Texto completo

(1)

INFORME

FINAL

DE

SERVICIO SOCIAL

NOMBRE:

MATRICULA: LICENCIATURA:

TELEFONO:

TRIMESTRE LECTIVO:

HORAS A LA SEMANA:

TITULO DEL TRABAJO:

ROMERO SOLlS MARIA DE LOIJRDES

9 1 234958

INGENIERIA BlOQUlMlCA INDUSTRIAL

il

856Y505

i

'97-P

20

PURlFlCAClON DL PROTEASAS A PARTIR DE UN m C T Q

C ~ I ~ T I c o

De

CAMARON

CLAVE: 181.020.96

ASESORAS

M.C. KEIKO SHlRAl MATSUMOTO

profra. Titular B

DRA. ISABEL GUERRERO LEGARRETA

profra. Titular C

LUGAR DE REALIZACION: LABORATORIO S-146 DEPTO. DE BIOTECNOLOGIA UAM-I FECHA DE INICIO: 19 DE AGOSTO DE 1996

FECHA DE TERMINACION: O3 de junio de 1598

NOMBRE DEL PROYECTO PURlFlCAClON Y CARACTERIZACION DE PROTEASAS DE CAMARON

NOMBRE DEL PROGRAMA UTILIZACION DE DESPERDICIOS DE LA INDUSTRIA CAMARONERA

ALUMNA ASESORAS

(2)

Dr.

Jose

Luis Arredondo F igueroa

Director de la DivisMn de Ciencias Biol6gicas y de la Salud.

PRESENTE

El que suscribe, miembro del personal academico de esta Universidad.

Por medio de la presente se hace constar que la alumna cuyos datos aparecen a continuaci6n, concluy6 satisfactoriamente su servicio social.

NOMBRE: ROMERO SOLlS MARIA DE LOURDES

MATRICULA: 91234958

LICENCIATURA EN: INGENIERIA BlOQUlMlCA INDUSTRIAL

PROGRAMA: UTlLlZAClON DE DESPERDICIOS DE LA INDUSTRIA CAMARONERA

TITULO DEL TRABAJO: PURlFlCAClON DE PROTEASAS A PARTIR DE UN EXTRACTO

ENZIMATICO DE CAMARON

PERIODO: O 1 DE AGOSTO DE1996 AL O 1 DE FEBRERO DE 1997

Por

lo cual no existe inconveniente para que se lleve a cabo su tramite final correspondiente.

ATENTAMENTE

"CASA ABIERTA AL TIEMPO'

PROFRA

T I T U L k B

(3)

1 .

2.

3.

4.

5.

6.

7.

7.1

7.1.1

7.1.2

7.2

7.2.1

7.2.2

7.3

7.3.1

7.3.2

7.3.3

7.3.4

7.3.5

7.3.6

Justificación Introducción Antecedentes Objetivo general Objetivos particulares Material y equipo Metodologia Fermentación

Preparación del medio de cultivo Preparación del inóculo

Preparación de la muestra

Precipitación con sulfato de amonio Diulisis

Preparación de las muestras para su caracterización. Deteminación de la actividad proteolítica

Cuantificación de proteínas Actividad a diferentes pH

Determinación de pesos moleculares Electroforesis

Efecto de inhibidores sobre la actividad proteolítica

7.4 Diagrama de flujo propuesto para la metodología

8. Resultados y discusiones 9. Recomendaciones

1

O.

Objetivos y metas alcanzados

1 1. Conclusiones

12.

Abreviaciones

13.

Bibliografía 14. Resumen

(4)

PURlFlCAClON DE PROTEASAS A PARTIR DE UN EXTRACTO

ENZlMATlCO DE CAMARON

Es

importante considerar que México tiene una producci6n considerable de camarón, aproximadamente

70,000

toneladas por año de las cuales 31,500 toneladas son desperdicios constituidos principalmente de cabezas y exoesquelestos. Asimismo las proteasas ocupan el segundo lugar de importancia en la producción de enzimas a nivel industrial. Su función de hidrolizar proteínas es aprovechuda en la industria de lácteos, de detergentes, la farmacéutica, la cárnica así como en el tratamiento de

desechos

líquidos. (Secretaria de Pesca 1993).

