II que se hizo más

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(1)

/Nombre: Vilchis Carrillo Guillermo Matricula: 94226323

Teléfono: 5612-9768

/Licenciatura: ingenieria en Alimentos /División: Ciencias Biológicas y de la Salud

Unidad: Iztapalapa Trimestre Lectivo: 99-P

/Nombre del proyecto: Purificación,

y

caracterización fisicoquimica parcial de las exopoligalacturonasas de Aspergiiius niger obtenidas por fermentación

en

medio sólido y medio liquido.

Titulo del trabajo: Detección de actividad enzimática de tanasa de Aspergdlus niger en geles de poliacrilamida.

Lugar de realización: Laboratorio S- 159 del Departamento de Biotecnología de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud de la Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Mapalapa.

Fecha de inicio: 13 de Noviembre de 1998. J Fecha de terminación: 14 de Mayo de 1999

J

Clave de registro: IA.079.98 /Nombre de los asesores:

Dr. Jorge Soriano Santos M.

en

B. Marco Aurelio Córdoba Salgado

Prof. Asociado, T.P.

Departamento de Biotecnologia

I

-

(2)

Nombre: Vilchis Carrillo Guillermo Matricula. 94226323

Licenciatura: lngeniería en Alimentos

Título del proyecto: PURIFICACIÓN

Y

CARACTERIZACIÓN FISICOQU~MICA PARCIAL DE LAS EXOPOLIGALACTLJRONASAS DE Aspergillus niger OBTENiDAS

POR FERMENTXION EN MEDIO SÓLIDO

Y

MEDIO LÍQLJIDO

Titulo del trabajo: Detección de actividad enzimática de tanasa de Aspergillus niger en

geles de poliacrilamida.

Registro del servicio social: IA.079.98 Fecha de entrega: 14 de Mayo de 1999. Nombre de los asesores:

Dr. Jorge Soriano Santos

Prof. Titular C.

Prof.

Asociado

Departamento de Biotecnología RESUMEN

En este trabajo se tuvo como objetivos principales la realización e interpretación de los perfiles electroforéticos y la zimograña por dos técnicas de los extractos enzimáticos de tanasa producidos

en

fermentación sólida de las cepas

Aa20,

V9-A35,

C13-B35

de

Apergdlus niger.

Al

realizar los zimogramas correspondientes se identificó la actividad de la enzima por la formación del complejo ácido gálico-rodanina, ya que las manchas rojizas que se formaron evidenciaron la actividad cnzimática de

tanasa,

aunque las manchas que se obtuvieron fueron difusas permaneciendo

poco

tiempo. La segunda técnica de zimografia

utilizada se basa en la desaparición de un complejo blanquecino ácido tánicoquinina, en el sitio correspondiente a la tanasa. En el zimograma, se lograron. distinguir dos bandas que denominamos Tanasa I.que desapareció al paso del tiempo y'Tanasa

II

que se hizo

más

evident.e; a esta última se asignó por comparación con los marcadores de referencia un peso molecular aparente de alrededor de 80

kD.

.Al

reaiizar la comparach del los zimogramas por las dos técnicas utilizadas.se

pudo

observar que la actividad enzimática fue revelada en

la misma zona de los Beles, pero donde pudo SCT

mas

claramente observada la actividad y donde pekmaneció por mayor tiempa .fue con la " técnica del- ácido tánieo-quinina, Finalmente pudimos hacer evidente esta actividad en las tres diferentes cepas de

A.

niger,

teniendo simila& pesos moleculares aparentes. Ambas fécnicas de zimografia utilizadas mostraron actividad enzimática en las muearas de SSF de las tres cepas de A.

niger,

pudiendo constatar que la segunda técnica mostró características útiles para obtener el peso molecular aparente de la tanasa de Aspergillus niger. Por

lo

que se puede decir que esta

técnica es un procedimiento rápido y simple para la detección de la actividad de tanasa en M. en B. Marco Aurelio Córdoba Salgado. Departamento de Biotecnología

(3)

INTRODUCCION

Las enzimas son proteínas con mecanismos cataiíticos que en muchas ocasiones son verdaderamente específicos, es decir catalizan en particular un G c o tipo de conversión química.

