IZTAPALAPA DIVISIÓN DE C I E N C I A S B I O L ~ G I C A S

Texto completo

(1)

UNIVERSIDAD AUTóNOMA METROPOLITANA

-

IZTAPALAPA

DIVISIÓN DE C I E N C I A S B I O L ~ G I C A S

Y

DE

LA

SALUD

LICENCIATURA EN BIOLOGíA EXPERIMENTAL

INFORME FINAL DE,L PROYECTO DE SERVICIO SOCIAL

/

" D E T E R M I N A C I ~ N DEL C O N T E N I D O DE Á C I D O S I Á L I C O (AS) D E L A S I S O F O R M A S D E L A H O R M O N A L U T E I N I Z A N T E ( L H ) . "

ASESOR INTERNO : ~

M. en B.E. Joaquín Fernando Herrera Muñoz Profesor Titular C. Medio Tiempo

Departamento de Ciencias de la Salud, UAM

-

I . Investigador Titular

Unidad de Investigación en Medicina Reproductiva Hospital "Luis Castelazo Ayala" I.M.S.S.

ASESOR EXTERNO :

Quim.Edgar Roger Barahona Bustillos Técnico de Investigación

Unidad de Investigación en Medicina Reproductiva. Hospital "Luis Castelazo Ayala" I.M.S.S.

LUGAR DE REALIZACION: Laboratorio de andrologia

Unidad de Investigación en Medicina Reproductiva. Hospital "Luis Castelazo Ayala" I.M.S.S.

TRIMESTRE: 98-P HORAS A LA SEMANA 20

FECHA DE INICIO: 19 DE NOVIEMBRE DE 1997 FECHA DE TERMINACION: 20 DE MAYO DE 1998

CLAVE: BE 033

" " " " " " " L " " " " " " " " "

SRITA. ARACELI MIRANDA SORIANO

4

" " " " " " " L " " " " " " " " "

(2)

Casa a b m al tmp

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

México, D.F.

,

a 26 de Junio de 1998.

DR.

JOSÉ

LUIS ARREDONDO FIGUEROA.

BIOLóGICAS

Y

DE

LA

SALUD

DIRECTOR DE

LA

DIVISIÓN

EN

CIENCIAS

Llamamos su atención con motivo de manifestar

a Ud. que con

fecha de hoy, podemos decir que se han concluido satisfactoriamente las

actividades relacionadas al proyecto de Servicio Social intitulado

ISOFORMAS DE LA HORMONA LUTEINIZANTE", en el que participó la

alumna de la Licenciatura en Biología Experimental

S r i t a . A r a c e l i M i r a n d a S o r i a n o

(matrícula 91234554) y que iniciara el 19 de noviembre

de 1997

y que, de acuerdo

a la programación inicial, debería haber

concluido el día

20

del pasado mes de mayo. Los motivos que

ocasionaron el retraso estuvieron relacionados

a la elaboración del

informe final, ya que fue necesario revisar

y discutir los importantes

resultados obtenidos por la Srita. Miranda.

" D E T E R M I N A C I ~ N DEL CONTENIDO DE

Á C I D O

SIÁLICO

DE

LAS

Sin mas por el momento que agregar nos despedimos enviándole

un respetuoso saludo.

Atentamente

Asesor Interno Asesor Externo

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M. en

N.

Joaquín Herrera Muñoz

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Q > s

Investigador Titular A Técnico en Investigación

Unidad de Investigación en Medicina Reproductiva, Hospital Luis Castelazo Ayala,

IMSS Profesor Titular Cy MT

Departamento de Ciencias de la Salud UAM

-

I

UNIOAO IZTAPALAPA

(3)

UNIDAD DE INVESTIGACION EN MEDICINA REPRODUCTIVA

México, D.F. , a 26 de Junio de 1998.

DR.

JOSÉ

LUIS ARREDONDO FIGUEROA. DIRECTOR DE

LA

DIVISIÓN EN CIENCIAS BIOL~GICAS

Y

DE LA SALUD

Presente:

Llamamos su atención con motivo de manifestar a Ud. que con fecha de hoy, podemos decir que se han concluido satisfactoriamente las actividades relacionadas al proyecto de Servicio Social intitulado “ D E T E R M I N A C I Ó N D E L C O N T E N I D O D E Á C I D O S I Á L I C O D E L A S

I S O F O R M A S D E L A H O R M O N A L U T E I N I Z A N T E ” , e n e l q u e p a r t i c i p ó l a alumna de la Licenciatura en Biología Experimental Srita. Araceli Miranda Soriano (matrícula 91234554) y que iniciara el 19 de

noviembre de 1997 y que, de acuerdo a la programación inicial,

debería haber concluido el día 20 del pasado mes de mayo. L o s

motivos que ocasionaron el retraso estuvieron relacionados a la

elaboración del informe final, ya que fue necesario revisar y discutir

los

importantes resultados obtenidos por la Srita. Miranda.

Sin mas por el momento que agregar nos despedimos enviándole un respetuoso saludo.

Atentamente

A s e s o r Interno Asesor Externo

Investigador Titular A Técnico en Investigación Unidad de Investigación en Medicina Reproductiva,

Hospital Luis Castelazo Ayala,

IMSS

Profesor Titular C, MT

(4)

UNIVERSIDAD

AUTONOMA

METROPOLITANA

DR.

JOSÉ

LUIS ARREDONDO

FIGUEROA.

BIOL~GICAS

Y

DE LA SALUD

DIRECTOR DE

LA

DlVlSlÓN

EN

CIENCIAS

Presente:

México, D.F. , a 26 de Junio de 1998.

Llamamos su atención con motivo de manifestar a Ud. que con fecha de hoy, podemos decir que se han concluido satisfactoriamente las a c t i v i d a d e s r e l a c i o n a d a s p r o y e c t o a l d e S e r v i c i o S o c i a l i n t i t u l a d o

“DETERMINACIÓN DEL

CONTENIDO

DE ÁCIDO SIÁLICO DE LAS

ISOFORMAS

DE

LA HORMONA LUTEINIZANTE”, en el que participó

la

alumna de la Licenciatura en Biología Experimental Srita. Araceli Miranda Soriano (matricula 91234554) y que iniciara el 19 de noviembre de 1997; la participación de la Srita. Miranda fue por demás activa y acertada, cumpliendo con el compromiso adquirido con su Universidad,

con nuestro Laboratorio y sobre todo con ella misma.

Sin mas por el momento que agregar nos despedimos enviándole un respetuoso saludo.

Atentamente

Asesor Interno Asesor Externo

Investigador Titular

A

Técnico en Investigación

Unidad de Investigación en Medicina Reproductiva, Hospital Luis Castelazo Ayala,

IMSS

Profesor Titular C, MT

Departamento de Ciencias de la Salud UAM

-

I

UNIDAD QTAPALAPA

(5)

INSTITUTO <MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL

UNIDAD DE INVESTIGACION EN MEDICINA REPRODUCTIVA

México, D.F. , a 26 de Junio de 1998.

