Sobrevivencia y actividad de Bacillus thuringiensis var israelensis en ambientes naturales contra larvas de mosquito

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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

Sobrevivencia y actividad de Bacillus

thuringiensis var. israelensis en ambientes

naturales contra larvas de mosquito

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QUE EN OPCION AL GRADO DE MAESTRO

EN CIENCIAS

P R E S E N T A :

Q.B.P. MARIBEL LEAL CASTILLO |

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NEUVO LEON

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

Sobrevivencia y Actividad de

Bacillus thuringiensis

var

israelensis

en ambientes

naturales contra larvas de mosquito

TESIS

Q U E EN OPCION AL GRADO DE

MESTRO EN CIENCIAS

CON ESPECIALIDAD EN MICROBIOLOGIA

PRESENTA

Q.B.P. MARIBEL LEAL CASTILLO

COMISION DE TESIS

T ^A

2 S3 ^

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r 3

A G R A D E C I M I E N T O S

Al Dr. J u a n M a n u e l S á n c h e z Yanes por d i r i g i r este t r a b a j o .

Al M. C. L u i s j. G a l á n W o n g por f a c í l i t a r los m e d i o s para la r e a l i z a c i ó n de la p r e s e n t e investigación, por su a s e s o r í a y r e v i s i ó n del e s c r i t o .

Al M. C. J o s é A. S u á r e z F e r n á n d e z por brandar el apoyo n e c e s a r i o p a r a r e a l i z a r este p r o y e c t o .

A la M. C. K a t y w s k a A r e v a l o Ni«o por sus s u g e r e n c i a s y la r e v i s i ó n del e s c r i t o .

A la G . B . P . M a r í a C o n c e p c i ó n L e a l Casti 1lo por su v a l i o s a c o l a b o r a c i ó n en el d e s a r r o 1 l o del t r a b a j o p r á c t i c o .

Al M . C . A l f o n s o F l o r e s L e a l por f a c i 1 i t a r el n a t e r i a l e o p l e a d o en los b i o e n s a y o s y p r u e b a s de t o x i c i d a d .

Al M . C . M a r i o E f r e n N i e t o por su a s e s o r í a en el a a n e j o de la c o m p u t a d o r a .

DEDICATORIft

ft D I O S : P o r que aún c o n s e r v o el Don m a r a v i l l o s o de su v i d a

A MI E S P O S O : Pa*~ i ro G a r r a M o l i n a por que h a s a b i d o s e r mi a y u d a idónea

ft M I S H I J O S : S a a u e l y David por que son la r a z ó n d e rai exi s t e n c i a

ft M I S P A D R E S : Sixto Leal M o r a l e s y S o l e d a d C a c t i l l o L ó p e z .

ft M I S H E R M A N O S : Sixto, F e r n a n d o , M a r i a E l e n a y T o a, C o n y y S o n i a

Y c a n t a n el c á n t i c o de M o i s é s iervo de Dios, y el c á n t i c o del C o r d e r o , d i c i e n d o : G r a n d e s y m a r a v i l l o s a s son t u s obras Señor D i o s T o d o p o d e r o s o ; j u s t o s y v e r d a d e r o s son t u s c a m i n o s ,

Rey de los s a n t o s .

Q u i é n no te t eraerá, oh Señor, y g l o r i f i c a r á tu n o m b r e ? pues sólo t ú e r e s s a n t o ; por lo cual t o d a s las n a c i o n e s v e n d r á n y te a d o r a r á n , por q u e t u s j u i c i o s se h a n raanifestado.

D i c i e n d o a gran v o z : Teaed a Dios, y d a d l e gloria, por que la h o r a de s u j u i c i o ha l l e g a d o ; y a d o r a d a a q u e l q u e h i z o el c i e l o y la t i e r r a , el oar y las f u e n t e s de las a g u a s .

E s t e t r a b a j o f u é real izado en el l a b o r a t o r i o de M i c r o b i o l o g í a industv-ial e i n m u n o l o g í a de la Facultad de C i e n c i a s B i l o l ó g i c a s de la U n i v e r s i d a d A u t ó n o m a de N u e v o León en c o l a b o r a c i ó n con la F a c u l t a d

C O N T E N I D O :

pag.

R E S U M E N 1

I M P O R T A N C I A £

O B J E T I V O 4

A N T E C E D E N T E S 5

E c o l o g í a de Bt i S T o x i n a s y M e c a n i s m o de A c c i ó n 7

A p i i c a c i ó n en la n a t u r a l e z a 8 E s t u d i o s genét icos de la <5-endotoxina de Bt i 9

O R I G I N A L I D A D 10

H I P O T E S I S IB

M A T E R I A L Y M E T O D O 11

I - I n d u c c i ó n d e mutant es 11 II— P r o d u c c i ó n d e la ó - e n d o t o x i n a de Bti. 11

II I - S o b r e v i v e n c i a y Act i vi dad Met aból ica 1£

M a t r á z t i po B a r t h a 13

I V - B i o e n s a y o s 14

R E S A L T A D O S 15 C u a d r o s 18 G r á f i c a s £ 3

D I S C U S I O N E S Y C O N C L U C I O N E S £ 8

R E S U M E N

Con el proposito de d e t e r a i n a r la s o b r e v i v e n c i a y c a p a c i d a d de c o l o n i z a c i ó n de Báoi1lus thuringiensi s var. israelensis en a m b i e n t e s a c u á t i c o s naturales. Se indujo r e s i s t e n c i a g e n é t i c a mediante d i f e r e n t e s . d o s i s de r a d i a c i ó n u l t r a v i o l e t a a 30 A^gr. de kanamicina y 5 5 0 pptn. de parathión m e t í l i c o .

Los r e s u l t a d o s ind i can que ¿?<ac¿ 1 lus thuri ngiensi s var. ¿srae 1ensis t i ene capacidad para s o b r e v i v i r en a m b i e n t e s a c u á t i c o s hasta por 10 días sin a u m e n t a r la población inicial.

P o r otro lado, para c o m p r o b a r que la m u t a c i ó n i n d u c i d a no a f e c t ó la capacidad de la b a c t e r i a para p r o d u c i r la ó - e n d o t o x i n a y su acción t ó x i c a c o n t r a larvas de

IMPORTANCIA

En los <511 irnos 2 0 anos se ha p r e s t a d o m a y o r interés p a r a r e e m p l a z a r o a u m e n t a r la p o t e n c i a de los p e s t i c i d a s q u í m i c o s que se emplean en el control de p l a g a s a g r í c o l a s y v e c t o r e s de e n f e r m e d a d e s humanas, no solo por su d e s f a v o r a b l e e f e c t o en el medio a m b i e n t e , t a m b i é n porque generan r e s i s t e n c i a en los

insectos. A f o r t u n a d a m e n t e desde 1901 se sabe de la e x i s t e n c i a de especies de bacterias r e l a c i o n a d a s con las e n f e r m e d a d e s de

larvas de insectos, entre ellas se e n c u e n t r a n e s p e c i e s del género Baci1lus, como son : B a c i 1 l u s thuringiensis, Baci11us

larvae, Baci1lus popillae, Baci1lus sphaericus. (18, 19,£0). Baci1lus thuringiensis es un organisrao e s p o r u l a d o q u e contiene una inclusión q u e se s i n t e t i z a al mismo t i e m p o q u e

la espora, se ha d e m o s t r a d o que la t o x i c i d a d c o n t r a i n s e c t o s esta a s o c i a d a p r i n c i p a l m e n t e con esta i n c l u s i ó n c r i s t a l i n a de n a t u r a l e z a p r o t é i c a que r e q u i e r e para su a c t i v i d a d de la

s o l u b i l i z a c i ó n en á l c a l i diluido o jugo intestinal del insecto (17,18,40).

