El continuo asotanlento de l a s fuentes de nitr6gen0,que e s e l nu-

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(1)
(2)

I .~Ju:cIc..!

m o c u ~ ~ m

P A H ~ L Z G U L I ~ ! ~ ~ ~ .

I

J u s t i f l caci Ón.

El continuo asotanlento de l a s fuentes de nitr6gen0,que e s e l nu-

r

1

t r i e n t e d e l suelo que reauieren l o s seres vivos en mayor cantidad,

y l e necesidad de aumentar r l rendimiento en l o s cultivos,ha colo- cado a e s t e elemento en una posición c r f t i c a en l a producci6n a p f - cola y en l a f e r t i l i d a d d e l suelosya que una mercade d e f i c i e n c i a de

e s t e reduce l a produccldn y l a calidad de l a s cosechas.

3ebido a que l o s f e r t i l i z a n t e s pufmicos y los abonos or&icos

proveen e610 une fracción de e l t o t a l de nitrógeno necesario pera l a agriculture,el restante debe satisfacerse e p a r z i r de l a s reser-

vas d e l suelo y a través de l a f i j a c i 6 n b l o l 6 g i c e de nitróseino at-

nosf ;rico (Alexander 1980).

La f i j a c i ó n biolóalca de nitrógeno pueae ser l l e v e d e a cabo p o r :

I

.-

Clanobacterlas

2.- Becteries de vlde l i b r e

3 . - xsociaciones simbi6ticasscompuestas p o r una p l a n t a . y un microor- ganismo.

is

3e los sistemas anteriores e l que ni& se ha invesi;ii)E?do es l a sip--

bios18 -3hizobium-Leguminosas. i1

La forma más segura y econ6nIca para e l sfpicultor de proporcionar

4

I

2

:

f

a i a s leguminosas l a s rhizobla,ea a través del uso de inoculantes;

I

(3)

I

I

l

I

y un s o p o r t e que en general es turba,son apiicedos el monento cie l e slenbra y cuando l a s eenilllas germinan l a s bacterias invaden los pe-

l o s absorventea de l a s raíces, fomándose unes pequeiiaa protuberancias

llamadas n ó d u ~ o s , s l t i o donde s e l l e v a a cabo l a simbiosis y la f i j a - cidn biol6@ca de nitr6s;eno.h reiac16n simbi6tica. ocurre a medide que l a p l s n t a provee energfa para l a bacteria,convirtlendo estas al nitrdseno etmosférlco en emonlaco (If&.) que es metsbolizado p o r l e pianta para s f n t e s i s de protefnas,creclendo alzunas veces s i n l a ne-

cesidad de adicioner f e r t i l i z a n t e s a l suelo.

I

~

-

La inoculacl6n COI? bacterias ?&icobiun efec+lvae asesure. una pronte formec16n de n6dulos proauctivos y un suministro adecuado de nitrbge- no para l a s lepminosas durante su crecimiento, reservánaoio para cosc- ches futura6,ge que e s t a conprobado que e l contenido de e s t e elemento

-

s e ve amentado(h.ii. cloi.;OZ and 5 . 2 . ZAXDST.2. 1977),aumenta e l conteni-

do de protrfnas y disminuye l o s costos de producción.

-

(4)

Naturaleza.

La naturaleza de e l proyecto se considera Como epuCad8,ya que

los resultados obtenidos en laboratorio y en l o t e s experimente- l e s , cuando estoa son positivos,se aplican a l a producci6n comercial obteniéndose todos los beneficios ya mencionados, sobresellendo

e l aspecto económico.

Ob J e t i v o .

Losrar le. producclbn comercial de concentrados iricrobianoa(1no- culantee), cuya e f i c i e n c i a en l a f i j a c i 6 n de nltr6C;eno e s t e compro-

bada,logando con esto un dptinio desarrollo de l a s plantes 1e.m.I-

nosas,sustituyendo o complementando la f e r t i l i z a c i ó n a r t i f i c i a l ,

teniendo como consecuencia un abatimiento en los costos de produc-

cibn.

rrograma y Actividades.

xpoyo en l a elaboraci6n de inocuiantes en SUB diferentes fases;

(5)

De l o s p r i n c i p a l e s nutrientes vegetales que se derivan d e l sue- l o (N,P,K) e l nitrd-;eno es indispensable ya que es e l elemento fundamental de l a moleaula de protefna y por l o tanto es u? compo- nente clave d e l protoplasma de animales, plantas y microorganismos.

S i n embarzo, a pesar de su función c r i t i c a en l a nutrición v e 8 ~ -

t a l , e l nitrógeno es asimilado casi completamente en estado inorgá- nico en forna de amonio o nitrato. Por otro lado l a mayor parte de l o s materiales nitrogenados encontrados en e l suelo o que se @re- gan en forma de residuos vegetales e8 orgdnica y por 10 tanto no aprovechable

.