Existen muchos métodos para comprobar la presencia de una reacción &ática; algunos de ellos sólo son cualitativos, utilizados ampliamente en estudios clinkos, donde el

cambio de color de una solución indica la actividad de ésta; sin embargo, cuando se caracteriza y purifica una enzima, es necesario conocer parámetros cinéticos de la misma, para lo cual se necesita identifcar la actividad de la enzima, por un método sencillo, fácil de

realizar, sensible y sobre todo reproducible. La mayoría de los métodos están basados en la

cuantifcación espectrofotométrica del producto de la reacción e-ática o la formación de un complejo de éste con ai& reactivo, qu pueda presentar absorbancia

a

una longitud de onda determinada. Existen otros métodos que pueden medir por ejemplo la liberación de protones producidos durante la reacción enzimática, también son frecuentes las reacciones acopladas para la medición de una actividad enzimática, en este caso el producto de una primera reacción enzimática, sirve como sustrato para una segunda reacción,

obteniéndose ' a veces. un cromóforo al cual pueda medirse la absorbancia. Existen mediciones de la actividad eñzimática' que contemplan la desaparición del sustrato, un ejemplo .son las descafeinasas; en este caso se mide la cafeína residual o también la aparición

de sustrato, aunque son más comunes aquellos donde se cuantifica la aparición del producto.

Durante la caracterización y purificación de .una enzima es necesario conocer entre

. .

. .

. I . I

I .

. .

.

" . .

. .

(4)

F

I

F

C

I

otras características el tamaño molecular; un método sencillo puede ser la determinación de

éste por electroforesis, aunque esta deba ser realizada en condiciones nativas; es decir que la enzima en el gel preserve su actividad enzimática, de esta manera, además de determinar la

actividad

in sifu,

se

puede conocer el peso

molecular

aparente correspondiente a la enzima

de interés.

La localización de una enzima después de la electroforesis

en

gel de poliacrilamida es

generalmente determinada

por

una detección específica para la actividad enzimática y por

una tinción no específica para proteína. Muchas técnicas se han desarrollado para cada

enzima para determinar sus actividades en geles (Gabriel, 1971).

La

tanasa es la enzima que lleva a cabo la catálisis para romper los enlaces éster

presentes en el ácido tánico; por acción de esta enzima se liberan glucosa y ácido @co (Dykerhoff y Ambruster, 1993).

La

enzima es altamente específica por el ácido tánico que es

su . sustrato, el cual interactúa especísamente con la quinina y forma complejos

blanquecinos insolubles en agua. Cuando los geles son incubados con ácido tánico y subsecuentemente con quinina, estos serán cubiertos con

el

complejo de ácido tánico y

quinina. Si la actividad de tanasa está contenida en los geles, las porciones de gel conteniendo la actividad serán distinguibies de la otra porción, debido a que la e & n a en los geles hidroliza el sustrato en glucosa y ácido gálico, tos cuales no forman complejo con la

quinina (Aoki,

ef..ul.,'

1979). . .

. . .

. .

. . , .

. .

En este proyecto se contempla la identificación

zn

sifu

de la actividad' de ia tanasa de origen iüngico en geles de electroforesis, por dos diferentes métodos, además se podrá

conocer el tamaño molecular aparente de la tanasa.

' I

(5)

.A

..

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,

P

ic

in

(c

IC:

I

lI

I

E

I

n:

I

Aoki eta/.. (1979), mencionaron que no se habian reportado procedimientos de

localización para la actividad enzimática de la tanasa En sus investigaciones de tanasa producida de Penzcrlizum, examinaron los procedimientos de localización de la actividad de

tanasa en geles de poliacrilamida Una característica favorable que utilizaron es que la enzima es altamente específica por su sustrato natural, el ácido tánico, el cual interactúa especificamente con quinina, y forma complejos blancos e insolubles en agua.

Skene y Brooker (1995) en un estudio sobre la caracterización de actividad de tanin acil-hidrolasa de bacterias niminales, realizaron una cuantificación de la actividad de tanasa utilizando la técnica modificada de rodanina de Inoue y Hagerman (1988). Postenormente realizaron una electroforesis en gel, a la que siguió un análisis de zimogratla demostrando así una inducción de la tanin acil-hidrolasa in situ,

en

este caso, el sustrato estuvo contenido en el gel de agarosa, el cual fue empalmado

ccn

el gel que contiene a la enzima en condiciones nativas Cuando la enzima entra en contacto

con

el sustrato se produce la catblisis; el producto de la reacción, el ácido gálico, es evidenciado cuando ambos geles se someten a la

acción de la rodanina en solución. El ácido gálico liberado y la rodanina forman un compiejo colorido. En un estudio posterior Niehaus y Gross (1997), realizaron la purificación y caracterización de una enzima de las hojas del cedro y demostraron que esta esterasa era análoga a las ,tanasas fúngicas; realizaron una electroforesis en gel, de poliacrilamida . y las. .

actividades de las esterasas fueron visualizadas en los geles con un substrato cromogénico

'

. . .. .

que era naflil-ac&ato (Gabriel, 1971).

(6)

l-

ia

?