DR.

JOSÉ

LUIS ARREDONDO FIGUEROA. DIRECTOR DE LA DIVISIÓN

EN

CIENCIAS BIOL~GICAS

Y

DE

LA

SALUD

2 2 2 5 0 3

Presente:

Llamamos su atención con motivo de manifestar a Ud. que con fecha de hoy, podemos decir que se han concluido satisfactoriamente las actividades relacionadas al proyecto de Servicio Social intitulado

ISOFORMAS DE LA HORMONA LUTEINIZANTE", en el que participó la alumna de la Licenciatura en Biología Experimental S r i t a . A r a c e l i M i r a n d a S o r i a n o (matrícula 91234554) y que iniciara el 19 de

noviembre de 1997; la participación de la Srita. Miranda fue por

demás activa y acertada, cumpliendo con el compromiso adquirido con su Universidad, con nuestro Laboratorio y sobre todo con ella misma. " D E T E R M I N A C I ~ N

DEL

CONTENIDO DE ÁCIDO SIÁLICO DE LAS

S i n m a s p o r m o m e n t o e l q u e a g r e g a r n o s d e s p e d i m o s enviándole un respetuoso saludo.

Atentamente

Asesor Interno Asesor Externo

A - -

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Investigador Titular A Técnico en Investigación

Unidad de Investigación en Medicina Reproductiva, Hospital Luis Castelazo Ayala,

IMSS

Profesor Titular C, MT

(6)

NOMBRE: Miranda Soriano Araceli MATRíCULA: 91 234554 LICENCIATURA: Biología Experimental

LAS ISOFORMAS DE LA HORMONA LUTEINIZANTE (LH).”

Clave: BE 0 3 3 26 de Junio de 1998.

ASESORES: A S E S O R I N T E R N O : M . e n B . E . J o a q u í n F e r n a n d o H e r r e r a M u ñ o z

IProfesor Titular C . Medio Tiempo. Departamento de Ciencias de la Salud, UAM

-

I . Investigador Titular. Unidad de Investigación en Medicina Reproductiva. Hospita

“ L u i s C a s t e l a z o A y a l a ” I . M . S . S . A S E S O R E X T E R N O : Q u i m . E d g a r R o g e r B a r a h o n : Bustillos. Técnico de Investigación. Unidad de Investigación en Medicin:

Reproductiva. Hospital “Luis Castelazo Ayala” I.M.S.S.

RESUMEN. La función testicular se controla en parte por factores extragonadales

específicamente por las gonadotropinas LH y FSH, la primera actúa sobre la!

células de Leydig, mientras que la última

lo

hace sobre las células de Sertoli. St ha demostrado que ambas hormonas se presentan en isoformas, definidas P O variaciones en el contenido de

los

carbohidratos que forman parte de su estructura

lo

cual tiene como consecuencia, cambios en la configuración estructural de la!

moléculas y en sus características fisicoquímicas como el punto Isoeléctrico Tomando en consideración que el punto isoeléctrico de las isoformas de LH tient

relación con el reconocimiento de la hormona por su receptor y que el puntc isoeléctrico de

los

oligosacáridos está definido por su contenido de unidades cor

carga, como el AS; es importante determinar y correlacionar el contenido de estc carbohidrato en cada isoforma de la LH, con el objetivo final de correlacionar I;

estructura de la hormona con su función.

O B J E T I V O G E N E R A L . A partir de las isoformas de la LH, determina1

cuantitativamente el contenido de AS de cada una.

O B J E T I V O S P A R T I C U L A R E S . Obtención de ‘isoformas moleculares’ de la hormon;

a partir de una preparación comercial. Estandarización de los métodos de hidrólisi: enzimática con neuraminidasas. Estandarizacion del método para la determinaciór

cuantitativa de AS. Determinación de los contenidos de AS en

los

productos de

hidrólisis de cada ‘isoforma’ de la Hormona Luteinizante. Correlacionar lo: contenidos de A S c o n el punto isoeléctrico de las ‘isoformas’ de la LH

RESULTADOS. Se determinó un patrón de distribución de ‘Isoformas’ para la Ll-

que permitió tomar alícuotas suficientes para las determinaciones de concentraciór

de hormona y d e l A S . El patrón encontrado fue semejante al reportado por múltiples autores, se hace notar que se presentó en forma constante una cantidad

de ‘isoformas’ en la zona más ácida del gradiente formada, un ‘pico’ en la zona de pH menor de 7 ; también hubo una zona de ausencia de ‘isoformas’ en una región de valores de pH entre 6 . 2 y 6 . 8 , este efecto se marcó en el resultado final donde a pesar de la baja concentración de ‘isoformas’ hormonales de la LH los contenidos

de AS son de los máximos medidos. El sistema metodológico utilizado en el Presente protocolo y en su control de calidad muestra que es un método confiable,

es decir tiene la exactitud y precisión adecuadas, respecto a la especificidad, el adaptar el método a un sistema de cromatografía de alta resolución, elimina

Cualquier posible efecto de interferencia. El punto mas importante es sin duda la

sensibilidad, la adaptación del método del ácido tiobarbitúrico-peryodato, originalmente para determinar cuantitativamente por espectrofotometría, se ha

transformado Para ser diez mil veces mas sensible, lo cual permitit, trabajar nuestras muestras.

CONCLUSIONES.

Los

resultados de la determinación del AS mostraron; un patrón,

de distribución Semejante al de las ‘isoformas’. AI h a c e r

los

cálculos adecuados,

10s

resultados demuestran que el contenido de AS está en función del pl de las ‘isoformas’ localizadas en el gradiente de pH. Estos resultados concuerdan con 10s antes reportados Por otros autores y dan pie a las interpretaciones que relacionan el contenido de los carbohidratos con su actividad biológica.

(7)

D E T E R M I N A C I ~ N

DEL CONTENIDO

DE ÁCIDO

SIÁLICO

DE

LAS

ISOFORMAS DE LA HORMONA LUTEINIZANTE

.

E S T R U C T U R A Y BlOSiNTESlS DE LAS GONADOTROPINAS.

Las Hormonas Estimulante de

los

F o l í c u l o s [ Follicle Stimulating Hormone ( F S H )

1,

Luteinizante [ Luteinizing Hormone (LH)

1,

Gonadotropina Coriónica Humana [ Choronic Gonadotropin ( C G ) ] y Estimulante de la Tiroides [ Tiroid Stimulating Hormone (TSH)

1,

consisten de dos diferentes subunidades proteicas,

comúnmente llamadas ~1 y

p ,

cada una contiene múltiples enlaces disulfuro

intracadena; las subunidades a y

p

están unidas no covalentemente para formar la

molécula activa. La subunidad (r es la misma para todas las gonadotropinas y en

términos evolutivos es muy conservada aun entre diferentes especies animales, siendo codificada por un solo gen, que en el humano está localizado en el

cromosoma 6 ( R a d e m a c h e r y cols, 1988 y R e d d y y Menom, 1981). La subunidad

p

es diferente para cada gonadotropina y es ésta la que va a determinar la especificidad biológica de cada hormona (Patel 1994, Apter y cols 1995, Mercer y Chin 1995), los genes de la LH y la FSH tienen arreglos genómicos similares

sugiriendo un origen filogenético común y explicando el hecho de que un sólo tipo celular -el gonadotropo- secrete ambas hormonas (Baezinger 1988, Mercer y C h i n ,

1995).