Las proteasas de orgunismos marinos, son conocidas por su alta actividad y se les considera responsables de cambios indeseables en algunos productos alimenticios del mar como son los pescados, se cree que su deterioro durante su procesamiento es debido a proteasas alcalinas. Muchas de estas enzimas tienen que ser sepafffda. purificadas y caracterizadas en términos de sus propiedades bioquímicas, lo cual demwsfrca que

mientras

que

en algunos productos, las proteasas resultan perjudiciales en

cuanto

o

su

coLdad,

en

otras favorecen

l

a

aparición de propiedades deseadas reduciendo efectos indeseables. (Jiang, S. et. al., 1991

).

Por lo anteriormente expuesto, es jústificable el hecho de querer obtener mediante purificación, proteasas a partir de residuos de camarón y caracterizar estas enzimas para su uso econbmico posterior.

(5)

Las proteasas son enzimas ampliamente utilizadas en la industria de alimentos con el fin de originar cambios en el sabor, textura y aspecto de un producto. Algunas proteasas microbianas son utilizadas en la hidrólisis de proteínas solubles presentes en la cerveza, por lo que si no se trata podría precipitar y producirse opacidad durante el enfriamiento. En la hidrólisis de gelatina para evitar la gelificación posterior en productos alimenticios así como en la hidrólisis de gluten en la masa de pan para controlar la viscosidad durante la manipulación y para incrementar la textura y apariencia final, estas son

solo

unas cuantas aplicaciones de las proteasas.

Las proteasas que se usan en la industria se derivan principalmente de plantas, animales y

algunos microorganismos, mientras que los derivados de organismos acuáticos no son muy utilizados. Algunas de las razones de la poca investigación sobre proteasas de origen marino son las siguientes:

1. Existen pocos estudios dedicados a este tipo de proteasas, de aquí que la información

2. Una actitud desfavoraMe

por parte

de bs investigadores relaclonada al olor del

sobre su potencial es limitada.

material,

Algunas de las propiedades que distinguen a bas proteams de organismos acuáticos incluye su alta eficiencia catalítia

u

bujos

tempxaiuras, su baja estabifidud térmica y substancial actividad catalítica relaciona&

con

su

estabilidad de pHs alcalinos y neutros.

Las proteosas de pescado se clasifican de acuerdo a su modo de catálisis en cuatro grupos: c o r n proteasas sérinicas, ácido aspájrticas, tiolcisteínicas y rnetaloproteasas. Estas pueden diferenciarse unas de otra en base a su respuesta a varios inhibidores.

Entre las posibles aplicaciones de estas proteasas en la industria de alimentos pueden mencionarse la reducción de la viscosidad, preparación de proteínas hidrolizadas de pescado para alimento de animales y en procesos de fermentación. Entre las aplicaciones más reciente se incluye la eliminación de cueros, hidrólisis de membranas y tejido de soporte que envuelven huevas

o

sacos de otros tejidos y en pigrnentos y sabores así como la limpieza de pescado, desproteinización de quitina y recuperación de proteína. (Haard y Simpsom, 1991).

La elevada importancia de las proteasas hace necesarios su aislamiento y purificación para

lo cual pueden emplearse procedimientos fraccionarios físicos o quimicos. El objeto en cada poso es retener tanto como sea posible el enzima deseado y eliminar las otras proteínas. La eficacia de cada paso viene dada por el rendimiento o la recuperación (que es el porcentaje que se ha retenido de la actividad total de la enzima originalmente presente) así como por la purificación. No hay reglas generales respecto al orden de las etapas de purificación, aunque el tratamiento con calor (cuando es posible) y la precipitación con sulfato de amonio se realiza al principio de la purificación.

Normalmente la caracterización consiste en la colección de fracciones de la filtración y en la determinación del perfil de actividad con respecto a: pH, temperatura e inhibidores.

En el presente trabajo se realizó una purificación parcial por medio de cromatografía en gel

(6)

ANTECEDENTES

La actividad de proteasas obtenidas del tracto digestivo del camarón pardo

(Penueus

cdiforniensisj fue estudiada eh el Centro de Investigaciones de Baja California Sur (México), obteniéndose las siguientes propiedades:

1 ) Alta halotolerancia, teniendo una máxima actividad entre O y 0.5 M de NaCI, pero con

2) una actividad optima a 50' c e inactivación irreversible a 6 0 c.

