Efecto antibacteriano in vitro de un enjuague bucal a diferentes concentraciones a base de extracto etanólico de stevia rebaudiana sobre el crecimiento de streptococcus mutans atcc 25175

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. FACULTAD DE ESTOMATOLOGÍA. AT O. LO. G. IA. -B. IB LI. O. ESCUELA DE ESTOMATOLOGÍA. TE CA. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. M. “Efecto antibacteriano in vitro de un enjuague bucal. TO. a diferentes concentraciones a base de extracto. DE. ES. etanólico de Stevia rebaudiana sobre el crecimiento. TA D. de Streptococcus mutans ATCC 25175” Becerra Quiroz, Layla Marinés. ASESORA: Dra. Teresa E. Ríos Caro.. FA. CU L. AUTORA:. TRUJILLO – PERÚ 2016. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA. TE CA. A mi confidente y soporte en adversidades, Dios, por guiar mi camino de tu mano haciéndome sentir que nunca estoy sola, enseñándome que todo. O. es posible con un corazón humilde, permitiendo que llegue hasta este. IB LI. momento tan importante de mi formación profesional.. -B. A mi querida mami: LUCINDA CHACÓN ROMERO, considerada por. LO. G. sapiencia.. IA. todos los que te queremos como nuestro pilar, por tu amor infinito y gran. AT O. A mis queridos padres: GLADIS Y ANTONIO. Por darme la vida y estar conmigo en todo momento, por su apoyo, comprensión y enseñarme que. TO. M. los sueños pueden ser más que eso.. ES. A mis lindas hermanitas: CINTHYA Y KIARA, cómplices y amigas;. DE. mosqueteras en la vida ―una para y todas para una‖.. TA D. A mi querida tía: HAYDEÉ, a quien considero como una madre y amiga,. FA. CU L. por compartir momentos significativos y tu disposición para escuchar y aconsejar a esta señorita de ―locas ideas‖.. A mi pequeña, SOFIA EMILIA, por tener esa inocencia que nos saca más de una sonrisa y llena nuestras vidas de mucha felicidad.. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. AGRADECIMIENTOS ―Donde hay fe hay amor, donde hay amor hay paz, donde hay paz esta. TE CA. Dios y donde está Dios no falta nada‖. Mi agradecimiento será infinito hacia ti y sobre todas la cosas, por darme lo más hermoso, mi familia.. O. A mis padres GLADIS Y ANTONIO, la vida no me alcanzará para. IB LI. retribuirles todo cuánto me ha sido dado, a ustedes les debo mi formación. -B. en principios y valores como persona. Los quiero mucho; en cada. IA. elección y decisión son sus palabras las que me hace continuar con. LO. G. coraje y perseverancia este arduo, pero gratificante camino.. AT O. A mis hermanitas CINTHYA, KIARA, y demás familiares; por depositar su. M. confianza en mi persona.. TO. A la Dra. TERESA RÍOS CARO, por su gentileza, dedicación y excelencia. paciencia brindados.. DE. ES. como mi asesora en la realización de este trabajo. Por su tiempo y. TA D. A las Dras. ELVA MEJÍA RÍOS Y MARILÚ SOTO VÁSQUEZ, por su. FA. CU L. paciencia, amabilidad, empeño y disposición para la ejecución del presente trabajo.. A LUIS MIGUEL, por ser la persona maravillosa que eres y además de ello, ser mi amigo. Destino o casualidad fueron los que permitieron encontrarnos para compartir esta carrera, que es nuestra pasión.. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN Objetivo: El presente estudio de tipo experimental, tuvo como objetivo. TE CA. determinar la actividad antibacteriana in vitro de un enjuague bucal a base de extracto etanólico de hojas de Stevia rebaudiana sobre Streptococcus. O. mutans ATCC 25175.. IB LI. Materiales y método: Los extractos se obtuvieron a partir de hojas frescas de Stevia rebaudiana, para luego ser agregado con solventes en. -B. la elaboración de un enjuague bucal a seis concentraciones en etanol de. IA. 70° y seis concentraciones en etanol de 30°. La concentración inhibitoria. LO. G. mínima se obtuvo por el método de dilución en caldo y agar y para el. AT O. efecto bactericida se empleó la técnica de difusión de discos de Kirby y Bauer.. M. Resultados: El análisis estadístico permitió seleccionar a la CMI en 1,07. TO. mg/mL en el enjuague a base de extracto de Stevia rebaudiana en etanol. ES. de 70° y la concentración de 2,14 mg/mL, en etanol de 30° (p> 0.05).. DE. Mientras la CMB en 75mg/mL en el enjuague bucal trabajado en etanol de. TA D. 70° y siendo estadísticamente nulo en etanol de 30° (p< 0.01). Conclusión: El enjuague bucal a base extracto etanólico de Stevia. CU L. rebaudiana posee efecto antibacteriano sobre Streptococcus mutans. FA. ATCC 25175. Palabras clave: Bactericida, Stevia, antiséptico bucal, Streptococcus mutans.. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT. TE CA. Objective: This experimental study, aimed to determine the antibacterial activity in vitro of a mouthwash based ethanol extract of leaves of Stevia. O. rebaudiana on Streptococcus mutans ATCC 25175.. IB LI. Materials and Methods: The extracts were obtained from fresh leaves of Stevia rebaudiana, before being added solvent in the preparation of a. -B. mouthwash to six concentrations of ethanol 70 ° and six concentrations of. IA. ethanol 30 °. The minimum inhibitory concentration was obtained by the. LO. G. broth dilution method and agar and the bactericidal effect diffusion. AT O. technique of Kirby and Bauer disc was used.. Results: statistical analysis allows to select the MIC 1.07 mg / mL based. M. on the rinse extract Stevia rebaudiana in ethanol 70 ° and the. TO. concentration of 2.14 mg / mL in ethanol 30 ° (p> 0.05). While the WBC. ES. 75mg / mL in the mouthwash worked in ethanol 70 ° and being statistically. DE. null in ethanol 30° (p <0.01).. TA D. Conclusion: that the ethanol extract mouthwash Stevia rebaudiana has antibacterial effect on Streptococcus mutans ATCC 25175.. FA. CU L. Keywords: Bactericide, mouthwash, Stevia, Streptococcus mutans.. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. TE CA. ÍNDICE. DEDICATORIA. IB LI. O. AGRADECIMIENTOS. -B. RESUMEN. LO. G. IA. ABSTRACT. INTRODUCCIÓN……………………………………………….…..7. II.. MATERIAL Y MÉTODOS…………………………………………28. III.. RESULTADOS……………………………………………………..51. IV.. DISCUSIÓN………………………………………………………...54. V.. CONCLUSIONES………………………………………………….62. VI.. RECOMENDACIONES……………………………………………63. DE. ES. TO. M. AT O. I.. TA D. VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………64. FA. CU L. VIII. ANEXOS……………………………………………………………78. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN.. TE CA. Actualmente en nuestro país, la caries dental es un problema de salud pública, siendo aún la atención odontológica de elevado costo y no. accesible a toda la población; teniendo en cuenta que la fitoterapia es una. IB LI. O. alternativa viable para todos los profesionales de la Salud en el. tratamiento de diversas patologías; por ello, se apuesta a tratamientos. -B. preventivos en donde se propone el uso de la Stevia rebaudiana, por sus. IA. bondades antibacterianas hipocalórias y accesible por su bajo costo lo. LO. G. que la calificaría para ser usada como un método en la prevención de. AT O. múltiples enfermedades, entre las que podría estar la caries dental. Las enfermedades bucodentales, como la periodontitis y los. TO. M. cánceres de la boca y la faringe, en especial, la caries dental, son un. ES. problema de salud de alcance mundial que afecta a los países industrializados, y cada vez con mayor frecuencia, a los países en. DE. desarrollo, en especial entre las comunidades más pobres. La. TA D. Organización Mundial de la Salud (OMS) ha afirmado que «Existe la idea de que la caries dental ha dejado de ser un problema en los países. CU L. desarrollados, cuando en realidad afecta entre el 60% y el 90% de la. FA. población escolar y a la gran mayoría de los adultos y que la caries dental es también la enfermedad bucodental más frecuente en varios países asiáticos y latinoamericanos.»1. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. En el paradigma actual se entiende la caries dental como una ―Enfermedad re-emergente, compleja y multifactorial, causada por un desequilibrio en el balance fisiológico entre el mineral dental y el fluido de. TE CA. la biopelícula, inducida microbiológicamente por bacterias endógenas y a su vez, relacionada con procesos sociales de los individuos y las. O. colectividades‖ considerada a su vez, como el padecimiento de mayor. IB LI. prevalencia y costo en el mundo.2. -B. Hace casi 100 años Millar y Black identificaron los principales. IA. componentes del proceso de la caries como dieta cariogénica, microflora. LO. G. destructiva, y dientes susceptibles. A lo largo de los años, muchos. caries. y. factores. AT O. investigadores han demostrado la asociación de diferentes grados entre la bioquímicos,. ambientales,. físicos,. microbianos,. M. sociodemográficos y de comportamiento. Desafortunadamente, ninguna. TO. de estas asociaciones probó ser suficiente para permitir una predicción. ES. exacta de la futura caries dental para el paciente individual. 3. DE. La OMS, en el 2003, reportó que 5 000 millones de personas. TA D. padecen caries, en América Latina afecta al 98 % de la población adolescente. El índice de dientes cariados perdidos y obturados (CPO-d). CU L. presenta incrementos permanentes de 5 dientes afectados a medida que. FA. avanza la edad, este aumento en adolescentes sugiere que durante este período se disminuye la prevención y control de la enfermedad que se realiza en la etapa escolar y las consecuencias se evidencian en la alta prevalencia en la adultez, por lo tanto, estudiar la experiencia de caries, puede resultar útil para evaluar la efectividad de los programas de 8. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. intervención de caries en la infancia y dirigir esfuerzos a la conservación de lo logrado en las primeras etapas de la vida en materia de prevención.4. TE CA. En el Perú, la condición de Salud Bucal, atraviesa una situación crítica, el 90% de la población padece de caries dental, 85% enfermedad. periodontal y 80%, mal oclusión, constituyendo un problema de salud. IB LI. O. pública; el índice de dientes cariados, perdidos y obturados (CPOD), a los 12 años es de aproximadamente 6, ubicándose según la OPS en un País. -B. en estado de emergencia.5. IA. La caries dental se define como un proceso o enfermedad dinámica. LO. G. crónica, que ocurre en la estructura dentaria en contacto con los. AT O. depósitos microbianos y por el desequilibrio entre la sustancia dental y el fluido de placa circundante, lo que da como resultado una pérdida de. M. mineral de la superficie dental, cuyo signo es la destrucción localizada de. TO. tejidos duros; afecta tanto la corona como la raíz del diente y la ausencia. ES. de atención es causa de la pérdida del órgano dentario, y constituye. DE. además un foco de infección para el organismo. Se clasifica como una. TA D. enfermedad transmisible e irreversible6. Fejerskov define la lesión cariosa como un mecanismo dinámico de. CU L. desmineralización y remineralización como resultado del metabolismo. FA. microbiano agregado sobre la superficie dentaria, en la cual con el tiempo, puede resultar una pérdida neta de mineral y es posible que posteriormente se forme una cavidad. Concluyendo que la caries es el signo de la enfermedad y no la enfermedad per se.7. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. En numerosos estudios se describen los aspectos más importantes del complejo mecanismo físico-químico de desmineralización del esmalte y se conocen como principales factores: la influencia inhibitoria de las. TE CA. proteínas salivales y del fluoruro, las variaciones anatómicas de los elementos dentarios, el componente químico de los fosfatos, la. O. importancia de la carga y los coeficientes de difusión en el gradiente. La. IB LI. estabilidad-inestabilidad del sistema dependen del pH del medio (está. -B. demostrado que la descalcificación del diente se acentúa cuando el pH. IA. disminuye por debajo de 5,5), de la concentración de fluoruros (los. G. dientes con esmalte fluorado son más resistentes a la descalcificación), y. LO. a la fuerza iónica. Tanto in vitro como in vivo, la presencia la acidez. AT O. favorece la disolución, mientras que la reducción del tiempo de exposición. M. estimula la remineralización.3. TO. La sacarosa, el carbohidrato más cariogénico presente en la dieta,. ES. es un factor importante que contribuye a la formación y el desarrollo de la. DE. placa bacteriana; esta es fácilmente metabolizada por las bacterias orales. TA D. quienes forman glucano8. Durante el metabolismo de carbohidratos, liberan ácido láctico que se difunde de la placa dental al esmalte,. CU L. disolviendo el mineral, con la pérdida neta de minerales que puede. FA. generar una cavidad.4 Entre 200 a 300 especies bacterianas aisladas de la placa dental las más patógenas de la caries dental son: Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Lactobacillus acidophilus, Actinomices viscusus y. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Bifidobacterium dentium, entre otros, contribuyen a la formación de biopelículas dentales.4. TE CA. Las lesiones de caries no se desarrollan sin presencia de la placa bacteriana y cuando la placa contiene altas proporciones de bacterias. acidogénicas como el Streptococcus mutans y es expuesta a azúcares. IB LI. O. fermentables se produce suficiente concentración de ácidos para desmineralizar el esmalte9. Conforme aumenta el número de bacterias,. y. mutans. de. la. después. IA. desarrollo. caries,. primero. G. Streptococcus. el. lactobacilos. los. LO. Durante. -B. aumenta el riesgo de la caries dental.10. aumentan. los. incrementan. AT O. significativamente; esto indica que el Streptococcus mutans está involucrado con el inicio de la lesión de caries, mientras que el. TO. M. Lactobacillus acidophilus lo es con el progreso de la lesión.11. ES. Streptococcus mutans es un coco Gram positivo, dispuesto en. DE. cadena, no móvil, catalasa negativo, pueden clasificar en 8 serotipos (serotipos c, e, f y k propiamente dichos), es productor rápido de ácido. TA D. láctico con capacidad de cambiar un medio de pH 7 a pH 4.2 en,. CU L. aproximadamente, 24 horas. Fermentador de glucosa, lactosa, rafinosa,. FA. manitol, inulina y salicina con la producción de ácido. 12 Los hábitats principales para Streptococcus mutans son la boca, la. faringe y el intestino. Es el principal microorganismo que contribuyen a la caries dental en los pacientes libres de caries, el cual se encuentra como flora normal en la cavidad oral, además es dominante en la placa de. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. pacientes con múltiples lesiones de caries activas. El período crítico de la colonización de Streptococcus mutans se produce a la edad de 19 a 31 meses en los que se establece la ventana de infectividad. Sin embargo,. TE CA. las pruebas mostraron que Streptococcus mutans se podría encontrar poco después de la erupción del diente, incluso en bebés de 6 meses de. varios. factores. IB LI. Existen. O. edad que no tienen ningún diente.13 relacionados. con. la. virulencia. de. -B. Streptococcus mutans, los cuales le permiten acumularse dentro de la. IA. placa dental y a la vez producir y tolerar los ácidos que causan las caries.. LO. G. El inicio de la infección ocurre en dos fases distintas; primero las. AT O. proteínas de superficie de la bacteria interactúan con el hospedador o con los productos bacterianos adsorbidos en la superficie del diente11. Luego,. y. otras. especies. TO. mutans. M. se forma una biopelícula de bacterias agregadas de Streptococcus bacterianas,. mediante. la. síntesis. de. sistema. enzimático. llamado. glucosiltransferasas. (Gtfs),. DE. un. ES. polisacáridos extracelulares específicos como los glucanos, a través de. TA D. quien desempeñan papeles críticos en el desarrollo de la placa dental virulenta absorbiéndose para producir glucanos in situ sobre el esmalte y. CU L. proporcionar los sitios para la colonización ávida por microorganismos así. FA. como una matriz insoluble para la formación de la placa 14. También se adsorben. a. las. superficies. de. otros. microorganismos. orales. convirtiéndolos en productores de glucanos 12.Por tanto, Streptococcus mutans produce las proteínas que enlazan éstos, fortaleciendo así la biopelícula.11. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Esta capa de glucano insoluble es esencial para la adherencia de los microorganismos a las superficies de los dientes 15.Otra característica del Streptococcus mutans es su corto efecto post-pH, que puede definirse. TE CA. como el tiempo necesario para recuperar su actividad de crecimiento habitual, tras estar sometido a un bajo pH éste vuelve a la normalidad.. O. Según lo expuesto, no es de extrañar que estas especies bacterianas. IB LI. sean las que consigan alcanzar más rápidamente el pH crítico 4.5. -B. necesario para iniciar el proceso de desmineralización. 16. IA. A partir del metabolismo de la sacarosa estos microorganismos, en. LO. G. particular el Streptococcus mutans, producen principalmente ácido láctico,. AT O. el cual es fundamental en la virulencia debido a que, aparentemente, es el ácido más potente que interviene en la desmineralización del diente,. M. causando daño en la presencia de hidratos de carbono fermentables tales. ES. TO. como sacarosa, fructosa, y glucosa.9, 11 Tanto el Streptococcus mutans como el Lactobacillus acidophilus. DE. producen ácido láctico a partir de azúcares fermentables y son capaces. TA D. de vivir en ambientes muy ácidos17. El Lactobacilo rhamnosus y el Lactobacilo acidophilus son las dos especies más abundantes que se. CU L. encuentran con frecuencia en lesiones de caries superficiales y. FA. profundas, en donde el pH tiende a ser ácido.18 Mientras el Streptococcus mutans es el principal microorganismo que contribuyen a la caries dental en los pacientes libres de caries, ya que se encuentra como flora normal en la cavidad oral, además de ser. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. dominante en la placa de pacientes con múltiples lesiones de caries activas12; el Lactobacillus acidophilus está más asociado con la dentina cariada y al avance de las lesiones cariosas en vez de iniciar con la. TE CA. enfermedad. Normalmente los lactobacilos son menos de 1% del total de la microflora cultivables. Sin embargo, sus proporciones y la prevalencia. O. pueden aumentar en lesiones de caries avanzadas, tanto del esmalte y de. IB LI. la superficie de la raíz19. Es por ello, que se encuentran con frecuencia en. -B. grandes cantidades en las lesiones de caries superficiales y profundos.20. IA. El Lactobacillus acidophilus no puede formar la placa en el diente. LO. G. por si solo y dependerá del polisacárido extracelular producido por otros. AT O. microorganismos orales, principalmente los estreptococos, para la colonización.21. TO. M. Históricamente y en la actualidad, se ha observado una tendencia. ES. hacia la investigación sobre el uso de sustancias de origen natural en diversas áreas de la odontología; con el fin de evaluar su actividad y. DE. posible aplicación para controlar la biopelícula dental 22. Ha sido bien. TA D. documentado. que. las. plantas. medicinales. confieren. actividad. antimicrobiana para bacterias orales23. El control de la placa se puede. CU L. lograr mediante procedimientos de higiene oral mecánicas, pero en. FA. muchos casos eso no es suficiente. Por tanto, la adición de agentes antiplaca o antimicrobianos para productos de cuidado de la salud dental ha sido de valor.24. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Hay varias tipos de edulcorantes en el mercado que varían en su nivel de dulce; natural o artificial, éstos últimos son productos de un proceso químico y su uso afecta al organismo humano de manera. TE CA. negativa. Con el aumento en obesidad y diabetes mundialmente nació la. creación de edulcorantes naturales. Los creadores de estos productos. O. abogan en la posibilidad de ser una alternativa eficaz y saludable para los. -B. control de peso, entre otros problemas crónicos. 25. IB LI. diabéticos y/o para aquellas personas que buscan una estrategia para el. IA. La mayor parte de las enfermedades en la boca comienza con la. LO. G. formación de la placa dental, por ello, tanto la caries dental y las. AT O. enfermedades periodontales pueden ser controladas si la formación de la placa dental se reduce8. Los hábitos alimentarios son difíciles de cambiar,. M. especialmente cuando se relaciona con el consumo de productos dulces.. TO. La búsqueda de un sustituto saludable del azúcar es una forma. DE. de otro tipo. 26. ES. importante de contribuir a la prevención de las enfermedades dentales y. TA D. No obstante, son muchos los estudios epidemiológicos que. correlacionan el consumo de azúcar con la prevalencia de caries y en los. CU L. que se demuestra una clara asociación entre frecuencia de consumo, la. FA. ingesta entre comidas y el desarrollo de la misma 27. La sacarosa se metaboliza fácilmente por las bacterias orales que se encuentran en los tejidos de la placa dental en el proceso dinámico de la caries 26, promoviendo la firme adhesión bacteriana a los dientes, límites ácidos de la placa y tampón28. Por ello, el aumento de la disponibilidad de sustitutos 15. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. seguros y eficaces para la sacarosa en la dieta durante períodos críticos del desarrollo de los dientes, sería vital para la salud pública a largo. TE CA. plazo.29 Una alternativa tanto al azúcar como a la fructosa es el uso de. edulcorantes no nutritivos. El consumo de alimentos y bebidas que. IB LI. O. contienen edulcorantes no nutritivos ha aumentado dramáticamente en. las últimas décadas, se estima que en Estados Unidos un 15% de la. -B. población consume edulcorantes no nutritivos como Sacarina, Aspartame,. IA. Sucralosa, Ciclamato, Acesulfame K, Neotamo, Alitamo. En cambio un. LO. G. estudio realizado en escolares chilenos muestra que la ingesta es cercana. AT O. al 99%.30. Cabe mencionar que la actividad antimicrobiana de sustancias de. TO. M. origen natural como son los flavonoides, xylitol y el propóleo está bien. ES. documentada. En el contexto de las bacterias cariogénicas, los flavonoides han demostrado ser activos31, debido a sus diversas. DE. propiedades muy apreciadas en la medicina, como antimicrobianos,. TA D. anticancerígenos, disminución del riesgo de enfermedades cardíacas,. CU L. entre otros efectos.32. FA. Entre los edulcorantes no nutritivos ya incorporado cabe mencionar. a la Stevia, cuyo sabor es lo más parecido al azúcar, distinguiéndose de los edulcorantes artificiales por no tener sabor metálico y no ser cancerígeno30. Un conjunto considerable de evidencia científica apoya la. eficacia y la seguridad en la promoción de la salud humana de los. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. extractos de la hoja de la "hierba dulce" Stevia (Stevia rebaudiana Bertoni), pues es no calórico, no sintético y un potente edulcorante.28. TE CA. La Stevia Rebaudiana Bertoni, es una planta originaria del Sudeste de Paraguay y pertenece a la familia Asteraceae, conocida como "hoja dulce"33. Considerada en varios estudios como un edulcorante natural que. IB LI. O. ha demostrado responder beneficiosamente a la salud general y oral 34. Resulta efectiva mientras que el azúcar blanco, fructosa, miel y jarabe de. -B. maíz que califican como edulcorantes naturales, ninguno de ellos es libre. IA. de calorías, ni son los componentes dietéticos beneficiosos para aquellos. LO. G. que sufren de trastornos de azúcar en la sangre y otras condiciones. 35. AT O. Durante su desarrollo inicial no posee ramificaciones, tornándose multicaule después del primer ciclo vegetativo, llegando a producir hasta. TO. M. 20 tallos en tres a cuatro años; puede alcanzar hasta 90 cm de altura en. ES. su hábitat natural y en los trópicos puede llegar a tener alturas superiores a 100 cm. La raíz es, pivotante, filiforme, y no profundiza, distribuyéndose. DE. cerca de la superficie34. Hojas elípticas, ovales o lanceoladas, algo. TA D. pubescentes23, tienen aproximadamente 5 cm de longitud y 2 cm de ancho y se disponen alternadas, enfrentadas de dos en dos 35. En su. CU L. estado natural, crece en la región subtropical, semihúmeda de América,. FA. con precipitaciones que oscilan entre 1.400 a 1.800 mm, distribuidos durante todo el año, temperaturas que van desde los 24 a 28°C y humedad relativa de 75% a 85%.36. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El botánico suizo Moisés Santiago Bertoni fue el primero que la describió, en 1887, detallando su sabor dulce. En 1900 el químico paraguayo. Ovidio. Rebaudi,. logró. aislar. dos. principios. activos. TE CA. responsables del dulzor30. Posteriormente, estos compuestos fueron llamados esteviósido y rebaudiosido, que son de 200 a 300 veces más. IB LI. O. dulces que la sacarosa, estables al calor y no fermentan. 35. La propiedad más importante de la Stevia Rebaudiana Bertoni se. -B. encuentra en sus hojas. Se utilizan como edulcorante natural o en. IA. suplementos dietéticos por su contenido de glucósidos 37. Se trata del. LO. G. edulcorante natural llamado esteviósido, que está constituido por una. AT O. mezcla de ocho glucósidos diterpénicos28. Esteviósido (300 veces más dulce que la sacarosa) y rebaudiósidos: A (Reb A, 250 - a 450 veces más. M. dulce), B (reb B, 300 - a 350 veces más dulce), C (Reb C, 50 - a 120. TO. veces más dulce), D (Reb D, 250 - a 450 veces más dulce), E (Reb E (150. ES. - a 300 veces dulce), Esteviolbiósido (100 - a 125 veces más dulce),. DE. Dulcósido A (50 - a 120 veces más dulce); isosteviol y dihydroisosteviol;. TA D. cuyas características químicas y farmacológicas son adecuadas para el uso en la alimentación humana.28, 30. CU L. Las hojas de la planta silvestre de Estevia contienen 0,3%. FA. Dulcósido, 0,6% Rebaudiósido C, 3,8% Rebaudiósido A y el 9,1% de Esteviósido. De las 110 especies estudiadas por el sabor dulce solo 18 muestran esta característica. De todas las especies la Stevia rebaudiana Bertoni es la más dulce30. Debido a que son ricas en metabolitos como el β-caroteno, tiamina, austroinulina, riboflavina, diversos terpenos y 18. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. flavonoides, estos dan a la planta las ventajas de ser usado como medicamento30,. 37. . En 1997 Ngowata purificó el extracto de Estevia. obteniendo un Esteviósido, un polvo blanco y altamente higroscópico, por. TE CA. lo cual hay que mantenerlo en un envase hermético para evitar la humedad.36. IB LI. O. Muchos estudios de toxicidad llevados a cabo con extractos de. Stevia rebaudina indican que es seguro para el consumo humano38. Se ha. -B. demostrado que los glucósidos de steviol cumplen con los criterios de. IA. pureza establecidos por el Comité Conjunto de Expertos en Aditivos. LO. G. Alimentarios de la OAA/OMS (JointFAO/WHO Expert Committee on Food. AT O. Additives, JECFA), no tienen efecto en la respuesta de la presión sanguínea ni de la glucosa en sangre, lo cual indica que los edulcorantes. M. de Stevia son seguros para ser utilizados por las personas que tienen. TO. diabetes39. Además, los esteviosidos han sido usados durante muchos. ES. años en América del Sur y en Japón. Otros estudios sugieren que este. DE. producto puede inhibir el desarrollo de microorganismos en la zona. TA D. bucal37. Además de ser antioxidante, no cariogénico, quimioprotector, antiinflamatorio, digestiva, y vasodilatadora. 28, 36. CU L. El Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en Aditivos Alimentarios. FA. (JECFA) en sus reuniones 68a y 69a del año 2008, estableció la Ingestión Diaria Admisible (IDA) para los glucósidos de Esteviol de mg por kg de peso corporal por día, es decir, peso molecular del total de Esteviol presente en la mezcla30. Llevó a cabo a un minucioso análisis de los datos científicos existentes sobre los glucósidos de steviol y ha concluido que 19. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. son seguros para utilizarse en alimentos y bebidas. La revista Food and Chemical Toxicology publicó un suplemento especial sobre el tema de la. TE CA. seguridad de los edulcorantes de Stevia en mayo de 2008.38 Un 70% de la producción mundial de stevia es destinada para. procesar cristales de esteviósido, el otro 30% se destina a herbarios 40. A. IB LI. O. escala comercial la utilización de este edulcorante está de moda desde. principios de los setenta en Japón. Actualmente se cultiva en Japón,. -B. Brasil, Canadá y China, siendo este último el principal exportador de. G. IA. esteviósido.30. LO. El cultivo de este fitoquímico en el Perú, ha sido introducido hace ya. AT O. una década mediante numerosos proyectos dado que es perfectamente adaptable a sus regiones tropicales y subtropicales, pues presenta. TO. M. condiciones ideales en altitud, clima, suelo y situación geográfica.. ES. Actualmente está incluida en el portafolio de pequeñas extensiones de Cajamarca, en la ceja de la selva; Amazonas, San Martin, Ucayali,. DE. Apurímac y Arequipa.41. TA D. Las hoja de Stevia en América del sur contiene en promedio de 8 a. CU L. 12% de esteviósido, en cambio las hojas de China contiene de 5 a 6% de. FA. esteviósido que es compensado con el gran volumen de producción. 