Esto r e p r e s e n t a una a l t e r n a t i v a en el c o n t r o l m i c r o b i o l ó g i c o de p l a g a s de interés a g r í c o l a y urbano, ya q u e t i e n e m ú l t i p l e s ventajas c o m o son: e s p e c i f i c i d a d , e s t a b i 1 i d a d , bajo costo, sin generar r e s i s t e n c i a en los insectos.(17).

Dentro de la especie thuringiensis se han e n c o n t r a d o

d iferentes v a r i e d a d e s mediante p r u e b a s b i o q u í m i c a s ,

s e r o l ó g i c a s en base a sus a n t í g e n o s f l a g e l a r e s H, t ipo y forma de cristal y con a d s o r c i ó n de fagos (8,9,£7). A d e m á s de a c u e r d o con la act iv idad insect icida que p r e s e n t a n se han e s t a b l e c i d o d i f e r e n t e s p a t o t i p o s d e n t r o del s e r o t i p o H. Patotipo A : prod u cen c r i s t a l e s b i p i r a m i d a l e s t ó x i c o s para lepidópt eros, patot ipo B : p r e s e n t a c u e r p o s e s f é r i c o s a o v o i d e s efect ivo contra Nematocera (Diptera).

En relación a salud pública se ha o b s e r v a d o q u e ni la segunda guerra mundial produjo t a n t a s bajas h u m a n a s c o m o las causadas por enfermedades d i s e m i n a d a s por mosquitos, esto ha incrementado el empleo de product os quí a icos para su cont>%o1,

que c o n t r i b u y e con la creciente c o n t a m i n a c i ó n a m b i e n t a l .

Una vez en el ambiente el pest icida puede s e g u i r di versas vías c o m o : ser asiailado por las p l a n t a s y a c u m u l a d o en partes c o m e s t i b l e s ; ser transportado a c o r r i e n t e s de agua con partículas de suelo, o acumularse en loabrices de t ierra y presentarse en grandes cant idades en aves que se a l i m e n t a n de gusanos. Tal es problemas son menos i m p o r t a n t e s en los compuestos que no son estables y permanecen poco t i e m p o en

la n a t u r a l e z a (£).

En estas c i r c u n s t a n c i a s el control b i o l ó g i c o y en e s p e c i a l Bacilias thuringien sis ofrece una a l t e r n a t i v a para d e v o l v e r al medio a m b i e n t e el equilibrio d i s t o r c i o n a d o por el h o m b r e .

Dentro del patot ipo B se encuentra una variedad muy act i va contra larvas de especies de mosquito y mosca n e g r a : Bacillus thuringiensis var. israelensis (30,35). En la actualidad se han realizado d i v e r s o s e s t u d i o s para e v a l u a r

el grado de toxicidad contra las d i v e r s a s e s p e c i e s de mosquitos dependiendo de sus habit os a l i m e n t i c i o s , comparación con c o m p u e s t o s químicos, c o n c e n t r a c i o n e s y

formulaciones más tóxicas, además se ha d e m o s t r a d o que la potencia de las toxinas de Bti pueden ser 300x m a y o r que los piretroides sintéticos y que los o r g a n o f o s f o r a d o s

(1,4,5,9, 12, £3, £7,40).

Sin embaY'go para pronosticar la e f i c a c i a del control de plagas con Bti. es necesario c o n o c e r más acética de la aut oeco logia de la bacteria y a u m e n t a r la probabi1 idad de éxito en su aplicación.

EN EL P R E S E N T E T R A B A J O SE P L A N T E O EL S I G U I E N T E O B J E T I V O

1.- D e t e r m i n a r sobrevi vencía y a c t i v i d a d m e t a b ò l i c a de Bacillus thuringiensis var. i sraelensi s bajo c o n d i c i o n e s a m b i e n t a l e s .

A N T E C E D E N T E S

A t r a v é s del t i e m p o se ha observado q u e los insectos t a m b i é n son suscept ibles a las e n f e r m e d a d e s c a u s a d a s por bacterias, en 1 8 7 0 Past eur o b s e r v ó una b a c t e r i a que p r e s e n t a b a una inclus ión cri stal i fera Baci1 lus bombyeis causante de la f l e c h e r í a del gusano de seda (17,18).

No obstante, fue en el ano de 1902 cuando Ishíwata a i s l ó de larvas enfermas del gusano de seda Bombix mor i, un m i c r o o r g a n i s m o que d e n o m i n ó Baci1 lus soto. P o s t e r i o r m e n t e B e r l i n e r en 1911 lo rea isló de larvas enfermas de la p a l o m i l l a del m e d i t e r r á n e o Ñnagasta kuehniella e i d e n t i f i c ó la e s p e e i e tipo de este grupo como Baci1lus thuhringiensis variedad thuringi en si s. ( 17, 19, £ 7 ). Más tarde cientl fieos j a p o n e c e s o b s e r v a r o n que c u l t i v o s viejos e s p o r u l a d o s de Bacillus thuringiensis var. sotto después de f o r m a r los c r i s t a l e s liberaban una s u s t a n c i a t ó x i c a para el gusano de seda (14,17).

F u é h a s t a 1954 en q u e se e s t a b l e c i ó una relación e n t r e la t o x i n a c r i s t a l i z a d a de la variedad sotto y la p a r á l i s i s q u e

ocurre en el insecto d e s p u é s de la ingestión del cristal.

S e o b s e r v ó q u e a u n q u e la toxina causa p a r á l i s i s al ser ingerida; é s t a no t i e n e efecto cuando se inyecta d e n t r o del c u e r p o del insecto < 17 ).

En 1958 H e i m p e l y A n g u s intentaron una c l a s i f i c a c i ó n de b a c t e r i a s c r i s t a l ! f e r a s ; en base a la morfología y pruebas b i o q u í m i c a s . P o s t e r i o r m e n t e De B a r j a c y Bonnefol, en 1962 r e p o r t a r o n un a n á l i s i s de 161 c e p a s de Bacillus thuringiensis y p r o p u c i e r o n una c l a s i f i c a c i ó n en base a sus a n t í g e n o s f1age lares H y p r u e b a s bi oquóra icas, organ i zaron nueve s e r o t i p o s con doce v a r i e d a d e s . E s t u d i o s p o s t e r i o r e s

En 1977 G o l d b e r g y Margalit encontraron una n u e v a b a c t e r i a en un lago al noreste del Negev en el desierto de Israe 1. En 1976 fué d e s c r i t a y c í a s i ficada por De B a r j a c como Baci1 lus

thurmgiensis var. i sr a elensi s serot ipo H - 14, que p r o d u c e un cuerpo parasporel ó - e n d o t o x i n a que es a l t a m e n t e t ó x i c a para larvas de dípteros, nematoceros, tales como m o s q u i t o s y simúlidos, no así c o n t r a larvas de 1epidópt eros (7,9).