3) actividad entre un pH de 10 con una máxima actividad a pH 8. Entre las enzirnas que presentaron actividad se encuentran: del tipo tripsina, cromotripsina, carboxipeptidadsa A y B y leucina-aminopeptidasa.

La

actividad de estas fue inhibido por cationes divalentes Cu, Cr, Zn, y Hg. No hubo ningún efecto sobre la actividad con Mg y Ca. (Vega-Villasante et. al., 1995).

un 50% de actividad máxima a 2M de NaCI.

Los

alimentos de origen marino presentan una alta actividad enzimótica y se cree que las proteasas son las responsables de cambios indeseables tanto en camarón como en pescado fresco. Se ha reportado que la vida media de camarón fresco congelado no es más de 3 4 días acausa de la actividad enzimática. f Jiang y Moody, 1991

).

Se ha logrado purificar hasta cuatro fracciones con actividad caseinolítica a partir del tracto digestivo del camarón (Penueus monodon), encontrándose que tres de ellas correspondían a tripsina y la otra a quimotripsina proteasa (Jiang, et. al., 1991.

Se han realizado purificaciones de proteasas de Ewhusiu

suRerba

con métodos de cromatografía en Shepadex G-75 con un 76% de recuperación de actividad y electroforesis en poliacrilamida (Fik, M., 1984).

Los

efectos de vanos inhibidores sobre la actividad de proteasas de fracciones obtenidas de la filtración en gel sephadex G-150 de un extracto crudo de E

swerba

a pH 8 y pH 5 dieron

los

siguientes resultados: EDTA y ST1 reprimieron la actividad de Hip-Arg, mientras que la C-Hb hidrolasa fue inhibido por DFP y EDTA a pHs 8 y 5 respectivamente. (Nishimura et. al., 1983).

(7)

Ching-San y colaboradores (1978), también determinaron

el

peso molecular de proteasas del E suoerba, aislando cuatro fracciones cuyos pesos rnoleculares se encontraron entre 24,000 y

27,000 Daltones.

Cinco proteasas fueron aisladas de EuDhasia smerba, utilizando sulfato de amonio, precipitación con acetona, filtración en gel y crornatografia con DEAE-Sephadex A50, así como una purificación por medio de electroforesis discontinuo y una recromatografía, encontrando que cuatro de ellas eran tripsinas y la otra una carboxipeptidasa. Probaron su actividad frente o inhibidores como 3indol propionato, D-fenilalanina y N-alfa-tosil-L-lisilclorometilcetona. (Chiang- Yon, et. al., 1976),

(8)

OBJETIVO

GENERAL

A partir de licor de residuos de camarón fermentado, purificar y caracterizar proteasas.

OBJETIVOS

ESPECIFICOS

l.

Determinación de pesos molecuñares mediante HPLC.

(9)

MATERIAL

Y

EQUIPO

MATERIAL BIOLOGIC0

Desperdicios de camarón molido y congelado a 4OC. comprado en la Central de Abastos de la ciudad de México.

EQUIPO

Potenciometro marca Beckman 450pHmetro Centrifuga Beckman J2-MI

Ultracentrifuga Sorvall nc-l2c Dupont Ultra Espectrofotómetro Beckman DU-650

Equipo millipore para filtración de soluciones Baño de agua marca FELISA

Balanzas analíticas Galaxy 400 y Mettler AT200 HPLC marca WATERS

Equipo para electroforesis Estufa FELISA

REACTIVOS

(10)

7.1 FERMENTACION

Se prepararon 4 fermentaciones cada una bajo las siguientes condiciones:

Se llenaron frascos de vidrio con camarón más dextrosa anhidra más inoculo: Lactobacillus spp, cepa 82, D.0 2.0 (I = 565nm

).

Se incubaron a 30 c por 48 horas.

7.2 PREPARACION DEL MEDIO

DE

CULTIVO

[PARA MANTENIMIENTO DE

Loctobocllus SDD cepa 82)

Agua destilada 75ml

M RS 3.9 g

Agar 1.125g

Se llenaron tubos de ensaye con rosca, con l5ml del medio anterior, se esterilizaron y se sembró en medio inclinado por estría la cepa 82, incubándose durante 24 horas a 30°C. Posteriormente se

realizó tinción de gram para identificar gram positivos.