La reserva natural de nitrógeno es e l aire atmosférico (8Op de su composición es nitrdgeno), pero l a mol6cula de e s t e elemento es una de l a s más estables, eiendo necesario e l ronper l a molécula J

hacerla reaccionar con hidrógeno para l a formeci6n de amoníaco; y

l a formación p o s t e r i o r de otros productos. Este proceso e6 llama-

do " f i j a c i ó n de n i t d g e n o " e!: Pactiule a n i v e l industrial mediante s f n t e s i s qdmica (método de Haber-Bosch) que requiere de grandes

cantldaaes de energía para satisfaaer l a s condiciones de ten;peratu- r a y presión (400-500 Oc

,

1oo-x)o

atmóoferes;.

b f i j a c i ó n de nitrógeno tanibiin puede ser llevado a cabo por d i f e r e n t e s microosanismos que tienen l a capacidad de tranoformar

(6)

bajo condiciones normales de presión y temperatura; e s t e proceso recibe el nombre de f i j a c i ó n b i o l d g l c a de nitr6aeno.Dentro de e s t e proceso s e encuentra l a asociación planta-microorganismo

( f i j a c i ó n ~ i m M 6 t i c a ) ~ e n l a cual l a relacldn RhieobiuiQ -Legum1 no8 a ha sido la más estudiada.

La primera evidencia de que la8 ieguminoeas Incorporan nitrógeno "de e l a i r e " s e debe a J.B.BouseIngault en I838;en I889 H e l l r i e e e l y :;ilfatrh,describen l a penetración de l a s bacterias a l a s r a f c e s de l a planta fOrm&dose l o s n ó d d o s en l o s que se l l e v a a ce.bo l a

transformación d e l nitrógeno atmosférico a

TX,~

anoniaco) asii..iiabie por l a planta.

2

Este comprobado que mediante e l sistema ~ o b i q - L e ~ u m i n o s a no s e requiere de t a n t o f e r t i l i z a n t e como en otra- cosechas,de hecho algunas lejuminosae son capaces de f i j a r g r a d e s cantidades de ni- trbgeno incrementando el contenido de este element,o en el suelo (n.~.Gornez and ii.G.Zandetre

1977).

*Ún cuando ce.si todos l o s t i p o s de suelos contienen estos rnicrar-

I

ganismo8 no 8e puede depender de l a infecci6n provocada por l a s

cepas nativas, ya que muchas localidade6 tienen en forma &enert?l:

25p de c;lulas de b a j o grado de e f e c t i v i d a ü , 5 0 ~ de Ectividad mode-

rada y solamente 25% de c6lulp.s ccmpletanente efectlvas(A1exender 1980).

I

Por l o tanto para compensar esta d e f i c i e n c i a e l uso de Inoculantes d e a l t a calidad permite obtener a l máximo l o s beneficios de l a f i j a -

(7)

Antecedentes.

En

Nexico l o s primeros estudios sobre Rhlz ob- -Le,mlnosa fueron

llevados a vabo por Sánchez Elarroqdn y Casa8 Campillo en l o s 8110s

cuarentasí Casas Campillo 1944) .Loa Intentos i n i c i a l e a de produvci6n

de inoculantes para leguminosas fueron hechos por Carlos Casas C m - pillo y Hector Ro¿iríguez quienes en

I950

trabajaban en l a %omiai6n

I~Iaclonal del b . f z , l a cual estaba Interesada en Introducir el c u l t i v o

d e l a soya en Mdxlco y a p e t i c i ó n expresa de ;-si;a,elaboraron lnocu-

l a n t e con cepas de Rhizobium &ponlcum alsl&as en el estado de

Morelos, empleando como soporte turba nacional.%tos tz'ebajos fueron llevados a czbo en e l campo experimental de l a comlsldn,ubicedo en Xalostoc, Morelos.

-

rn e l a.&o de IS53 Caees cem:illoYSj8nchez Iiarroqdn y i?%rio Zapa-Le.

fundaron e l laboratorio Ao;rol&b,i5.X.,oon e l ob.ir.to de producir comer-

cialnwite inoculontes para fri J o l

,

soga, a l ? s . l f u , rkTcharo ,hcba, l e n t e j a ,

:T veza; errpicando cepas nativas áe -GAZOWiL?r;

,

::

t w b ? . n8cional .írs.te

producto Be re5i;istr-Ó con e l nombre de RhILC:.ik..,aí cuel eca produ(li8o

ae acuerüo e. 100 peuidoe reclSidos y bajo u11 e s t r i c t o control de ce-

lideci,ecte proáucto permanacid en e l mercaao cinco i l . i o ~ .

hb esta miama época se empezó a importer Inoculante de IC empreaa X i trayin.

