pronóstico la presencia de uno, dos o los tres síntomas. 1.1.2.3.- Factores relacionados con el tratamiento: como ya se ha mencionado antes, esquemas terapéuticos que incluyan doxorrubicina como es el tradicional CHOP siguen siendo el mejor tratamiento para el LNH18. Las otras estrategias son más tóxicas y con resultados muy similares. Seguramente sea un concepto más importante que el propio tratamiento, la tolerancia/intolerancia del paciente al mismo y sobre todo el poder utilizar las dosis óptimas de sus fármacos pudiendo esquivar sus efectos adversos.. 1.2.-Apoptosis.. Las formas avanzadas de vida no serían posibles sin un mecanismo que elimine las células individuales que ya no son necesarias, o que funcionan de manera anormal. Esta eliminación fisiológica, por tanto en ausencia de procesos patológicos como puede ser un proceso inflamatorio, se conoce como.

(20) 12. muerte celular programada o apoptosis y se produce de forma estructuralmente definida47. La regulación defectuosa de la muerte celular programada puede desempeñar un papel en la etiología del cáncer, el SIDA, las enfermedades autoinmunes e las enfermedades degenerativas del sistema nervioso central48. La muerte celular puede ocurrir de dos maneras distintas: o bien por un mecanismo de necrosis o mediante el denominado de apoptosis49*51. Recientemente se ha podido reconocer que la muerte celular mediada por linfocitos T citotóxicos y por los natural killer muestra hallazgos de ambas formas de muerte celular. La necrosis seria una forma patológica o accidental de producirse la muerte celular y ocurre cuando ésta es expuesta a una variación muy extrema de sus condiciones fiisiológicas como pueden ser una severa hipoxia o hipertermia, que producen una lesión de la membrana celular, semejante a la que en ciertas condiciones patológicas pueden suceder como la acción litica del complemento o la de ciertos virus. El proceso comenzaría por la imposibilidad de la célula a mantener su homeostasis en relación con el exterior, sobre todo en lo que hace referencia al agua y los iones. Así se producirá un cambio de forma, con hinchazón de toda la célula y de algunas organelas intracelulares, especialmente las mitocondrias. Todo ello conduce a la rotura de la membrana celular vertiéndose al exterior los contenidos intracitoplasmáticos incluidos enzimas tisosómicos, lo que a su vez conduce a una extensa lesión tisular y una intensa respuesta inflamatoria. Durante todo este proceso es necesario recalcar que el núcleo y especialmente el patrón de cromatina nuclear se encuentra perfectamente preservado. Sin embargo en la apoptosis, la muerte celular ocurre bajo condiciones fisiológicas, participando la propia célula de forma activa y por ello la denominación de "suicidio" celular"49. Este fenómeno lo podemos encontrar durante el recambio celular en la homeostasis de tejidos, en el mantenimiento de la tolerancia inmunológica, en la embriogénesis, en el desarrollo del sistema nervioso y en la atrofia de tejido dependiente del sistema endocrino. Actualmente se reconoce que la gran mayoría de muerte celular fisiológica se produce por este mecanismo, del que se han producido avances.

(21) 13. importantes en relativamente poco tiempo, para conocer los mecanismos más básicos de su funcionamiento. Así conocemos que al menos dos genes pueden estar implicados en ello como son el Bcl-2 y el enzima convertidor de la interleukina 1ß. A partir del conocimiento de estos mecanismos, la investigación se centra en conocer mejor el papel de la apoptosis dentro del tejido tumoral y su influencia vs la capacidad de proliferación en el resultado final en el enfermo como podría ser el pronostico de la enfermedad o como desarrollar nuevos tratamientos. De las misma forma, se puede aplicar. a enfermedades. neurodegenerativas, SIDA y entidades autoinmunes y/o inflamatorias. Las células que se encuentran en proceso de apoptosis muestran unos cambios característicos tanto morfológicos47 como bioquímicos49'52. Estos hallazgos incluyen la agregación de la cromatina nuclear, condensación y división tanto nuclear como citoplásmica con envoltura la de la membrana citoplásmica. intacta. dando. lugar. a. unas. vesículas. identificables. 49. morfológicamente y por microscopía electrónica como cuerpos apoptoicos que contienen ribosomas, mitocondrias intactas y material nuclear. In vivo este material es rápidamente reconocido y fagocitado por los macrófagos del tejido adyacente53. La eficiencia del mecanismo es tal que en la desaparición de las células apoptoicas no hay respuesta inflamatoria. In vitro los cuerpos apoptoicos sufren finalmente una lisis por lo que entonces se trataría de una "necrosis secundaria" (Tabla V). Desde el punto de vista bioquímico, el fenómeno más importante es la degradación del DNA genómico, sin otro cambio ni siquiera en la permeabillidad de la membrana celular. Es una fragmentación prelítica del DNA. Dicho proceso requiere energía con movilización de Ca++ y Mg++ dependientes de una endonucleasa54. Por electroforesis en gel de agarosa se puede distinguir un patrón de subunidades de 180 bp. La citotoxicidad mediada por células, se puede llevar a cabo tanto por un mecanismo apoptoico, poniendo en marcha la célula efectora sobre la diana una fragmentación prelítica del DNA, como por un mecanismo puramente litico mediante moléculas como la "perforina" produciendo "poros" a nivel de la.