7.1.2 PREPARACION DEL INOCULO Medio APT

Agua destilada

Incubar a W C , 24 horas hasta D. O

=

2.0

Después de las 48 horas de fermentación se procedió a obtener el licor mediante la filtración a través de gasas y centrifugación a 8OOO rpm durante 25 minutos a 4OC. Posteriormente el licor se

liofilizó y guardó el producto en bolsas de plástico al vacío en congelación.

7.2

PREPARACION DE LAS

MUESTRAS

Las muestras liofilizadas se resuspendieron en un volumen igual al inicial en buffer de fosfatos pH 4 (muestras 1 y 2) y buffer de fosfatos pH 6.5 en NaCl0.6M (muestras 3 y 4).

7.2.1 PREClPlTAClON

CON

SULFATO DE AMONIO

(11)

7.2.2

DlALlSlS

Después. de la centrifugación, se separó el sobrenadante (el cual se guardo en refrigeración a

4OC).

y el precipitado se coloco en bolsitas especiales para dialisis, estas se suspendieron en agua desionizada con agitación magnética a 4' c por 48 horas haciendo cambios de agua cada 24

horas. El dializadofue conservado a -7OOC

7.3

PREPARACION DE LAS MUESTRAS PARA

SU

CARACTERIZACION

7.3.1 DETERMINACION DE ACTIVIDAD PROTEOLITICA

La actividad proteolítica de

las

muestras de camarbn se determinó por el método de Kunitz (1 946). La mezcla de reacción contenía:

2

minutos

y se ley6 a

280

nm en

el

esp6ctrofotornetro.

DEFlNlClON DE UNIDAD DE ACTIVIDAD PROTEOLITICA

Kunitz ( 1 947) Define :

" Una unidad de actividad como la cantidad de enzima que produce un

cambio en lo adsorbancia a 280 nm de 0.01 por minuto a las condiciones descritas 'I.

7.3.2

CUANTIFICACION DE PROTEINAS

Para

la

cuantificación de proteínas de las muestras se utilizó la técnica de Lowry. La mezcla de reacción contenía:

(12)

7.3.3 ACTIVIDAD A DIFERENTES pH

El

pH se determinó mediante la actividad proteolítica como se describió anteriormente, excepto que el buffer de fosfatos en el que esta disuelta la caseína se cambió a pH 6 ,

7

y 8. Se utilizó hemoglobina en buffer de fosfatos a pH 4, 6 y 8.

7.3.4 DETERMINACION DE PESOS MOLECULARES

Se inyectaron 500 pl de muestra de camarón dializado y filtrado en membranas

0.2

pm en HPLC bajo las siguientes condiciones:

Columna Marca WATERS de 300rnm de longitud por 8 mm de diámetro. Volumen de columna 15.079 cm3

Volumen de vacío 5.66 mi

Flujo

O.

1 Sml/min.

Tiempo de eiwción

37.748

min.

Absorbancia 210 nm

EMPAQUE SEPHADEX

Se utilizaron las siguientes soluciones:

.

Metano1 al 10%

.

Agua destilada y desionizoda

.

Buffer de fosfatos pH 4 ( para muestras 1 y 2)

.

Buffer de fosfatos pH 6.5 con NaC10.6 M (para muestras 3 y 4)

.

NaOH 0.2 M

(todos ellos filtrados en millipore, membrana 0.2 p n )

Se inyectaron los siguientes marcadores para construir la curva de caiibración (Fig. No.2)

Anhidrasa carbonica 2 9 , O O O Daltones

0 Albúmina serica bovino 66,000 Daltones 0 Alcohol deshidrogenasa 150,000 Daltones

0 p-Amilasa 200,000 Daltones

7.3.5 ELECTROFORESIS

Se prepararon las siguientes soluciones:

A . ACRILAMIDA/BIS

87.6 g de acrilamida/bis (29.2g/100ml)

2.49 N'N'-bis-metileno-acrilamida (0.8g/100ml)

Hacer 300ml con agua destilada, filtrar y almacenar a 4' c

( 3 0

días máximo de

(13)

B. 1.5M TRIS-HCI, pH .8.8

27.239 tris base ( 1 8.1 5g/lOOml) 80 ml de agua destilada

Ajustar a pH 8.8 con 1 N de HCI.

Preparar 150 ml con agua'destilada y almacenar a 4'C.

