Validación del método analítico para determinar proteínas totales séricas en el laboratorio quintanilla s r l ”
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(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. A. Agradecimientos:. M. IC. A Dios:. Q UI. Gracias por fortalecerme y. BI. O. por iluminar cada paso. FA RM. AC. IA. Y. de mi camino.. Gracias por permitirme lograr mis metas,. DE. por el inmenso amor que me regalas. queridos.. BI. BL I. O TE CA. y por bendecir a mis seres. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. A mis padres Gladys Reyna y Marco Tello, desde lo más profundo de mi corazón. M. IC. A. mil gracias por su apoyo, por su ayuda. Q UI. incondicional, comprensión y estar. AC. IA. Y. BI. O. siempre conmigo.. FA RM. A mis amores Cristhian y Mathias,. DE. gracias porque son el motivo de seguir. BI. BL I. O TE CA. creciendo cada dia. Los amo.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. A. Un sincero agradecimiento al:. M. IC. Dr. Pedro Alva Plasencia. Q UI. Dra. Judith Castro Guzman. BI. O. por su apoyo y asesoramiento. IA. Y. en la realización del. BI. BL I. O TE CA. DE. FA RM. AC. presente trabajo.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. M. FA RM. AC. IA. Y. BI. O. PRESIDENTE. Q UI. Salomón Alva Bazán. IC. ----------------------------------------. A. JURADO EVALUADOR. -----------------------------------. MIEMBRO. BI. BL I. O TE CA. DE. Anabel González Siccha. ----------------------------------Pedro Alva Plasencia MIEMBRO. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRESENTACIÓN. M. IC. A. Señores miembros del jurado:. Q UI. Dando cumplimiento a las disposiciones establecidas en el Reglamento para la. O. obtención de GRADOS Y TÍTULOS DE LA FACULTAD DE FARMACÍA Y. BI. BIOQUÍMICA DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO, presento. Y. a vuestra consideración y elevado criterio el Informe de Prácticas Pre-. AC. IA. profesionales, intitulado: “VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO PARA DETERMINAR PROTEÍNAS TOTALES SÉRICAS EN EL. FA RM. LABORATORIO QUINTANILLA S.R.L.”, con el que pretendo obtener el Título de Químico Farmacéutico.. DE. Dejo a vuestra consideración, señores miembros del jurado la calificación del. BI. BL I. O TE CA. presente Informe de Prácticas Pre profesionales.. Trujillo, Noviembre de 2012. Cynthia R. Tello Reyna. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. INDICE. IC. A. RESUMEN………………………………………………. ......i. O. Q UI. M. ABSTRACT………………………………………..…….…..ii. Y. BI. I. INTRODUCCIÓN ................................................................... 1. AC. IA. II. MATERIAL Y MÉTODO ..................................................... 9. FA RM. III. RESULTADOS.......................................................... ….….20. DE. IV. DISCUSIÓN ......................................................................... 23. O TE CA. V. CONCLUSIONES ................................................................ 27 VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.............................. 28. BI. BL I. ANEXOS……………………………………………………31. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN Este informe, tuvo como objetivo general, validar el método analítico para la cuantificación de proteínas totales séricas utilizando el kit de reactivos Wiener Lab empleado en el laboratorio Quintanilla S.R.L, Trujillo; cumpliendo con los parámetros de linealidad, exactitud, precisión, límite de cuantificación, recuperación. A. y robustez según la OMS. Para lo cual se utilizó suero patrón: solución de albúmina. IC. y globulinas en estado nativo con título conocido de proteínas totales (Biuret o. Q UI. M. Kjeldhal): 9,6 g/dL y albúmina (Unión BCF): 5,40 g/dL. En la linealidad del estándar, la pendiente (b) fue 0.041949 y el intercepto (a) de -0.02626; el coeficiente. BI. O. de correlación fue 0,996719 y el coeficiente de determinación de 0,9934; los límites. Y. de confianza de “b” fueron 0,039909 y 0,043990; y texp = 44,4022; los límites de. IA. confianza de “a” fueron -0,015065 y 0,009812; y texp = 0,4560; obtenido con un nivel. AC. de confianza del 95 %; es preciso con coeficiente de variación igual a 0,944 % para. FA RM. repetibilidad y con coeficiente de variación igual a 0,7833 % para precisión intermedia; es exacto con un porcentaje de recuperación media de 99,7618 % y texp =. DE. 0,407; tiene un límite de cuantificación de 0,101g/dL, y al emplear diferentes analistas, diferentes tiempos de reacción de 5 minutos y 10 minutos y temperatura de. O TE CA. reacción de 20 oC y 37 oC, tiene robustez; cumpliendo con los parámetros de. BL I. validación establecidos según la OMS.. BI. Palabras claves: Proteínas Totales, validación, OMS.. i. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT This report, aimed generally validate a method for the quantification of total serum protein using the reagent kit Wiener Lab used in the laboratory Quintanilla SRL,. IC. A. Trujillo; complying with the parameters of linearity, accuracy, precision, limit of. M. quantification, recovery and robustness according to WHO. Which was used for. Q UI. standard serum: albumin and globulin solution in the native state with known titre of. O. total protein (Biuret or Kjeldhal): 9.6 g / dL and albumin (Union BCF): 5.40 g / dL.. BI. In the linearity of the standard, the slope (b) was 0.041949 and the intercept (a) -. IA. Y. 0.02626, and the correlation coefficient was 0.996719 and 0.9934 coefficient of. AC. determination, the confidence limits of "b" were 0.039909 and 0.043990, and texp =. FA RM. 44.4022, confidence limits "a" were -0.015065 and 0.009812, and texp = 0.4560, obtained with a confidence level of 95%; necessary with variation coefficient equal to 0.944% for repeatability and variation coefficient equal to 0.7833% for. DE. intermediate precision, is accurate to one half percent recovery of 99.7618% and texp. O TE CA. = 0.407; has a limit of quantification of 0.101 g / dL, and by using different analysts, different reaction times of 5 minutes and 10 minutes, and reaction temperature of. BI. WHO.. BL I. 20°C and 37°C, is robust, meeting the established validation parameters according to. Keywords: Total Protein, validation, WHO.. ii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN Se entiende por aseguramiento de la calidad el conjunto de medidas que garantizan los estándares de calidad y el correcto funcionamiento del laboratorio para promover la excelencia de resultados en la asistencia médica. La calidad se define como “grado en que un conjunto de características inherentes cumple con unos requisitos” [ISO 9000:2000].1 El aseguramiento de la calidad analítica forma parte imprescindible de la. A. administración de laboratorios, que busca demostrar y evaluar de manera. M. IC. transparente, objetiva y documentada la validez de los procedimientos utilizados en. Q UI. el laboratorio para generar datos confiables, mediante