!ci

I

ie:

ic

difusión después de que la comente ha sido quitada. Por io tanto, la muestra de enzima tiene que ser acarreada hacia afuera tan pronto como sea posible En casos donde la enzima puede

ser congelada sin pérdida de actividad, el gel puede ser guardado en congelación ( Gabriel, 1971)

Para evitar el problema de la difusión después de una separación completa con electroforesis, la enzima puede ser acarreada con distintas técnicas que permitan su

localización.

La tanasa (tanin acil hidrolasa EC 3.1 1.20), es una enzima que hidroliiza las uniones éster del ácido tánico, para producir ácido gafico y glucosa; el ácido tánico además modifica muchas proteínas y forma complejos insolubles en agua con ellas (Haworth et. al., 1985;

Goldstein y Swain, 1965).

La tanasa es usada para remover algunos compuestos polifenólicos, principalmente taninos en té; también puede ser utilizada ;om0 clarificante en la producción de cerveza y

jugos de htas (Masschelein y Batum, 1931) Además es usada en la producción de ácido

gálico, en el tratamiento de polifeno’es de malta para e d i c i ó n y en la purificación de proteínas con ácido tánico (Giovanelli, 1989; Mejbaum-Katzenellenbogen et. al., 1970)

La

enzima es ampliamente utilizada en el procesamiento industrial de fiutas y vegetales debido a

que disminuyen la viscosidad de los jugos y facilita los procesos de extracción, maceración, lituefacción, filtración y clarificación (Robbins 1968; Braman 1981)

Algunos hongos pueden hidrolkm los taninos durante el proceso vegetal, resultando en una pérdida económica considerable

Los

taninos pueden ser hidrolizados a ácido gálico

. .

(7)

I..."

por la enzima tanasa que es producida por ciertos hongos. El ácido gálico tiene varias aplicaciones tecnológicas e industriales (Suseela, 1983).

La actividad de tanasa se ha detectado en hongos y bacterias, también en los fntos de algunas plantas (Lewis y Starkey, 1969; Sourlangas, 1947; Madhavakrishna et. al.,

1960)

La

literatura existente revela el aislamiento, purificación y propiedades de la tanasa

de cepas de

Aspergiilus,

levaduras como Cana'iab q p y plantas. (Ikeda et. a1.,1972). Se ha

reportado que algunas especies de Penicillium pueden crecer bien en cultivo líquido y son

capaces de producir tanasa (Suseela y Nandy, 1983).

Métodos indicados para la identificación de enzimas en peles de poiiacriinmida

Reacciones de captura simultánea. Este método es utilizado cuando la

enzima

no

es estable bajo las condiciones necesarias para el proceso de revelado. Este principio está basado en la eliminación en del producto principai de la reacción del

sustrato el cual,

en

cambio se acopla con el reactivo presente en la mezcla de

incubación para

formar

u I producto insoluble coloreado. Este método ha sido

usado extensivamente para la demostración histoquimica de hidrolasas.

Métodos autocromicos Este método esta basado en la utilición de sustratos y una

visualización directa de la reacción. Edán incluido9 los métodos que. utilizan cambios en las

propiedades ópticas del sustrato'o del producto(s), tales cpmo fluorescencia y absorbancia de luz ultravioleta. Para el propósito de la localización de la enzima es suficiente observar el^ color inicial y notar la ubicación'apropiada por medio de la aplicación.de un marcador.

El

mismo gel puede ser teñido subsecuentemente para localizar proteínas.

Así,

las bandas que

. .

~ . .

, .

:.

.

.

. .

. .

(8)

desplieguen actividad enzimática pueden ser comparadas con la correspondiente enzima- proteína en el mismo gel

I n a b u c h ~ t i p s a n h v ~ ~ h con "rndicudor" de geZ. Para muchas clases importantes de

enzimas, por ejemplo, transferasas o enzimas catabólicas con sustratos de alto peso molecular, los primeros dos métodos no son aplicables El proceso de revelado para estas enzimas necesitan la presencia de sustratos de alto peso molecular, aceptores o enzimas auxiliares en el gel de separación. Invariablemente tales componentes tendrán gran influencia en la movilidad de los componentes que van a ser separados (Lieflander y Stegemann 1968).

Se pueden hacer numerosas modificaciones en el método de '?indicador" de gel, las más importantes son el uso de agar, gel de almidón o papel.