C. 0.5M TRIS-HCI, pH 6.8

6 g de tris base

60 ml de agua destilada Ajustar a p H 6.8 con 1 N de HCI

Preparar 1 OOml con agua destilada y almacenar a 4' c

D. 10% SDS

Disolver 1 Og de SDS a agua con 1 OOml con agua destilada

E. BUFFER MUESTRA (SDS)

Almacenar a temperatura ambiente agua destilada 4,O

ml

gliceroi 0.80 mi

10% (w/w)SOS 1.6

ml

2-p-rnercaptoetanol 0.4 ml

O.S%(w/v) Bromofenol-azul 0.2 ml total 8.0 ml 0.5 M triS-HCI, pH 6.8 1

.O

ml

F. 5X BUFFER PARA CORRIDA EN ELECTRODOS p H 8.3

Tris-base 9 g Glicina

43.2

g

SDS 3 9

Prepara 600ml con agua destilada Almacenar a 4' C

Diluir 60 ml5X stock con 240 ml de agua destilada para una comda de electroforesis

PREPARACION DEL GEL PARA SEPARACION

0.375M Tris pH 8.8

Agua destilada 4.02 ml

10% (w/v) SDS stock

1004

Acrilamida/bis 3.33 ml

1.5M Tis-HCI, pH 8.8 2.5 ml

DESGASIFICAR POR 15 MINUTOS

10% de persulfato de amonio (PREPARADO AL MOMENTO) 50 pl

(14)

7.3.6 EFECTO DE

INHIBIDORES

EN

U

ACTIVIDAD PROTEOLlTlCA

EFECTO DE EDTA (INHIBIDOR DE METALOPROTEASAS)

El efecto del EDTA en la actividad proteolítica de las muestras dializadas de camarón se determino a 4 concentraciones : 0.2, 0.3, 0.5 y 1

.S

mM en buffer de fosfatos pH 6.5 de la caseína que

lo

contenía a manera de dar esa concentración en el volumen final (3,150 ml). Posteriormente se

determinó la actividad proteolítica descrita anteriormente.

EFECTO DEL PMSF [INHIBIDOR DE PROTEASAS SERICAS Y TlOL PROTEASAS)

Se trabajo concentraciones de 1 8 0 pg/ml, disuelto en isopropanol, agregándose de esta solución

(15)

Cabezas

de

\

camarón

láctica

Centrifugación

cxlzl

Fracción insoluble

Filtración en gel

HPLC

h .I

L

lnhibidores

t

(16)

RESULTADOS Y DISCUSIONES

Tabla 1. Se muestran los resultados obtenidos de cada una de las fermentaciones realizadas.

Tabla l . Condiciones físicas de las fermentaciones realizadas

En la tabla

2,

se puede observar la diferencia que hay en cuanto a concentración de proteína entre el extracto del lote 1 y el 2. Esto se debe en parte a el tipo de camarón que se utilizó en

la

primera fermentación, el

cual

presentaba características físicas que diferían del segundo lote, como son color,

olor

y

tamaño

de

lar

cabezas de camarón, esto también se puede apreciar en el p H que se obtuvo de la fermentación y que se muestra en la tabla 1 .

(17)

Tabla

3.

Se muestran

los

resultados obtenidos de la curva patrbn para cuantificaa6n de proteína, en la cual se utiliz6 seroalbubina bovina corno proteína patr6n.

o

tU 20 30 40 50 60 70 80 90

CONCENTRACION (mglml) y = 0.0058~ + 0.2846 R2 = 0.942

(18)

FI. 3 EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ESPECIFICA DE LA MUESTRA 3 UTILIZANDO

CASEINA COMO SUSTRATO

6 7 8

PH

Tabla 4. Dotos de pH utilizando hemoglobina y caseina como substratos para detrminar la actividad proteolitica del dializado

(NH4)2S04p,p.

FIG. 4 EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ESPECIFICA DE LA MUESTRA 3 UTILIZANDO

HEMOGLOBINA COMO SUBSTRATO

4 6 8

PH

Se encontró una actividod mayor a un pH de 8 utilizando como sustroto hemoglobina y un pH de 6

(19)

Tabla 5. Pesos moleculares obtenidos de diferentes marcadores inyectados en HPLC para construir la curva de calibración.

De

los

datos obtenidos de la tabla 5, se gráfico el logarifmo natural de los pesas moleculares contra el tiempo de retención obteniéndose la ecuación de la recta (Figura ), que nos permitió encontrar los pesos moleculares de la muestra 3 que a continuación se presentan.