Se han probado e x t r a c t o s de d i v e r s a s c e p a s de Baci1 lus thuringiensis y no t o d a s presentan la misma t o x i c i d a d c o n t r a d i f e r e n t e s insectos, las cepas GM-1, GM-6, GM-7, GM-8, GM-9, G M - 1 0 y G M - 1 3 a i s l a d a s de m u e s t r a s de suelo fueron p r o b a d a s contra larvas de Redes aegypti y Culex pipieos var quinqué fasciatus sin e n c o n t r a r r e s u l t a d o s p o s i t i v o s d e toxicidad c o n t r a estos insectos, en c a m b i o c u a n d o se p r o b ó la toxicidad de Baci1lus thuringiensis var. i sraelens i s a n i v e l de campo se presentaron p o r c e n t a j e s a c e p t a b l e s de m o r t a l i d a d en c o n c e n t r a c i o n e s de 5 kg./ha.< 12,14,26,36).

D i s t i n t a s c e p a s de Bacillus thuringiensis var. israelensis muestran d i f e r e n t e c a p a c i d a d para producir t o x i ñ a s 1 e t a l e s contra larvas de mosquitos, en función del m e d i o de c u l t i v o y c o n d i c i o n e s de c r e c i m i e n t o , sin e x i s t i r pt^opo re i onal i dad entre la cant idad de e s p o r a s y t o x i n a s p r o d u c i d a s < 3 9 ).

E C O L O G I A DE Baci1lus thuringi ens i s var. i sraelensi s

En o t r o s e s t u d i o s se ha o b s e r v a d o que la t o x i n a de Bt i. t i e n e m a y o r acción sobre larvas de no s quito del primero al t e r c e r instar d i s m i n u y e n d o el efecto tóxico en larvas del c u a r t o instar r e q u i r i e n d o de 1.5 a £ veces más t o x i n a del p o r c i e n t o normal usado para fíedes nigromaculis y Psoropora coluwbiae ( 3, ££ ).

M e d i a n t e modelos de l a b o r a t o r i o que simulan las c o n d i c i o n e s n a t u r a l e s e m p l e a n d o m u t a n t e s de Bt i. r e s i s t e n t e s a tres a n t i b i ó t i c o s , c u a n d o se inocularon e s p o r a s de una c e p a de Bt i m u t a n t e en p a r t í c u l a s d e lodo, se d e t e c t ó una a d s o r c i ó n i n m e d i a t a de la a c t i v i d a d t ó x i c a sin influir en la viabilidad d e la bacteria, por a g i t a c i ó n del lodo se logró d e t e c t a r

b a c t e r i a s viables al m e n o s por 2 2 d í a s ; a u n q u e las esporas fueron i n c a p a c e s de g e r m i n a r en el fango (3).

T O X I N A S Y M E C A N I S M O D E A C C I O N

poros que desequilibran el balance osmótico o e a c i o n a n d o lisis de las células epiteliales, se d e t i e n e la a l i m e n t a c i ó n y la

larva muere. Se ha incrementado la e videncia b i o q u í m i c a de la presencia de sitios de unión especí fica de a l t a a f i n i d a d en el epitelio del intestino medio que puede d e f i n i r si un insecto es resistente o susceptible a d e t e r m i n a d a t o x i n a

(£4,£8,40).

APLICACION EN LA N A T U R A L E Z A

Al probar formulaciones para d e t e r m i n a r la act i v idad de toxinas de Bti. contra larvas de especies de Ñnophe1 es e m p l e a n d o sustancias que facilitan la aspersión y flotación de p a r t í c u l a s de formulados como aceite de maíz, lecitina, y dos productos comerciales de Bti. (Arosurf y Liparol). Se e n c o n t r ó que las concentraciones y c o m b i n a c i o n e s más e f e c t i v a s f u e r o n : ingrediente activo con h a r i n a de trigo y a c e i t e de maíz. La mortalidad c o m p l e t a se obtuvo en c o n c e n t r a e i o n e s de O . 1 % para

{fínopheles stephenis), de <2f.£% c o n t r a ifínopheles albimanus), y 0. 3 % c o n t r a ( fin. quadrimaculatus ), < 1£).

En la actualidad existen d i v e r a s c o m p a ñ í a s c o m o : Duphar, Novo-Labs, Ecogen, Abbott Labs, S a n d o z etc. que se d e d i c a n a la producción de formulados a base de Baci1lus thuringien sis de sus diferentes vari edades, entre ellas isr&elensis con

product os como: skeetal, tetonar, vect obac que se api ican en d i v e r s a s regiones principalmente en Norte A m e r i c a . <1, £8,40).

En un estudio a nivel de campo se api i carón foY^mulaciones granuladas de Bti para c o m b a t i r la mosca negra, y m e d i a n t e un a n á l i s i s de costos se o b s e r v ó que estos pueden r e d u c i r s e hasta en un después del primer a«o de a p l i c a c i ó n , debido al incremento en la e f i c i e n c i a de operación, e n t r e n a m i e n t o , etc. <£ñ,34).

E S T U D I O S G E N E T I C O S C O N LA A - E N D O T O X I N A D E Bacillus thuringiensis var. israelensis

M e d i a n t e la i n t r o d u c c i ó n del gen-Cry 1VD p r o c e d e n t e de Bti en la c i a n o b a c t e r i a u n i c e l u l a r fígmenellum quadruplicatum se ha o b s e r v a d o que el gen f u s i o n a d o se e x p r e s a a a l t o s n i v e l e s en las c i a n o b a c t e r l a s y los b i o e n s a y o s revelan que las

larvas de mosquito Culex pipi en 5 f a c l í m e n t e ingieren la c i a n o b a c t e r i a t r a n s f o r n a d a c o n s e r v a n d o su toxicidad c o n t r a la larva (5).

Se h a d e s c r i t o la c l o n a c i ó n de g e n e s que c o d i f i c a n p a r a las t o x i n a s 5 1 . 4 y 91.4, la 100-KDa p r o c e d e n t e de Bacillus

O R I G I N A L I D A D

En t r a b a j os a n t e r i o r e s se ha investigado el t i e m p o de act ividad tóxica de Bti. en a m b i e n t e s acuá.t icos, en el presente estudio se verificará la capacidad de c o l o n i z a c i ó n de una c e p a de Bti.marcada, así como su toxicidad c o n t r a m o s q u i t o s

H I P O T E S I S DEL T R A B A J O

M A T E R I A L Y M E T O D O

Origen de las c e p a s de Bacillus thuringiensis va.r.israelensis En el present e trabajo se e m p l e ó una c e p a de Baoi 1lus thuringiensis v a r . i s r a e l e n s i s H D - 1 4 p r o p o r c i o n a d a por el L a b o r a t o r i o de M i c r o b i o l o g i a e Inmuno 1 ogía de la Facultad de C i e n c i a s B i o l ó g i c a s de la U.A.N.L.