MATERULES

Y

METODOS

Materiai bidógico:

Se utilizaron las cepas

Aa-20,

V9-A35,

C13-B35

de Aspergillus niger. Estas cepas

se conservaron en matraces de 250

mL

en

un medio de agar papa-dextrosa

(PDA)

3.9% (p/v), con resiembra cada 20 días

Ropagacibn da esporas:

Las esporas se suspendieron en &a solución de Tween 80 (O 01% v/v), y se

propagaron en PDA (3.9% p/V) durante 72 horas a SO'C, las soluciorles antériores se esterilizaron antes de.su uso en una autoclave a 12OOC y 20

Lb

de presión durante.15

minutos. Las cepas se sembraron por triplicado con 200-300 pL de la suspensión de esporas en solución de Tween 80, para cada uno de los matraces.

' , .

. . , .

. .

(9)

c

3

P

F

F

G

Preparaci<irr del soporte:

Se utilizaron hojas de poliuretano

(p=17Kg/m3),

las cuales se cortaron en cubos de

0.5 cm por lado. Posteriormente los cubos se lavaron con agua caliente y con agua destilada

fria, después se exprimieron y se secaron a 6OoC por 24 horas

Beparacih del medio

Se pesaron 0.5g de cubos de poliuretano (PUF) en 3. matraces de 250

mi

cada

matraz con PUF se impregnó con 14.7

mL

de medio de cultivo cuya composición se da en la

siguiente tabla:

Tabla

1.

Composición para el medio de cultivo que se utilizó en la fermentación sólida de Aspergillus niger (Lekha y L o m e , 1994).

;. , . . ,

(10)

inmuiacidu:

La cuenta de esporas se realizó en una cámara de Neubauer, en donde las esporas se suspendieron en solución de Tween 80 (0.01%) p/v, y se realizaron las diluciones

correspondientes de cada cepa. Se determinó el tamaño del inoculo como número de

, .esporas por gramo de sustrato (Zhu el. al., 1993), por io que se procedió a inocular en condiciones asépticas con 5x10' esporas por gramo de sustrato contenido en cada matraz.

Se agitaron vigorosamente los matraces y se incubaron

Las condiciones de incubación fueron de 3OoC durante 120 horas, y agitación manual

de los matraces dos veces al dia. Se tomaron muestras cada

24

horas Obtención

dcl

edracto ando enzimático:

El PUF se

colocó

dentro de una jeringa de plástico de 60 mL y se exprimieron los

cubos de poiiuretano ejerciendo presión sobre el émbolo; el extracto crudo exuimático obtenido se filtró en

una

membrana de 0.45 1 y

se

guardo

a

4°C hasta su análisis.

ANALISIS:

Detenitinación

de

ía dcrividad de tanasa

Se &terminó la actividad de tanasa en cada una de las muestras, segh una

. .modificación a la metodología original de Beverini y Metche (1990),. en este.caso por la

aparición .de ácido' gáiico, que es el producto de la. reacción enzimática; . . se utilizó . un .

cromatografo de líquidos de alta resolución (HPLC) (Thenno Separations) coh una &se ' I

estacionaria que cohsistió en una Columna de fase reversa Phenomenex, en tanto que la fase móvil estuvo dada por un gradiente lineal 90-10 de metanol-ácido fórmico (1% v/v); con

'

. ,

: . . . . . , . ,, .,

(11)

una velocidad de flujo de 1.5

mL

por minuto y un volumen de inyección de 20 pL; la

detección del producto se realizó a 280 nm.

La reacción se inició cuando se adicionaron SO pl de extracto crudo enzimático

PCE),

a 1

mL

de una solución de ácido tánico 0.05% (ph) preparada en una solución

amortiguadora de acetatos 0.1M de pH 5.0. La mezcla de reacción se incubó durante 30 minutos a

30°C;

para detener la reacción se adicionaron 200 pL de HCI 2N; posteriormente

se filtró la muestra a través de una membrana de nylón de 0.20 p de diámetro. Se preparó un blanco adicionando 200 pL de

HCI

(2N) a la solución de sustrato y enseguida el ECE, estas

muestras se filtraron bajos

las

condiciones antes mencionadas.

Determinación de proteha

Se determinó la cantidad de proteína producida por

mL de extracto crudo

enzidtico, con el método del colorante lig: do a la proteína (Bradford, 1976).

A cada tubo se le adicionó 100 p L de muestra, 200 de reactivo de

azul

de

Coomasie y 700 pL de agua, 1 mezcla de reacción se leyó a una longitud de onda de 595

nm;

previo a esto se elaboró de

una

curva patrón de albúmina sénca bovina (2-10pg/mL).

- Determinad&

de

los perfires e l e ~ f o r ~ c m .

. ,

, . I) Eiectroforesis en cqndiciones desnaíamzlizantes (PAGE-SDS)

(12)

empaquetamiento de 3.9?/0 (p/v) de acrilamida y pH 6.8, conteniendo 0.4% (p/v)de SDS y

10% (p/v) de persulfato de amonio y TEMED.