42 En Perú se ha demostrado que es un cultivo viable en la Amazonía. alta, es muy rentable. Debido a su clima, así, la Amazonía es apta para su cultivo, mucho más que en Paraguay, Brasil y Argentina, razón por la que existe mayor productividad: hasta siete toneladas de hoja seca por. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. hectárea frente a 1.5, 3 y 4 toneladas en otras regiones sudamericanas. La variedad peruana contiene hasta un 80% de rebaudiósido A 43. Su ciclo de vida es de 8 años y rinde en promedio 7 TM de hoja seca por Ha/año a. TE CA. partir del año 2 y en esteviósido 700 kgr/ha/año (10% del peso de las hojas) 36. En otros países como Paraguay y Brasil se efectúan 3 ó 4 cortes. IB LI. O. por Ha/año, siendo los rendimientos mucho menores (3 TM /Ha/año). 44. A nivel nacional, se comercializa en bolsas plásticas transparentes,. -B. básicamente en tiendas naturistas y ferias. Los envases son de 15 grs. IA. con un precio al público de S/. 2.0 c/u y de 50 grs al precio de S/. 10 c/u.. LO. G. En la actualidad hay solamente 3 empresas que comercializan la hoja de. AT O. Stevia seca en esta forma. Se debe indicar que muchos de estos. TO. 20 soles el Kg.44. M. industriales no producen Stevia sino que compran a un promedio de S/.. ES. Hay estudios que informan de la actividad antimicrobiana de extractos obtenidos de Stevia rebaudiana sobre los hongos y bacterias. DE. Gram-negativas y Gram-positivas de los géneros Streptococcus y. TA D. Lactobacillus.45. CU L. Amaya Varas R 46, en Perú. En 2015; demostró el efecto. FA. antibacteriano del extracto etanólico de Stevia rebaudiana sobre. Lactobacillus acidophilus ATCC 4356. Según su estudio in vitro, las concentraciones mínimas inhibitorias del extracto etanólico de Stevia rebaudiana fueron de 1,07mg/ml en el extracto trabajado en etanol de 70°. y 2,14 mg/mL en extracto trabajado en etanol de 30°; y las. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. concentraciones mínimas bacterianas fueron de 5 mg/mL en el extracto trabajado en etanol de 70° y 10,7 mg/mL en etanol de 30°.. TE CA. Deniņa L.et al47. En Letonia. En 2013. Demostraron inhibición en el crecimiento de seis cepas de Lactobacillus reuteri en presencia de los. O. edulcorantes de los glucídos de la Stevia: Esteviósido y Rebaudiósido A.. IB LI. Pérez Guevara S48, en Perú. En 2013; demostró el efecto. -B. antibacteriano del extracto etanólico de Stevia rebaudiana sobre. IA. Streptococcus mutans ATCC 25175. Según su estudio in vitro, las. G. concentraciones mínimas inhibitorias del extracto etanólico de Stevia. 4,28mg/mL. en. extracto. trabajado. AT O. y. LO. rebaudiana fueron de 1,07mg/ml en el extracto trabajado en etanol de 70° en. etanol. de. 30°;. y las. concentraciones mínimas bacterianas fueron de 10mg/mL en el extracto. TO. M. trabajado en etanol de 70° y 42,8mg/mL en etanol de 30°.. ES. Mohammadi-Sichani M, Karbasizadeh V, Aghai F, Mohammad M, 33. DE. en 2012, reportó que extractos de Stevia rebaudiana, tienen actividad antibacteriana moderada contra SM, comparada con la concentración de. TA D. 1% del antibiótico empleado (tetraciclina). El estudio mostró que los. CU L. extractos de Stevia rebaudiana en acetona y etanol presentan un efecto. FA. inhibidor mejor en S. mutans que los de cloroformo y metanol. Por otra parte, el extracto acuoso de hojas de Stevia rebaudiana, era prácticamente ineficaz contra SM. Vitery et al.49 en el 2010, compararon el efecto in vitro de diferentes. concentraciones de extractos de Stevia, en agua, metanol, etanol, hexano. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. y acetato de etilo, en cepas de Streptococcus mutans y Lactobacillus acidophilus utilizando vancomicina como control positivo. El extracto de Stevia que mostró los mejores resultados en la inhibición del crecimiento,. TE CA. fue en hexanoico, en el que después de 48 horas, se formaron halos de. inhibición con una media de 14,5 mm de Streptococcus mutans y 15,5. IB LI. O. mm de Lactobacillus acidophilus en una concentración de 50 mg / ml.. Sathishkumar et al.50 en 2008, evaluaron la actividad antibacteriana. -B. de la Stevia rebaudiana, extraída por medio de diversos disolventes frente. IA. a Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Salmonella. LO. G. typhi y Vibrio cholerae; encontrando que el extracto de acetona mostró. AT O. una mayor actividad contra las bacterias Gram positivas que las bacterias Gram negativas.. TO. M. Sato en Japón en 2000, reportado por Jarma A et. al42. Demostró la del extracto de Stevia; mencionado. ES. acción antimicrobiana selectiva. extracto eliminó a E. coli, Salmonella, Estafilococcus, bacilos, y no afectó. DE. bacterias útiles, lo que indicó una acción selectiva.. TA D. En un estudio in vivo, se midió la acumulación de la placa dental. CU L. después de enjuagar con una solución de sacarosa al 10% cuatro veces. FA. al día durante 5 días y se comparó con un enjuague de solución al 10% de la Stevia rabaudiana Bertoni cuatro veces al día, durante 5 días; El análisis de los índices de Silness-loe y O'Leary después de 5 días del uso de la solucion de Stevia demostró una menor capacidad para la formación de la placa dental. El nivel de placa fue de 57, 82% menos en el índice de. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Silness-LOE y 10, 40% menos en el índice de O'Leary 26. La transmisión y colonización de Streptococcus mutans en la cavidad oral son factores importantes para prevenir la caries dental teniendo en cuenta que. TE CA. Streptococcus mutans tiene un papel potencial en la formación de caries inicial13.. IB LI. O. Existen diferentes estudios que evidencian que las principales. bacterias cariogénicas son Lactobacillus acidophillus y Streptococcus. -B. mutans. Dentro de las medidas preventivas para esta patología se ha. IA. propuesto el remplazo de los azúcares energéticos dentro de la dieta por. LO. G. carbohidratos no energéticos, tal como la Stevia Rebaudiana Bertoni.51. AT O. En el ámbito odontológico, el importante crecimiento mundial de la fitoterapia dentro de programas preventivos y curativos ha estimulado la. TO. M. investigación con el fin de avalar la actividad antimicrobiana de distintos. ES. extractos de plantas con el fin de ayudar en el control de la placa bacteriana y por consiguiente en la disminución de la incidencia de caries. DE. dental y enfermedad periodontal.52. TA D. El enfoque preventivo se debe encaminar a controlar los factores de. CU L. riesgo e instaurar tratamientos curativos antes de la aparición de lesiones. FA. irreversibles que requieran la eliminación de la estructura cariada y obturación de la lesión. La OMS y la Organización Panamericana de la Salud comparten la ideología de atender a la caries dental como aspecto fundamental de las condiciones generales de salud. Se pretende como meta global establecida para el año 2020 que el 50% de los niños de 5 y 6. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. años de edad estén libres de caries, que el promedio de CPOD no sea mayor de 3 en niños de 12 años de edad y por ende que el 85% de la población tenga todos sus dientes a los 18 años de edad52. Por tanto, la. TE CA. atención odontológica debería visualizar el tratamiento contra la caries dental desde un enfoque preventivo más que curativo teniendo en cuenta. O. la relación entre el gasto sanitario público de un país con la salud. IB LI. bucodental.2. -B. Teniendo en cuenta los estudios encontrados donde se observa una. IA. relación directa entre el metabolismo de la sacarosa y su influencia en. LO. G. crear un ambiente propicio para el desarrollo de la caries dental, y en. AT O. especial para el establecimiento de niveles nocivos de Streptococcus mutans en cavidad oral; habiéndose demostrado su capacidad de sobre. los. patógenos. M. inhibición. principales. de. la. caries. dental. TO. Streptococcus mutans y Lactobacillus acidophillus buscamos evaluar su. ES. efectividad como componente principal de un enjuague bucal, objetivo de. DE. esta investigación, mismo que pueda ser utilizado como agente preventivo. TA D. de la caries dental teniendo en cuenta además que esta especie vegetal es considerada como cultivo rentable y cuya industrialización es. CU L. prometedora en el marcado nacional e internacional. Actualmente estos. FA. estudios han ido incrementándose. siendo. ya. algunos de. ellos. concluyentes; y habiéndose comprobado su efectividad en el crecimiento del Streptococcus mutans.46, 48. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Por lo antes expuesto, dentro de esta misma línea de investigación, el presente estudio propone establecer la efectividad e impacto en el control de la caries dental de un colutorio a base de extracto etanólico de. TE CA. Stevia rebaudiana in vitro sobre el crecimiento de sobre una cepa. O. estándar Streptococcos mutans.. IB LI. 1.1 PROBLEMA. -B. ¿Cuál es efecto antibacteriano in vitro de un enjuague bucal. IA. a diferentes concentraciones a base de extracto etanólico de. G. Stevia rebaudiana sobre el crecimiento de Streptococcus mutans. AT O. LO. ATCC 25175?. M. 1.2 HIPÓTESIS. TO. El enjuague bucal a diferentes concentraciones a base de. ES. extracto etanólico de Stevia rebaudiana presenta algún efecto. DE. antibacteriano in vitro sobre Streptococcus mutans ATCC 25175.. TA D. 1.3 OBJETIVOS. FA. CU L. 1.3.1 Objetivo General: Determinar el efecto antibacteriano in vitro de un enjuague bucal a diferentes concentraciones a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana sobre el crecimiento de Streptococcus mutans ATCC 25175.. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 1.3.2 Objetivos Específicos:. 1.3.2.1. Determinar. la. concentración. mínima. TE CA. inhibitoria (CMI) in vitro de un enjuague. bucal a diferentes concentraciones a base. el. crecimiento. Streptococcus. Determinar. la. G. 1.3.2.2. IA. -B. mutans ATCC 25175.. de. IB LI. sobre. O. de extracto etanólico de Stevia rebaudiana. concentración. mínima. LO. bactericida (CMB) in vitro de un enjuague. AT O. bucal a diferentes concentraciones a base. M. de extracto etanólico de Stevia rebaudiana. TO. sobre. el. crecimiento. de. Streptococcus. FA. CU L. TA D. DE. ES. mutans ATCC 25175.. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II. MATERIAL Y MÉTODOS. TE CA. 2.1 TIPO DE ESTUDIO La presente investigación es básica de acuerdo a su. IB LI. O. orientación, experimental de acuerdo a su diseño de contrastación.. -B. 2.2 DEFINICIÓN DE LA POBLACIÓN MUESTRAL:. La población bajo estudio estuvo conformada por el conjunto. G. IA. de placas petri que contenían cada una de las diferentes. LO. concentraciones del enjuague bucal a diferentes concentraciones a. AT O. base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana sobre el crecimiento de Streptococcus mutans ATCC 25175 (3x108 UFC),. TO. M. en el laboratorio de Microbiología, de la Facultad de Medicina de la. ES. Universidad Nacional de Trujillo.. DE. 2.2.1 Criterios de Inclusión. FA. CU L. TA D. -. Placas con presencia adecuada de Streptococcus mutans (3x108 UFC/mL) a priori al enfrentamiento con el enjuague bucal a diferentes concentraciones a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana.. -. Placas utilizadas para la determinación de la Concentración Mínima Bactericida (CMB) que presentaron efecto antibacteriano (ausencia o. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. presencia de halos de inhibición de un diámetro mayor de 8mm). -. Placas utilizadas para la determinación de la. crecimiento. bacteriano. IB LI. contaminación por otros microbios. 2.2.2 Criterios de Exclusión. mostraron. -B. Placas que después del proceso de incubación, contaminación. por. otros. microbios. IA. -. ni. O. presentaron. TE CA. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), que no. LO. G. (hongos).. AT O. 2.3 CONSIDERACIONES ÉTICAS:. M. Esta investigación contó con la autorización del Comité. TO. Permanente de Investigación de la Facultad de Medicina de la. ES. Universidad Nacional de Trujillo y siguió los principios de la. DE. Declaración de Helsinki de la asociación médica mundial,. TA D. adoptada por la 18a Médica Mundial (Helsinki 1964) y revisada. CU L. por la 64a Asamblea General de Fortaleza - Brasil 2013.. FA. 2.4 DISEÑO ESTADÍSTICO DE MUESTREO: 2.4.1 Unidad de análisis La unidad de análisis para determinar la CMI lo constituye cada una de las placas Petri que se utilizaron. Las que contenían caldo de cultivo de. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tioglicolato, enjuague dental a base de extracto etanólico. de. Stevia. rebaudiana. a. determinadas. concentraciones, y el inóculo de Streptococcus mutans. TE CA. ATCC 25175.. O. La unidad de análisis para determinar la CMB lo. IB LI. constituye cada una de las placas Petri inoculadas con. -B. las suspensiones obtenidas a partir de la CMI.. G. IA. 2.4.2 Unidad de muestreo: unidades. de. muestreo. estuvieron. LO. Las. AT O. conformadas por las unidades de análisis. Éstas. M. cumplieron con los criterios de selección.. TO. 2.4.3 Marco de muestral. ES. El marco muestral es el listado o registro de las. DE. unidades de muestreo, es decir de las placas petri.. FA. CU L. TA D. 2.4.4 Tamaño de muestra Para determinar el tamaño de muestra se hizo uso de la fórmula que nos brinda el muestreo cuando el interés es comparar la media de dos o más grupos de estudio, para variable cuantitativa: n = 2(Zα/2 + Zβ)2 (DE) 2/d2 donde:. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. : Tamaño (Número de elementos) de cada. n. grupo de estudio. : Probabilidad de cometer error tipo I.. β. : Probabilidad de cometer error tipo II.. Z. : Valor estándar (Coeficiente de confianza) de. O. distribución normal asociada a un tipo de error. :. DE. Desviación. IB LI. la. TE CA. α. estándar. la. variable. -B. cuantitativa.. de. : Diferencia mínima que se desea detectar. IA. d. G. entre los promedios de ambos grupos, para rechazar. AT O. LO. la igualdad de medias.. Asumiendo las exigencias del 95% de confianza. M. (α = 0.05 Zα/2= 1.96), una potencia de la prueba del. TO. 80% (β =0.20 Zβ= 0.842), una desviación estándar de. ES. DE=37 para CMI según referencia, y una diferencia. DE. mínima de d=55 para rechazar la igualdad de medias,. FA. CU L. TA D. se obtiene: n= 2*(1.96 +0.842)2*(37)2 = 7 552 Con estos valores se empleó una muestra de 7. repeticiones para cada grupo de estudio. El total de tubos de ensayo y/o las placas Petri que se utilizó como muestra, se determinó por el. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. número de concentraciones que se utilizaron en el experimento. Estas concentraciones fueron en total de 12 para la determinación de la Concentración Mínima. TE CA. Inhibitoria y en número de 12 para la determinación de. la Concentración Mínima Bactericida, incluyendo los. IB LI. O. controles. Por lo tanto la muestra total fue de:. -B. n = n° de concentraciones x 7 repeticiones.. IA. Para CMI:. G. n = 12 x 7 = 84 placas Petri.. LO. Control A = 02 placas Petri.. TO. Para CMB:. M. AT O. Control B = 02 placas Petri.. ES. n = 12 x 7 = 84 discos de Kirby y Bauer. (21 placas).. TA D. DE. Control = 01 placa Petri.. FA. CU L. 2.4.5 Diseño de contrastación: El presente estudio es un diseño experimental, con varios grupos de estudio y medición posterior. El esquema. puede. representarse. de. la. siguiente. manera:. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Grado de alcohol. Grupo. Variable dependiente Variable independiente Concentración X. X1. Diámetro de halo.. O. UFC. II. X2. IB LI. Diámetro de halo. UFC. III. X3. IV. -B. LO. G. X4. Diámetro de halo.. IA. 30°. TE CA. UFC. I. V. AT O. X5. VI. Diámetro de halo. UFC Diámetro de halo. UFC Diámetro de halo.. TO. M. X6. UFC. DE. ES. I. FA. CU L. TA D. 70°. II. III. IV. V. VI. UFC X1. Diámetro de halo. UFC. X2. Diámetro de halo. UFC. X3. Diámetro de halo. UFC. X4. Diámetro de halo. UFC. X5. Diámetro de halo. UFC. X6. Diámetro de halo.. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Donde:. extracto etanólico de Stevia rebaudiana.. TE CA. Concentración del enjuague bucal a base de. X:. IB LI. O. 1.07% usando etanol de 70° y 2.14% usando. X1:. -B. etanol de 30°.. IA. 5 % usando etanol de 70° y 4.23 % usando. X2:. 10 % usando etanol de 70° y 10.7 % usando. X3:. AT O. etanol de 30°.. M. 25 % usando etanol de 70° y 21.4 % usando. TO. X4:. LO. G. etanol de 30°.. ES. etanol de 30°. 50 % usando etanol de 70° y 32.1 % usando. etanol de 30°. X6:. 75 % usando etanol de 70° y 42.8 % usando. etanol de 30°.. FA. CU L. TA D. DE. X5:. 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.5 PROCEDIMIENTO E INSTRUMENTO DE RECOLECCIÓN DE DATOS:. TE CA. 2.5.1 Recolección e identificación taxonómica 02 Kg de hojas se Stevia rebaudiana fueron. O. recolectadas el día 12 de Julio del 2015, de la localidad. IB LI. de Timaruca, distrito de San Ignacio (1050 m.s.n.m). -B. provincia de San Ignacio, región de Cajamarca.. IA. Un ejemplar completo de planta fue llevado al. G. Herbarium Truxillensis de la Universidad Nacional de. AT O. LO. Trujillo, para su identificación y verificación taxonómica. 2.5.2 Preparación de la muestra54: Selección y lavado de. M. -. la muestra: El material. TO. recolectado fue transportado al laboratorio de. FA. CU L. TA D. DE. ES. Farmacognosia de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, en donde se seleccionó las hojas en buenas condiciones. Luego se procedió a lavar el material vegetal con agua destilada, seguido de una desinfección, utilizando hipoclorito de sodio al 0.5 %. Posteriormente se realizó. un enjuague de la. planta con suficiente agua destilada estéril, esto es para retirar los residuos de hipoclorito.. 35 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. -. Secado: Las hojas de Stevia rebaudiana Bertoni fueron colocadas sobre papel Kraft y sometidas a secado primero a temperatura ambiente por 24. TE CA. horas, y luego en la estufa a una temperatura de. 40°C, por cinco días . Se realizó la determinación. Pulverización: Una vez secadas las hojas, estas. IB LI. -. O. de peso cada 24 horas hasta valores constantes.. Tamizaje: El material obtenido de la pulverización,. IA. -. -B. se pulverizaron con ayuda de un mortero.. G. se pasó a través de los tamices Nº 2, 1.2, 0.7, 0.3.. Almacenamiento: El polvo de las hojas de Stevia. AT O. -. LO. La muestra de trabajo correspondió al tamiz 0.7.. M. rebaudiana bertoni obtenidas, se guardaron en. ES. TO. frascos de vidrio de color ámbar de boca ancha.. DE. 2.5.3 Preparación del extracto etanólico54:. TA D. -. y tamizada. Luego se humectaron. por separado. con 20 mL de etanol de 70º G.L., se colocaron en. CU L FA. Se pesó 20g de la muestra previamente pulverizada. una cápsula de porcelana y se mezclaron con cantidad suficiente de arena lavada. -. Luego se vertió en un cartucho de papel de filtro y se colocó en el extractor del equipo de soxhlet y se. 36 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. extrajo con 150 mL de etanol de 70° Gay Lussac a una temperatura de 60oC a 80oC durante 4 horas. -. El producto se filtró. 3 veces, primero con papel. TE CA. filtro Whatman N° 41, un segundo filtrado se realizó. con papel filtro Whatman N°4 y por último un tercer. O. filtrado fue en papel Whatman N°2. Así se obtuvo. La solución resultante fue llevada a sequedad en. -B. -. IB LI. un extracto purificado libre de gérmenes.. IA. una cámara de secado al vacío a una presión. G. reducida y a una temperatura de 40 °C; luego se. LO. pesó el residuo seco y se guardó en refrigeración a. AT O. 2°C en frasco de vidrio de color ámbar estéril. Del. M. residuo seco, se prepararán las concentraciones. TO. de 1,07%, 5%, 10%, 25%, 50% y 75% disueltas en. ES. etanol de 70ºGay Lussac respectivamente; y las. 32,1% y 42,8% en etanol de 30º Gay Lussac.. TA D. DE. concentraciones de 2,14%, 4,23%, 10,7%, 21,4%,. FA. CU L. 2.5.4 Preparación del enjuague bucal55: El material recolectado fue trasportado al laboratorio de Farmacología de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo Se tomó el extracto etanólico de Stevia rebaudiana como edulcorante del mismo, acompañado de. 37 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. saborizantes, conservantes y preservantes. Por medio de procedimientos como:. TE CA. 2.5.4.1 Formulación del enjuague bucal a base de extractos etanólicos de Stevia rebaudiana. O. Bertoni.. IB LI. Para la formulación del enjuague bucal se. Ángeles. y. Veloz. (2011). con. IA. los. -B. procedió de acuerdo a lo establecido por De. G. modificaciones. Dentro de la formulación se las. LO. consideraron. materias. primas. más. AT O. importantes: un tensioactivo o detergente. M. (lauril éter sulfato de sodio), sustancias. TO. humectantes (sorbitol y glicerina),. y el. FA. CU L. TA D. DE. ES. principio activo (extracto etanólico de Stevia rebaudiana bertoni). Las concentraciones utilizadas de cada materia prima estuvieron dentro de los rangos sugeridos por la bibliografía (Muñoz, 2000). En las Tablas del 1 al 12 se presentaron las fórmulas del enjuague bucal para una presentación de 80 mL y en la tabla 13 el enjuague bucal sin el extracto (control negativo). (Anexo 01). 