*

NOTA: Los picos 1 y

2

presentaron volúmenes de retención que están fuera de

la

curva de calibración.

En investigaciones realizadas con E suDefba se han encontrado enzimas con pesos moleculares entre 28,000 a 30,OOO daltones (Kimoto y Kusama, 1982), y de 24,000 a 28,000 cuyos pesos son similares a la enzima del tipo tripsina (Chen y Yon, 1978). Mientras que en enzimas del tracto digestivo Penueus monodon se han encontrado pesos moleculares desde 18,500 hasta

50,000

daltones (Jiang y Moody, 1991). Comparando estos datos con

los

obtenidos en este trabajo, podemos suponer que el pico 5 correspondería al tipo de enzima tripsina por presentar un peso molecular similar al reportado en bibliografía y que los otros pesos moleculares son demasiado altos

(20)

CURVA PATRON PARA PESOS MOLECULARES

I

I

. f

y = -0.0393~ +. 14.055

2

0 -

". "~

1 .

i

- "_

i

i

~"

"

O 20 40 60 80 1 0 0 120 140

Tr (minutos)

FIGURA 5. Curva patrón para detrminar

los

pesos mofeculares de las muestras inyectadas en HPLC. La linea (-) muestra los datos dispersos, to línea

6-1

muestra los datos ajustados mediante regresión lineal.

Tabla 7. Determinación de 4a uctiv!drJr=f

p?oteolitica

de

l

a

muestra 3, utilizando hemoglobina como subs4 irato y

En la tabla 7, se muestran los resultados de la actividad proteolítica realizada a las fracciones obtenidas del HPLC, no obstante que la actividad fue baja utilizando el método de Kunitz, al realizar actividad con caseína al 1 % en geles de poliacrilamina

al

10% de las mismas fracciones, se

(21)

2.5 -

2 -

Perfil de elución de

la

muestra 3 en el HPLC

filtración en gel

a

- 30

- 25

- 20

.- 15

- 10

- 5

- 0

Tiempo de retenci6n (minutor)

m absorbancia

-+

actividad

FIGURA 6. Perfil de elución de la muestra 3 en HPLC., donde podemos apreciar que sólo hay actividad proteolítica en

los

picos 3, 6 y 9.

(22)

I

I

' 20100

t ,

' 40100 '

I ,

6 0 ; O0 SO: O 0 1001.00

I

1201. 001

(23)
(24)

c>

U

c.

r-

' i

(25)

\

\

I

t

z

,

I

i x

6

O

(26)

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1

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1.50-

I . 40-

l. 30-

1.20

1.10-

1.00-

O. 90

o. ao-

O m 7 0 -

O. 60-

o. 50

O . 40-

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o. 20-

o.

10-

(27)

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(28)

I

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I S I , I , * ,

201 O0 40100 ' " 1 60.00 8 0

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(29)

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(30)
(31)
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(33)

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o

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(34)

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1

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. ^ I n -

(35)

Millennium Results Report May 2 , 1997 Page: 3 of 3

Report Plethod: Default Version: 2 - 1 0

For Sample: marcador2

;?roc Chan; Wvln Chl

V i a l : 1 I n j e c t i o n : 2 Channel: Wvln C h l

Processed: 02/05/97 05:22:47 PM

Channel Descr: PDA 2 1 0 . O nm

S8 ¡ 116.302 7 0 5

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7 8 3 0

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(36)

lMilfennium Results Report May 2, 1997 Page: 2 of 3

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I

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1

625868

1

VB

52

I

99.518 4396 394

1

BB

53 102.702 12710

1

353 BB

(37)
(38)
(39)
(40)

Iu

a m

(41)
(42)

w

O

M

(43)
(44)

TABLA

8.Resultados de los dos inhibidores utilizados para determinar 7% de inhibición utilizando actividad proteolítica con caseína como substrato utilizando la técnica de Kunitz y a dos diferentes PH.

La

inhibición con EDTA y PMSF supone la presencia de metaloproteasas, proteasas séricas y tiol proteasas que son las enzimas que son inhibidas con estos compuestos. Sin embargo no se encontró inhibición con EDTA a concentraciones bajas, lo cual supone la presencia de metaloproteasas en pequeña cantidad que sólo pueden ser inhibidas con altas concentraciones del mismo o que la inhibición se pudo deber no al efecto del EDTA sobre estas enzimas sino a la saturación con este tipo de sal.

