Casa abierta ai PO

Casa

abierta ai

PO

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

DMSiON DE CiENClAS BiOLOGfCAS Y DE LA SALUD

SERVICIO SOCIAL

SS.CBS.726.95

A QUIEN CORRESPONDA:

por medio de l a presente se hace constar que el (la)

- - -

-

QUIM. JOSE MARIA BARBA CHAVEZ

del Departamento de BIOTECNOLOGIA

de la División de Ciencias Bioiógicas y de la Salud, asesoró e l si

-

guienre Servicio 'Social:

TITULO:

"Cinetica de Crecimiento de Pleurotw Ostreatus - en Medio Sólido Definido"

ALUMNO: V E R G A R A RODRIGUEZ MIRIAM SELENE

LICENCIATURA: INGENIERIA BIOQUIMICA INDUSTRIAL

PERIODO: Agosto 24, 1994

--

Marzo 23, 1995

S e extiende l a presente para los fines que a i interesado convengan, en l a Ciudad de México,

D.

F.,

a los 24 dias del mes de

Noviembre de mil novecientos noventa y cinco.

A t e n t a m e n t e " C A S A g f

BIO"

M. en

.

Ern o Rodríguez A.

Secretario adémico Div. CBS

'mcbb

UNIDAD IZTAPAiAPA

Nombre : Miriam Selene Vergara Rodriguez. ( 91 773 J 5

O0

70

Matricula :

88338409

Llcenclatura: lngenieria Bioqulmica Industrial.

DMsi6n de Ciencias Biol6gkas

y

de la Salud Unidad Iztapalapa.

Trimestre Lectlvo: 94-P

Horas semana: 20 horas

Titulo del trabajo: Cinétira de Crecimiento de Pleurotus

ostreetus

en Medic Solido Definido

Nombre del Asesor: Qulm José Maria Barba Chávez

Profesor Asocudo Tipo * C

Departamento

de

Biotecnologla Universidad Autdnoma Metropolitana Unidad Iztapalapa.

Ttempa Completo

Lugar de trabajo: Instalaciones y Laboratorio del Area de Productos Naturales de la Universidad Autdnomz Metropolitana- lztapalapa

Fecha

de

Iniclo: 24 de agosto de 1994

Fecha de termlnaclon : 24 de febrero de 1995.

Clave:

Nombre del proyecto: Fisiología Comparada in vitro de

Pleur0;us

ostreatus

CINÉTICA

DE CRECIMIENTO DE

Pleumtus

ostreatus

EN

UN MEMO SÓLIDO DEFINIDO

En México crecen de manera silvestre mas de 200 especies de hongos comestibles, 13 de los cuales se cultivan convencionalmente a nivel mundial (Guman, 1983). En nuestro pais solo se cultivan a nivel industrial dos especies de hongos comestibles, el champiñón cuyo nombre científico es Agaricus bispoms, y las setas nombre comercial en México del hongo Pleurotus

ostfeatus,

los

cuales se comercializan en fresco o enlatados.

Diversas especies de hongos comestibles que pertenecen al genero Pleurotus, crecen sobre un gran número de sustratos de carácter agroindustrial lignocelulósico, tanto en zonas templadas como tropicales.

Se han realizado estudios morfológicos, fisiológicos, genéticos, de crecimiento y

desarrollo micelial en varias especies de Pleumtus y otros hongos comestibles (Matchan, 1985; Chahald, 1989 ). Muchos de estos estudios demostraron que las características motfológicas de los cuerpos fructíferos pueden variar de acuerdo con la temperatura,

luz,

pH, sustrato sobre el cual crecen. Realmente son pocos los estudios que se han desarrollado sobre el análisis del crecimiento del micelio de hongos perfectos in vitro como base para entender la fisiología de producción in situ de esos micelios en sustratos sólidos.