38 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 5.6.4.2 Elaboración del enjuague bucal a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana. TE CA. Bertoni.. En primer lugar se procedió a pesar y medir. O. todos los ingredientes de la fórmula de cada. IB LI. enjuague bucal. Seguidamente se mezcló el. el. sorbitol. en. un. agitador. IA. glicerina,. -B. lauril éter sulfato de sodio junto con la. G. magnético a 800 rpm durante 10 minutos y,. LO. poco a poco, se añadió las ¾ partes del. AT O. disolvente (agua), luego el alcohol y el. M. extracto etanólico de Stevia. Así se fue. TO. completando la formulación con el resto del. FA. CU L. TA D. DE. ES. disolvente hasta alcanzar el volumen total especificado en la fórmula. Posteriormente, se procedió al envasado y etiquetado del enjuague bucal en un frasco de vidrio, dejándolo reposar por 24 horas para que desaparezca la espuma formada durante. el. Finalmente,. proceso se. de. manufactura.. determinó. el. efecto. antibacteriano del enjuague bucal preparado a las diferentes concentraciones.. 39 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(40) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.5.5 Método microbiológico56. A.. Obtención de la cepa:. TE CA. Este estudio utilizó un cultivo liofilizado de la cepa de Streptococcus mutans ATCC 25175, el cual se. O. obtuvo del laboratorio GenLab, de Lima.. IB LI. La cepa de Streptococcus mutans ATCC 25175. en. microanaerobiosis. utilizando. el. IA. Sangre,. -B. se reactivó cultivándola en Agar Soya Tripticasa –. LO. G. método de la vela por 04 días a 37 °C.. AT O. La cepa preparada se diluyó en medio Tioglicolato hasta alcanzar la turbidez del tubo 0.5 de la. TO. M. escala de Mc Farland correspondiente a 108. ES. bacterias/mL.. FA. CU L. TA D. DE. B.. Preparación del inóculo:. Las cepas de Streptococcus mutans ATCC 25175 se cultivaron en tubos de ensayo cerrados herméticamente conteniendo el medio Agar Soya Tripticasa - Sangre. Se. incubaron. bajo. condiciones. de. microanaerobiosis a 37oC con el fin de obtener colonias jóvenes. Luego de 24 horas cada cepa. 40 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(41) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. de Streptococcus mutans ATCC 25175 se diluyó en caldo de Tioglicolato hasta que se obtuvo una turbidez semejante al tubo número 05 de la escala. TE CA. de Mac Farland. Los tubos con la bacteria fueron girados entre las manos durante 30 segundos. O. antes de proceder al sembrado para distribuir los. Determinación de la concentración mínima. G. inhibitoria (CMI):. IA. C.. -B. IB LI. microorganismos adecuadamente.. determinar. la. LO. Para. concentración. inhibitoria. AT O. mínima del extracto etanólico de la Stevia. M. rebaudiana se realizó lo siguiente: Se colocó 0.8. TO. ml del del enjuague bucal a base de extracto. ES. etanólico de la Stevia rebaudiana al 1,07%, 5%,. FA. CU L. TA D. DE. 10%,. 25%, 50% y 75% disueltas en etanol de. 70ºGay. Lussac. respectivamente;. y. las. concentraciones de 2,14%, 4,23%, 10,7%, 21,4%, 32,1% y 42,8% en etanol de 30º Gay Lussac, cada concentración en un tubo de ensayo, previamente etiquetado. Después del proceso de dilución se colocó un inoculo de 0.2 ml del cultivo preparado de Streptococcus mutans ATCC 25175, en los tubos que contenían las diversas concentraciones. 41 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(42) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. del enjuague bucal; así como al control A (tubo que no contuvo extracto etanólico a base de Stevia rebaudiana), y al control B (tubo que. TE CA. contuvo la bacteria sin tratar) obteniéndose un. volumen final de 10mL para cada tubo y se llevó a. O. incubación a 37º C por un periodo de 24 horas en. Luego. de. 24. -B. IB LI. condiciones de microanaerobiosis. horas. se. realizó. la. G. IA. determinación de la CIM con Agar Müller Hinton –. LO. Sangre, tomando 0,1 ml de las suspensiones de. AT O. los tubos y se dispersó en toda la placa para determinar las unidades formadoras de colonias. M. (UFC).Después. del. sembrado,. se. llevó. a. TO. incubación a 37oC por 24 horas en jarra Gaspak. FA. CU L. TA D. DE. ES. en condiciones de microanaerobiosis 5 a 10% de CO2. Todo el procedimiento fue realizado bajo condiciones. asépticas. y. se. efectuaron. repeticiones por concentración. Luego. 07. de 24. horas se realizó el conteo de las colonias en cada una de las placas. La concentración inhibitoria fue aquella en la que se llegó a inhibir completamente el desarrollo de los gérmenes.. 42 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(43) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. D.. Determinación. de. susceptibilidad. de. Streptococcus mutans ATCC 25175 frente al enjuague bucal a diferentes concentraciones. TE CA. (CMB):. O. Determinación de la sensibilidad o resistencia. IB LI. antibacteriana (Efecto antibacteriano).. -B. Un hisopo estéril fue embebido con la cepa. IA. preparada a una distancia de 10 cm de la llama. G. del mechero se procedió al sembrado en camada. LO. en placas Petri conteniendo Agar Müeller Hinton -. AT O. Sangre, se estrió el hisopo uniformemente sobre. M. toda la superficie del agar, girando cada placa 30. TO. grados, 10 veces aproximadamente. Las placas sembradas. fueron. incubadas. en. ES. recién. FA. CU L. TA D. DE. condiciones de microanaerobiosis a 37º C en atmósfera con 5% de CO2 durante 24 horas. Para el efecto antibacteriano se empleó la técnica de. difusión de discos de Kirby y Bauer, la cual consiste en preparar discos de papel de filtro estériles, los que fueron sumergidos dentro de cada concentración del enjuague bucal a base de extracto etanólico de Stevia rebaudiana, por el periodo no menor de una hora. Además se. 43 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(44) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. colocaron. los. discos. embebidos. con. cada. concentración del enjuague bucal empleando una placa. de. control;. se. utilizó. como. control. TE CA. Clorhexidina al 0.12% (Perio·Aid®), el cual fue embebido de la misma forma que los discos. IB LI. O. experimentales.. -B. Luego con una aguja estéril, estos se colocaron sobre los cultivos de Streptococcus mutans ATCC las. placas. IA. en. petri. previamente. G. 25175. LO. preparadas; las placas se mantuvieron en la. AT O. misma posición por un periodo de 5 minutos. Luego de este tiempo las placas se voltearon de. M. posición y se incubaron en microanaerobiosis. TO. utilizando la jarra de GasPack, con el método de. FA. CU L. TA D. DE. ES. vela, mediante el cual se obtuvo un ambiente aproximadamente de 5 a 10% de CO 2, a 37º C. durante 24 horas. Todo el procedimiento se llevó a cabo dentro del diámetro de 10 cm de la llama de un mechero. La lectura de los resultados se llevó a cabo después de las 24 horas, mediante la inspección visual de cada placa. Se efectuó tomando el registro en milímetros de los halos de inhibición. 44 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.