También hay que observar que a pH ácidos y a un 70% de saturación con sulfato de amonio hubo mayor porciento de inhibición con EDTA que a un pH de 6.5 y un 80% de saturación. esto tal vez por

la forma iónica del EDTA que se favorece a pH igual a 4.

En cuanto al PMSF, con una concentración de 1 mM se observó que pH ligeramente neutros (6.5) y

un 80% de saturación con (NH+SO, favorece la inhibición de proteasas séricas y tiol proteasas

ELECTROFORESIS

La electroforesis se practicó a las fracciones recolectadas de cada pico observado en el cromatograma e inyectadas inmediatamente a los geles de poliacrilamida 10% y practicándoseles actividad proteolítica en caseína al 1 % observándose como resultado ligeras bandas de actividad en prácticamente todos los picos [ver figura 7),

lo

que nos indica la presencia enzimática en dichas fracciones. No obstante que en el perfil de elución obtenido del HPLC, sólo se aprecia actividad

en 3 picos, lo que hace suponer que en las fracciones pueden encontrarse enzimas en muy poca cantidad y es por ello que al suspender

los

geles en caseína resulte ser un medió adecuado para

(45)

7 0

FIGURA

7.

Gel obtenido por electroforesis

en

acrilamida I 0%

(46)

3 Se sugiere trabajar en porcentajes de saturación de sulfato de amonio al 80% ya que con el 70% que se uso al principio de este trabajo, se observo actividad proteolítica en el sobrenadante de camarón, lo cual influía en la disminución de actividad en los dializados posteriormente obtenidos.

3 El tiempo de incubación para determinar la actividad proteolítica propuesto en el método De Kunitz, es de 10 minutos, sin embargo, se observó en la práctica que con este tiempo la actividad proteolítica es casi nula, por lo cual se propone 1 hora de incubación a una temperatura de 33OC.

3 Se observó que las fracciones de camarón recolectadas en HPLC, no se conservan en buen estado en refrigeración a 4OC, por lo cual se sugiere que si es necesario su almacenamiento, se guarde en ultracongelación.

~j Se inyecto una muestra de licor de camarón fermentado en HPLC, encontrándose una alta

contaminación e impurezas presentes en la misma que la hacen difícil de leer: No se sugiere realizar esta prueba ya que resultó inútil obtener alguna información.

a Es importante que todas las muestras que se de en almacenar, se guarden en bolsas al vacío 0

recipientes de plástico en congelación ya que en refrigeración se observó lisis de proteinas 10 cual alteran los resultados.

Para obtener datos más exactos, es importante que se trabaje con la misma especie de camarón, pues como se pudo demostrar en este trabajo, los resultados difieren mucho cuando se trabaja con dos especies distintas.

3 En este trabajo no se utilizo una columna de baja presión debido a que no se contaba con el gel de empaque en buen estado, por lo cual no se pudo recolectar fracciones de mayor volumen y realizar análisis de actividad proteolítica y cuantificación de proteínas y obtener datos comparativos. Resultaría adecuado que en posteriores trabajos se contara con ello.

(47)

OBJETiVOS

Y

METAS ALCANZADAS

Los objetivos se cumplieron en su totalidad, ya que se aprendió el manejo de

los

distintos tipos de análisis de enzimas, manejo de equipo de filtración y análisis cromatografico, en

los

cuales se tuvo la oportunidad de aplicar los conocimientos adquiridos en la carrera.

AI realizar el servicio social en el laboratorio de macromoléculas del departamento de biotecnología de la Universidad Autonoma Metropolitana, se adquirieron conocimientos en cuanto al manejo del equipo de HPLC, electroforesis, y técnicas empleadas en la caracterización de enu'mas.

De esta manera se pudo realizar actividad proteolítica utilizando tanto la técnica de Kunitz como en electroforesis de las muestras dializadas y las recolectadas de HPLC.

Se logró determinar el efecto del pH sobre la actividad especifica de una muestra dializada encontrándose un pH optimo de 8 utilizándose como substrato hemoglobina y un p H de 6 con caseína.