La clonación de los genes de las gonadotropinas ha aumentado el grado de conocimiento respecto a como son sintetizadas estas proteínas a nivel pretraduccional, aclarándose también la biosíntesis y el procesamiento

postraduccional. Una de las principales características en su estructura, es su alto contenido en residuos de cisteína y el alto grado de conservación de ellos entre las diferentes subunidades y aún a través de las especies; los residuos de cisteína forman enlaces disulfuro y sirven para establecer y restringir la estructura terciaria de las subunidades, aunque la secuencia primaria de

los

aminoácidos de las varias subunidades

p

sean diferentes, la localización de los residuos de cisteína se ha conservado, por lo que algunos dominios funcionales de las subunidades han sido descritos en términos de las asas peptídicas que se extienden entre las cisteínas;

se dice que las diferencias en las secuencias de

los

aminoácidos en estas asas

intercisteína son las responsables de las distintas propiedades de unión al receptor de las hormonas individuales. Los puentes disulfuro intracadena han sido

elucidados para ambas subunidades, usando métodos químicos y proteolíticos, la subunidad a tiene 5 puentes disulfuro y la subunidad

p

6 , no existen cisteínas libres en cada subunidad y estas se asocian no covalentemente para formar los heterodimeros (Nagaya y Jamesson 1994, Mercer y Chin 1995).

La dimerización y glicosilación son requeridas para proveer la actividad

biológica de las gonadotropinas, en las subunidades a y

p

están los sitios de anclaje para las cadenas de azucares, y existe una heterogeneidad considerable en la composición de los oligosacáridos que se forman y además, según se ha demostrado pueden variar bajo diferentes circunstancias fisiológicas.. Según

Nagaya y Jamesson 1994, el péptido dirige su propia glicosilación, la biosíntesis del

oligosacárido unido a

los

dominios del polipéptido plegado, es controlada en parte,

.

por las interacciones polipéptido-oligosacárido que están involucradas en la estabilización del polipéptido conformada por el oligosacárido. La incorporación

(8)

que ocurre cotraduccionalmente con las subsecuentes modificaciones durante el transporte intracelular y el procesamiento después de la traducción en l o s ribosomas, los polipéptidos entran al Retículo Endoplásmico Rugoso (RER) con el

rompimiento cotraduccional del péptido señal. La subunidad a esta generalmente en exceso en relación a la subunidad

p ,

los heterodímeros de las subunidades a y

p

son formados en RER y los residuos de glucosa de las ramificaciones de los

oligosacáridos son rápidamente adicionados (Nagaya y Jamesson 1994, Mercer y Chin 1995).

Existen dos clases de sitios de glicosilación; las cadenas de carbohidratos

unidas a -N que se encuentran ancladas a residuos de asparagina (Asn) y cadenas unidas a -0 que están ancladas a residuos de serina y treonina por enlaces

glicosídicos. La subunidad a tiene dos sitios de glicosilación unidos a - N , estudios realizados por mutagénesis sitio-dirigida indican que la ausencia de glicosilación en

Asn52 no modifica la dimerización con la subunidad

p,

pero la hormona pierde la capacidad de inducir señales vía su receptor, esto sugiere que directamente la

cadena de azucares o una conformación secundaria que se induce en la molécula, es crítica para disparar las señales en el receptor; mutaciones en Asn78 tienen efectos diferentes sobre la subunidad a , esas alteraciones causan una rápida degradación de la proteína sugiriendo que la cadena de azucares es importante

para el procesamiento intracelular y / o en la estabilidad de la subunidad a . L a subunidad LHP tiene un solo sitio de glicosilación localizado en Asn30 en humanos.

Todas las subunidades

p

d e L H , F S H , T S H y C G tienen una extensión peptídica de

25 residuos en el extremo carboxílo, el cual contiene 4 sitios de glicosilación unidos a O , pero solo permanece en la GC (Mercer y Chin, 1995).

2 2 2 5 8 3

Las subunidades a y

p

son sintetizadas de genes separados y son cotraduccionalmente glicosilados en los sitios de asparagina apropiados, la

subunidad a permanece libre (no combinada) o asociada de manera no-covalente con la subunidad LHp o FSHp, para formar los heterodímeros, que aun permanecen en el RE, las subunidades diméricas o las no combinadas reciben las últimas

modificaciones en l o s oligosacáridos asociados a ellas; existe una variación

considerable, en las proporciones de l o s oligosacáridos sulfatados y sialilados tanto para la LH como en la FSH en las diferentes especies animales. Las

modificaciones hormona-especificas de los carbohidratos se realizan en el Aparato

de Golgi, las cadenas de carbohidratos pueden ser bi o tricatenarias y pueden terminar con ácido siálico (AS), sulfato o azucares neutros (Baezinger y G r e e n , 1988, Nagaya y Jamesson 1994, Mercer y Chin 1995).

Los oligosacáridos base presentes en LH contienen: N-Acetil-Glucosamina, N-Acetil-Galactosamina y M a n o s a , los que pueden aparecer en varios tipos:

monosulfatados, híbridos que contienen

O.

1 o 2 residuos de manosa periféricos; oligosacáridos monosulfatados complejos que tienen una ramificación periférica y también oligosacáridos complejos disulfatados que contienen dos ramificaciones

donde una termina en sulfato y la otra puede estar sialilada. La FSH no contiene cantidades significativas de N-Acetil-Galactosamina, ni de sulfato pero contiene N- Acetil-Glucosamina y M a n o s a , a d e m á s c o n t i e n e g r a n d e s c a n t i d a d e s d e A S y Galactosa en oligosacáridos que contienen dos ramificaciones sialiladas, l o que explica su pl más ácido (Veerasinham y Katlic, 1989).

En resumen se crea una marcada microheterogeneidad en la composición de los azucares. En parte, la adición de sulfato o AS es determinada por la presencia de una galactosa terminal o de N-Acetil-Galactosamina (GalNAc) en una reacción que es llevada a cabo por una GalNAc-transferasa; en contraste el AS es

(9)

circulante mas alta por

lo

que la FSH tiene una vida media mayor que la LH. La distribución de oligosacáridos sulfatados y sialilados es diferente para cada gonadotropina y parece que es influenciada por las condiciones hormonales

( A c e v e d o , 1 9 9 7 ) . L a L H e s s u l f a t a d a y la FSH es sialilada aún siendo producidas por el mismo gonadotropo, consecuentemente tanto las características

intramoleculares tales como: cambios en la estabilidad de la gonadotropina, su tasa de proteólisis, la estabilidad térmica, la solubilidad, etc. así como también en las

características intermoleculares, como la interacción con las enzimas proteolíticas que determinen su vida media y las interacciones con

los

receptores, es decir su bioactividad, también son influenciadas por los carbohidratos(Eyr1ad y cols, 1971).