I.- INDUCCION DE M U T A N T E S de Bti. a ) - A c t i v a c i ó n :

De la cepa de r e f e r e n c i a de Bti. se s e m b r ó en un matráz de 5 0 mi. con 10 mi. de c a l d o n u t r i t i v o , se i n c u b ó de 13 a 18 hrs. a 3 7 °C. en a g i t a c i ó n r o t a t o r i a de 2 5 0 r.p.ra. b)- P r e p a r a c i ó n de cultivo para ensayo de m u t a g é n e s is en Bti.

Con la cepa act ivada se inocularon 3 6 placas de agar n u t r i t i v o , luego se les irradio con luz ultra v i o l e t a en dos longitudes de onda a d i f e r e n t e s t i e m p o s : 2 5 3 . 7 nm. y 3 7 5 nm. a 5, 10, 15, 20, 2 5 y 3 0 min., c a d a prueba se r e a l i z ó por t r i p l i c a d o .

A las c e p a s de Bti. s o b r e v i v i e n t e s de c a d a d o s i s se les as i g n ó un número diferent e para e v a l u a r r e s i s t e n c i a a un

p e s t i c i d a y a n t i b i ó t i c o s .

c)— El p e s t i c i d a probado f u é P a r a t h i ó n M e t i 1 ico 5 0 c o n c e n t r a d o e m u l s i f i c a b l e o r g a n o f o s f o r a d o , a t r e s c o n c e n t r a c i o n e s : 25, 5 0 y 100 p.p.n.

d > - El P a t r ó n de r e s i s t e n c i a de a n t i b i ó t i c o s se obtuvo con el uso de s e n s i d i s c o s para b a c t e r i a s gram + (13,32).

II.- P R O D U C C I O N DE LA A - E N D O T O X I N A .

a).— Se s e l e c c i o n ó la cepa m a r c a d a para la p r o d u c i ó n de la ó endotoxina, en m a t r a c e s e r l e m — m e y e r de 5 0 0 mi. con una q u i n t a parte de su volumen total de c a l d o de p r o p a g a c i ó n

(medio melaza) ( 10,£2 ) .

Como control se e m p i e ó la cepa s i l v e s t r e Bt i.

aonit oreando al a i c r o s c o p i o c a d a 4 o 6 h r s . h a s t a la liberación h o a o g e n e a de la espora y el c r i s t a l .

b). - E x t r a c c i ó n de la ó - e n d o t ox ina de Bti.

P a r a o b t e n e r el c o m p l e j o e s p o r a c r i s t a l se e m p l e ó el mét odo propuesto por D u l a a g e 1 9 7 0 < 19, £1, ££ ).

c). - U n a vez obtenido el c o m p l e j o e s p o r a - c r i s t a l se p r o c e d i ó a la formulación del i n g r e d i e n t e act ivo. ( 12,38 >.

F O R M U L A D O

I n g r e d i e n t e activo.. 1. '/• - C o m p l e j o e s p o r a - c r i s t a l S o p o r t e 50. % - T i e r r a de d i a t o m e a s C o a d y u v a n t e 0. 1 % . - T r i t ó n 67. (12, 2 7 ) .

I I I . - S O B R E V I V E N C I A Y A C T I V I D A D M E T A B Q L I C A DE Bti. EN A M B I E N T E N A T U R A L

Se eaplearon matraces t ipo B a r t h a para eva-1 uar la a c t i v i d a d metabólica del f o r m u l a d o de Bti. en un m i c r o a m b i e n t e que s i m u l ó las c o n d i c i o n e s n a t u r a l e s . L a a c t i v i d a d a e t a b ó l i c a se midió m e d i a n t e la c a p t a c i ó n del C O 2 en álcali y se r e g i s t r ó d i a r i a m e n t e , a los m a t a c e s se

P 2D J o

T I P O B A R T H A

-2

T a p a n de G o m a

Na DH .1 M

S u s p e n c i ó n d e p r u e b = .5 gr d e f o r m u l a d o + 1/5 d e l v o l ú m e n

d e agua de r i o f i l t r a d a c o n m e m b r a n a m i l i p o r e d e 0 . 2 m i e r a s

C o l u m n a p a r a c a p t u r a de C O ^

S í l i c a gel

* ?0H

-L a viabi1 idad t a m b i é n se determinó, c o l o c a n d o en una serie de vasos con 150 al. de a g u a de rio y 14 ppm. del formulado. Se e m p l e a r o n 3 t r a t a m i e n t o s : d e s i g n á n d o s e un número a c a d a c e p a ; 1 para la cepa s i l v e s t r e y £ para la motante, para c a d a t r a t a m i e n t o se corrio un t e s t i g o sin formulado con 4 r e p e t i c i o n e s cada uno. D i a r i a m e n t e se r e a 1 i z a r o n d i l u c i o n e s en placas de agar n u t r i t i v o con el p e s t i c i d a y a n t i b i ó t i c o , la maestra a n t e s de inocularse se past eur I z ó 8 0 ° C / 1 0 IB in. para eliminar la f 1 ora veget at i va, m o n i t o r e a n d o s o l a m e n t e la población esporulada.

IV.— Se e f e c t u a r o n t a m b i é n bioensayos para probar la t o x i c i d a d d e los formulados p r e p a r a d o s con la cepa de Bti. m a r c a d a y

el control (cepa s i l v e s t r e ) siguiendo el método r e c o m e n d a d o por la o r g a n i z a c i ó n mundial de la salud ( O.M.S.), d e s c r i t o por De B a r j a c en 198£, con el uso de larvas del t e r c e r e s t a d i o o del c u a r t o estadio t e m p r a n o (££,42).

R E S U L T A D O S

I . - S E L E C C I O N D E M U T A N T E S DE Bacillus thuringiensis var. israejensis

Se o b s e r v ó desarrollo escazo de c o l o n i a s en los extremos de las c a j a s irradiadas con 5, 10 y 15 min a £ 5 3 - 7 nm. e s t a s c e p a s se etiquetaron con los n ú m e r o s 1, 2, y 3. En la api icación con la segunda d o s i s 375 ntn. se e n c o n t r o mayor sobreviven i^ en t o d a s las cajas, aqui las c e p a s se etiquetaron coso 4 al t r a t a m l e n t o con 5 min., h a s t a 9 el de 3® min., el número 10 fué para la c e p a de Bti. silvestre (control sin irradiar). Esto se muestra en el c u a d r o No.1.

L a sensibilidad a a n t i b i ó t i c o s se m u e s t r a en el cuadro N o . £ . El desarrollo de las c e p a s de Bti. irradiadas fué

s e m e j a n t e a la cepa silvestre, en p r e s e n c i a de cuatro ant ibiót icos: tetraeiclina, estreptomicina, 1 i n c o m m i c i n a

y eritromicina. La cepa silvestre m o s t r ó res i stencia n a t u r a l solo a ampicilina, esta resi s t e n c i a se mantuvo solo en las cepas 7 y 9. Se s e l e c c i o n a r o n las c e p a s 1, 6, y 9 r e s i s t e n t e s a 10 M9r* de gentamicina, y las c e p a s 2 y

5 r e s i s t e n t e s a k a n a m i c i n a en una c o n c e n t r a c i ó n de 3 0 ¿¿gr.