El buffer de muestra de pH 6.8, contenía 30% (dv) de glicerol, 10 % (p/v) de SDS, 6 %

(ph) de P-mercaptoetmol y 0.012 % (p/v) de azul de bromofenol. La porción de proteína

analizada se diluyó en una relación 5 : l.(v/v) con la solución de buffer y se calentó de 3

a

5

minutos a 100°C para su desnaturalización.

Revelado dc geles nrediante tine& con pirita.

Los geles se sometieron a una tinción en plata utilizando la siguiente metodología (CPMB, 1997). Los geles obtenidos de la electroforesis se lavaron 50 mL de solución

fijadora de formaidehído, que se componía de 40 % metano1 (v/v) y 0.5 % de formaldehído

(37% v/v) durante 10 minutos con agitación lenta. Posteriormente se retiró la solución y se lavaron los geles con agua desionizada d irante 5 minutos, este procedimiento se hizo por duplicado Después del lavado con agua desionizada se les adicionó 50 mL de tiosulfato de

sodio (0.2glL) (Na2Sz03) durante I minuto; se retiró la solución y nuevamente se lavaron los geles con agua desionizada durante 20 segundos por duplicado; el agua se retiró y se

colocaron 50 mL de nitrato de plata (O 1% p/v ) durante 10 minutos; pasado este tiempo se eliminó la solución y se lavaron los geles con agua desionizada. Se adicionaron 50 mL de

solución desarrolladora de tiosulfato de sodio en donde se obtuvieron unas bandas aparentes en 1 minuto. Cuando se evidenciaron estas bandas se añadieron 5 mL de ácido cítrico 2 3 M

(13)

II) Electroforesis en condiciones nativas.

Para llevar acabo la electroforesis en condiciones nativas se siguió la misma metodología que para la elaboración de los geles en condiciones desnaturalizantes; sin embargo para la preparación de la muestra, el buffer que se utilizó para diluirla no contenía el agente reductor B-mercaptoetanol.

Una

vez realizada la electroforesis, el SDS fue

removido lavando el gel con buffer de acetatos a pH 5 de baja molaridad.

Determinación de 10

Actividad

de tanasa in situ por diferentes métodos.

a) Detección de la tanasa in si& utüiundo la formación del complejo rodanina-ácido giilico.

Una vez realkda la electroforesis, los geles fueron lavados

3

veces por 30 minutos

a

temperatura ambiente con una solución a ~ortiguadora 1mM de Tris-HCI, pH 8.0, 20

YO

(v/v) 2-propanol y 5 mM de 2

p

mercaptoetanol, para remover SDS. Posteriormente, se lavaron

a

4OC dos veces por 2

h,

con un buffer que contenía 50

mM

Tris-HCI, pH 8.0, 1mM EDTA y 5mM de 2

p mercaptoetanol.

S elaboró un gel de agarosa al 1% (plv) que contenía 0.2 % (p/v) de metil-gaiato. El gel acrilamida y el gel de agarosa se empalmaron y se dejaron

. incubando a 35OC durante toda la aoche. Despues de

la

incubación, los geles fueron baiiados

con una solución metanólica.de rodahina 0.67% (p/v),

La

foqmción de una mancha rojiq

evidenció la formación del complejo ácido gálico-rodanina (Skene and Brooker, 1995).

. j

, .

. .

, .

. .

(14)

b) Detección de la tanasa in situ utilizando la formación del complejo ácido tánico-

quinina.

Una vez terminada la comda electroforética, los geles se lavaron dos veces durante

45 minutos con

un

buffer de acetatos de O

01M

de pH 5.0, procurando mantenerlos en

agitación, esto para eliminar el

SDS

y para que la enzima recuperará la actividad,

posteriormente se incubaron

con

una solución O 1 % (p/v) de ácido tánico en solución amortiguadora de acetatos 100 mh4 durante 30 minutos a 35°C con agitación orbital suave Terminado el tiempo de incubación, los geles se lavaron dos veces abundantemente con U M

solución amortiguadora de acetatos 10 mh4 (pH 5

O),

para eliminar el exceso de sustrato; la actividad de tanasa se reveló al someter los geies a un baño con una solución de quinina de

O

1%

(p/v) en buffer de acetatos de 50

mM

(pH 5 O). Cuando se comenzaron a distinguir

bandas transparentes sobre un fondo blanquecino, la solución de quinina se desechó y se

reemplazó

con

agua desionizada.

El tamaño molecular de

la

tanasa fue observado por comparación con un marcador de peso molecular conocido

Los perfiles electroforéticos en condiciones desnaturalizantes fueron comparados con los geles elaborados para la detección de actividad de tanasa in situ y se realizó una interpretación .de los mismos.

. ,

. .