(22) 14. membrana,. siendo. los. dos. mecanismos. no. excluyentes. e. incluso. compleméntanos.. Tabla V: necrosis y apoptosis Cambios morfológicos Pérdida integridad membrana. Membrana íntegra.. Floculación de cromatina nuclear. Agregación cromatina nuclear. Hinchamiento celular y organelas. Condensación y división celular. Lisis completa celular. Formación de cuerpos apoptoicos. Desintegración de organelas celulares. Las organelas quedan intactas. Cambios bioquímicos No regulación homeostasis iónica. Puesta en marcha proceso con actividad enzimàtica.. No requiere energía, (proceso pasivo que. Requiere energía ATP-dependiente. prosigue a 4°C). (proceso activo que se detiene a 4°C.). Digestión de DNA desordenada.. Fragmentación de DNA mono y oligonucleosómica.. Fragmentación DNA postlítica. (evento. Fragmentación prelítica. (evento precoz en. tardío en muerte celular). la muerte celular).. Significación fisiológica. Muerte de células en grupos. Muerte células individual. Provocado por alteraciones no fisiológicas. Inducido por estímulos fisiológicos.. Respuesta inflamatoria significativa. No respuesta inflamatoria.. Este enzima rompe el DNA en puntos localizados entre unidades nucleosomales generando fragmentos mono y oligonucleosomales.. 1.2.1.- Cambios metabólicos durante la apoptosis. La puesta en marcha de la apoptosis puede estar generada también por estímulos patológicos. De hecho los agentes capaces de producir necrosis celular son capaces también de inducir apoptosis. Cabe interpretar entonces la apoptosis como una respuesta celular coordinada a estímulos nocivos que no son inmediatamente letales..

(23) 15. Entre los factores capaces de inducir apoptosis55 los más importantes son: glucocorticoides, factor de necrosis tumoral (TNF), factor transformador de crecimiento ß (TGF-ß), proteína HIV gp 120 y el ligando APO-1/FAS. En la mayoría de tipos celulares el inicio de la apoptosis se traduce en un aumento del calcio ionizado intracitoplasmático. Este activaría enzimas latentes como la endonucleasa nuclear que invariablemente fija ADN y que induciría la rotura del mismo en secuencias determinadas, sin duda el inicio de los cambios que se producirán en la apoptosis. Así mismo otras enzimas como una transglutaminasa que se une a proteínas del citoplasma, o la calpaína capaz de degradar el citoesqueleto. La apoptosis suele necesitar energía en forma de ATP. La síntesis activa de ARN y proteínas depende del tipo de célula y del estimulo apoptoico que la desencadena. Así, en los linfocitos, los agentes que inhiben la síntesis proteica y el ARN suelen bloquear la apoptosis, mientras los mismos compuestos la aumentan en los neutrófilos y en algunas líneas celulares leucémicas56 1.2.2.- Proliferación y apoptosis. Sabemos que la proliferación celular está relacionada con el crecimiento de un tejido y más concretamente con el de un tumor. No sólo guarda está lógica relación sino que además se ha demostrado su relación con la agresividad de la enfermedad tumoral y por tanto con su pronóstico. En los LNH ya se demostró que en el momento del diagnóstico, el tejido parafinado, estudiado por citometría de flujo en cuanto a contenido DNA, así como tanto por ciento de fase S de las células tumorales, se correlaciona con el tipo histológico y pronóstico de la enfermedad. En algunos estudios experimentales de carcinogénesis se describe que la capacidad de crecimiento de un tumor respondería a una formula en los siguientes términos: Crecimiento Tumoral = (Indice proliferación) - (Apoptosis).