T a n t o las cepas s e l e c c i o n a d a s como la cepa silvestre m o s t r a r o n una marcada r e s i s t e n c i a natural al parathión c o m o se observa en el c u a d r o No.3, por lo tanto las c o n c e n t r a c i o n e s fueron a u m e n t a d a s p r o g r e s i v a m e n t e d e s d e 2 5 ppm. hasta 550 ppm. a c o n c e n t r a e i o n e s s u p e r i o r e s no se d e t e c t ó sobrevivencia de n i n g u n a cepa de Bti., esta fué la c o n c e n t r a c i ó n seleccionada, los r e s u l t a d o s se expresan en el c u a d r o No.4. Tanto las c e p a s m a r c a d a s como el control p r e s e n t a r o n r e s i s t e n c i a nat ural al pest icida en las c o n c e n t r a c i o n e s probadas. En el cuadro N o . 3 se o b s e r v a el patrón de sensibilidad de 5 c e p a s de Bti. a gentamicina,

k a n a m i c i n a y 550 p.D.m. de o a r a t h i ó n metílico.

En los n e d i o s de cult ivo q u e c o n t e n í a n ant i b i ó t i c o y p e s t i c i d a n o no se o b s e r v ó con c l a r i d a d la p r o d u c c i ó n del c r i s t a l , por lo q u e las c e p a s se s e m b r a r o n en c a l d o t r i p t i c a s e l na y f o s f a t o para c o m p a r a r la p r o d u c c i ó n del c r i s t a l , ft las 4 8 h r s . se r e v i s a r o n las c e p a s y se s e l e c c i o n ó

la n ú m e r o £ r e s i s t e n t e a 10 pgr. de k a n a m i c i n a y 5 5 0 ppra de p a r a t h i ó n , para la p r o d u c c i ó n de la 5 - e n d o t o x i n a y las p r u e b a s de s o b r e v i v e n c i a , act ividad m e t a b ò l i c a y t o x i c i d a d

II.- S O B R E V I V E N C I A Y A C T I V I D A D M E T A B O L I C A

En la g r á f i c a N o . l se m u e s t r a la s o b r e v i v e n c i a de la p o b l a c i ó n e s p o r u l a d a n a t i v a del a g u a de prueba, se o b s e r v o estabi 1 idad d u r a n t e 6 dias y p o s t e r i o r m e n t e d e c i i n ó en c o n d i c i o n e s n a t u r a l e s . En la g r á f i c a No. £ se m u e s t r a e 1 c o m p o r t a m i e n t o de la c e p a Bti. s i l v e s t r e , q u e no p r e s e n t a r e s i s t e n c i a a k a n a m i c i n a ni p a r a t h i ó n y s o b r e v i v i ó por 10 di as. En la g r á f i c a N o . 3 se d e s c r i b e el patrón de s o b r e v i v e n c i a de la c e p a m u t a n t e de Bt i. que f u é muy s e m e j a n t e al de la c e p a de Bti. s i l v e s t r e . Sin e m b a r g o la d e n s i d a d p o b l a c i o n a l d i s m i n u y ó m e n o s d r á s t i c a s e n t e q u e en la g r á f i c a N o . £ . Se d e t e c t ó mayor n ú m e r o de m u t a n t e s de Bti. en los monit oreos real i z a d o s en p l a c a s de a g a r n u t r i t i v o y en p r e s e n c i a de p a r a t h i ó n q u e en los m e d i o s c o n k a n a m i c i n a , a u n q u e el patrón de c r e c i m i e n t o de a m b a s c e p a s m o s t r a d o en la

g r á f i c a N o . 3 fué muy s e m e j a n t e .

Las b i o e n s a y o s de t o x i c i d a d de Bti. r e a l i z a d o s c o n t r a fledes aegypti a o s t r a r o n que el formulado preparado con la cepa a u t a n t e de Bti. tuvo un buen rango de aceptación al igual que la cepa silvestre, con una LDso de 0 . 3 3 9 2 y LDPO de 2 . 4 3 0 para la s e g u n d a y una LDso de 0 . 3 6 1 8 y LDPO de 2 . 5 6 6 ¿jgr/ml. para la pr ira era.

Los a n a l i s i s e s t a d í s t i c o s de Probit r e a l i z a d o s con los r e s u l t a d o s de los b i o e n s a y o s p r e s e n t a r o n un intervalo de c o n f i a n z a de 9 5 % para arabas cepas.

C u a d r o No. 1

S o b r e v i v e n c i a de Baci1lus thuringiensis var. i sraelensis a d i f e r e n t e s dosis de irradiación con luz ultra violeta.

T i e m p o de expos ición en m i n u t o s

R e s i s t e n c i a a la radiación

£ 5 3 . 7 nm.

T i e m p o de exposición en minutos

R e s i s t e n c i a a la Y-'ad i ación

£53. 7 nm.

1.- 5 + 4 . - 5 +

£ . - 1 0 + 5 , - 10 +

3 . - 1 5 + 6 . - 15 +

. —£G - 7 . - £ 0 +

. - £ 5 - 8. - £5 +

. - 3 0 - 9 . - 3 0 +

10.-control sin irradiar

C u a d r o N o . 2

P a t r ó n de r e s i s t e n c i a mutant es de Baci 1lus

y sens i b i 1 i d a d a thuringiens is vai

a n t i b i ó t i c o s de israelensis ftnt ibiót ico

1

4

c e p a s

5

irrad iadas

£ 7 8 9

cefat oxi ma

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Cuadro N o . 3

R e s i s t e n c i a de raut ant es de B<aci llus thuri ngiens is a d i f e r e n t e s a g e n t e s q u í m i c o s

N o . c e p a P a r a t h i ó n metí 1 ico 5 5 0 p. p. m.

Gentaraicina

1 0 ¿¿gr.

Kanam icina 3 0 ¿¿gr.

1 £

5

6

3

10

+

+

+

+

+ +

+

+ +

Cuadro N o . 4

Mortalidad de larvas del tercer estadio y c u a r t o t e m p r a n o de

Ñedes aegypti a las £ 4 horas d e s p u é s de la e x p o s i c i ó n a £ f o r m u l a d o s a base de Bti. C e p a 1 H D - 1 4 y C e p a £ H D - 1 4 ilutante.

Concent rae ión

en mg/lt.

No.de larvas

tratadas

"/. de

Cep

mortal idad

a-1 control •/.de

C e p a

m o r t a l i d a d

- 2 m a t a n t e

0. 0 2 3 0 0 £ 0 18

0. 0 4 3 0 0 4 5 3 5

0. 0 6 3 0 0 5 6 4 0

0. 06 3 0 0 7 0 6 6

0. 10 3 0 0 8 5 7 0

0 . ia 3 0 0 9 0 7 8

0. 14 3 0 0 9 0 8 4

Cuadro No. 5

Resultados del análisis estadístico PROBIT de los bioensayos de 2 cepas de Bacillus

thuringensis var. israelensis contra larvas

de Aedes aegypti. Con un intervalo de confianza del 95%.