La secuencia de aminoácidos requeridas tanto para el ensamble de las subunidades a y

p,

como su unión al receptor se han localizado al usar péptidos

sintéticos, mutagénesis sitio-dirigida y modificaciones químicas de péptidos

naturales, como se había mencionado en general la subunidad a se encuentra en exceso en relación de la subunidad

p,

esto llevó a pensar que la concentración de la subunidad

p

fuera el paso limitante para la formación del heterodímero, pero se

ha comprobado que la subunidad

p

se degrada más rápidamente en ausencia de la subunidad a.

El mecanismo por el cual las hormonas esteroideas regulan la síntesis de

gonadotropinas es complejo, al parecer es necesario un aumento en l o s estrógenos antes de la secreción de la LH , junto con el incremento en la secreción de GnRH,

para obtener el incremento de la LH.( Keel y Schanbacher, 1987 y Phillips y W i d e , 1994). La influencia en la hipófisis de esteroides gonadales como la testosterona

y/o el estradiol en

los

procesos de biosíntesis de las gonadotropinas, puede alterar

la incorporación de carbohidratos a la molécula y por ende cambiar el proceso general de síntesis y con ello generar cambios en las proporciones de las diversas moléculas secretadas, por lo tanto es posible que el ambiente endocrino hipofisaro pueda determinar cual de las isoformas sea sintetizada y secretada preferentemente, haciendo concebible la idea de que cada una de las diferentes

formas moleculares de FSH y LH pudiera tener un papel específico en los eventos reproductivos (Rademacher y c o l s . , 1 9 8 8 y P a t e l , 1 9 9 4 ) . S e h a v i s t o q u e la L H regula la síntesis de andrógenos en las células de la teca, mientras que la FSH es responsable de regular la actividad de la aromatasa en las células de la granulosa,

lo cual va a determinar la proporción de síntesis de estrógenos a partir de los precursores androgénicos y cualquier perturbación en el equilibrio dinámimico entre estos tipos de hormonas, daría como resultado un desequilibrio en el cociente de L H / F S H . ( P u r c u y cols. 1987).

E L

Á C I D O S I Á L I C O .

Forma parte de una familia de azúcares de 9 carbonos, denominados ácidos siálicos. Su síntesis se puede describir en la siguiente forma: la primera reacción

de esta compleja ruta implica la epimerización de la UDP-N-acetilglucosamina por

una 2-epimerasa a N-acetilmanosamina, ocurriendo concomitante la eliminación del nucleótido UDP; es muy posible que esta reacción de la 2-epimerasa transcurra

mediante una eliminación en orientación trans del UDP, con formación del

intermediario insaturado 2-acetamidoglucal. En los tejidos de mamíferos la N- acetilmanosamina se fosforila con ATP a N-acetilmanosamina 6-fosfato, el cual se condensa seguidamente con fosfoenol piruvato para formar ácido N-

acetilneuraminico 9-fosfato. Este producto se rompe por una fosfatasa y se activa con CTP formando el derivado de CMP, ácido CMP-N-acetilneuramínico que es un precursor de otros derivados de tipo A S , algunos de los cuales se forman por

modificación del N-acetil a N-glicolil ó hasta O-acetil, una vez que se han

(10)

por la formación de enlaces a o

p ,

con cada uno de

los

grupos hidroxilo asequibles en el sacarido aceptor. De hecho, se sabe que la especificidad de muchas

moléculas biológicas está determinada por la naturaleza de

los

restos glucídicos (Reuter y Schauer, 1994)).

D E T E R M I N A C I ~ N C U A N T I T A T I V A DEL

Á C I D O

S I Á L I C O .

Reconociendo que

los

oligosacáridos desempeñan un papel importante en la

biología humana, en el cual pueden ser afectadas las propiedades dinámicas y físicas de proteínas, el contenido estructural de la diversidad de oligosacáridos

ramificados unidos a los mismos o diferentes sitios de glicosilación pueden ser crucial debido a que la especificidad y actividad funcional pueden ser moduladas por tales variaciones. La importancia de conjugados de glicanos en función

biológica ha demandado el desarrollo de técnicas analíticas que puedan combinar

rapidez con alta resolución, uno de los métodos más populares de HPLC usados involucra resinas de intercambio aniónico a bajo o elevado pH como medios de

separación y detección amperométrica pulsada (Paerels y Schut, 1965 y Patrick y cols, 1995). Para la determinación de la concentración de ácidos siálico se j'

pueden emplear también una rápida adaptación de HPLC del método de ácido .,

tiobarbitúrico (TBA) acoplado a peryodato que fue primeramente desarrollado para la cuantificación del AS en sobrenadantes de fluidos de lavado de células

El método de ácido tiobarbitúrico (TBA) acoplado a peryodato ha sido usado : para la determinación de AS en muestras biológicas. Para poder determinar AS en

muestras de células por este método, el AS deberá ser liberado por hidrólisis ácida,

oxidado por I O 4 - el ácido pformilpirúvico (PFPA) el cual es acoplado con TBA a un I

-

aducto que es extraído en una pequeña cantidad de solvente orgánico y usualmente

es determinado espectrofotometricamente a 550nm (Eylard y c o l s . , 1 9 7 1 ) . S i n 1 ' 1 .

embargo, debido a que a mayoría de los glicoconjugados de interes carecen de funciones cromofóricas, su absorbancia U V es baja, de modo que la detección de

alta sensibilidad a longitudes de onda de cerca de 200 nm a menudo es difícil , (Aminof, 1961 y Paerels y Schut, 1965.). Se ha sabido durante mucho tiempo que . estas pruebas pueden ser alteradas por compuestos tales como ácidos grasos . . insaturados o 2-desoxirribosa los cuales pueden liberar malondialdehído ((MDA)

bajo las condiciones de prueba, ya que las propiedades espectrales de el aducto

MDA-TBA son muy similares. Así, el desarrollo en una simple y rápida de HPLC del método de TBA acoplado a peryodato puede ser utilizado para la cuantificación de AS en sobrenadantes de muestras en células o de sobrenadantes de hidrólisis enzimática con neuroaminidasas (Powell y Hart, 1986).