Se logró cuantificar el peso molecular de la mayoría de los picos obtenidos en el cromatograma en HPLC, encontrándose que uno de ellos presenta un peso molecular muy similar a la enzima del tipo tripsina

.

El Efecto de

los

inhibidores EDTA y PMFS mostraron inhibición a concentraciones altas del primero suponiendo la presencia de metaloproteasas y de proteasas séricas y tiolproteasas por parte del segundo.

Por

lo

anterior se concluye que en licor obtenido de los residuos de camarón

(48)

ABREVIACIONES

EDTA: Acido diaminoetilo tetracetico

HPLC: Cromatografia de líquidos de alta resolución PMSF: Floruro de fenilmetanosulfonilo

RPM: revoluciones

por

minuto

SDS: Dodecilsufato

de

sodio

TCA: Acido tricloro acético

TEMED: N, N, N', N'-tetrametileno-etilendiamina

(49)

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Figure

Fig.  1.Diagrama  de  flujo  propuesto  para  el  aislamiento  y purificaci6n  de  proteasas  a  partir  de  desperdicios  de  crusthceos
Fig. 1.Diagrama de flujo propuesto para el aislamiento y purificaci6n de proteasas a partir de desperdicios de crusthceos p.15
Tabla  1.  Se  muestran los resultados  obtenidos de cada una  de  las  fermentaciones  realizadas

Tabla 1.

Se muestran los resultados obtenidos de cada una de las fermentaciones realizadas p.16
Tabla  l .   Condiciones  físicas de las  fermentaciones  realizadas

Tabla l .

Condiciones físicas de las fermentaciones realizadas p.16
Tabla  3.  Se  muestran  los  resultados  obtenidos de la curva  patrbn  para  cuantificaa6n  de  proteína,  en  la  cual  se  utiliz6  seroalbubina  bovina  corno  proteína  patr6n

Tabla 3.

Se muestran los resultados obtenidos de la curva patrbn para cuantificaa6n de proteína, en la cual se utiliz6 seroalbubina bovina corno proteína patr6n p.17
FIGURA  2.  CURVA PATRON  PARA  LA  CUANTIFACION  DE PROTEINA. Se  utilizó como proteína  patrón

FIGURA 2.

CURVA PATRON PARA LA CUANTIFACION DE PROTEINA. Se utilizó como proteína patrón p.17
Tabla 4. Dotos de pH utilizando hemoglobina y caseina como substratos para detrminar la  actividad proteolitica  del dializado  (NH4)2S04p,p

Tabla 4.

Dotos de pH utilizando hemoglobina y caseina como substratos para detrminar la actividad proteolitica del dializado (NH4)2S04p,p p.18
FIG. 4 EFECTO DEL  pH  SOBRE  LA  ACTIVIDAD  ESPECIFICA DE  LA MUESTRA 3 UTILIZANDO
FIG. 4 EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ESPECIFICA DE LA MUESTRA 3 UTILIZANDO p.18
Tabla 5. Pesos  moleculares  obtenidos  de  diferentes  marcadores  inyectados  en  HPLC  para construir  la  curva de calibración

Tabla 5.

Pesos moleculares obtenidos de diferentes marcadores inyectados en HPLC para construir la curva de calibración p.19
Tabla  7. Determinación  de  4 a   uctiv!drJr=f  p?oteolitica  de  l a muestra  3, utilizando hemoglobina como  subs4 irato y

Tabla 7.

Determinación de 4 a uctiv!drJr=f p?oteolitica de l a muestra 3, utilizando hemoglobina como subs4 irato y p.20
FIGURA  5. Curva patrón para detrminar  los  pesos mofeculares de las  muestras inyectadas en HPLC

FIGURA 5.

Curva patrón para detrminar los pesos mofeculares de las muestras inyectadas en HPLC p.20
FIGURA 6.  Perfil de elución  de la muestra  3  en  HPLC.,  donde  podemos  apreciar  que  sólo  hay  actividad proteolítica en  los  picos  3,  6 y 9

FIGURA 6.

Perfil de elución de la muestra 3 en HPLC., donde podemos apreciar que sólo hay actividad proteolítica en los picos 3, 6 y 9 p.21
TABLA  8.Resultados  de  los  dos  inhibidores  utilizados  para  determinar  7% de inhibición  utilizando

TABLA 8.Resultados

de los dos inhibidores utilizados para determinar 7% de inhibición utilizando p.44

Referencias

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