En cuanto al crecimiento en la fase micelial de algunos Pleurotus, se han realizado estudios sobre la influencia de la fuente de carbono y nitrógeno, siendo diversos

los

resultados obtenidos: Lilly y Barnett (1951) afirman que en el hongo comestible P. ostreatus; utilizando sales de amonio como fuente de nitrógeno, permiten un mejor crecimiento que con los aminoácidos.

Hacskaylo et al. (1954) estudian el comportamiento de 25 especies de Basidiomicetos (entre ellos el P. ostreatus), empleando tres fuentes de nitrógeno, (nitrato, amoniaco, asparagina); se encontró que todas las especies estudiadas utilizan el nitrógeno orgánico y amoniacal y muy lentamente

los

nitratos.

En relación a la influencia de las diversas fuentes de carbono sobre el crecimiento micelial, Kockw (1958) y Tsao (1963) observan, que la glucosa, fructuosa, manosa y xilosa son buenas fuentes de carbono y favorecen el crecimiento micelial.

Khanna et a/. (1985), estudiaron el efecto de 10 fuentes de carbono en el

@&osa, manosa, arabinosa), 3 disacáridos (lactosa, mamsa, sacarosa);

~ ~ r b i o l y manitol.

Encontraron que los monosacáridoe son los azucares preferidos por las 4 especies. La eficiencia del

cultivo

produce máMmo de micelio y proteína, esta

última

eficiencia es la misma en las 4 especies.

Se han estudiado algunos moddos matemhücos de Trinci (1971), para hifas de hongos filamentosos y para microorganismos que han sido propuestos con relación al mecanismo de adición de nuevo material de pared a la formación adoptada por la zona de extensión hifal.

Diversos estudios sobre los requerimientos nutricionaies del Pku& Osireatus

se han realizado; (Makaya-LKano, 1975). detenninando la velddad de crecimiento micelial de ésta especie y sus formas afines, sobre diferentes fuentes de carbono y nitrógeno, empleando un medio de cultiivo mineral base.

Algunos estudios de Trinci (1971; 1974) han demostrado que las ramificaciones se pueden originar en cualquier punto a

lo

largo de la hifa dando origen a las ramificaciones primarias y éstas a ramas secundarias, y así sucesivamente. A medida que dvergen unas de otras las ramas k dan a la colonia su micircular característico. Trinci (1974) considera que cada hfa individual crece a velocidad constante, mientras que todo el miceiio mce expomcialmnte, y sugirio que

los

OBJETIVO

Determinar el crecimiento micelial de Pleuratus Osireatus en base a la variación de la fuente de carbono y niírógeno en un medio químicamente definido (Czapek).

METODOLOG~A

Obtención de la cepa

La

cepa de trabajo se adquirió por compra del cuerpo fructífero silvestre en el mercado de la Merced, posteriormente se cracteruó en el Departamento de Micología del Instituto de Biología de la UNAM, resembrandolo en tubos y cajas petri sobre medio PDA y conservándolas a

20

C. De esta forma se obtuvo la cepa

pura y se caracterizó como JMD.Po1. Obtención del inóculo

De la cepa pura obtenida se tomó el inóculo empleando un marca-cortador; esto con el propósito de obtener inóculos cuantitativa y cualitativamente semejantes. Medio de cultivo

Tratamiento

No.

7. El medio de referenda se prepara según Czapek, definido para hongos, teniendo la siguiente composición:

COMPONENTE CANTIDAD (@I)

Glucosa 30.0

NaNO3 3.0

IGHP04 _I

.o

MgSOd ?”& 0.5

KC I 0.5

FeSO. 7H20 0.0025

Agar 0.01

Se preparan medios de Czapek modificados con la intención de conocer el comportamiento de Pleumtus osbeatus, con diferentes concentraciones de carbono y nitrógeno, realizando esto por dilución.

a) En un matraz de 500 mL se agregaron 7.5 g de glucosa y 150 mL de agua

b) En un matrer de 100

mL

agregar 0.25 g de IGHP04 más 25 mL de agua destilada.

destilada

C) En un matraz de 250 mL agregar NaN03 (0.75 g),

MgSO,

7iiz0 (0.125 g), KCI

Estos matraces se esterilizaron para que posteriormente se haga una mezcla del medio base.

d) En 4 matraces agregar a cada uno 225 mL de agua destilada y 3.75 g de agar, (0.125 9). FeS04 7Hz0 (0.0025 g), más 75 mL de agua destilada.

se esterilizan.