Concentra~ón Be las muestras.

$0

mL

de extracto crudo extracelular proveniente de

SSF

cosechado después de 96 h

(15)

de 0.22 p y concentrados a 10000 rpm utilizando membranas de Centricon de un corte de

10 kD durante 25 minutos a 4°C.

Eledroforesis en condiciones ndhspara la elaboración de Umogramas.

Se elaboraron geles de poliacnlamida con una concentración de 10% y 0.7% de

BIS

para el

gel de separación, en tanto que el gel de empaquetamiento contenía

4%

de acnlamida y

0.7%

BIS.

Ambos geles contenían 0.1% de

SDS.

La corrida electroforética fue llevada a

cabo a voltaje constante de 150 Volts, durante 65 minutos y con una temperatura de 4OC.

En cada uno de los geles se aplicaron 10 pL de una solución de marcadores de referencia

-preteñidos de un rango de 203 a 29 kD (BioRad). Los geles heron cargados con 20 o 30

(16)

I-

?

F

P

F

F

F

F

OBJETIVOS

= Comparar dos técnicas de zimografia de tanasa de Aspergillus niger

Determinar si las técnicas antes empleadas son útiles para obtener el peso molecular

aparente de la tanasa de Aspergillus niger.

. .

(17)

METAS ALCANZADAS

1. Se aprendieron los conceptos teóricos y prácticos de las diferentes t&m¡cas electroforéticas así como de cromatografia de líquidos de alta resolución.

2. Se estudiaron y compararon las técnicas de zimografia de tanasa: Formación del complejo ácido gálico-rodanina.

o Formación del complejo ácido tánico-quinina

ACTIVIDADES REALIZADAS

40

.:.

.:.

.:.

.:.

.

..

*. *

.

.:.

Anáiisis

de los objetivos, estudio y lectura de conceptos básicos, así como literatura relacionada

con

el proyecto

Conocimiento teórico de las técnicas analíticas a emplearse en este proyecto Manejo de las técnicas electroforéticas.

Elaboración de la técnicas zimográficas de formación del complejo ácido tánico- rodadnina y de ácido tániCO-qUiniM

Manejo del equipo de

HPLC

(18)

M

~

Aa-20 V9-A35 C l f B 3 5

P8 , O @

iE:

I

2.46 2.82

F

2.75

I

I.

I.

F:

F

I

F

F

RESULTADOS

1) Perfiles electroforéticos de los extractos crudos enzimiticos de tres cepas de

Aspergillus niger obtenidos en SSF.

En

la Fig. 1 se presentan los perfiles electroforéticos de los ECE’s de las tres cepas

de

A.

niger cuando fueron cultivadas en soporte sólido de espuma de poliuretano; en la

siguiente tabla se describen las cantidades de proteína total aplicada en el gel para la obtención de los perfiles electroforéticos bajo condiciones desnaturalites de las tres cepas trabajadas, se puede observar que las cantidades fueron muy pequeñas, pero fue posible obtener los perfiles por que se utilizó el revelado con plata.

Como se puede observar en cada uno de los perfiles electroforéticos no se aprecian diferencias entre ellos, ya que en todos se observan el mismo número de bandas, ad como de inteiisidad de éstas. E n los diferentes perfiles electroforéticos se pueden apreciar al menos 13 diferentes bandas, aunque se puede apreciar que hay diferencia en la intensidad entre ellas,

así se observó que la banda con un peso molecular a 66

kD

es predominante con respecto al resto de las bandas Tanto la cantidad de proteína total cuantificada que se aplicó en el gel

(19)

de electroforesis, así como el número y aparente homogeneidad en las bandas encontradas en las tres diferentes bandas, podrían sugerir que estas cepas se comportan fisiológicamente de la misma manera, cuando son crecidas bajo las mismas condiciones de sustrato, fuente de carbono y de soporte.

2) Detección de la tanasa in situ utilizando la formación del complejo rodaninn-ácido

gálico.

En la Figura 2 se presentan los zimogramas correspondientes a las muestras de las cepas Aa-20, V9-A35 y

C13-B35

de

A.

niger, utilizando la técnica de la formación del complejo rodanina-ácido gálico; se puede observar que se logró identificar la actividad en las muestras de SSF, ya que las manchas rojizas evidenciaron la formación del complejo rodanina-ácido gáiico, sin embargo, la técnica mostró manchas difusas que permanecían

poco tiempo; otro detalle encontrado cn esta técnica es el desarrollo de manchas amarillentas, antes de la adición de la solución de rodanina.

Las

manchas rojizas que se obtuvieron fueron comparadas entre sí y a su vez pudo ser determinado el peso molecular aparente de las manchas mediante la utilización de un marcador de peso molecular conocido.