El tratamiento de glicoproteinas con neuraminidasas, enzimas especificas para la 'destrucción' de la actividad biológica de la hormona, sin afectar la

actividad inmunologíca, se explica por el desprendimiento de residuos de el A S de estas moléculas (Eylar y cols., 1971). El efecto de desialisar las glicoproteínas

ocasionan notables problemas en la actividad biológica de dichas hormonas,

demostrandose en ensayos de actividad "in vivo" ( R o s h a n y c o l s . , 1 9 7 7 ) . Recientemente en hormonas (hCG) y (LH), se ha mostrado que presentan una cierta

afinidad preferente en los sitios de unión al receptor las moléculas o isoformas con mayor cantidad de residuos de AS y que son sumamente importantes para la

conservación de las hormonas durante el metabolismo in vivo, pero también se muestra puede ser no esenciales para la actividad biológica en células blanco

(Tsurhara y cols., 1972). En bioensayos de las isoformas humanas en células de Leydig, se han obtenido resultados donde se demuestra la presencia de menor

actividad biológica de las isoformas de la LH en la región más alcalina, (Stanton y

(11)

7

ANTECEDENTES

E n los últimos años el grupo de investigación en el que se realizó este

proyecto, se ha interesado en tratar de resolver algunos aspectos de la Fisiología

testicular. En relación a la función de las CL se ha demostrado la presencia de al menos un factor proveniente de las CS capaz de disminuir la secreción de T en las C L (H e r r e r a y Cols 1996), también se ha demostrado que ese factor es de

naturaleza proteica y que tiene un peso molecular aparente de 21 Kda. (Ruiz- Paniagua, 1995); para poder tener un marco de referencia y determinar el mecanismo de acción de dicho factor, se evaluaron a profundidad l o s mecanismo de transducción de la LH (Perdomo-Esquivel, 1997). AI evaluar el efecto de LH en las

CL, se demostró que dicha hormona al presentarse en isoformas, tiene diferencias

de asociación o reconocimiento inmunológico con anticuerpos mono y policlonales, por lo que la evaluación cuantitativa de esta hormona pudiera tener problemas de

exactitud (Pichardo-Hernández, 1996). También se demostró que la presencia de isoformas moleculares de LH puede alterar, al menos en el síndrome de ovarios

poliquísticos (SOP), la síntesis de hormonas sexuales, específicamente T ,

(Acevedo-Vargas, 1997). Recientemente se desarrolló un protocolo de

investigación que demostró cualitativamente las posibles diferencias de afinidad de

las isoformas de la LH con su receptor en las CL (Miranda-Soriano, 1997, Herrera y cols., 1998).

La función testicular se controla en parte por factores extragonadales,

específicamente por las gonadotropinas LH y F S H , l a p r i m e r a a c t ú a s o b r e l a s C L ,

mientras que la última lo h a c e so b r e la s C S . S e h a d e m o s t r a d o q u e am b a s

hormonas se presentan en isoformas, definidas por variaciones en el contenido de los carbohidratos que forman parte de su estructura; lo cual tiene como

consecuencia, cambios en la configuración estructural de las moléculas y en sus características fisicoquímicas como el pl. Tomando en consideración que el punto isoeléctrico de las isoformas de LH tiene relación con el reconocimiento de la

hormona con su receptor y que el punto isoeléctrico de

los

oligosacáridos está

(12)

H I P ~ T E S I S

Los contenidos

de

ácido siálico

en las ‘isoformas’

d e

la

hormona luteinizante estan

en función

d e

su

punto

isoeléctrico.

OBJETIVO GENERAL

A partir de las isoformas de la hormona Luteinizante ( L H ) ,

determinar cuantitativamente el contenido de AS de cada una.

OBJETIVOS PARTICULARES

Obtención de ‘isoformas moleculares’ de la hormona a partir de una preparación comercial.

Estandarlzación de

los

métodos de hidrólisis enzimática con neuraminidasas.

Estandarizacion del método para la determinación cuantitativa de A S .

Determinación de los contenidos de A S en l o s productos de hidrólisis de cada ‘isoforma’ de la Hormona Luteinizante.

(13)

9

METODOLOGíA UTILIZADA.

S E P A R A C I ~ N DE LAS ‘ I S O F O R M A S ’ DE L A HORMONA L U T E I N I Z A N T E .

Para la separación de las ‘isoformas’ de la Hormona Luteinizante se utilizó una técnica de isoelectroenfoque en geles de poliacrilamida, la cual se describe

brevemente mas adelante (Rigetti, 1980 y Haavisto y c o l s . , 1 9 9 3 ) ) . L a Gonadotropina en su forma no marcada con característica de ser altamente

purificadas, de grado para radiomarcaje fueron obtenidas de Sigma Chemicals C o . ,

se ‘garantiza’ que los estándares contenidos fueron calibrados con los estándares internacionales (2nd IRP-HMG) y se expresan los resultados en mUI como actividad biológica y no como masa.

E n particular el sistema para la preparación de la ‘muestra’ que se montó fue el siguiente: Primero se pasó la muestra por una minicolumna de Sephadex G-10

superfino con el propósito de separar las sales que acompañan a las proteínas y

que así no se afecte el pH del sistema, la hormona salió como parte del material disuelto en el volumen vacío, posteriormente, para eliminar la albúmina, la muestra se pasó por una minicolumna de Sephadex G-50 fino, colectando y reuniendo las fracciones que contienen actividad en cantidad superior a 0.1 mUI.

Preparación de los geles: Se preparó como indicador, una mezcla de l o s siguientes indicadores de pH. de grado histológico o bioquímico (Merck, México): Azul de Bromofenol,

Rojo

de Fenol, Verde de Malaquita, Negro de Amido, todos

ellos al 0.001

YO.

En cada ‘corrida’, se hicieron dos geles blanco para demostrar

que no hubo contaminación entre las muestras: además se hicieron dos geles con l o s indicadores de color para determinar el momento en que dichos indicadores se han enfocado. Se utilizaron como soporte tubos de vidrio de borosilicatos con

diámetro interno de 0 . 5 c m . y longitud de 10 cm. Se preparó la mezcla gelificante

de la siguiente forma: 3 . 0 partes de la solución de Acrilamidas (Acrilamida al 30

Oh y Bisacrilamida al 0 . 8 % ) , 0 . 8 partes de la solución de TEMED al 1.0 % y 0 . 3

Partes de los anfolitos (en el intervalo 5 a 10 de p H ,

Is0

Lyte, ICN Biomedicals Inc.), se tomaron 0 . 5 mL. de la mezcla gelificante y se depositaron en un tubo de ensayo de vidrio de 10

x

75 mm., se agregó la ‘muestra’ en un volúmen no mayor

de 0.25 mL., se agregaron 1.5 mL. de solución de persulfato de amonio (0.14 Y O , ) y

se transfirieron a los tubos de isoelectroenfoque estratificando agua destilada en la parte superior. AI tener todos los tubos correspondientes a una ‘corrida’ se colocó en la cámara superior de un equipo para electroforesis (Buchler), y una solución de ácido fosfórico 0.1 %. La doble-cámara inferior se conectó a un sistema de

refrigeración con agua, se le colocaron 650 mL. de NaOH al 0.1 %. Se conectó la

cámara a una fuente de poder con el electrodo positivo en la cámara superior y el negativo a la inferior, se desarrolló a 0 . 5 mAmp. por gel hasta que los indicadores se encontraron enfocados. AI término del desarrollo, se sacaron l o s geles para ser rápidamente congelados, en este estado se cortaron en secciones de 1.2 k 0.1 mm. y las rebanadas se utilizaron para diversos fines. El tratamiento de la hormona no marcada se realizó con un protocolo que incluía la hormona marcada como control.