Cepa-1 Cepa-2

PENDIENTE 1 .45581 1 .508115 INTERCEPCCION 5 .721832 5 .665805 CHI CUADRADA 5 .2338 3 .8192

LD50(PPM) = 0 .3192802 0 .3618416

LD,0(PPM) = 2 .430187 2 .566935

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Al a p i i c a r radiación ultra v i o l e t a en dos l o n g i t u d e s de ,nda en d i f e r e n t e s dosis sobre Bacilias thurngiensis var. israelensis, a baja f r e c u e n c i a (253.7nm.) se p r o d u j e r o n daftos

iue se manifestaron en falta de viabilidad, puesto que la 'adiación inhibió los m e c a n i s m o s e n z i m á t i c o s de r e p a r a c i ó n iromosómicc. Las dosis letales api icadas se r e q i s t r a r o n a más Je 15 rain. La cepa t r a t a d a con 375 nm. en d i f e r e n t e s t i e m p o s no presento a l t e r a c i ó n en cuanto a s o b r e v i v e n c i a , pero los efectos se manifestaron c u a n d o las c e p a s se probaron en p r e s e n c i a de d i f e r e n t e s a n t i b i ó t i c o s , a u n q u e el m e c a n i s m o enzimático de reparación funciono a n u l a n d o los danos letales, es auy probable que las a l t e r a c i o n e s en c u a n t o a s e n s i b i l i d a d , r e s i s t e n c i a parcial o total a los a n t i b i ó t i c o s se d e b a a la foraación de di meros de t imina que c o m u n m e n t e se generan por el efecto de la r a d i a c i ó n ultra v i o l e t a sobre el genooa bacteriano.(36).

T a n t o la cepa silvestre de Bti. como las m u t a n t e s i r r a d i a d a s presentaron r e s i s t e n c i a al p a r a t h i ó n m e t í l i c o h a s t a 100 ppm.

La m a r c a d a r e s i s t e n c i a al p a r a t h i ó n m e t í l i c o se d e b e a que una gran cant idad de m icroorgan ismos, entre e l l o s los e s p o r u l a d o s como Bacillus tienen la c a p a c i d a d de u t i l i z a r los pest icidas como sustrato, por c o m e t a b o 1 ización o como fuente de carbono, e n e r g í a y, o c a s i o n a l m e n t e de n i t r ó g e n o fósforo y azúfre. (2). Las m u t a c i o n e s f a v o r e c i e r o n la capacidad de síntesis de e n z i m a s para m e t a b o l i z a r el pest icida en c o n c e n t r a c i o n e s aayores, como se o b s e r v a en el c u a d r o No.3,

En lo c o n c e r n i e n t e a l a s p r u e b a s de s o b r e v i v e n c i a , la población e s p o r u l a d a n a t i v a del a g u a de p r u e b a se mantuvo constante d u r a n t e 5 dias d e b i d o p r o b a b l e m e n t e al c o n s u m o de nutrientes, que d i s m i n u y e r o n l e n t a m e n t e h a s t a el d é c i m o dia.

En la g r á f i c a No. £ se o b s e r v a q u e a u n q u e la c e p a s i l v e s t r e de B a c i l l u s thurmgiensis var. israelens i s posee r e s i s t e n c i a

natural al parathión las c o n c e n t r a c i o n e s s e l e c c i o n a d a s de antibiótico y pesticida para la c e p a mutant e r e s u l t a r o n tóxicas inhibiendo c o m p l e t a m e n t e el c r e c i m i e n t o de la cepa silvestre. No obstante la c e p a s i l v e s t r e s o b r e v i v i ó en agua de río d u r a n t e 10 dias, (gráfica No. 2 ) pero en los r e c u e n t o s se d e t e c t ó una d i s m i n u c i ó n p o b l a c i o n a l más d r á s t i c a que en las c e p a s n a t i v a s del a g u a de rio (gráfica No.1).

La c e p a m u t a n t e se mantuvo d u r a n t e 10 d i a s con r e c u e n t o s poblaci onales 1 i gerament e m a y o r e s a la c e p a s i l v e s t r e , esto indica que de a l g u n a manera las m u t a c i o n e s f a v o r e c i e r o n la capacidad de c o m p e t e n c i a c o n t r a la p o b l a c i ó n n a t i v a del agua,

(gráficas N o . 2 y 3).

Por otra parte en la g r á f i c a No. 4 se o b s e r v a que la la c e p a s i 1vestre p r e s e n t a m a y o r e s val ores de act ividad n e t a b ó l i c a (producción de CO2) q u e la c e p a mutante, en a m b o s casos se d e t e c t a la ú t i l i z a c i ó n de dos fuentes de ca r bono, la primera p o s i b l e m e n t e más s i m p l e q u e la s e g u n d a p u e s t o q u e p r e s e n t ó una mayor c a p a c i d a d de as i m i 1ación.

A u n q u e a m b a s cepas p r e s e n t a r o n un patrón de act ividad muy semejante, los valores a l c a n z a d o s por la c e p a m u t a n t e fueron menores en c o m p a r a c i ó n con los o b t e n i d o s por la c e r p a silvestre, esto p r o b a b l e m e n t e se d e b i ó a los e f e c t o s c a u s a d o s por la r a d i a c i ó n a p i i c a d a d u r a n t e el marcaje.

Los a n á l i s i s de Probit real izados con los r e s u t a d o s de los b i o e n s a y o s con Ñedes aegypti m o s t r a r o n que la p o t e n c i a del

disminuido ligeramente la capacidad de s o b r e v i v e n c i a no a f e c t ó la síntesis ni la toxicidad de la <5-endot ox i na.

Los bioensayos real izados con Ñnopheles albimanus m o s t r a r o n que ni la cepa silvestre ni la «utante t i e n e n efecto t ó x i c o contra dichas larvas, en este caso t a m p o c o se a l t e r ó la toxicidad Ge 1« cepa probada.

ftl analizar lo- tes. tados c o n c l u y ó que la s o b r e v i v e n c i a de Bti. es m s i ^íciente para lograr un control b i o l ó g i c o constante p .esto que no a leanza poblaci ones mayores a las q u e

se introduje ínicialmente ya que s o b r e v i v e pero no c o l o n i z a el medio, aunque para a f i r m a r esto es n e c e s a r i o r e a l i s a r e s t u d i o s con larvas de mosquito en el a m b i e n t e y c o n t r o l a n d o las concentraciones de matria orgánica, asi como la t e m p e r a t u r a y otros factores que pudieran a f e c t a r la c o l o n i z a c i ó n de Bti.

No obstante el uso de bioinsect icidas es el m e j o r c a m i n o para 1ograr un control efectivo en las p l a g a s de insectos, (1,3,£7).