Ya realizada la mezcla del medio base, se realizaron diluciones con un factor de dilución de 9:1, para obtener cinco medios de cultivo diFennte8 MO, M1,

M2,

M3,

M4,

(MO

> M l >

M2

> M3

M 4

en concentración).

Preparación de cajas Petri.

Se utilizaron 15 cajas Petri, estériles y desechable8

para cada medio diluido

preparado, se vertieron 15 mL en csda una de las cajas Petri con el medio de cultivo correspondiente y posteriomnte se dejaron solidincar.

TratamEentO

No.

2. Este tratamiento consiste en variar la concentración de la

fuente de carbono y niúógeno con un factor de diiucion 9:l en cada

uno

de los matraces marcados por dilución, en cada uno de ellos se mantuvo constante la misma cantidad de nutrientes y sales minerales que el

matráz

MO considerando este, como el medio base que contlene todos los nutrientes recomendados en la etiqueta comercial.

La razón de realizar esta variación es para comprobar si el efecto del crecimiento y de proteína o biomasa que se registra por dilución tiene que ver también con la concentración de micronutrientes.

1) En cinco matraces de 50 mL se agregaron agar, MgS04, KCI, FeS04, y 125 mL

2) En un matraz de 125 mL se agregaron NaNOs, Glucosa y 100 mL de agua 3) En cinco matraces de 50 mL se agregaron 25 mL de agua destilada y &HP04. 4) En cinco matraces de 125 mL se agregaron 50 mL de agua destilada en cada

de agua destilada.

destilada.

uno de los matraces.

Todo esto se esterilizó por separado, con el fin de no alterar la composición de cada componente.

Vaciado en cabs.

Antes de vaciar el medio de cultivo en las cajas, se realió una mezcla de todos los componentes que son esterilizados por separado, la mezcla tendrá un volumen total de 250 mL, en cada matraz.

-

Se hizo

el

vaciado de 25 mL de medio de cultivo en cada caja y cuatro cajas por cada medio.

En 15 cajas Petri por cada medio diluído preparado se virtieron 10 mL. de medio correspondiente y posteriormente se dejó solidificar.

Desarrollo de la fase micellal de P. osfnwtus

en los

diferemías medios de cultivo

/noculación.

A la cepa se le hicieron perforaciones con un mulü oradador de aluminio o marca cortador y es con el propbit0 de obtener inóculos cuantitativa y cualitativamente semejantes, con el fin

de

reducir el error en la cinéüca de crecimiento y producción de biomasa, partiendo desde la inoculación.

Se tomó el aza para separar el pequeño inóculo del medio de cuitivo en que se encuentra la cepa, procurando que quede la menor cantidad de medio adherido al inóculo, éste se depositó en el centro de la caja Petri que contiene medio de cultivo Czapek modificado.

Esto se realizó en cada una de las cajas Petri que contienen medio diluído preparado.

Imubación. Una vez inoculados los diferentes medios de cultivo, se incubaron a 2 5 O C. midiendo el avance del micelio vegetativo cada dos días, después del tercer día que es el día cuando se inicie la primer medición, hasta llegar al noveno.

Detenninación de la velocidad de crecimiento del micelio vegetativo

En la parte posterior de cada caja, con un plumón se marcó la parte externa de la colonia del micelio que ha crecido y se trazaron tres lineas para determinar el

diámetro promedio, se empleó una regla y se midió el crecimiento del micelio ~

vegetatiivo, sacando un promedio de las tres medidas tomadas, cada medición se & d a por muestra y por íriplikado.