E n todos los casos se determinó el pH de las fracciones de los geles que contenían los indicadores de pH, ésta determinación se realizó en tubos de vidrio

de 10 x 75 mm. con un potenciómetro digital Beckman modelo 3550 y un electrodo de vidrio Universal de 5 mm. de diámetro, en el líquido (1.0 mL.) resultante de la

‘elución’ de los anfolitos de cada rebanada a la que se le agregó ese volumen de

agua destilada y desairada; la determinación del pH se realizó en los primeros 3 minutos posteriores a la apertura del tubo conteniendo las fracciones; estas

determinaciones permiten formar la gráfica del gradiente de pH de cada ‘corrida’.

(14)

10

anfolitos por medio de diálisis con solución salina a 4"C, se determinó el contenido de la isoforma por RIA y por la radiactividad presente en 0.1 mL. y se determinó el patrón de distribución de las 'isoformas' correspondiente. Dependiendo del

experimento los geles se trataron de forma especial, por ejemplo, dos geles de la

muestra de LH no marcada y los blancos se fijaron y tiñeron con una solución de ácido tricloroacético al 10 Oh con

0.01

% de azul brillante G de Coomasie por 24-48 hs. quedando como patrones teñidos para la comparación con los resultados de las rebanadas de gel.

Posteriormente las soluciones resultantes de la elución se reunieron en

intervalos de 0.2 ó 0 . 5 unidades de pH y se utilizan como la 'muestra' a probar en el análisis del AS, ajustando la cantidad de isoforma inmunoactiva en cada 0.5 mL. Nuevamente, la obtención de las "isoformas" de la hormona no marcada se realizó

siguiendo el protocolo con la hormona marcada como control. En su caso, la

determinación de la cantidad de hormona inmunoactiva se determinó por RIA en fase sólida, utilizando un sistema de anticuerpos monoclonales (Acevedo, 1997).

D E T E R M I N A C I ~ N DE Á C I D O

S I Á L I C O .

Con base en la metodología empleada por Powell y Hart 1986, se utilizó la adaptación del método del peryodato y ácido tiobarbitúrico para desarrollar una

reacción con un producto identificado y cuantificado por un sistema de cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Los reactivos utilizados fueron de grado para HPLC, como el ácido tiobarbitúrico (Eastman Kodak), ácido fosfórico,

perclorato de sodio y el metano1 ( Merk, México); las enzimas Neuroaminidasa de

Vibrio colerae (Calbiochem) y Neuroaminidasa tipo X de Clostridium perfringens

(Sigma Chemicals Co.) se utilizaron para la hidrólisis de las 'isoformas' de LH, el estandar de AS, ( Sigma Chemicals Co.).

Las digestiones se realizaron en tubos cónicos de polipropileno de 1.5 mL de capacidad, a 5 0 0 pL de la solución conteniendo la 'isoforma' se agregaron 200 pL

de la preparación de neuraminidasa ( 200 mU / m L de V. colerae ó 40 mU / m L de

C. perfringens durante 30 minutos a 37 "C. La incubación se suspendió por rápido

congelamiento en un baño de hielo seco-acetona y l o s tubos se almacenaron congelados hasta el siguiente paso de la determinación.

A una alícuota de 40 pL de la nueva muestra se agregaron 20 pL de la solución de peryodato ( 128 mg de meta peryodato de sodio, 1.7 mL de ácido fosfórico en 1.3 mL de agua), se dejó 20 minutos a temperatura ambiente y se agregaron lentamente 100 pL de una solución de arsenito de sodio al 10% en ácido sulfúrico, se taparon y sellaron los tubos; después de 5 minutos se agregaron por inyección, 600 p L del reactivo de ácido tiobarbitúrico ( 0.1 M de 2 tiobarbiturato ajustado a pH 9 con hidróxido de sodio), se agitaron violentamente y se introdujeron a un baño de agua hirviente por 10 minutos; posteriormente los tubos se enfriaron drásticamente y se almacenaron en refrigeración, los productos formados son

estables por 48 horas. Las muestras fueron atemperadas y centrifugadas a 1500 x g durante 15 minutos antes de la determinación. Se inyectaron al cromatógrafo alícuotas de 100, 200 y 300 p L de cada muestra. Para el análisis cromatográfico y

la cuantificación del AS se utilizó un equipo Waters con un controlador modelo 600

(15)

11

RESULTADOS.

RESULTADOS GENERALES DEL ISOELECTROENFOQUE.

En cuanto a

los

valores de

pH

obtenidos de las fracciones de

l o s

geles,

fueron constantes con una variabilidad menor

al

1.3 %

en la región mas

alcalina,

con los valores de

pH

entre

8 . 5 y 10;

la gráfica que muestra el gradiente formado se

muestra en la figura siguiente:

2 2 2 5 0 3

ISOELECTROENFOQUE GRADIENTE DE pH

11

10 9

pH 7 8

6

5

1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 FRACCIÓN DEL GEL

Gráfica que muestra el gradiente de pH obtenido de los experimentos de isoelectroenfoque-La gráfica representa el promedio de

1 O

experimentos.

S E P A R A C I ~ N DE LAS 'ISOFORMAS' DE LH M A R C A D A Y N O M A R C A D A .

Las diversas 'isoformas' de

la

LH*

se distribuyeron en los geles en la forma

señalada en las gráficas

de la figura siguiente.

Es

notable el hecho de que

se

encuentran acúmulos de radiactividad

en fracciones que no deberían tener marca,

tal es el caso de la zona de

pH

correspondiente a valores menores de

7.

ISOELECTROENFOQUE DE LH'

O

6.6 6 6.6 7 7.6 8 8.6 S 9.5 10

PH

Gráfica de distribución de las "isoformas" de la

L H

marcada.

L H *

-

1 , a - 3

(16)

12

Se hace notar que los patrones de distribución al ser comparados entre s í ,

resultan ser semejantes pero no iguales, lo que ya establece un punto de variación interensayo y una diferencia cuando se hacen los análisis de la hormona utilizando

los estuches de la misma marca pero de lotes diferentes. Otro aspecto a notar es que el rendimiento del isoelectroenfoque al sumar la cantidad de radiactividad

presente en todas las fracciones obtenidas no fue superior al 85 % con respecto a

una alícuota igual que no se sometió al procedimiento.

Basados en la experiencia con la hormona marcada se realizaron

experimentos para obtener la distribución de “isoformas” de la hormona no

marcada y determinar si los patrones de distribución de los ‘estándares’ no

marcados fueran semejantes entre sí y a los de la hormona marcada, el resultado se muestra el la figura siguiente:

ISOELECTROENFOQUE DE LH

5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10

P H

Gráfica que muestra los patrones de distribución de “isoformas” de la

L H

no marcada. Se tomó una alícuota correspondiente a 200 mUI de la hormona.