la participación de un tercero.. O. Éste presupone la existencia de un sistema de control de calidad (Quality Control). BI. de las mediciones, de un sistema de evaluación de la calidad (Quality Assessment) y. Y. de un sistema de documentación que proporcione evidencia objetiva de su existencia.. IA. La ausencia de cualquiera de estos componentes compromete la validez de los. AC. resultados analíticos.2, 3. FA RM. La importancia de estos criterios modernos en el mejoramiento del desempeño de los laboratorios clínicos ha sido reconocida por la Organización Mundial de la Salud,. DE. para la que uno de los problemas en lograr una cobertura adecuada de las necesidades de la población en materia de servicios de laboratorios es que la calidad. O TE CA. de los mismos no llega a los estándares requeridos, recomendando la implementación de sistemas de aseguramiento de calidad para mejorar el desempeño de los mismos,. BL I. al proporcionar los laboratorios datos relevantes y creíbles, dando confianza a los. BI. médicos en los resultados reportados.4 La importancia de estas ideas para los laboratorios clínicos ha sido reconocida ampliamente. Ya en 1986, Westgard y Klee, refiriéndose al aseguramiento de calidad en química clínica, establecieron que este es el medio para definir objetivos de calidad, sin los cuales no hay una manera objetiva de determinar si se está alcanzando una calidad aceptable, de planificar estrategias efectivas para mejorar la calidad, o de diseñar procedimientos que garanticen que un nivel especificado de calidad ha sido alcanzado, considerando que los resultados de los análisis clínicos son críticos para la salud de los pacientes.4 0. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El término control aplicado a calidad se refiere al ajuste y valoración continua y sistemática de los procesos, subprocesos y técnicas de laboratorio empleando procedimientos estadística y científicamente aceptados y de los cuales se derivan múltiples indicadores que al ser comparados con sus correspondientes estándares contribuyen a detectar, reducir y corregir las deficiencias que pueden aparecer durante los procesos analíticos en el laboratorio. Los procedimientos de control de calidad se engloban bajo la denominación de mejora continua y se fundamentan en la emisión de registros de no conformidad y la realización de las pertinentes acciones. A. correctivas y preventivas.2, 5. IC. Aunque pueda resultar una obviedad, los términos documentación, certificación y. Q UI. M. acreditación, que están estrechamente relacionados, no significan lo mismo. Suele decirse que: ‘en todo sistema de aseguramiento de la calidad si se documenta, debe. O. hacerse; si se hace, debe documentarse. Lo que no está documentado jamás se ha. Y. BI. hecho’.4. IA. La certificación, además de aportar los documentos necesarios, confirma el. AC. cumplimiento de ciertas normas o requisitos de gestión, en este caso las exigidas por. FA RM. un sistema de calidad, para cualquier producto, proceso, persona o servicio; la certificación no supone una declaración sobre su perfección, calificación o competencia técnica y diagnóstica sino más bien un visado de conformidad sobre. DE. dichos requisitos de gestión. En otras palabras, es posible certificar un producto que. O TE CA. funciona sin la eficiencia debida; basta que esté documentado y todo el proceso tenga adecuada trazabilidad dentro del sistema.6 Desde hace ya algunos años los procedimientos de certificación se han estandarizado. BL I. genéricamente ateniéndose a las normas internacionales ISO 9000, desarrolladas en. BI. el seno de la Organización Internacional para la Estandarización ISO (ISO, de la palabra griega isos, igual) que prácticamente es susceptible de regular cualquier actividad y donde los estándares son el conjunto de normas cualitativas o cuantitativas que actúan como medida patrón de lo evaluado. 7. El reconocimiento formal de la competencia técnica de un laboratorio en la realización de los análisis o pruebas específicas, corresponde a la acreditación del laboratorio. La acreditación es el resultado final de una evaluación (auditoría analítica) realizada por un equipo de evaluador (auditores), que tienen la experiencia, 1. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. los conocimientos científicos y técnicos suficientes para verificar que los requerimientos establecidos en una normativa definida, se cumplan.8 Las directrices de un sistema de aseguramiento de calidad consisten básicamente en seguir las buenas prácticas de laboratorio, las cuales pueden resumirse en la iniciativa desarrollada en el Reino Unido para promoverlas, denominada Mediciones Analíticas Válidas (Valid Analytical Measurements), basada en seis principios generales, aplicables a cualquier laboratorio: 1) Las mediciones analíticas deben hacerse para satisfacer un requisito acordado. A. (esto es, un objetivo definido), 2) Las mediciones analíticas deben hacerse utilizando. IC. métodos y equipo que han sido probados para asegurar que son adecuados para el. Q UI. M. propósito buscado, 3) El personal que realiza las mediciones debe ser calificado y competente para realizar la tarea, 4) Debe haber una evaluación rutinaria. BI. O. independiente del desempeño del laboratorio, 5) Las mediciones realizadas en un. Y. lugar deben ser consistentes con aquellas realizadas en otra parte, 6) Las. IA. organizaciones que realizan mediciones analíticas deben tener procedimientos bien. AC. definidos de control y aseguramiento de calidad.4,7,8. FA RM. El cumplimiento de estos principios garantiza las buenas prácticas y son acordes con cualquier esquema que se utilice para evaluar la eficacia y eficiencia técnica del. DE. sistema de aseguramiento de calidad de un laboratorio.6. O TE CA. El laboratorio debe validar los métodos que no sean estandarizados, los desarrollados por el laboratorio, los métodos estandarizados que se utilizan fuera de su ámbito de aplicación. La validación debe ser tan extensiva como se requiera para el uso que se. BL I. pretende. El rango y exactitud de los valores obtenidos de los métodos validados. BI. deben ser adecuados al uso y relevantes a las necesidades de los clientes.9 Los laboratorios deben, cuando sea pertinente, estimar la incertidumbre de sus resultados. Cuando no sea posible realizar determinaciones metrológicas formales de la incertidumbre, al menos se deberán identificar todas las fuentes de incertidumbre y asegurarse de que no se sobrestime la precisión de los resultados. Se debe contar con una verificación adecuada y sistemática de los datos y cálculos. Este requisito establece la obligación de una supervisión permanente y documentada de los resultados.9, 10 2. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Los métodos utilizados en un laboratorio de análisis químicos han de ser evaluados y sometidos a prueba para asegurarse de que producen unos resultados válidos y coherentes con el objetivo previsto, es decir, han de ser validados. La verificación supone menos operaciones experimentales que la validación. Si un método se modifica o se aplica en una situación nueva (por ejemplo, una muestra de matriz nueva) se necesitará una revalidación o una verificación, según el alcance de la modificación y el carácter de la nueva situación. Por ejemplo, se necesitará una revalidación si un método diseñado para actuar con orina se utiliza. A. con sangre; se necesitará una verificación si se utiliza una columna cromatográfica. IC. de un carácter o una dimensión diferentes. No se necesitará adoptar ninguna medida. M. si la modificación es sólo pequeña, por ejemplo, si se sustituye una columna. Q UI. cromatográfica por otra del mismo tipo.10, 11. BI. O. La validación o la verificación de un método se realizan mediante una serie de. Y. pruebas normalizadas y experimentales de las que se obtienen datos sobre su. IA. exactitud, precisión, etc. El proceso que ha de seguirse para ello debe constar por. AC. escrito como procedimiento normalizado de trabajo. Una vez validados o verificados. FA RM. los métodos, su utilización habitual en el laboratorio debe ser autorizada formalmente por la persona responsable, por ejemplo, el director del mismo.12. DE. Puede tratarse de métodos de análisis elaborados en el laboratorio; aunque es posible. O TE CA. que algunos sean métodos nuevos, lo más frecuente es que se basen en un método oficial que se ha simplificado de algún modo para que resulte más fácil, rápido, barato y cómodo de aplicar. Normalmente no se han sometido a ensayos entre. BL I. laboratorios, pero muestran características de rendimiento (distintas de la. BI. reproducibilidad entre laboratorios) que son comparables a las del método oficial. Al igual que otros métodos ordinarios, deberán coincidir perfectamente con el método de referencia en lo que respecta a los valores próximos a un nivel utilizado en la aplicación de normas, y si es probable que se ponga en duda un resultado, se aplicará el método de referencia en un nuevo análisis.13 Cuando se trate de métodos cuantitativos en los que sea necesario establecer un nivel de concentración definido (un umbral) para reflejar resultados, deben determinarse los parámetros siguientes: Especificidad/selectividad, Límite de detección, Precisión (en condiciones de repetibilidad y/o reproducibilidad en laboratorio), Linealidad y 3. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. rango de trabajo, Exactitud (en condiciones de repetibilidad y/o reproducibilidad en laboratorio), Recuperación, Incertidumbre de la medición y Estabilidad. 14, 15. Si un laboratorio está utilizando un método que ya ha sido validado, no es necesario volver a validarlo en su totalidad aunque deba verificarse el cumplimiento de los parámetros mínimos antes enumerados. Normalmente la verificación supone determinar el cumplimiento de menos parámetros y hacer menos mediciones de cada. A. parámetro que si se tratara de una validación.15. determinada sustancia biológica. M. una. presente. en. el. Q UI. cuantificación de. IC. En el campo de la medicina, y específicamente en el de los análisis clínicos, la. organismo puede ser de gran importancia para la prevención, diagnóstico y control. Y. BI. O. de enfermedades.16. IA. Las proteínas son parte básica de la estructura de la célula viviente y están. AC. indisolublemente ligadas a casi todas sus funciones. Sirven como componentes. FA RM. estructurales de las células, enzimas, algunas hormonas, algunos receptores de hormonas, moléculas de transporte, factores de la coagulación, etc.17. DE. Están compuestas por combinaciones de los 20 aminoácidos esenciales que se unen. O TE CA. entre si por uniones sustituidas de amidas (enlace peptídico) entre el grupo carboxilo de un aminoácido (aa) y el grupo amino del (aa) siguiente. De lo anterior se deduce que las proteínas plasmáticas son numerosas y tienen. BL I. diferentes funciones, para mayor especificación, Ej. Albúmina o serina, proteína de. BI. transporte por antonomasia; factores de la coagulación; inmunoglobulinas; lipoproteínas; transferrina; alfa1 antitripsina; ceruloplasmina; haptoglobina, etc. Difieren entre sí por los tipos de aminoácidos que presente, su disposición, cantidad, peso molecular y cambios superficiales, entre otros aspectos. Por lo tanto, el número de proteínas es infinito, ya que la permutación de veinte posiciones posibles, con las consecuencias que esto origina, así lo hace posible. De aquí se desprende que si las proteínas intervienen en las defensas del organismo, es decir la inmunidad, las posibilidades de crear estrategias defensivas específicas son realmente igual de infinitas.16, 17 4. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. La presencia de proteínas en el plasma es un reflejo dinámico de su movimiento en el líquido extracelular, y, si bien es cierto que se espera, con razones lógicas, que se encuentren en tal fluido, se desconoce la razón de la presencia de muchas otras, estrictamente desde el punto de vista funcional. Las proteínas plasmáticas son un reflejo o indicador de la absorción de aminoácidos producto de la digestión de las proteínas de la dieta y/o de la función de síntesis de los órganos especializados como el hígado y la integridad de la membrana filtrante del riñón que impide que escapen por la orina en su paso por el riñón.. 17, 18. A. El tipo de muestra determina el contenido de las proteínas ya que algunas de las. IC. mismas se consumen, por ejemplo durante la coagulación como sucede con el suero,. Q UI. M. mientras que el plasma conserva los factores de la coagulación; el nivel de los factores va disminuyendo según la labilidad de los mismos, a menos que se. BI. O. conserven a temperaturas extremadamente bajas. Es el caso del factor VIII y del fibrinógeno. Sin embargo, aún en el suero existen cantidades de los mismos aun. IA. Y. cuando son pequeñas, como el caso de los factores XI y XII.17. AC. El primer reto de las investigaciones relacionadas con las proteínas es saber si están o. FA RM. no presentes en una muestra. Esto es lo que se impone cuando, por lo general, estas muestras no poseen proteínas, y su presencia implica anormalidades o la cantidad de las proteínas es pequeña, al punto de ser indetectables con métodos comunes y por lo. DE. tanto se hace necesario el uso de técnicas especiales. Pero este caso no es el habitual. O TE CA. en el plasma, pues se espera encontrar muchas proteínas en el mismo. Se trata de lo que ocurre con líquidos biológicos como la orina o el líquido cefalorraquídeo. Por lo tanto, debemos tratar las técnicas diseñadas para saber cuánta proteína de cierto tipo. BL I. hay en una muestra de plasma o suero.18. BI. Es decir dosificar la concentración de masa proteica en la muestra. Este término se refiere a él conociendo de cuantos gramos o múltiplos del mismo contiene un volumen de la muestra (un litro). Esta cuantificación de masa se debe a que muchas proteínas son heterogéneas para su clase y dentro de una clase existen variantes, para ejemplificar: los subtipos de Hb A, A1, A1c, A1b, As, SS, AF, las subclases de Inmunoglobulinas (Igs) G, A, M, D, E. 17, 18 Los principales métodos empleados para la determinación de proteínas totales son los siguientes: Método del Biuret: En solución alcalina el Cu+2 reacciona con el enlace peptídico de las proteínas dando un color purpúreo que se cuantifica 5. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. espectrofotométricamente. (540nm).. Método. de. Lowry:. Dependen. de. la. concentración de tirosina y triptófano de la muestra. Consiste en dos reacciones: 1. Reacción de Biuret 2. Reacción de Folin: característica de los grupos –OH reductores de los aminoácidos tirosina y triptófano que, junto con los complejos Cu+2, reducen el reactivo de Folin generando un color azul. Está sujeto a muchas interferencias. Se utiliza fundamentalmente en orina. La turbidimetría mide la radiación transmitida de forma similar a la espectrofotometría de absorción molecular (aunque en ésta se mide la. radiación absorbida). Se puede llevar a cabo en un espectrofotómetro aunque. requiere ser aplicada a soluciones. suficientemente. A. convencional,. IC. concentradas que originen disminuciones importantes en la potencia de la radiación. Q UI. M. transmitida. La nefelometría consiste en evaluar la dispersión de la radiación por las partículas de una disolución o suspensión, midiéndose la potencia de la radiación. BI. O. dispersada en un ángulo diferente al de la radiación incidente, por lo general, en un. Y. ángulo igual o menor a 90º respecto al eje horizontal. El Proteinograma es una. IA. representación gráfica de la distribución de las distintas fracciones de las proteínas. AC. plasmáticas. Se basa en la separación de las proteínas en función de su masa y su. FA RM. carga, tras someterlas a un campo eléctrico. Es una representación densitométrica de las bandas obtenidas tras someter al suero a electroforesis y es complementario a la determinación de proteínas totales en suero.18, 19.. DE. Las alteraciones que presentan el estudio de las proteínas plasmáticas se conocen con. O TE CA. el nombre genérico de disproteinemias. En el laboratorio bioquímico clínico el método de elección para su estudio es el proteinograma electroforético.18 La mayoría de las proteínas plasmáticas sufren alteraciones por exceso o disminución. BL I. de las mismas, debemos aclarar que la excepción es la albúmina, cuya única. BI. patología corresponde a una disminución, siendo los principales órganos involucrados el hígado (por disminución de la síntesis) y el riñón (por aumento en la eliminación).19. Para la obtención de resultados exactos y precisos con alto grado de seguridad es indispensable realizar la validación del método analítico, que se utilizará en la cuantificación de proteínas totales séricas, con el fin de asegurar la confiabilidad y establecer una evidencia documentada del procedimiento. 6. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Conociendo la importancia del proceso de validación dentro del Sistema de Gestión de Calidad y conociendo también que valores erróneos traen como consecuencia un mal diagnóstico es que se decidió realizar éste trabajo de investigación; para lo cual se planteó la siguiente interrogante: ¿Cumplirá con los criterios de validación del método para la cuantificación de proteínas totales séricas utilizando el kit de reactivos Wiener Lab empleado en el laboratorio Quintanilla S.R.L.? Los objetivos a alcanzar fueron:. A. Validar el método analítico para la cuantificación de proteínas totales. IC. séricas utilizando el kit de reactivos Wiener Lab empleado en el laboratorio. Q UI. . M. Quintanilla S.R.L.. Determinar los parámetros de validación del método analítico para la. BI. O. cuantificación de proteínas totales séricas: linealidad, exactitud, precisión,. Y. límite de cuantificación, recuperación y robustez, utilizando el kit de reactivos. AC. IA. Wiener Lab empleado en el laboratorio Quintanilla S.R.L.. O TE CA. MATERIALES. DE. FA RM. II. MATERIAL Y MÉTODO. Muestra: Suero Patrón: solución de Albúmina y globulinas en estado nativo con título conocido de Proteínas Totales (Biuret o. BI. BL I. Kjeldhal): 9,6 g/dL y Albúmina (Unión BCF): 5,40 g/dL.. Materiales de Laboratorio Baño maría Tomos. Cronómetro Espectrofotómetro Stat Fax 3300. Gradilla de plástico Guantes de látex 7. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. . Micropipetas regulables de 5 µL a 50 µL (Pipet4u) y de 100 µL – 1000 µL (TECO DIAGNOSTICS).. Puntas para micro pipetas hasta 200 µL y hasta 1000 µL Tubos de ensayo.. Reactivos Reactivo EDTA/Cu: complejo EDTA/Cu 13mmol/l en NaOH 875 mmol/l y alquil aril poliéter (AAP).. IC. A. MÉTODO. Q UI. M. Cada una de las determinaciones a realizar se efectuará empleando la técnica descrita en el inserto del kit de reactivos de la marca provista por el fabricante. AC. Fundamento de la reacción:. IA. Y. BI. O. Wiener Lab (Ver anexo). FA RM. Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el ion cúprico, en medio alcalino, para dar un complejo color violeta con máximo de absorción a 540. la muestra.. DE. nm, cuya intensidad es proporcional a la concentración de proteínas totales en. O TE CA. Condiciones de Reacción:. - Longitud de onda: 540 nm en espectrofotómetro o en fotocolorímetro con filtro verde (520nm-560nm).. BL I. - Temperatura de reacción: 37°C.. BI. - Tiempo de reacción: 15 minutos - Volumen de muestra: 50 µL - Volumen de Reactivo EDTA/Cu: 3,5 ml - Volumen final de reacción: 3,55 ml PROCEDIMIENTO En tres tubos de fotocolorímetro marcados B (Blanco), S (Standard) y D (Desconocido), colocar: 8. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. B. S. D. Agua destilada. 50 µL. -. -. Suero Patrón. -. 50 µL. -. Muestra. -. -. 50 µL. Reactivo EDTA/Cu. 3,5 mL. 3,5 mL. 3,5 mL. Mezclar con varilla. Incubar 15 minutos a 37°C .Leer en espectrofotómetro a 540 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (520nm-560nm) llevando a cero con el Blanco. M. IC. A. de Reactivo.. Q UI. ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL: El color de la reacción es estable durante 12 horas por lo que la absorbancia debe ser. Y. BI. O. leída dentro de ese lapso.. IA. Para determinar si el método empleado en la cuantificación de proteínas totales. AC. séricas cumple con los criterios de validación, se evaluaron los siguientes test: 14. FA RM. Linealidad. Para evaluar la linealidad se hará uso de un estándar o suero patrón que viene con el. DE. kit de reactivos PROTI 2 de concentración para Proteínas Totales de 9,6 g/dL; con el cual se realizará diluciones cuyas concentraciones serán de 7,2g/dL; 4,8g/dL;. O TE CA. 3,6g/dL; 2,4 g/dL; las cuales serán analizadas cada uno por triplicado y por un mismo analista.. BL I. Precisión. Para determinar la precisión del método, se evaluará su repetibilidad y su. BI. reproducibilidad de la manera que se describe a continuación: Repetibilidad: Se realizarán un número de 10 determinaciones de la dilución de 7,2g/dL por un mismo analista, el mismo día, con los mismos reactivos y los mismos instrumentos. Precisión Intermedia: Para su determinación se empleará estándar de 7,2g/dL, el cual se analizará en dos días diferentes, por dos analistas en un número de tres determinaciones; por analista y por día. 9. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Exactitud Se la evaluará a través de un análisis repetitivo de 3 concentraciones: 9,6g/dL, 7,2g/dL y 2,4 g/dL. El análisis de cada uno de estos estándares se llevará a cabo por triplicado. Límite de Cuantificación Se determinará mediante el análisis repetitivo de un blanco. El blanco utilizado será el reactivo para la determinación de proteínas totales séricas del kit de reactivo. Q UI. M. IC. A. PROTI 2 y se llevarán a cabo 10 determinaciones.. BI. O. Robustez. Y. La robustez se determinará de acuerdo al diseño de Youden & Steiner, siendo las. IA. variables evaluadas: Temperatura de incubación, analista (2 analistas) y tiempo de. FA RM. AC. reacción.. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS 12,14. LINEALIDAD. DE. Cálculos para el test de Regresión. O TE CA. Fórmula empleada para el cálculo de la Pendiente o Coeficiente de Regresión “b”.. BL I. La pendiente b fue determinada empleando la fórmula siguiente:. BI. b. xy x. 2. x y. . n x 2 n. Donde: x= Concentración de las muestras utilizadas. y= Absorbancias obtenidas en las lecturas de las muestras n= Número de determinaciones. 10. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Fórmula empleada para el Cálculo del Intercepto “a” Su determinación se hizo mediante la siguiente fórmula:. y b x a n. Ecuación de la Recta de Regresión Con los datos obtenidos en este procedimiento se procedió a. Q UI. M. Donde:. IC. y bx a. A. elaborar la recta de regresión, la cual tuvo la siguiente fórmula:. y = Absorbancias obtenidas a partir de las lecturas de. BI. O. los estándares y muestras utilizadas.. Y. x = Concentración de las muestras utilizadas.. IA. b = Pendiente de la recta de regresión.. AC. a= Intercepto de la regresión lineal con el eje de. FA RM. ordenadas.. Cálculo del Coeficiente de Correlación “r”. O TE CA. DE. Para su determinación se empleó la siguiente fórmula:. BI. BL I. r . x2 . x xy n x y n. y. 2. y . 2. 2. . n. . Cálculo del Coeficiente de Determinación “r2” Se determinó mediante la siguiente fórmula:. r 2 (r )2. 11. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Cálculos efectuados en el Test de Linealidad de la Pendiente b Cálculo del valor de la varianza residual “ S 2y , x ” Se la halló a través de la siguiente fórmula:. y ay bxy 2. 2 y,x. S. n 2. A. Donde:. M. IC. b = Pendiente de la recta de regresión.. Q UI. a = Intercepto con el eje de ordenadas.. BI. O. n = # de determinaciones.. Y. Cálculo del valor de la varianza de la pendiente b “ S 2b ”. S 2y , x. S 2 b. x. 2. . ( x ) 2 n. O TE CA. DE. FA RM. AC. IA. Se determinó empleando la fórmula siguiente:. Cálculo del valor de la desviación estándar de la pendiente b “ Sb ”. BI. BL I. Se obtuvo a partir del valor de la varianza de la pendiente b ( S 2b ) mediante la siguiente fórmula:. Sb . S 2b. Fórmula empleada para determinar el Intervalo de Confianza de la Pendiente “b” Se empleó la siguiente fórmula:. Int.Conf . b tSb 12. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Donde: b = Pendiente. t = ttab para un nivel de significancia del 95% yn-2 grados de libertad.. Sb = Desviación estándar de la pendiente.. Cálculos efectuados en el Test de Proporcionalidad Cálculo de la Varianza del Término Independiente “ S a2 ”. A. Se utilizó la siguiente fórmula:. IC. x . 2. Q UI. 2 b. M. S S 2 a. BI. O. n. Y. Fórmula empleada para determinar la Desviación Estándar del. AC. IA. Término Independiente “Sa”. Sa . S a2. O TE CA. DE. fórmula:. FA RM. Para determinar la Desviación Estándar se utilizó la siguiente. Fórmula empleada para determinar el Intervalo de Confianza. BL I. del Intercepto “a”. BI. Para determinarla se aplicó la siguiente fórmula:. Int.Conf. a tSa Donde: a = Intercepto. t = ttab para un nivel de significancia del 95% y n-2 grados de libertad.. Sa =Desviación estándar del intercepto. 13. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Cálculo del valor de texp El valor de texp se determinó empleando la siguiente fórmula:. b Sb. t exp . Donde:. b = Pendiente de la recta de regresión.. Sb = Desviación estándar de la pendiente b.. A. El método será lineal si, para la pendiente (b) texp es mayor al. M. IC. ttab y para el intercepto (a) texp es menor al ttab, con el 95% de. Q UI. confianza y n-2 grados de libertad con el 95% de confianza y n2 grados de libertad y el coeficiente de correlación (r) es igual o. Y. BI. O. mayor que 0,990.. AC. Repetibilidad. IA. PRECISIÓN. FA RM. Determinación de las concentraciones prácticas a partir de las absorbancias. Los valores de las concentraciones prácticas se. DE. obtuvieron al empelar la fórmula elaborada a partir de la. BI. BL I. O TE CA. ecuación de la recta obtenida en la curva de calibración:. x . ya b. Donde: x = Concentración práctica y = Absorbancia b = Pendiente de la recta de regresión. a = Intercepto de la regresión lineal con el eje de ordenadas. Determinación de la Media “ x ” Se utilizó la fórmula siguiente: n. x 14. . xi. i 1. n. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Donde: x Media. n = Número de determinaciones Determinación de la Desviación Estándar “s”. S. M. i1. x. 2. i. IC. x n. A. Para hallarla se empleó la fórmula siguiente:. BI. O. Q UI. n 1. Y. Determinación del Coeficiente de Variación (CV). AC. IA. Se hizo uso de la fórmula descrita a continuación:. FA RM. CV . Donde:. S * 100 x. x = Media. O TE CA. DE. s = Desviación Estándar. Determinación de los Intervalos de Confianza Individual y de la. BI. BL I. Media.. Se hicieron uso de las siguientes fórmulas: Intervalos de Confianza Individual. x t tab * S Donde: x. Media. ttab=. Valor de t tablas para un 95% de confianza y n-1 grados de libertad.. s = Desviación estándar 15. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Intervalo de Confianza de la Media. s n. x t tab * Donde:. A. x Media. IC. ttab= Valor de t tablas para un 95% de confianza. Q UI. M. y n-1 grados de libertad. s = Desviación Estándar. IA. Precisión Intermedia:. Y. BI. O. n = Número de determinaciones.. AC. Los valores de concentraciones prácticas, de la media, de la. FA RM. desviación estándar, del coeficiente de variación y de los Intervalos de Confianza se obtuvieron de manera idéntica que. DE. en el test de repetibilidad. El método será preciso si en los procedimientos de Repetibilidad. O TE CA. y Precisión Intermedia se obtiene un coeficiente de variación. BL I. menor al 2%.. EXACTITUD. BI. Cálculo de las concentraciones prácticas a partir de las absorbancias Las concentraciones fueron obtenidas mediante la siguiente fórmula, obtenida a partir de la curva de calibración:. x . ya b. Donde: x = Concentración práctica 16. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. y = Absorbancia. Cálculo del Porcentaje de Recuperación En la determinación de la exactitud del método los valores de las concentraciones se expresaron como porcentaje de recuperación de la siguiente forma:. cc. Pr áctica 100 cc.Teórica. % Re cuperación . A. Cálculos efectuados en la aplicación de la Prueba t Student. IC. Para la aplicación de esta prueba fue necesaria la. O. 100 % R n CV. Y. BI. texp . Q UI. M. determinación del valor de texp mediante la siguiente fórmula:. IA. Donde:. AC. % R = Valor del promedio de los % de. FA RM. recuperación.. n = Nº de determinaciones.. DE. CV = Coeficiente de variación.. O TE CA. El método será exacto si el valor de ttab es mayor que el texp, al 95% de confianza y n-1 grados de libertad en la aplicación de la. BL I. t Student.. BI. LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN Se obtuvo mediante la aplicación de la siguiente fórmula:. CLQ . K Sbl b. Donde: CLD =Límite de detección. CLQ =Límite de cuantificación. K. = Constante (3 para el límite de detección y 17. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 10 para el límite de cuantificación). b = Pendiente obtenida en el test de linealidad.. ROBUSTEZ Se empleó el diseño de Youden & Steiner, el cual se muestra en. 8. a. IC. a. A. B. M. Factor / Prueba. 1. 2. 3. 4. 5. 6. A/a. A. A. A. A. a. B/b. B. B. b. b. B. b. B. C/c. C. C. C. c. C. c. C. C. Resultado. s. t. u. v. x. y. Z. Q UI. A. 7. O. el siguiente esquema:. IA. Y. BI. w. AC. Siendo:. FA RM. A: Temperatura de reacción: 20°C. a: Temperatura de reacción: 37°C. B: Analista 1. DE. b: Analista 2. O TE CA. C: Tiempo de Reacción: 5 minutos. c: Tiempo de Reacción: 10 minutos. s, t, u, v, w, x, y, z: concentraciones de proteínas totales. BI. BL I. determinadas en cada prueba.. A continuación se procederá a determinar las diferencias para cada factor, empleando la fórmula siguiente: VA = 1/4 (s+t+u+v) - (w+x+y+z) VB = 1/4 (s+t+w+x) - (u+v+y+z) VC = 1/4 (s+u+w+y) - (t+v+x+z) Vx S 2 Donde: VA, VB, VC =Valor de las diferencias existentes entre las variables 18. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. estudiadas. Si V x S 2 y la diferencia no es significativa, el método será robusto para esa variable. (S = desviación estándar hallada en el. BI. BL I. O TE CA. DE. FA RM. AC. IA. Y. BI. O. Q UI. M. IC. A. test de repetibilidad).. 19. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II.. RESULTADOS. Cuadro 1: Parámetro de Linealidad de la validación del método analítico para proteínas totales séricas en el laboratorio Quintanilla S.R.L. Estimadores estadísticos. Criterio de. Resultado. Conformidad. r > 0,990. 0,996719. Conforme. r2> 0,990. 0,9934. Conforme. aceptación Coeficiente de correlación (r). A. Coeficiente de. Resultado. O. Criterio de. Conformidad. BI. Estimadores estadísticos. Q UI. M. IC. determinación (r2). IA. Y. aceptación. AC. Test de verificación de la. de LC no incluye el LS= 0,043990. DE. a. Límite. FA RM. pendiente. O TE CA. confianza (LC) cero. texp>ttabla. Conforme. texp= 44,4022 ttabla= 2,160. BL I. b. Test de t. LI= 0,039909. Test de verificación de la. BI. variable independiente a. Límite. LS= 0,009812. de. confianza (LC) LC incluye el cero. b. Test de t. texp < ttabla. LI= -0,015065. Conforme. texp= 0,4560 ttabla= 2,160. ttabla: 2,160 para: α = 0,05 y n-2 grados de libertad Límite inferior (LI) Límite superior (LS) 20. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IC A. Gráfico 1: Recta de regresión obtenida en el test de Linealidad, empleado en la cuantificación de la Proteínas Totales.. BI. O. 0.450. Y. 0.400. AC. IA. 0.350. M. 0.300. FA R. 0.250 0.200. DE. ABSORBANCIAS. y = 0.0419x - 0.0026 R² = 0.9934. Q. UI M. LINEALIDAD. CA. 0.150. 0.000 0.00. 2.00. BI. 0.050. BL. IO TE. 0.100. 4.00. 6.00. 8.00. 10.00. CONCENTRACION TEORICA. 21. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/. 12.00.
(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Cuadro 2: Parámetro de precisión de la validación del método analítico para determinar proteínas totales séricas en el laboratorio Quintanilla S.R.L. Estimadores estadísticos. Criterio de aceptación. Resultado. Conformidad. Repetibilidad. C.V< 2 %. 0,944314 %. Conforme. Precisión Intermedia. C.V< 2 %. 0,7833 %. Conforme. A. Cuadro 3: Parámetro de exactitud de la validación del método analítico para determinar. t Student. t exp< t tab. Resultado. M. Criterio de aceptación. Q UI. Estimadores estadísticos. IC. proteínas totales séricas en el laboratorio Quintanilla S.R.L.. Conforme. Y. BI. O. 0,4079 < 2,306. Conformidad. AC. IA. Cuadro 4: Límite de cuantificación de la validación del método analítico para. FA RM. determinar proteínas totales séricas en el laboratorio Quintanilla S.R.L. Parámetro. 0,101 g / dL. DE. Límite de cuantificación. Resultado. O TE CA. Cuadro 5: Parámetro de robustez de la validación del método analítico para determinar proteínas totales séricas en el laboratorio Quintanilla S.R.L Criterio de aceptación. Factores. Resultado. Conformidad. Temperatura de reacción. 0,0345 < 0,099. Conforme. Analista. -0,019 < 0,099. Tiempo de reacción. -0,012 < 0,099. BI. BL I. Estimadores estadísticos. Vx. Vx S 2 Conforme. Conforme. IV .DISCUSIÓN. 22. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. En el presente trabajo se desarrolló la validación del método analítico para determinar proteínas totales séricas en el laboratorio Quintanilla S.R.L. Los test a evaluar en un estudio de validación de un método dependerán de la naturaleza del mismo. Para determinar si el método empleado en la cuantificación de proteínas totales séricas cumple con los criterios de validación, se evaluaron los siguientes test: Linealidad, Precisión, Exactitud, Límite de cuantificación y Robustez.. La linealidad es la capacidad del método analítico para obtener resultados directamente. A. proporcionales a la concentración o cantidad del analito en un rango definido. Se. IC. determina mediante el tratamiento matemático de los resultados obtenidos en el análisis. Q UI. M. del analito a diferentes cantidades o concentraciones. La selección del rango y del número de puntos experimentales está estrictamente relacionada con la aplicación del. BI. O. método. La curva de regresión se determinó sobre los puntos individuales sin promediar. Y. por el método de los mínimos cuadrados. En el eje de las "x" apareció la cantidad o la. IA. concentración del analito y en el eje "y", la respuesta analítica (absorbancia), así como. AC. también la variable independiente (b) y la dependiente (a) 20. Nº 01) demuestra el intervalo de. FA RM. La linealidad del método evaluado (cuadro. concentración teórica comprendido entre 2,4-9,6 g/dL con un coeficiente de correlación