Las manchas que se obtuvieron en las tres cepas. diferentes, corresponden aparentemente ai mismo compuesto, se podría especulb acerca de la naturaleza de este compuesto, que p o d h e r ácido gálico en su forma oxidada, que fue producido por la actividad de la tanasa

sobre el sustrato, en este caso el metil-galato.

. .

, . , .

(20)

i!

ic

I

i

C

I

:c

IrD Dalton mark a)

b)

c)

(21)

3) Detección de la tnnasn in situ utilizando la formación del complejo ácido tánico-

quinina.

En

la Figura 3 se presenta el zimograma desarrollado cuando se favoreció la

formación del complejo ácido tánico-quinina en las muestras provenientes de las cepas

Aa20

V9-A35 y C13-B35 de

A.

niger; obtenida

por

la técnica de

SSF

Las muestras fueron

concentradas tres veces y se aplicaron 30

6

que representaron 0.0102

UE.

La técnica del zimograma se basa en la desaparición de un complejo blanquecino ácido tánico-quinina, en el sitio correspondiente donde quedo ubicada la tanasa; es decir en la banda donde la tanasa se encuentra no se forma este complejo, dado que el ácido gálico, que es producto de la reacción de la tanasa sobre el ácido tánico, no puede formar este complejo blanquecino

La

enzima fue altamente específica por su sustrato natural ácido tánico, el cual interactua específicamente con la quinina y forma los complejos blancos insolubles en agua.

Como se puede observar en el zimograma, se distinguieron dos bandas que

denominamos Tanasa I y Tanasa

II,

para

las

tres cepas de

A.

niger; para ambas bandas se asignó, por comparación con los marcadores de referencia un peso molecular aparente de alrededor de 80

kD.

Cabe mencionar, que la banda Tanasa I desapareció con el tiempo, en

tanto que la Tanasa I1 se hizo más evidente al paso del tiempo, ya que aumentó en intensidad

(22)

f

F-

Figura 2. ZimDgrama de tanasa proveniente de tres cepas de

A.

Niger producida en

SSF

con formación del complejo rodanina-&ido gálico. a) Dalton mark prestained (kD)

Miosina, p-gaiactosidasa, Albúmina sérica bovina, Ovoalbúmina, anhidrasa carbónica,

Inhibidor de tripsina de soya, lisozku, 203,115,83,49.4,34.6,29,20

kD

respectivamente,

b) Aa20, C)

V9-A35,

d) C13-B35.

Figura 3

.

Zimograma por la técnica de la fomiación del complejo ácido tbnico-quinina. a) Dalton mark prestained

(kD),

Miosina, p-galactosidasa, Albúmina sérica bovina,

Ovoalbúmina, anhidrasa carMnica, Inhibidor de tnpsina de soya, lisozima, 203, 115, 83,

49.4,34.6,29,20

kD

respectivamente b) Aa20, c) V9-A35, d) C13-B35.

(23)

Podría especularse sobre la continuación de la reacción de esta forma de la enzima a temperatura ambiente. Aunque también es posible, que Tanasa I posea menor afinidad por

este substrato o sea inhibida rápidamente por éste.

Al

realizar la comparación de los zimogramas por las dos técnicas utilizadas, se pudo

observar que la actividad enzimática fue revelada en la misma zona de los geles, pero donde

pudo ser mas claramente observada la actividad y donde permaneció por mayor tiempo fue

con la técnica del ácido tánico-quinina. Finalmente pudimos hacer evidente esta actividad en las tres diferentes cepas de

A.

nzger, teniendo similares pesos moIeculares aparentes.

Por otra parte el extracto de

SSF

fue de fácil manejo, no necesitó condiciones

especiales de manejo, ya que todas las operaciones se realizaron a temperatura ambiente,

lo

que podría significar resistencia de la emir .a proveniente de

SSF

a desnaturalizarse o perder

actividad.

Cuando se compararon las técnicas de zimografia desarrolladas en este trabajo, se pudo constatar que cuando se usó la técnica de la formación del complejo rodanina-ácido

gálico, se logró identificar la actividad de tanasa en las muestras de

SSF,

sin embargo, la actividad se identificó como manchas difusas y temporales, a Herencia de la técnica de

quinina-ácido tánico, ohservamos días después de revelada la actividad, que esta se intensifica y el halo transparente se hizo más evidente

Lo

antenor se puede interpretar como

(24)

E;,;

-[

j.:

E

i

.

al menos en condiciones ambientales. Estas observaciones podrían sugerir novedosas

técnicas de separación y purificación de la enzima, como podna ser la electroelución.