Como se puede observar, no hay una correspondencia total entre los patrones de distribución de las hormonas marcada (control) y no marcada, se que hubo un corrimiento en el patrón de distribución de ‘isoformas’ de la hormona no

marcada hacia la zona neutra, así como también se notan con menos claridad las diferencias en las cantidades presentes en cada una de las fracciones encontradas,

generando un patrón de distribución con picos menos marcados en relación a la hormona radiactiva (control). En cuanto a rendimiento, al evaluar el área bajo la curva, se determinó que se recuperó el 93 % de la hormona total agregada.

D E T E R M I N A C I ~ N DE Á C I D O S I Á L I C O .

E n c u a n t o a la determinación cuantitativa del A S presente en cada fracción

obtenida a partir del isoelectrenfoque, en la siguiente figura se muestra la curva de

(17)

O

u

P

.-

13

Curva

Patrón para

Ácido Siálico

l o

T

8

6

4

2

O

O

10 20 30 40 50

Ácido Siálico ( pmoles)

Figura que muestra la proporcionalidad de la respuesta obtenida al medir AS por el método del ácido tiobarbitúurico adaptado a HPLC

.

E s importante hacer notar que hubo proporcionalidad en las determinaciones

de cantidades crecientes de A S . Los parámetros de control de calidad fueron los siguientes:

Sensibilidad, La variación de la línea base del

cromatógrafo fue nula, la variabilidad de las determinaciones de 1 pmol fue menor al 1 Oh, por lo que se definió como la dosis mínima

detectable.

Exactitud. La evaluación de este parámetro se basó en determinar la cantidad de A S presente en una muestra en repetidas ocasiones, de hecho las 12 veces que se utilizó el cromatógrafo; los resultados presentaron un Coeficiente de Variación (CV) de 1 . 3 Oh.

Precisión. La variabilidad de los puntos de la curva patrón sirvió para determinar este parámetro, la variabilidad máxima fue de 2.1 Oh a la dosis de 50 pmoles.

Especificidad. Basados en la literatura relacionada al método, y por la utilización adecuada del sistema de

H P L C ,

el método

e s e s p e c í f i c o .

Los

resultados obtenidos al tratar las muestras de 'Isoformas' de la LH se

(18)

14

Ácido Siálico en lsoformas de LH

T

5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10

P H

Gráfica que muestra el patrón de distribución del AS en relación a las fracciones obtenidas por isoelectrenfoque de una muestra de Hormona Luteinizante.

Como puede apreciarse en la figura anterior, fue posible determinar la

presencia de A S en las fracciones del isoelectroenfoque, se nota un patrón un tanto irregular, coincidente con las regiones de acumulación de las 'Isoformas' de la

hormona; se observa también que el contenido de A S va disminuyendo conforme las fracciones corresponden a valores de pH mayores aunque sorpresivamente no

se llega a cero contenido del carbohidrato sino hasta valores de pH de 9 . 6 en adelante.

Para poder interpretar la relación del contenido del A S en función de la cantidad de hormona presente, se hicieron cálculos pra correlacionar estos

parámetros y resultaron el lo que se presenta en la siguiente figura:

Ácido Siálico

en

Isoformas

de LH

0 1

I

6

6.4

6.8 7.2 7.6 8

8.4 8.8 9.2 9.6

10

PH

(19)

D I S C U S I ~ N

Y CONCLUSIONES

Se demuestran semejanzas, pero no igualdad en la distribución de las

‘Isoformas’ de la LH marcada procedente de lotes diferentes. Existen acúmulos de

m a r c a , tanto en la zona ácida con valores entre 6 . 0 y 6 . 4 ; como en la zona neutra y alcalina hasta valores de pH de 9.4. Estos patrones de distribución de ‘Isoformas’

de la LH* son semejantes a l o s reportados en la literatura para la hormona obtenida de hipófisis (Stanton y c o l s . , 1 9 9 3 y S n y d e r y c o l s . , 1 9 8 7 ) y a los obtenidos para la hormona sérica (Acevedo,l997). Se presentan variaciones en la forma del patrón,

a pesar de que se agregó una cantidad igual en cada lote, se presentan las regiones

características de acumulación de la marca, pero estas cambian no solo en cantidad sino en forma, lo cual define diferencias reales en los diversos estuches haciendo crítico el error interensayo por la incertidumbre de “igualdad” de los reactivos entre l o s lotes. En forma semejante se comprobó la diferente distribución de ‘Isoformas’

de la hormona no marcada entre l o s dos lotes mostrados, así como tampoco

muestra el mismo patrón que la hormona no marcada empleada para el resto del protocolo experimental.

Se determinó un patrón de distribución de ‘Isoformas’ para la LH no marcada que permitió tomar alícuotas suficientes para las determinaciones de concentración

de hormona y lógicamente del objetivo de éste proyecto, del A S . El patrón encontrado fue semejante al reportado por múltiples autores, se hace notar que se

presentó en forma constante una cantidad de ‘isoformas’ en la zona más ácida del gradiente formada, un ‘pico’ en la zona de pH menor de 7; también hubo una zona

de ausencia de ‘isoformas’ en una región de valores de pH entre 6.2 y 6 . 8 , e s t e efecto se marcó aen la gráfica final donde a pesar de la baja concentración de

‘isoformas’ hormonales de la LH l o s contenidos de A S son de los máximos medidos.

En cuanto a la determinación del AS, se localizaron en la literatura varios métodos para la determinación cuantitativa de éste importante carbohidrato,

métodos espectrométricos basados en la reacción con el ácido tiobarbitúrico y el peryodato y la evolución de éste método hasta llegar a la adaptación a un sistema d e H P L C q u e lo hace mucho más sensible, de pmoles hasta pmoles (Aminoff,1961, Paerels y Schut, 1965, Powell y Hart, 1986, ) , también se encontraron otros

métodos con diferentes principios y utilidades (Reuter y Schauer, 1994, Bayer y c o l s . , 1 9 9 5 , R o s h a n y c o l s . , 1 9 9 7 ) . El sistema metodológico utilizado en el presente protocolo resultó un tanto complicado, posiblemente por la inexperiencia

de quienes participamos en el manejo de los sistemas de HPLC, no obstante el control de calidad muestra que es un método confiable, es decir tiene la exactitud y precisión adecuadas para el trabajo con múltiples muestras; en cuanto a la especificidad, el mecanismo de acción involucrado puede implicar la reacción de

otros componentes metabólicos que muy posiblemente se encuentren en el medio.

E n nuestro caso al no utilizar una fracción celular o productos tisulares, sino una preparación ‘áltamente purificada’ de una proteína, el aspecto de contaminación es

prácticamente eliminado, por si eso fuera poco la adaptación del método del ácido a un sistema de cromatografía de alta resolución, elimina cualquier posible efecto de interferencia. El punto mas importante es sin duda la sensibilidad, la

adaptación del método del ácido tiobarbitúrico

-

peryodato, originalmente para determinar cuantitativamente por espectrofotometría, se ha transformado para ser diez mil veces mas sensible, lo cual permitió trabajar nuestras muestras.