(24) 16. La aplicación de esta sencilla formula al tejido tumoral en el momento del diagnóstico, añade a la información morfológica y al inmunofenotipaje, en definitiva a un diagnóstico anatomopatológico estático y limitado a la pieza en este momento una dimensión de previsión de crecimiento. Esta información adicional y para caracterizar un tumor podría ser muy útil. De todas formas una célula tumoral puede dividirse más lentamente incluso que las células normales, es decir tener un índice de proliferación bajo, pero el tumor sigue creciendo debido al período prolongado de vida de dichas células que sería debido a una alteración de la apoptosis. De lo cual se desprende que la apoptosis es un método eficiente de evitar la transformación maligna porque elimina las células con lesiones genéticas47. En este sentido resulta paradójico que el mismo oncogen corno el cmyc que estimula la división celular también induce la apoptosis.. 1.3.-Oncogenes. A principio de la década de los 70 se conocía que algunos virus tenían la capacidad de introducir a las células animales, ciertos genes, que provocarían una transformación en las mismas con capacidad proliferativa. En 1976, Bishop y Varmus descubren un gen vírico, que induce tumores en pollos, idéntico a un gen normal presente en células humanas. Estos genes normales susceptibles de transformarse en oncogenes, reciben la denominación de protooncogenes. El paso de protooncogén a oncogen puede ser debido a una mutación o bien a una expresión aumentada de alguna oncoproteína. Se conocen unos 70 protooncogenes de los cuales unos 20 se han encontrado en retrovirus. Aunque la función fisiológica de estos protooncogenes no es bien conocida su elevada conservación a lo largo de la evolución sugiere un papel importante en el crecimiento y diferenciación celular. La transformación neoplásica no parece el resultado de un defecto o alteración única sino más bien el resultado de varios trastornos y a diferentes.

(25) 17. niveles. De esta manera es conveniente distinguir diferentes tipos de protooncogenes. 1.3.1.- Protooncogenes con ganancia de función. Las oncoproteínas codificadas por estos genes tienen acciones bioquímicas bien conocidas como la fosforilación de los residuos de serina, treonina o tirosina o la interacción con proteínas G (se unen a nucleótidos de guanina). Las dos suceden en el citoplasma de la célula y tienen mucho que ver con la transducción de señales al núcleo. Un ejemplo característico son los genes de los factores de crecimiento o sus receptores57. Además de las acciones bioquímicas descritas también pueden interaccionar con factores de transcripción. Los oncogenes más representativos de este grupo son: - Ras. Incluye toda una familia de genes como H-ras-1, K-ras-2, N-ras que codifican una serie de oncoproteínas llamadas p-21 por su tamaño (de 21 kD) y que están muy relacionadas con las proteínas G interviniendo en la transmisión de señales desde la membrana al núcleo. La transformación en oncogen es por la mutación puntual en alguna zona crítica (codones 12, 13 y 61) que altera su función normal. Los tumores relacionados son: el carcinoma de colon, pulmón, páncreas, vías urinarias, tiroides, melanoma y leucemias agudas. - MYC, c-myc. Se encuentra en el cromosoma 8 y codifica un factor nuclear de transcripción de 62 kD, que interviene en la división celular. La traslocación recíproca con un fragmento del cromosoma 14 en un punto cercano a un promotor de una de las cadenas de inmunoglobulinas, es un hallazgo constante en los LNH de Burkitt de estirpe B. También puede reconocerse en carcinomas gástricos, de mama, de vejiga urinaria, de cuello uterino o de pulmón de células pequeñas. - abl. Este gen se encuentra en una zona frágil del cromosoma 9, pudiendo romperse y trastocase el fragmento distal a un lugar del cromosoma 22 que contiene el gen ber (breakpoint cluster region) dando lugar al conocido cromosoma Philadelphia, implicada en la leucemia mieloide crónica..

(26) 18. 1.3.2.- Genes supresores de tumores. Son un conjunto de oncogenes que su función es proteger de las proliferación tumoral por este motivo también reciben la denominación de antioncogenes. Siguen un patrón de herencia recesivo con lo que es necesaria la alteración de ambas copias de alelos para que se produzca la desregulación. Los más conocidos son: - rb. Fue el primero que se descubrió, ubicado en el cromosoma 13 codifica una proteína nuclear de 110 kD que se fosforila progresivamente a medida que el ciclo celular se acerca a la fase S. Se relaciona con el retinoblastoma. - p53. Se localiza en el cromosoma 17 codifica un factor de 53 kD formado por 393 aminoácidos y su función sería promover la estabilidad genética al igual que la rb tenderían a mantener las células en fase de reposo evitando su entrada en fase proliferativa. Es el más frecuentemente encontrado implicado en procesos neoplásicos. - p16. Se encuentra en el cromosoma 9 codificando una proteína de 148 aminoácidos, idéntica a un inhibidor previamente bien identificado la CDK4. La proteína p16 se une a la CDK4 y probablemente también a la CDK6 inhibiendo la progresión del ciclo celular a fase G1. - APC. Relacionado con la poliposis adenomatosa familiar y una variedad de esta, el síndrome de Gardner, localizado en el cromosoma 5. - DCC. Gen asociado al carcinoma colorrectal (Deleted in Colorectal Carcinoma) se encuentra en el cromosoma 18. Su expresión presente en la mayoría de células normales está ausente en el 90% de las líneas celulares de carcinomas de colon estudiadas. - BRCA1. Implicado en susceptibilidad al cáncer de mama se localiza en el cromosoma 17 y su inactivación se halla en carcinomas de mama de incidencia familiar.. 1.3.3.- Genes reguladores de muerte celular programada. Al igual que hemos encontrado oncogenes ganadores de función y antioncogenes, también encontramos un grupo de oncogenes que inhiben y otros que estimulan la apoptosis..