Los experimentos anteriores podrían traducirse para confirmar las bondades y

facilidades que bnnda la técnica de SSF para la producción al menos de esta enzima.

(25)

i3

P

F

F

P

F

I!

F

L

CONCLUSIONES

Se realizaron los perfiles electroforéticos correspondientes pudiendo comparar e interpretar posteriormente dos técnicas de zimografia de tanasa de Aspergillus niger como

io

fue la técnica de zimografía con formación del complejo rodanina-ácido gálico y la técnica

de zimografia con formación del compiejo ácido tánico-quinina. Ambas técnicas mostraron actividad enzimática en las muestras de

SSF

de tres cepas distintas; sin embargo, la técnica del complejo quinina-ácido tánico mostró bondades de manejo e interpretación de resultados sobre la técnica de comparación. Por

lo

que se puede decir que esta técnica es

un

procedimiento rápido y simple para la detección de la actividad de tanasa en geles de

poliacrilamida.

I

.

, L . .

. .

F

(26)

RECOMENDACIONES

Una de las ventajas que

se

obtiene al trabajar con esta técnica de Wmogrda es que permite seguir realizando estudios posteriores referentes a la enzima como

lo

pude

ser

una

electroelución, ya que sabemos que la enzima permanece activa, por que revela su actividad, y tenemos localizada la enzima y se pueden conocer características tan importantes corno su peso molecular, de esta manera, la enzima de interés puede ser separada de otro grupo de proteínas que hailan sido extraídas junto con la enzima, además por esta técnica la enzima no esta sujeta a procedimientos de eliminación de colorantes o algún compuesto de naturaleza similar, que puedan representar la probabilidad de desnaturalizar la

&ma

Probablemente

el inconveniente que podría presentarse

se

referiría a la cantidad tan pequeña de enzima que

se

recupera por estos métodos, aunque la utilización de electroforesis preparativa podría aliviar en parte este problema.

(27)

I.

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F

(30)

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

SECRETARIA ACADÉMICA

A QUIEN CORRESPONDA:

Por medio de la presente se hace constar que el:

del Departamento de BIOTECNOLOGIA

de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud, asesor6 el siguiente Servicio Social:

Di. JORGE SORIANO SANTOS

TITULO "DETECCI~N DE ACTIVIDAD

ENZIMATICA

DE TANASA DE Aspergillus niger EN GELES DE POLIACRILAMIDA"

ALUMNO VILCHIS CARRILLO GUILLERMO

M A T R k U L A 94226323

LICENCIATURA INGENIERIA DE LOS ALIMENTOS

PERIODO NOVIEMBRE 13, 1938 A MAYO 17,1999

Se extiende la presente para los fines que al interesado convengan, en la Ciudad de México, Distrito Federal a seis de septiembre de mil novecientos noventa y nueve.

A T E N T A M E N T E , "CASA ABIERTA AL TIE IL.4 O"

M.

/

(31)

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

.

DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

DR JOSE LUIS ARREDONDO FIGUEROA

DIRECTOR

ic

LIC. JULIO DE LARA ISASSI

COORDINADOR DE SISTEMAS ESCOLARES P R E S E N T E

Por este conducto se hace constar que el alumno GUILLERMO VILCHIS CARRILLO, matricula número 94226323 de la Licenciatura en INGENIER~A DE LOS ALIMENTOS

concluyó SU SERVICIO SOCIAL con ei proyecto:

i

i

~

DE ACTIVIDAD

~

~

~

~

~

~

ó

~

ENZIMÁTICA DE TANASA DE

Aspergillus

niger EN GELES DE

POLIACRILAMIDA" bajo la asesoría del Dr. JORGE SORIANO SANTOS y del M. EN

B.

MARCO AURELIO CÓRDOBA SALGADO.

Se extiende la presente constancia para los fines que al interesado convengan, en México, Distrito Federal a cuatro de junio de mil novecientos noventa y nueve.

A T E N T M E T E ,

b

. .

U Ni DAD IZTAPALAPA

(32)

Casa abierta al tiempo

DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LASALUD

Departamento de Bioiecnologia DR JORGE SORIANO SANTOS

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

Mayo 14,1999.

Dr. José Luis Arredondo F,

Director de la Div. C.B.S. P r e s e n t e

Por medio de la presente, le informo que el alumno GUILLERMO VILCHIS CAFUULLO con matrícula 94226323 de la Licenciatura en Ingeniena de los Alimentos, concluyó satisfactoriamente su servicio social titulado “Detección de actividad enzimática de Aspergillus niger en geles de poliacrilamida” que se realizó del 13 de noviembre de

1998 ai 14 de mayo del año en curso, en el Departamento de Biotecnología de esta Universidad. Adjunto se presenta el informe final de la investigación.

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