Los

resultados de la determinación del A S se mostraron primero como

contenido por fracción; una gráfica con ‘picos’, semejante al patrón de ‘isoformas’,

(20)

16

los

cálculos adecuados, l o s resultados se transforman a una línea que demuestra que el contenido de A S está en función del pl de las ‘isoformas’ localizadas en esa

parte del gradiente de pH.

Estos

resultados concuerdan con los antes reportados por otros autores (Wilson y cols.,1990, Stockell y Renwick, 1992, Stanton y c o l s . , 1996). y dan pie a las interpretaciones que relacionan el contenido de los carbohidratos con la actividad biológica.

ACTIVIDADES REALIZADAS

Como puede deducirse de la lectura del informe, las actividades que se

desarrollaron implicaron el establecimiento de las metodologías y de los controles de calidad correspondientes al Isoelectroenfoque, y a la cuantificación del A S . También se implica el establecimiento de las condiciones de incubación para la

hidrólisis enzimática de las ‘isoformas’ y la liberación del A S . Toda la actividad de laboratorio se acompañó con otra actividad igualmente importante, la búsqueda y análisis bibliográfico, de ahí la cantidad de referencias citadas.

OBJETIVOS

Y METAS ALCANZADOS

Tras analizar

los

objetivos planteados en el proyecto original , se demuestra

claramente qu dichos objetivos se alcanzaron completamente, todos y cada uno de ellos se cumplieron satisfactoriamente.

RECOMENDACIONES.

Como posibles recomendaciones a la alumna que realizó este proyecto serían, que continuara sus estudios de posgrado, que defina algún aspecto de la

(21)

17

BIBLIOGRAFíA

2 2 2 5 0 3

Acevedo Vargas J. 1997. Caracterización de las Isoformas de la Hormona LuteiniZante en Pacientes con Síndrome de Ovario Poliquístico. Tesis para la obtencion del grado de Maestría en Biología Experimental. UAM

-

I.

Aminoff D. 1961. Methods for the quantitative estimation of N-acetylneuroaminic acid and their application to hidrolysates of sialomucoids. Bioch J 81: 384-391.

Andreoii E, Hoffman F and Fanestil S. 1987. Membrane Physiology. The Interaction Of Hormones with Biological Membranes. Second Edition. Plenum Medical. 355-367.

Apter D, Butzow T, Laughlin

J

and Yen

SCC.

1995. Metabolic Features of Polycystic Ovary Sindrome are found in Adolescent Girls with Hyperandrogenism. J.Clin Endocr Metab. 80: 2966-2973. Baezinger JU.1988 Structure Synthesis and Function of the pituitary glycoprotein hormone oligosaccharides. J.Biol. Chem. 287: 1123-1 134.

Baezinger JU and Green ED. 1988. Pituitary glycoprotein hormone oligosaccharides: Structure, Synthesis and Function of the ASN-linked oligosaccharides on lutropin, follitropin and tyrotropin.

Biochem Biophys acta 947: 287-306.

Bayer AG, Fachbereich T, Wuppertal B and Germany H. 1995. Rapid, high performance liquid chromatography based periodate coupled thiobarbituric acid method for the determination of sialic acid in bronchoalveolar lavage fluid. Exp Toxic Pathol, 48: 526-528.

Berridge MJ. 1987. Inositol Triphosphate and diacylglycerol; T m interacting second messenger. Annu. Rev. Biochem. 56:159-193.

Cassel D and Selinger S. 1986. Basement Membrane Increase G-Protein Levels and Follicle-

Stimulating Hormone Responsiveness of Sertoli Cell Adenylyl Cyclasa Activity.Arch. Biochem Biophys

Catt KJ, Tsurahara J, Mendelson C and Dufau ML..1974.Gonadotropin Binding and Activation of the Interstitial Cell of the Testis. In: Dufau M.L,Hormone Binding and Target Cell Activation in the Testis.Plenum Press,NY,l-30.

Choi MSK and Cooke BA. 1991. Evidence for T m Independent Pathways in Stimulation of Steroidogenesis by Luteinizing Hormone Involving Chloride Channels and Cyclic AMP. FEBS Letter.

Dattatreyamurty 6, Sehneyer A and Reichert

K.

1986. Physical and Functional Association of

Follitropin Receptor With Cholera Toxin-Sensitive Guanine Nucleotide-Binding Protein: J. Biol. Chem.

Davis JS. 1992. Modulation of Luteinizing Hormone-Stimulated Inositol Phosphate Accumulation by Phorbol Esters in Bovine Luteal Cells. Endocrinology, 1992; 131: 749-757.

Drummond G. 1983. Advances in Cyclic Nucleotide Research 15, Greenand P and Robinson G A (eds). Raven Press. N.Y., pp 373.

Dufau ML, Homer

KA,

Hayashi K, Tsuruhara T, Conn PM, and Catt KJ. 1975. Actions of the Choleragen and Gonadotropin in Isolated Leydig Cells. J. Biol. Chem. 253: 3721-3729.

Dufau ML. 1988. Endocrine Regulation and Communicating Functions of the Leydig Cell. Ann. Rev. Physiol. 50: 483-508.

Ewing R and Keeney

P.

1993. Evidence that the F S H receptor itself is not a caolcium channel.

Endocrinology 131: 979-981.

Exxon JH,Taylor SJ and Augert G. 1991. Cell Signaling trough Phospholipid break dom.Mol Cell Biochem 104: 81-86.

&lard V, Hall PI Vaitukaitis J and Griffit T. 1971. Immunological and Biological activities of h c G following progressive desialysation. Endocrinology 88: 456-464.

Gilman AC. 1984. G Protein and Dual Control of Adenylate Cyclase. Cell 36: 577-79.

Hall SH and Freneh FS. 1990. Follicle -Stimulating Hormone Regulation of Androgen Binding Protein Menssager RNA in Sertoli Cell. Mol. Endocrinol. 4: 349-55.

Herrera J, Mendieta E and Bermúdez JA. 1996 Sertoli cell Conditioned media modulate the androgen Biosynthetic pathway in Leydig cell. Arch of Androl. 37: 127-133.

k r r e r a J , Miranda A, Acevedo J y Bermúdez JA. 1998. Evaluación de la afinidad de las 'isoformas' de la I-brmona Luteinizante (LH) por su receptor en un bioensayo de células de Leydig (CL). XXIII Reunión anual de la Academia de Investigación en Biología de la Reproducción, A.C.. Cuemavaca, Mor. 24

-

27 de mayo de 1998.

252:538-551.

261 402-404.

Figure

Figura  que  muestra  la  proporcionalidad  de  la  respuesta  obtenida  al  medir  AS  por  el  método  del  ácido  tiobarbitúurico  adaptado  a  HPLC

Figura que

muestra la proporcionalidad de la respuesta obtenida al medir AS por el método del ácido tiobarbitúurico adaptado a HPLC p.17

Referencias

Actualización...