(27) 19. 1.- Inhibidores de la apoptosis: Bcl-2. Normalmente se encuentra en el cromosoma 18 y cuando es trastocado al 14 cerca de un gen promotor de las inmunoglobulinas lo que produce un aumento en su función. La traslocación 14; 18 se encuentra en el 85% de los LNH foliculares. Este gen no induce proliferación celular sino que previene la muerte programada. En relación con este gen se ha descrito el bcl-1 presente en muchos casos de leucemia linfática crónica y el gen bax que codifica una proteína que compite con la acción de Bcl-2 pudiendo formar homodímeros y heterodímeros tipos Bcl-2/Bcl-2,Bcl-2/bax y bax/bax que en definitiva marcarán la susceptibilidad celular para la apoptosis. 2.- Estimuladores de la apoptosis: p53 y Fas: - p53. Se ha descrito que en ocasiones este gen puede comportarse como inductor de apoptosis y de hecho la perdida de función de p53 puede inhibir la apoptosis y promover el desarrollo de tumores. - Fas. La unión del receptor Fas a su ligando (FasL) es una señal inductora de apoptosis. Este receptor es una molécula de superficie relacionada con el TNF que se encuentra en diversos tipos celulares, pero el FasL se expresa en las células T activadas y su malfuncionamiento causa síndrome linfoproliferativo y trastornos autoinmunes.. 1.3.4.- Mecanismos de transformación. Las causas que producen desregulación de cualquiera de los protooncogenes que se han mencionado puedes ser múltiples58. - Traslocación: Como está bien establecido se produce primero una rotura y posteriormente recombinación de fragmentos cromosómicos en sitios próximos a un promotor que aumenta su expresión. Un ejemplo típico sería la traslocación del gen c-abl del cromosoma 9 a la región ber del cromosoma 22 que se encuentra en la leucemia mieloide crónica. - Amplificación. En este caso se produce un aumento del número de copias de un protooncogén normal. Así en el neuroblastoma las células malignas pueden llegar a tener cientos de copias del gen N-myc..

(28) 20. - Mutación puntual. La mutación de un sólo nucleótido puede dar lugar a una oncoproteína que escapa a los mecanismos de regulación. y acabar. transformando una célula como se ha constatado en la familia ras. - Inserción vinca (transducción). Es la inserción de un protooncogén cerca de un promotor celular que aumenta su expresión. Por ejemplo, sería el caso del hepatocarcinoma asociado al virus de la hepatitis B. Por otra parte e independientemente de los mecanismos antes mencionados se ha descrito que la longitud del telómero, en los extremos cromosómicos, son tanto más largos en cuanto potencial de división tiene la célula. De forma que cada vez que se divide pierde un trozo de telómero hasta que su ausencia no hace posible nuevas divisiones. Excepto si la célula posee un mecanismo que restituya el fragmento telomérico perdido. El enzima responsable de ésto es la telomerasa. Este. mecanismo. de. restitución. se. encuentra. en. precursores. hematopoyéticos y en células cancerosas.. 1.4.- Citometria de flujo. La técnica de la citometría de flujo fue desarrollada, en la década de los años sesenta, en los Estados Unidos y Alemania como un avance importante en la investigación de la biología celular59. Pero es desde hace aproximadamente 10 años en que los recientes avances en inmunología, oncología y hematopatología, con el advenimiento de la tecnología de los anticuerpos monoclonales60, han permitido la aplicación de la citometría de flujo a la investigación biomédica, tanto a nivel básico como clínico, de un modo generalizado. Se define como citómetro de flujo al aparato que es capaz de medir componentes y propiedades de células y organelas celulares. (partículas. biológicas) que fluyen en una suspensión celular. Los sorters tienen las mismas prestaciones y posibilidades que los citómetros de flujo, pero con la capacidad adicional de separar partículas selectivamente de la suspensión líquida59..