Cuantificación de la biomasa

Para ello se empleó una aguja de disección, con la cual se separó el pequeño inóculo inicial del crecimiento micelial,

con

la

misma aguja ae

cortó

5

mm

d s del iímite

de

crecimiento y este se pasó a un

vaso

de precipitados con 150 mL de agua destilada, se tapó con un vidrio de reloj para evitar que se derrame

el

agua.

Se utilizaron cajas Petri pequeñas a manera de platos o recipientes previamente taradas.

Tratamiento de las cajas :

-Limpias las cajas Petri se metieron

a

la

estufa

por 17 h n a 700 C. -Transcurrido el tiempo se pasaron

al

dosecador 21 hrs

.

-Se pesaron

Se metió el vaso de precipitados con la muestra al

homo

de microondas por 10 min y con potencia 5, esto es con el fin de separar

el

medii de cultivo del crecimiento del micelio.

Transcurrido el

tiempo,

se

tomó

el

micolb flotante con pinzas Ó con aguja de disección y se colocó en a j a s previmente taradas, dandoles el mismo tratamiento a las cajas.

RESULTADOS Y CONCLUSIONES

Re8ultadoo con el primer tratamiento:

Medición Tiempo PRIMERA 3 días SEGUNDA 5 días TERCERA 7 días CUARTA 9 días

cultivo promedio de

biomau w 2.3E-3

1.3E-3 1.3E-3

M3 1.6E-3

M4

2.3E-3

MO 4.OE-3

M1 7.OE-3

M2

6.6E-3

M3 0.6E-3

M4

1.6E-3

MO 12.6E.3

Mi 24.0E-3

M 2

18.6E-3

M3 7.3E-3

M4

5.0E-3

MO 27.6E-3

40.6E3 25.0E-3 13.3E-3 9.3E-3

üiámebo promedio w

(un)

1 .31 1.50 1.83 1.69 1.51 2.93 3.47 4.79 4.07 3.25 4.40 5.6 6.87 6.69 5.77 5.88 7.66 7.96 7.96 7.49 Conconüación de glucoui

ani

30 3.0 0.3 0.03 0.003 30 3.0 0.3 0.03 0.003 30 3.0 0.3 0.03 0.003 30 3.0 0.3 0.03 0.003

Como se puede observar, la producción de biomasa con respecto a

la

concentración de glucosa de 3.0 g/L (Ml), es mayor, dafiniendose a partir de 5 días de incubación y sigue constante

el

aumento a 7 y 9 días de incubación, de ésto se puede decir que hay una etapa de asimilación de nutriintes a los 3 días de la inoculación y después es la etapa de desarrollo de biomasa (gráfika 3), sin embargo, la velocidad de crecimiento micelial no tiene la misma tendencia, ya que desde los 3 primeros días de incubación

el

desarrollo micelial a una concentración de glucosa de 0.3 g/L

em

mayor que a otras concentraciones y esto sigue un crecimiento constante a nivel miceiial (gráfica 1).

La producción de biomasa y el desarrollo micelial son directamente proporcionales al tiempo de incubación.

Resultador con el segundo tratamiento:

Tiempo promedio M

(cm)

PRIMERA Mo

1.655

Mi

1.69

M2

1.93

3 días

M3

1.562

M4

1.397

SEGUNDA

Mo

2.705

M1

M 2

5

días

M3

M4

TERCERA Mo

M1

M2

7

días

M3

3.247

3.772

2.737

2.432

4.285

5.312

6.155

4.64

M4

4.062

CUARTA

MO

I

5.96 ... ~

M1

7.77

M2

8.0

9

días

M3

7.10

M4

6.57

Concentración de glucow

(on)

30

3.0

0.3

0.03

0.003

30

3.0

0.3

0.03

O.

003

30

3.0

0.3

0.03

0.003

30

3.0

0.3

0.03

0.003

El tratamiento del medio de cultivo sin dilución de nutrientes da corno resultado una velocidad de crecimiento micelial mayor a una concentración de glucosa de

0.3

g/L durante todo el tiempo de experimentación (gráfca 5).