En est e t r a b a j o se m o s t r ó como Bt i. t i e n e s u f i c i e n t e capacidad para sobrevivir, a u n q u e por p e r i o d o s c o r t o s en a m b i e n t e s acuát icos n a t u r a l e s s i e m p r e que exista m a t e r i a orgánica disponible en el medio. Es n e c e s a r i o para p o d e r a p r o b e c h a r mejor los c o n t r o l e s b i o l ó g i c o s real izar más estudios, ahora para v e r i f i c a r si d u r a n t e su sobreviv e n c i a se produce la síntesis y 1 iberación del c r i s t a l .

Una posible a l t e r n a t i v a son los e s t u d i o s que se r e a l i z a n mediante la introducción de genes p r o c e d e n t e s de Bt i en la cianobacteria u n i c e l u l a r Ñgmenel1um quadruplicatua, el gen fusionado se expresa en altos n i v e l e s y los ensayos r e v e l a r o n que las larvas de mosquito f a c i l m e n t e ingieren la cianobacteria t r a n s f o r m a d a c o n s e r v a n d o su t o x i c i d a d . ( 5 , 4 0 ) .

Por otra parte se han clonado g e n e s p r o c e d e n t e s de Baci21us sphaericus \ Bti. en plásmidos con a m p l i o r a n g o de h o s p e d e r o y

L I T E R A T U R A C I T A D A

1.- A b b o t t , L a b o r a t o r i es; (1988) "Una a l t e r n a t i v a bi o l ó g i c a para el control de mosquitos y mosca negra". C h e m i c a l and Agricult ural Product s Division. North Ch icago,11, 6 0 0 6 4

2. - A l e x a n d e r , M a r t i n ; ( 1 9 8 0 ) . " I n t r o d u c c i ó n a la M i c r o b i o l o g í a del S u e l o " A. G. T. EDITOR S.A. M é x i c o 18 D -F.

3 . - Al y, C., M.S. Mulla. ;(1987)."Floating bait f o r m u l a t i o n increase e f e c t i v e n e s of Bacillus thuringiens is var. israelensis against Ñnopheles larvae." Journal of the

A m e r i c a n M o s q u i t o Control A s s o c i a t i o n . 3 : 5 8 3 — 5 8 8 .

4. - Aranda, B. A. ; (1986)."Toxicidad de Baci11 us thuringiensis

GM-7, 6 M - 8 y 6 M - 9 en larvas de Redes aegypti y Cu lex p. var. quinquéfasciatus" F a c u l t a d de C i e n c i a s B i o l ó g i c a s

U.A. N. L. M é x i c o (Tesis Inédita).

5. - C . , M u r p h y , R; Stevens, S t e v e n s , E . , S ; (1992)."Cloning and

e x p r e s s i o n of the cryIVD gene de Baci1lus thuringiensis subsp. isrselensis in the C y a n o b a c t e r i un Ñgmenellum cuadruplicatue P R - 6 r e s u l t i n g larvicidal a c t i v i t y Applied and E n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y 5 8 : 1 6 5 0 - 1 6 5 5

6 . - B a l a r a m a n , K., S. L. Hoti.;(1988> "Compet i t i v e c o s t s of m o s q u i t o control with larvicidal b a c i l l u s and insecticides"., The E n v i r o n m e n t a l i s t , 8 : 123 - 126.

7.- Barak, Z . , L . , B l a u s t e i n . ;<1980). "The fate of Bacillus thuringiens var. israelensis in the natural h a b i t a t " . Ben

8.- Barba C a b r e r a A. L. ; (1983) "Ident i ficación b i o q u í m i c a y sero lógica de cinco c e p a s de Baci1 lus thuringiensis a i s l a d a s de suelos de nuevo león". F a c u l t a d de C i e n c i a s

Biológicas U.A.N. 1 M é x i c o ( T e s i s Inédita )

3. Bosques, P . M . C . \ ( 1 9 8 ^ ) "Toxicidad de Baci1lus thuringi ensis GM i, G M - 6 y G M - 1 0 en larvas de ñedes aegypti L. y Culex pipiens var. quinquéfasciatas s a y . " Facultad de C i e n c i a s B i o l ó g i c a s , U . A . N . L . M é x i c o .

( Tesis Inédita ).

1 0 . - Castro, P. E. ;(1986)"Toxicidad de trece n u e v o s a i s l a d o s a partir de suelo y larvas enfermas, d e Bacillus

thuringiensis (GM-20 a GM-3S)". F a c u l t a d d e C i e n c i a s Biológicas, U.A.N.L. México. ( T e s i s I n é d i t a ).

11.-Cerda, M.A.; J M , S á n c h e z , Y . (1987). " I n t e r a c c i ó n b i o l ó g i c a de Baci1lus thuringien sis con m icroorgan ismos de suelo".

Facultad de Ci eneias Bilóg icas, U.A.N. L. Méx ico. ( T e s i s I n é d i t a ).

12.- Cervant es, S. •. ; (1985). "Tox icidad de c e p a s n a t i v a s de Baci1lus thuringiensis en larvas de ñedes aegypti l y Culex pipi ens var. quinquéfasciatus. "Facultad de C i e n c i a s

B i o l ó g i c a s U. A. N. L. México ( T e s i s I n é d i t a ).

13.- Coronado, P. R. ; JM, Sánchez,Y. (1984). " S o b r e v i v e n c i a y c o l o n i z a c i ó n de Rizobium phaseoli en suelo y r i z o s f e r a de tres var i edades de fri .j o 1 Phaseol us vulgar i s )" F a c u l t a d

14. — Culebro, C.M de J. ,< 969) "Evaluación de l a b o r a t o r i o y c a m p o de una f o r m u l a c i ó n , a base de Bao i llus

thuringiens i s . is aelensis (H-14) en larvas de fíedes aegypti y C le .p'. F caltad de Ciencias B i o l ó g i c a s

U . A . U . M é x i c o ( Tesis Inédita ).

15.- Cheung, , P. , ? ammo<-k D. B , (1985) "Micro-1ipid-droplet encaps-1atior c^ Sa illus thnringiensis var. israelensis <5-Endotoxina for control of mosquito larve." Appiiéd

and E n v i r o n s e n t a l M i c r o b i o l o g y . 50: 9 4 8 - 388.

16. - D a v i d s o n E.,Yaraarcoto T. ; (1984). "Isolation and assay of the t o x i c component from the c r i s t a l s of Baoi11 us

thuringi ensi s var. i sraelensi s". Current M i c r o b i o l o g y . 11: 171 - 174.

17.— D e b a c h , P . ; (1385) "Control biológico de plagas de insecto y malas hierbas". 1£ impresión, Ed. C . E . C . S . A .

18.-

;(1384)

cobo

( Tes ina Inédita ).

19.- Dulmage, H.T.; (1981). "Production de B a c t e r i a for biological control of insects". Published by U.S.D.A.,

Brownsville, Texas, U.S.A. No. 9.

£ 0 . - Dulmage, H.T.; and Aizawa, k.? (1980) "Distribution of Bacillus thuringiensis in Nature. P u b l i s h e d by

2 1 . - Dui mag e, H. T. ; J. Pi . C o r r e a and A. J. M a r t i n e z ; (1970). "Copre s i pitación with lact ose as a means of r e v e r i n g the spore-cristal c o m p l e x of Baci 11 us thuringiens is".