(29) 21. Los principios básicos de la citometría de flujo son sencillos61. Es esencial disponer de una suspensión celular de modo que la dificultad para obtenerla es un factor limitante para el empleo de la técnica. La posibilidad de conseguir una suspensión celular individualizada varía con el tejido: la sangre y la médula ósea no necesitan casi procesamiento, el tejido linfoide precisa de una mínima disgregación mediante machacado, filtrado o pases por una jeringa con agujas de decreciente calibre, mientras que la mayor parte de los tejidos epiteliales y otros tumores sólidos necesitan una disgregación cuidadosa, usualmente con técnicas enzimáticas, seguidas de filtrado. Los tejidos pueden ser disgregados y teñidos en fresco o después de estar almacenados en congelación; también pueden ser recuperados a partir de bloques de parafina. Las células o partículas (núcleos, organelas, cromosomas) son unidas a colorantes específicos fluorescentes que son capaces de excitarse con una fuente luminosa de alta energía. La suspensión celular convenientemente procesada y teñida se inyecta en la cámara de flujo del citómetro de flujo que está hidrodinámicamente enfocada para que las células pasen individualmente una detrás de la otra en "fila india" a través de un punto en que éstas interaccionan físicamente con un haz de luz monocromática dispersando la luz en todas las direcciones. La luz dispersada hacia adelante (llamada forward scatter a 0 grados) está relacionada con el tamaño de la célula. La que lo está a 90 grados del grado de refracción (denominada light scatter a 90 grados) está relacionada con la estructura interna y la complejidad citoplasmàtica. La excitación de los fluorocromos ocurre en el punto de interacción de la célula y el haz lumínico dando como resultado la emisión de una luz de longitud de onda diferente a la inicial. Esta luz es recogida a 90 grados, siendo dirigidas las longitudes de onda seleccionadas mediante espejos (dicroicos) adecuados a detectores fotomultiplicadores, mientras que las longitudes de onda no deseadas son bloqueadas por filtros ópticos. Si se dispone de múltiples fuentes de luz más, de un fluorocromo puede ser unido a las células permitiendo, de este modo, medidas fluorescentes simultáneas de varios parámetros en una sola célula..

(30) 22. Las señales eléctricas analógicas son convertidas en señales digitales y son procesadas por un ordenador con el objeto de generar histogramas correlacionando los parámetros deseados y efectuar el análisis de los mismos. Si se requiere una separación celular, entonces las propiedades de las células a ser seleccionadas son programadas en el computador. La partícula después de ser analizada abandona la cámara de flujo laminar y, en ese momento, por acción de las vibraciones de un cristal piezoeléctrico el flujo se rompe en gotitas. Si la gota contiene una célula de las características deseadas y programadas es cargada positiva o negativamente y posteriormente desviada por un campo electromagnético entre dos placas de alto voltaje a colectores que permiten una posterior investigación de sus propiedades. A este proceso de separación en el citómetro de flujo, en atención de las características fluorescentes de las células, se le conoce con el nombre de "sorting". Las ventajas que proporciona la citometría de flujo frente a otros métodos que trabajan con fluorocromos incluyen: objetividad,. elevada. sensibilidad y velocidad de análisis, posibilidad de realizar mediciones simultáneas sobre una sola célula y separación celular en los sorters. Las desventajas y limitaciones son los altos costes de instrumentación y la incapacidad de visualizar las células que estamos analizando.. 1.4.1.- Características generales de los citómetros de flujo. Para la lectura, por citometría de flujo, las células son teñidas con fluorocromos que se unen específicamente a uno o varios constituyentes celulares. Las células son inyectadas en un flujo liquido laminar y pasan, una a una, por un punto de medida iluminado con luz de alta intensidad (láser). Cada célula, en el punto de interacción, produce una señal fluorescente que es de intensidad proporcional a su contenido en fluorocromo. Uno o varios detectores recogen la fluorescencia emitida y transforman la señal a pulsos eléctricos. También se recoge la luz dispersada por la célula que es función del tamaño, forma y estructura de la misma62. A diferencia de otras técnicas, el citómetro de flujo mide características celulares individuales de un gran número de células (no una media de los.