Esto nos muestra que el crecimiento miceiial no depende de la composición mineral del medio de cultivo, pero si a una conceniración de glucosa adecuada en este caso a una dilución de

1

O0 veces.

VELOCIDAD DE EXTENSION RADIAL VS CONCENTRACION DE GLUCOSA

I

0.003 0.03 0.3 3 30

C O N C E N T R A C l d N D E O L U C O S A

-3 DIAS - 5 DfAC - 7 DrAS -9 DIAC

Gráñca 1. Tratamiento 1.

La velocidad de extensión radial a una concentración de glucosa de 0.3 giL en un

periódo de incubación de 7 días es mayor con respecto a las otras

concentraciones.

5

Velocidad de Extensión Radial Vs Tiempo

-t-I30.0 g l L i

-13.0 g/LI

+10.3 g/LI

-&-I0.03 g l L l

+10.003 g/LI O J

3 5 7 9

T i e m p o I D í a s )

Gráfica 2.

En este caso, la velocidad de extensión radial es mayor cuando tiene 7 días de incubación, esto nos dice que la velocidad de extensión radial e8 proporcional al

tiempo de incubación.

1

DETERMlNAClÓN DE BIOMASA VI CONCENTRACIÓN DE QLUCOSA

4.50E-02 - 4.00E-02 ..

3.50E-02

__

cL 3.00E-02

__

2.50E-02

__

U

0.003 0.03 0.3 3 30

C O N C E N T R A C 1 6 N D E G L U C O S A I g / L I

+5 DIAS

+7 DIAS

-9 DIAS

Gráfica

3.

ia

cantidad

de

biomasa formada en un medio de culüvo con una concentración de gJucosa de 3.0 giL es mayor que a otras concentraciones.

BIOMASA VS TIEMPO

4.50E -02 - 4.00E-02 ..

3.50E-02 ..

ri 3.00E-02

__

2.50E-02

__

u

1 .OOE -02 ..

5.00E-03

__

3 5 7 9

T I E M P O I D I a s l

Gráñca 4.

- c 1 0 . 0 0 3 g/LI

-10.03 g/ll

-10.3 g / L l

+

13.0 g/ L1

-130.0 g / L I

VELOCIDAD D E EXTENSldN RADIAL VI CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA

0.003 0.03 0.3 3 30

C O N C E N T R A C 1 6 N D E Q L U C O S A I p i L i

-3 D f A S -5 D f A S +?DIAS -9 D l A S

GrMica 6. Tratamiento 2.

Como se muestra en la g M c a , la velocidad de extensión radial e8 mayor cuando

el medio de cultivo tiene una concentraciibn de 0.3

dL

de glucosa, esta gráfica puede compararse con la gráfica 1. y los resultpdos pueden ser paco direrenies

pero

siguen

una tendencia igual que es alcanzar su máxima velocidad de

CONCLUSIONES

La velocidad de extensión radial y la producción de biomasa son proporcionales ai tiempo de incubación (gWcas 2 y 4), sin embargo no se p u d e decir que soan igualmente proporcionales con respecto a la concentración de nutrientes, esto es, que a una dilución del medio de culüvo de 1 O veces, la producción de biomasa es mayor (gr8fica 3), mientras que

la

velocidad de extensión radial es mayor cuando existe una ditución del medb de cultivo de 100 voms (flea 1).

AI realizar las mediciones de la extención radial del micslio durante diferentes tiempos de incubación, los resultados obtenidos de los dos tratamientos son en algunos casos mayores en el tratamiiento 1 y en otros casos son mayores en el tratamiento 2, no afectando esto, que los dos tratamientos coincidan en tener su mayor velocidad de extensión radial con una concentración de glucosa de 0.3 glL (gréfcas 1 y 5).

Por lo que el mantener el peso constante de los micronutrientos presentes en cada dilución nos confirma que al no registrar diferancias significatias en la velocidad de crecimiento y biomasa, estas diferencias pueden registrarse al

BlBLlOGRAFíA

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