Joj--al of Invertebrate Patho 1ogy; 15: 1 5 - 2 0 .

¿l2. - D mirage, H. T. ; A . A . Y o u s t e n , 5 S. Singer. ; L. ft. Lacey, ; (1990). "G ide'line for prod._tion of Baci 21 us thuringiensis H - 1 4 and Bacillus sphaericus". UNDP / W O R L D B A N K / WHO. S p e c P r o g r a n for Re search and Train ing in T r o p i c a l

D i s e a s e s ( T D R ).

£3.-Faust. R., M ;,Mulla, L . A . J r . ; (1982) " B a c t e r i a and t h e i r toxins as insecticides". pp. 7 5 - 2 0 8 . In: K u r s t a k E. (ed), Microbial and Viral P e s t i c i d e s N e w Y o r k : M a r c e 1 D e k k e r .

£ 4 . - H u g u e t t e de Barjac; (1989) "New facts and t r e n d s in b a c t e r i o l o g i c a l control of m o s q u i t o e s " . Mem. Inst. O s w a l d o

Cruz . Rio de J a n e i r o 84: 101-105.

£ 5 . - I barra, J.E.; B. A. F e d e r i c i ; (1985) " I s o l a t i o n of a relatively n o n t o x i c 6 5 - k i l o d a l t o n protein i n c l u s i o n from the parasporal body of Bacillus thuringiensis var. israelensis. " Journal of B a c t e r i o l o g y . 165: 5 2 7 - 5 3 3 .

£ 6 . - Klein,M.T. ; M. A l e x a n d e r . ; (1986). " B a c t e r i a l i n h i b i t o r s in lake water". Applied and E n v i r o n m e n t a l M i c r o b i o l o g y

5 2 : 114-118.

£ 7 . - Kreig A.; S c h n e t t e r W. ; (1987). "Bacillus thuringiensis var. tenebronis, strtain B l - £ 5 6 - 8 2 a third p a t h o t y p e

2 8 . - Lambert, B; Feferoen, M; (133c:) " Ir sect icidal promise of Baci 11. s thuringiensis". Bioscience 42:112-121

13. - Leal,C,.M. ;JM. Sánchez, i. ;(1984), 'Efecto de B i o c i d a s Ei Ln Fluido de Covate". Faci. It ad de C i e n c i a s B i o l ó g i c a s

b.G.N.L. Méx co Tesis Inèdite).

3 0 . - L. Ce.eh. T., ' V _q ito pat ogenicity of Baci 111*

thuringiensis var. i s'ae 1 ens i s". Simposiuir: M i c r o b i a l

Control of Mosquitoes.

3 1 . - Marín, M. D; JM. Sánchez,Y. ; (1985) "Efecto del r i e g o con agua residual en la actividad m e t a b ò l i c a de suelos agrícolas" Facultad d e C i e n c i a s B i o l ó g i c a s . U. fi.N.L.

México (Tesis Inédita).

3 2 . - Medrano, G; JM. S á n c h e z Y. ; (1986) " S o b r e v i v e n c i a de Baci 1lus thuringiensis en r i z o s f e r a de frijol Paseólas

vulgaris Facultad de C i e n c i a s B i o l ó g i c a s . U. A.N.L. México (Tesis Inédita).

3 3 . - Mendoza, M. M.,JM. Sánchez, Y. 5 (1985) " R e s i s t e n c i a a fintibíóticos de Baci 1lus thuringi ens is Como M a r c a d o r e s Genéticos" Facultad de C i e n c i a s B i o l ó g i c a s . U. ft.N.L.

México (Tesis Inédita).

3 4 . - M o l l y , D - , P . ; Struble,R., H; (1989). "Invest igación of the feasibility of the microbial control of black flies

(Diptera: s1mul1idae) with Baci 1lus thuringiensis var. 1sraelensis in the Adirondack mountains of New Y o r c k "

3 5 . - Mulla,S.;B.ft. F e d e r i c i . ; (1982) "Field e v a l u a t i o n of the microbial insecticide &a ill thurmgiensi s s e r o t y p e

H - 1 4 against f l o o d w a t e r m o s q u i t o e s " . A p p l i e d and E n v i r o n m e n t * ! Microbi xoqy 43: 1.J88 - 129w>.

36. - F e ¿czar., Re id,. C h a n . , (19£ 1) " M i c r o b i o l o g í a " C u a r t a Edición Me. G r a w - Hill M é x i c o .

3 7 . - Pérez, 0. , C. ; R o d r i g u e z , T . , M . ; G a l á n , W . , L . ( 1 9 8 5 ) " E f e c t o de tres extract os de Baci11 us thur-ingi ens is en l a r v a s de Redes aegypti L. Culex pipi ens var. quinqué fascist us Say

(Díptera : culicidae) en c o n d i c i o n e s de l a b o r a t o r i o " . Folia E n t o m o l o g í a M e x i c a n a . 63: 7 5 - 81.

&Q.- Santos, Terreros J. G. ;(1990) " E v a l u a c i ó n de l a b o r a t o r i o y campo de un f o r m u l a d o a base de Baci11 us thuringiensis var. israelensis H - 1 4 De B a r j a c (1982). en larvas de fíedes aegypti Lineo y Culex quinquéfasciatus Say Díptera Culicidae" • Facultad de C i e n c i a s Biológ icas U. ft.N.L.

México (Tesis Inédita).

39,- Smith.A. R. . , ( 1 9 8 2 ) . ; "Effect of strain and medium variat ion on mosquito toxin product i on by Baci11 us thuringiens is var. israelensis ". J o u r n a l of

M i c r o b i o l o g y . £8: 1089-1092.

^0. - S., Fe 11 e 1 son, ; J. F'ayne, ; K. Leo; (1992). " Baci 1 lus thuringiensis; insects and beyond ". B i o t e c n o l o g y

Thanabalu, Thiruraaram; J. H i n d l e y , ; Barnner, S. ; (1992) "Expression of the mosquitocidal toxins of Baci11us thuringiensis subsp. j s r a e l e n s i s by r e c o m b i n a n t Caulobacter crescent us, a vehicle for b i o l o g i c a l control of a q u a t i c insect larvae". Applied E n v i r o n m e n t a l

Microbiology 58: 905 - 910.

Vandekar, M. ; H. T. Du linage. ; (1982) "Guide lains for production of Baci1lus thuringiensis H - 1 4 " P u b l i c by

U N D P / W H O Genova S w i t z e r l a n d .

W a r d , E . , S . ; Ellar,D.,J. ; (1988) "Single amino acido c h a n g e s in the Baci1lus thuringiensis var. israelensis 6 - e n d o t o x i n a affect the toxicity and e x p r e s s ionof the protein" Journal Molecular Biology 2 0 2 : 5 2 7 - 535.

Weinstein, S.,A. ; Bernheimer, A. , W. ; (1988). "Kinet ics of heraolisis induced by a toxin from Bacillus thuringiensis