(31) 23. resultados) y además permite medir características de poblaciones en muestras heterogéneas63. El sistema óptico: El sistema óptico está constituido por la fuente de iluminación (que puede ser un láser o una lámpara de arco voltaico), los filtros necesarios para discriminar la señal lumínica y llevarla al detector adecuado y, por último, los fotodetectores que se encargan de recoger la luz. Los instrumentos basados en una fuente de iluminación láser tienen una configuración ortogonal, es decir, que en ellos son perpendiculares los ejes de iluminación, detección y paso de muestra. El láser por acción de lentes tiene una sección elíptica y la intensidad de la luz decrece hacia la periferia de forma gaussiana. Su grosor se considera hasta que su intensidad ha disminuido del centro del haz al valor 1/e2, el cual es aproximadamente 100 um de ancho64. La fluorescencia se recoge a 90 grados por lentes de alta apertura numérica. Recoge del 5 al 10% de la fluorescencia emitida, pero con un espejo de diseño especial se puede llegar a recoger hasta el 90%. Por la lente que recoge la señal fluorescente también se recoge la señal de la luz dispersada a 90 grados (right angle scatter) que es llevada, mediante espejos, a su detector específico y que es función de la refractariedad y estructura celular. Entre la lente colectora y los fotodetectores se debe situar una placa con un agujero (pinhole) para aumentar la relación señal/ruido. Existe un detector para la luz dispersada hacia adelante o dispersión frontal de la luz (low angle scatter), que es función del tamaño celular65. La cámara de flujo puede ser cerrada o abierta según la lectura se realice en el seno de la cámara o una vez el líquido ha abandonado Las cámaras cerradas producen menos señal de ruido que cuando la lectura es en aire. Se usan filtros ópticos para eliminar y separar la luz recogida y que, en definitiva, son los responsables de la especificidad de la lectura de los fotodetectores. En citometría de flujo se emplean los filtros coloreados o de absorción que se usan como filtros de paso largo o "long pass" y que se caracterizan porque absorben la luz de determinada longitud de onda. También se emplean los filtros de interferencia o dicroicos que reflejan la luz que tiene.

(32) 24. una longitud de onda superior o inferior a la que dejan pasar66. Los filtros son los que seleccionan la longitud de onda que llega a cada fotodetector. La luz producida por la fuente de iluminación, después de interaccionar con las partículas en la cámara de flujo, excita la fluorescencia de los fluorocromos unidos a ella y es dispersada. Esta es recogida por la lente colectora y mediante los filtros ópticos de la bancada óptica es llevada a los fotodetectores. Existen dos tipos de detectores de la luz: los fotomultiplicadores y los fotodetectores diodos o de estado-sólido64. Los fotomultiplicadores se usan generalmente para la detección de la señal de fluorescencia y luz dispersada a 90 grados. Tienen una buena relación señal/ruido, aunque se eficiencia cuántica es baja. Los fotodetectores diodos se usan para detectar la dispersión frontal de la luz. Son muy resistentes y eficientes para señales fuertes, pero tienen una baja relación señal/ruido, lo que los hace poco útiles para señales débiles. Sistema hidráulico y electrónico: Constituyen los componentes hidráulicos de los citómetros de flujo: la cámara de flujo, y el sistema de presión y de inyección de la muestra Las cámaras de flujo son muy diferentes según sea la fuente de iluminación de aparato. Los citómetros con fuente de iluminación láser utilizan modificaciones del diseño de la cámara de flujo descrita por Crosland y Taylor. Hay dos tipos: las cerradas y las abiertas (detección en "chorro en aire"). El sistema de presión y de inyección de la muestra se encarga de adquirir la muestra e inyectaría junto con el fluido de arrastre en la cámara de flujo. Es muy importante que la velocidad de inyección de la suspensión celular sea constante, si bien, la velocidad óptima depende de la aplicación, y las presiones estables. Hay dos sistemas fundamentales: por presión en la que se crea una presión en el tubo de la muestra que obliga a que ésta fluya hacia la cámara de flujo o por inyección isovolumétrica por jeringa en la que la muestra es aspirada por una jeringa que después la inyecta en la cámara de flujo64. Componente electrónico: Cuando la luz incide en los fotodetectores se produce una respuesta de los mismos en forma de señal eléctrica. Los pulsos detectados por los fotodetectores pasan a un amplificador y, después, son convertidos de señal.