de 0,996719 y un coeficiente de determinación de 0,9934 (cercanos a la unidad) que. DE. indica la existencia de una proporcionalidad lineal entre las concentraciones de. O TE CA. proteínas totales respecto a la absorbancia, con un grado de probabilidad del 95%. Además de obtener la ordenada al origen que pasa por cero con un α de 0,05;. de varianza.. BL I. obteniéndose una diferencia altamente significativa de la regresión lineal en el análisis. BI. Según AEFI, Bioanalytical Methods Validation e ICH establecen para el test de Linealidad, que el coeficiente de correlación debe ser mayor o igual r > 0,990. Los valores obtenidos suponen una correlación aceptable con una probabilidad superior al 99,90%.14 Para confirmar que dicha regresión era lineal se aplicaron diferentes test de linealidad, considerando el t Student, tal como se muestra en la cuadro Nº 1, para que cumpla con los criterios de aceptabilidad según los organismos internacionales: texp> ttab, y valor del texp (44,402211) obtenido es mucho mayor al ttab (2,16) (n-2= 13 grados de libertad) con 23. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. un nivel de confianza del 95 %, con esto nos demuestra que el método cumple con el test de linealidad. También se observa en la ecuación resultante del test de linealidad para hallar las concentraciones, la pendiente “b” indica la sensibilidad de calibración o del método y se expresa en unidades de respuesta sobre unidades de concentración o cantidad del analito. La sensibilidad analítica relaciona la aleatoriedad de la respuesta con la aleatoriedad debida a la variación de la concentración, es inversamente proporcional a la capacidad de detectar pequeñas diferencias en la concentración del analito, y se obtiene. IC. A. dividiendo la pendiente de la curva de calibración por la desviación estándar de las. M. respuestas en cada punto o concentración. Se considera que a mayor pendiente, mayor. Q UI. sensibilidad y que mientras más pequeño sea el coeficiente de variación de la pendiente. O. mayor será la linealidad (coeficientes de variación de la pendiente mayores que el 5,0 %. Y. BI. indican falta de linealidad).14, 20. IA. El término “a” independiente u ordenada en el origen, Es el estimador que se relaciona. AC. con la presencia de interferencias o errores sistemáticos. El intervalo de confianza del. FA RM. intercepto debe incluir al cero para cumplir con el requisito de proporcionalidad (como se exige para el cumplimiento de la ley de Lambert-Beer en los métodos. DE. espectrofotométricos). 20. O TE CA. También podemos apreciar que en la concentración 9,6 g/dL los puntos están fuera de la recta debido a que su concentración es amplia y hubo diluciones, si bien esta alejado del promedio se considera que hubo error humano.. BL I. En lo que respecta al test de precisión, expresa el grado de dispersión entre una serie de. BI. medidas de tomas múltiples a partir de una misma muestra homogénea en las condiciones prescritas. El objetivo es conocer la variabilidad del método de ensayo, esta variabilidad es debida a errores aleatorios inherentes a todo el método de ensayo. Como consecuencia los análisis efectuados sobre muestras idénticas, en las mismas circunstancias, no conducen generalmente a resultados idénticos. Los factores susceptibles de influir sobre los resultados de un ensayo no pueden ser siempre controlados (analista, equipo instrumental, reactivos, tiempo, etc.), de aquí la importancia del estudio de la precisión.14. 24. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. La precisión se expresa matemáticamente por el coeficiente de variación, AEFI establece que el coeficiente de variación sea menor que 2 %. En el caso de la determinación de la repetibilidad, tal como se muestra en el cuadro Nº 2 se obtuvo un coeficiente de variación igual a 0,944 %, siendo menor al valor máximo del criterio de aceptación. 21 Referente a la precisión intermedia, estudia la variabilidad del método efectuando una serie de análisis sobre la misma muestra pero en condiciones operativas diferentes (diferentes analistas, aparatos, días, etc.) y en un mismo laboratorio. El cual se realizó. A. en diferentes días, en el cuadro Nº 02, se presenta un C.V.= 0,7833 % y lo establecido. Q UI. M. IC. por la AEFI que sea menor al 2%.20. La exactitud indica la capacidad del método analítico para obtener resultados lo más. BI. O. próximos posibles al valor verdadero. A diferencia de la precisión, que refleja el error. Y. aleatorio, la exactitud refleja el error sistemático o la tendencia a él. Cuando existen. IA. interferencias en el método por falta de selectividad (desviación por exceso en los. AC. resultados), o cuando se trata de métodos analíticos muy laboriosos (desviación por. FA RM. defecto en los resultados), el método se considera no exacto o biasado. Para asegurar una buena exactitud, es necesario eliminar los errores que no están sujetos a tratamiento estadístico (calibración o control incorrectos de equipos), los errores inherentes a. DE. blancos (errores constantes) y los que dependen de la cantidad del analito presente. O TE CA. (errores proporcionales). Ellos opinan que la mejor manera de identificar estos errores será realizando una prueba interlaboratorio. 14,20. BL I. Para determinar la exactitud, se obtuvo el porcentaje de recuperación media el cual fue. BI. de 99,7618 %, no existiendo diferencia significativa con el 100 %. En el cuadro Nº 03 se observa un texp = 0,41 que es menor al ttab = 2,306, teniendo como criterio de aceptación que el ttab debe de ser mayor al texp, con esto el método cumple con el test de exactitud.14 Límite de cuantificación es la mínima cantidad de un analito presente en la muestra que podemos determinar con una precisión y exactitud adecuadas, se expresan. como. concentración del analito. En el cuadro Nº 04 se observa el Límite de cuantificación de 0,101 g/dL, siendo resultados óptimos y muy aceptados. 20. 25. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Finalmente, la robustez, es la medida de su capacidad para permanecer inalterado ante pequeñas pero deliberadas variaciones en ciertos parámetros, proporcionando idea de su fiabilidad o estabilidad durante su empleo en rutina. En el estudio, los cambios a los que fue sometido el método analítico, en concentración de 9,6 g/dL fueron: la variación de analistas, tiempo de reacción (5 minutos y 10 minutos) y temperatura de reacción (20oC y 37oC). Se consideran como aceptables aquellos valores absolutos de las diferencias obtenidas de acuerdo al diseño de Youden & Steiner que sean menores o iguales al valor del producto de su desviación estándar. A. multiplicado por 2, en el cuadro Nº 05 se observa que el valor del producto de su. IC. desviación estándar multiplicado por 2 es 0,099, y los resultados obtenidos en cada. Q UI. M. operación son de 0,0345; -0,019 y -0,012, siendo estos valores menores a 0,109. Tomando en cuenta esto, se aprecia en los resultados que el método es robusto a las. O. variaciones de analistas, tiempo de reacción (5 minutos y 10 minutos) y temperatura de. Y. BI. reacción (20 oC y 37 oC). Al haberse comprobado experimentalmente que no hay. AC. BI. BL I. O TE CA. DE. FA RM. límites de temperatura establecidos.14, 21. IA. influencia de los factores estudiados recomienda la realización de este test dentro de los. 26. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. V .CONCLUSIONES . Se validó el método analítico para la cuantificación de proteínas totales séricas utilizando el kit de reactivos Wiener Lab en el laboratorio Quintanilla S.R.L.. . Se determinó los parámetros de validación del método analítico para la cuantificación de proteínas totales sérica en el laboratorio Quintanilla S.R.L, siendo : - Lineal, con un “r” = 0,996719 con valor del texp = 44,402211 obtenido. IC. A. un nivel de confianza del 95 %.. con. Q UI. M. - Preciso, con coeficiente de variación igual a 0,944 % para repetibilidad y con. O. coeficiente de variación igual a 0,7833 % para precisión intermedia.. BI. - Exacto, con un porcentaje de recuperación media de 99,7618 % y texp = 0,407;. IA. Y. tiene un límite de cuantificación de 0,101g/dL.. AC. - Robusto, al emplear diferentes analistas, diferentes tiempos de reacción de 5 y. FA RM. 10 minutos y temperatura de reacción de 20oC y 37oC, cumpliendo con los. BI. BL I. O TE CA. DE. parámetros de validación establecidos.. 27. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. VI .REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Organización Panamericana de la Salud. Curso de Gestión de Calidad para Laboratorios.[Fecha de Acceso: 11 de Agosto del 2012] Disponible en: http://www.paho.org/Spanish/AD/THS/EV/labs-CGC.htm 2. García R. Gestión de Calidad de Anatomía Patológica.. Aplicación. Informática.2007 .[Fecha de Acceso: 11 de Setiembre del 2012] Disponible en: http://www.patologia.es/volumen42/vol42-num2/pdf%20patologia%2042-2/42-. IC. A. 02-02.pdf. M. 3. Oficina de las Naciones Unidas. Directrices para la validación de métodos. Q UI. analíticos y la calibración del equipo utilizado para el análisis de drogas ilícitas. del. 2012]. BI. Agosto. O. en materiales incautados y especímenes biológicos. [Fecha de Acceso: 11 de Disponible. en:. Y. http://www.unodc.org/documents/scientific/Validation_Manual_STNAR41_Ebo. AC. IA. ok_S.pdf. FA RM. 4. Duffau B et al: Validación de métodos y determinación de la incertidumbre de la medición: “Aspectos generales sobre la validación de métodos”.2010. Instituto de Salud Pública. Santiago de Chile. [Fecha de Acceso: 12 de Agosto del 2012] en:. DE. Disponible. O TE CA. http://www.ispch.cl/sites/default/files/documento_tecnico/2010/12/Guia%20T% C3%A9cnica%201%20validaci%C3%B3n%20de%20M%C3%A9todos%20y% 20determinaci%C3%B3n%20de%20la%20incertidumbre%20de%20la%20medi. BL I. ci%C3%B3n_1.pdf. BI. 5. Crubellati R. Aspectos prácticos de la validación e incertidumbre en medidas químicas.2009. Argentina. [Fecha de Acceso: 18 de Agosto del 2012] Disponible en: www.validacion_e_incertidumbre_en_medidas_quimicas.pdf 6. Guía para la validación y la verificación de los procedimientos de examen cuantitativos empleados por el laboratorio clínico. 2008. México. [Fecha de Acceso:. 18. de. Agosto. del. 2012]. Disponible. en:. http://www.ema.org.mx/descargas/guias_tecnicas/ensayos_clinicos/laboratoriosc linicosv00.pdf. 28. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 7. International Organization for Standardization. Quality management principles. 2012. [Fecha de Acceso: 20 de Agosto del 2012] Disponible en: http://www.iso.org/iso/qmp_2012.pdf 8. Guía de Validación de Métodos de Ensayo en Laboratorios Clínicos.2011. Ecuador. [Fecha de Acceso: 20 de Agosto del 2012] Disponible en: http://www.oae.gob.ec/files_oae/evaluadores/OAE_G04_R00_Guia_validacion_ Clinicos.pdf 9. Ministerio de Salud. Manual de Buenas Prácticas de Manufactura de Productos. A. Farmacéuticos. Informe de la Dirección General de Medicamentos, Insumos y. IC. Drogas: DIGEMID. 1999. Pag. 19-20, 26.. Q UI. M. 10. Lagarto A et al : Validación del método de determinación de efecto anestésico. BI. http://scielo.sld.cu/pdf/far/v46n2/far07212.pdf. O. local.2012. Cuba. [Fecha de Acceso: 22 de Agosto del 2012] Disponible en:. Y. 11. Rodríguez G. Aseguramiento de la calidad analítica y norma ISO 17 025 en. IA. laboratorios clínicos y químicos.2001. Costa Rica. [Fecha de Acceso: 22 de. AC. Agosto del 2012] Disponible en: http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?pid=S0253-. FA RM. 29482001000100009&script=sci_arttext. 12. Díaz M et al: Validación de técnicas analíticas utilizadas en el control de la calidad.2000. Cuba. [Fecha de Acceso: 26 de Agosto del 2012] Disponible en:. DE. http://bvs.sld.cu/revistas/far/vol32_2_98/far05298.pdf. O TE CA. 13. Validación de Procesos. Consultoría en calidad y GMP[Fecha de Acceso: 26 de Agosto del 2012] Disponible en: Disponible en: http://www.infodynamics.com.uy/index.php?Itemid=61&id=33&option=com_c. BL I. ontent&task=view. BI. 14. Castro M et al: Validación de Métodos Analíticos. Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria (AEFI). Sección Catalana. Ed Farma Internacional. España.2001. pp.: 13-55. 15. Cortés G. Lineamientos para el control de calidad analítica.2000. Bogotá .[Fecha de. Acceso:. 12. de. Setiembre. del. 2012]. Disponible. en. :. http://www.medigraphic.com/pdfs/patol/pt-2010/pt104e.pdf 16. Torres P et al: Aseguramiento de la calidad en la etapa analítica en química clínica.2006.Cuba .[Fecha de Acceso: 12 de Setiembre del 2012] Disponible en : http://redalyc.uaemex.mx/redalyc/pdf/2111/211118053006.pdf 29. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
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(41) BI. O. Q UI. M. IC. A. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. BI. BL I. O TE CA. DE. FA RM. AC. IA. Y. ANEXOS. 31. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(42) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo Nº 1: Información sobre reactivos usados en el ensayo de Validación Proti 2. Proteínas Totales Lote 1105068760 Exp. /Venc. 05/2013. Estándar Lote Exp. /Venc.. 068760 05/2013. 3 1. 2. BL I. 3. BI. Muestra 5. 1 2 3. 0.378. 3.63. 92. 9.60. 4.07. 92. 0.295. 2.12. 52. 0.301. 2.17. 52. 7.20. 0.304. 2.19. 52. 4.80. 0.195. 0.94. 23. 4.80. 0.198. 0.95. 23. 4.80. 0.202. 0.97. 23. 3.60. 0.150. 0.54. 13. 3.60. 0.147. 0.53. 13. 3.60. 0.151. 0.54. 13. 2.40. 0.100. 0.24. 6. 2.40. 0.095. 0.23. 6. 2.40. 0.097. 0.23. 6. A. 9.60. 0.424. IA. AC. DE 1. O TE CA. Muestra 4. 92. FA RM. 1. 3. 3.81. 7.20. 3. 2. 0.397. 7.20. 2. Muestra 3. 9.60. BI. Muestra 2. X2. IC. 2. XY. M. 1. Absorbancia (Y). Y. Muestra 1. g/dL (X). O. Nº Repeticiones. Q UI. Anexo Nº 2: Datos experimentales obtenidos en el test de Linealidad. 32. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
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