(33) 25. analógica a digital (ADC). Se puede efectuar amplificaciones lineales a 256 canales (8 bits), 1024 canales (10 bits) o logarítmicas (3 o 4 décadas)67. Existe la posibilidad de seleccionar un umbral de señal de modo que las señales inferiores al umbral sean deshechadas. Además, se pueden crear regiones selectivas de adquisición en que pueden ser evaluadas determinadas señales producidas por células que se encuentren dentro de rangos predeterminados de otras señales68. Después del procesamiento informático de la señal se obtienen histogramas mono o biparamétricos63. Los datos obtenidos con la lectura por citometría de flujo pueden ser guardados en forma de histograma o como bases de datos en las que se registra en forma de lista para cada evento la señal producida para cada parámetro evaluado. A esta última forma de almacenar los datos se le denomina modo lista o "list mode".. 1.4.2.- Procesamiento de las muestras. Debido a las especiales características de los citómetros de flujo la muestra a analizar debe encontrarse en forma de suspensión monodispersa. Hay muestras como la sangre periférica, médula ósea o otros fluidos biológicos que precisan de un mínimo procesamiento; en cambio los tumores sólidos o las muestras parafinadas necesitan de una disgregación más o menos intensa (mecánica, enzimàtica, etc.). En función de la muestra biológica que deseemos teñir y analizar por citometría se aplican protocolos diferentes69. En ocasiones, puede ser conveniente o necesario enriquecer la concentración celular en la muestra antes de su procesamiento por citometría ya sea para obtener una concentración celular adecuada para la incubación con los reactivos o para acelerar el proceso de sorting. Disgregación de material parafinado: Generalmente, son procedimientos basados en el método desarrollado por Hedley en 198370'71. Se ha constatado que sirven para gran cantidad de tejidos y para muestras archivadas con más de 10 años de antigüedad. De un 10 a un 15% de los casos se obtienen coeficientes de variación superiores al 10% que no permiten el análisis del ciclo celular..

(34) 26. Se obtienen histogramas casi idénticos si el tumor es procesado en fresco o después de parafinización lo que indica que no hay pérdida celular selectiva durante el procesamiento, además, los índices de ADN son casi idénticos y sólo se advierte una disminución del porcentaje de aneuploidías en tumores con índices de ADN muy bajos (por el aumento del coeficiente de variación de los picos)72; la existencia de falsas aneuploidías es excepcional73. Se pueden procesar y estudiar las muestras con patrones internos de ploidía (hematíes de pollo) o células no tumorales74'75, pero en los tumores suele quedar algo de población normal residual que sirve de control de diploidia. Para analizar los histogramas de ADN obtenidos partir de muestras parafinadas o frescas hace falta el uso de software especial que permita la discriminación de ruido continuo por núcleos cortados y una aproximación matemática. para el cálculo de las fases, puesto. que el. histograma. monoparamétrico que se obtiene presenta superposición entre las fases GOG1 y S, y entre S y G2M76^°.. 1.4.3.- Fluorocromos y procesamiento de datos. Los fluorocromos ofrecen un método sensible para obtener información acerca de la estructura, función y vitalidad de las células. En función del flurocromo empleado o del anticuerpo al que esté conjugado el aparato mide una u otras característica celular. Los citómetros producen una gran cantidad de información que puede ser guardada en forma de histogramas (histogramas monoparamétricos de 256 o 1024 canales, histogramas biparamétricos de 64 x 64 = 4096 puntos) o en "modo lista" (list mode) que consiste en guardar toda la información obtenida para cada evento, de modo, que se pueden modificar las regiones de análisis y reconstruir los histogramas en función de nuevos parámetros de selección, así como, enviar y reanalizar la información con ordenadores extemos al citómetro de flujo81'82. Para evitar interpretaciones subjetivas y aprovechar al máximo la información obtenida es necesario la ayuda informática y usar pruebas matemáticas estadísticas. Los datos univariantes suelen ser representados como un histograma monoparamétrico. Un método rápido y sencillo de interpretación es la.

(35) 27. observación del histograma y la ayuda del soporte informático del citómetro para calcular el porcentaje de eventos en regiones seleccionadas82. La transformación o uso de escalas logarítmicas es útil en caso de que la señal sea muy amplia o se halle muy dispersa puesto que agrupa los canales de señal alta y permite diferenciar igualmente el control negativo. En algunos casos, por la dificultad de interpretación de los datos y la elevada información que contienen, es necesario aplicar modelos matemáticos. En ellos se emplean conversiones matemáticas de los histogramas y sus datos a curvas o ecuaciones y se usan en el análisis de las distribuciones de ADN y modelos de cinética celular83. La representación de dos parámetros se realiza mediante histogramas biparamétrícos con dos ejes y el número de eventos se representa como densidad de puntos, colores, o líneas isométricas. En el análisis multiparamétrico, la principal dificultad es la limitación humana de poder manejar cómodamente y de forma comprensible información relativa a más de tres variables simultáneamente. Se necesitan modelos matemáticos de componentes principales, agrupación y clasificación para analizar la compleja información84. La información se representa en forma de múltiples histogramas mono/biparamétricos, cubos tridimensionales85 y matrices de datos.. 1.4.4.- Estudio del contenido en ADN y fases del ciclo celular por citometría de flujo. La medición del ADN ha sido una de las primeras y más empleadas aplicaciones de la citometría de flujo61'86. Las células malignas, en algunos tumores humanos, poseen frecuentemente alteraciones en el contenido de su ADN que pueden ser detectadas por citometría de flujo. El estudio del contenido en ADN y de las fases del ciclo celular son útiles para el estudio de la biología celular y han demostrado tener una relación diagnóstica y pronostica en determinadas neoplasias humanas62'68'69. Se dispone de muchos fluorocromos que se unen específicamente a las bases del ADN. La señal fluorescente es proporcional a la unión del fluorocromo al ácido nucleico que es de tipo estequiométrico..

(36) 28. Los fluorocromos que se usan para la Quantification de ADN por citometría de flujo se clasifican en función de su mecanismo de unión. Los intercalantes, como el bromuro de etidio, yoduro de propidio y naranja de acridina, se unen al material genético de doble cadena intercalándose entre las dos bases; los de unión preferente a las bases adenina-timina, como DAPI, DIPI y Hoescht y; por último, los de unión preferente a las bases citosina-guanina, como la mitramicina, olivomicina, y cromomicina Aß.. 1.4.5.- Estudio de la aneuploidía de ADN y del ciclo celular. En el ciclo celular se distinguen varias fases: la fase de reposo (GO), fase de síntesis proteica (G1a), síntesis de ARN (Gib), síntesis de material genético o ADN (fase S), de nuevo síntesis de proteínas (G2) y, por último, división celular (M)87. Según el tipo y función de la célula, ésta tiene más o menos actividad proliferativa y el ciclo puede variar según diversas condiciones: fármacos, radiaciones, etc. Técnicas para medir ía síntesis de ADN; estudio del ciclo celular la intensidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de fluorocromo que es proporcional a la cantidad de ADN de la célula88. Hay cierta variation entre el resultado teórico y el obtenido debido a la variación biológica en la tinción y en la lectura, por ello, se define el coeficiente de variación (CV) que nos da una idea de la semejanza de los resultados obtenidos a la realidad y que hace necesario el empleo de programas informáticos para discriminar correctamente el porcentaje de células en cada una de las fases del ciclo celular. A. partir del. histograma monoparamétrico de los canales de. fluorescencia del cromóforo que se ha unido al ADN, para calcular la fase S se pueden emplear varios métodos informáticos: rectangular, lineal, polinomial, Gauss89. Se puede hacer doble mareaje con yoduro de propidio y la técnica de la bromodeoxiuridina-antibromodeoxiuridina para conocer la síntesis real y el tiempo de duplicación90. Detección de aneuploidía: el término aneuploidía, por citometría de flujo, significa la presencia de una población con un contenido en ADN diferente a un control de células semejantes y en igual fase del ciclo celular88. El termino de aneuploidía citométrica no es semejante al de aneuploidía citogenètica y la.

(37) 29. ausencia de aneuploidía por citometría de flujo no excluye presencia de alteraciones citogenéticas que no conlleven a un aumento del la cantidad total de ADN (traslocaciones balanceadas, etc.)91. Se define como Indice de ADN (ID) al cociente entre la moda del pico GOG1 de la población problema y la moda del pico GOG1 del control (en %). A partir de ahí, se define la siguiente terminología: diploide si ID igual 1, aneuploide si ID diferente de 1, hiperploide si ID superior a 1, hipoploide si ID inferior a 1, poliploide si ID es igual a 1.5, 2, 2.5, etc. y haploide si ID es igual a 0.569. Un problema importante en la lectura de algunas muestras es la discriminación de dobletes que interfieren y aumentan, artefactualmente, la fase de mitosis. La solución se debe buscar en el procedimiento técnico, en criterios de standardización y en soluciones citométricas del análisis de la señal92. Hay citómetros que pueden mediante la señal de la altura, anchura y área del pico de fluorescencia discriminar entre células en G2M y dos células unidas en GOG1. Se define como criterio de aneuploidía la presencia de dos picos en canales diferentes de fluorescencia con dos poblaciones en la muestra88. Se acepta que el coeficiente de variación de la población aneuploide suele ser mayor que la euploide, de modo, que si se obtiene un histograma con dos picos y desconocemos cuál de ellos es el diploide se aceptará que se está ante la presencia de una población hiperploide o se escogerá como aneuploide el pico con un mayor coeficiente de variación. Ante un histograma dudoso se puede buscar la presencia de células en la región de G2M de la población problema dudosamente aneuploide, la existencia de proporcionalidad entre las fases de los ciclos celulares o comprobar la existencia de aneuploidía con diferentes técnicas. Con una buena técnica y el citómetro en condiciones óptimas se pueden conseguir coeficientes de variación que permitan separar grupos de células con índices de ADN de 0,95 a 1,05; en su defecto al menos de 0,9 a 1,1, aunque, generalmente, se obtienen mejores histogramas con muestras frescas que parafinadas..