En Ig55 los laboratorlos F i o r a &icrobIana,5.0., introducen NITiWBhC-

ilEL?,¿iesapexeciendo de e l mercado en e l

ano

de 1960.se desconoce que

(8)

Anderson Clayton en I9Ó7

para soya, f r i j o 1 , a l f a l f a y trébo1,empleando turbc importado de

Esc.

-

dos Unidos y cepas natives e 1ntroducldas.Este producto deseparecid en e l ario de 1970.

produce

el.

inoculente rf&Auuí,proáuci'ai

Los productores actuales de lnoculantes son l o s siguientes:

Qufmlco. LUCa.ve,b.h., e s t a empr>esa i n i c i o le. pro3ucclón en

I97T

ele- borando inoculante para alfalfa,soya,cacahuate, chicharoahaba y garban-

z o .

?hpresns X i t r e z i n , S .A.,empez¿i a prod.ucir inoculcntes en I i S 2 , e n Le ciuda3 d& Guadalajars.,Jcil..Este empresa elabora dos t i p o s de inoculac-

t e s , e l aranular que es envasado en bolsas de I O LJ. y en polvo envase-

dv en bolsas de p o l i e t i l e n o de 2 5 0 y . y de I &&en estas dos Últiaas

presentaciones e l inoculante s e acmpana con e l a:ülerente XIEUÜCA?, patrnte ae 15itroc;iii.

dímond 5namroch.Lsta ercpreaa pro3uce e l i n o c u l m t e DI&~i?:?O--?I~~

E p a r t i r %e F 7 5 , e s proaucido en ~uadalajara,Jel.,~ro.=iucE. psrt. i'riJoL

yaroanzo, soya,

tllf?.lr~,

en l a s presentaci ..mes &e polvo y ~ r m u l e i ~ ~ .- erivasacioc en bolsas de pali-etileno y papel :espectivax;ntc.

Otros proauctores de inoculantes .Mferent'es centros de ensenansa e inveetiEaoión corno e l c o ~ ~ g i o de postgraduados fie cnapinso,m cole- gio-kjuperior de Agricultura Tropical en Cbdenns, Tabae.co,Lz üX&:,Zl

Centro de Investigaciones y Estudios Avanzados, etc. elaboran solamente

(9)

Be v i ei ón Jun. J u l . bibllográf i c ~

1:uesireo e a

C NO1 J O

i i i s l a i e n t o y

p w i f i ceci

ón

L i t l e c c i ó n de

cepas en I nvernaae ro Caracteri zacióii ae cepas

se l e ccionndas iruebas en

ce'

; ci

(10)

-

. - I . - . . r '.-.

B l b l i oaraf I!&.

Alexander I:. 1980. i.Ilcrob?.ologfa d e l Suelo

Batthyany C. 1977. Lesume Inoculants For Latin fimericí,

Curiey 3.. ¿. ¿in; 2 . U. Burton. 1375. Agroiiorny Jouiai, 5 7 : 8Ci7-DC.E

Vurso Internacionzl de Tecnoio,fe de ñhizohiun. 1C.Z. Vole2i.o de Eost-

,gcduadoE

Uepertmentos de Sueios y Laboratorio. l%l. ;roLicitcd di^- r s g i s t r o de

productos. Dirección general de z ~ t e n s i ó n Agrícoia. 5. di. A. kA. ikxico

JoOTilez A. anü i-;. ir. Lanastra. 1977. 1 s mr.i:rsis o f t h e r o l e o?

c

(11)

, 3 1

..

-

1 -

(12)

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(13)

I

-f-

Gbjetivo.

L s y a r l a producción corrercial de inoculantes cuya e f i c i e n c i a en ~ ~ .~ ~~~~ -

ir Cijacidn d e l nitróseno este conlirobade, octenlendo con esto un

&;;.tiu:o

d e s a r r o l l o en l a s plantas leguminosas, eustituyendo o conple-

mentando l a f e r t i i i z a c i 6 n nitrogenada, teniendo coino consecuencia

u

;Ir,atiiiento en l o s costos de producldn. e ' j

. . - .~ .. ~ .~~ ~. ~ .. ~

. .

. . . ..~

_ _

. .

(14)

-

..-

- 1

La.s actividades que se desarroll&ron durmte l a prestación, Bel

a e r v i c i o b o c i a l iicplicaron trabajo en laboratorio,invwn&dero y

!

::-::yo.

t ~n el ieboratorio de r.eaiizo e i mwstreo,aisianisnto y ce.racterl

ziciÓn de cepas de .Shizobium provenientes de legminosas i-ecolecta- .?.xs en l a s l o c e l i d n d e s de Chelco Edo.cie Kéxico r: Parres D.F...

t

I,

t.

. !

n. n i v a l invs,nnaiíero s e efectuaron pruebas de nodiilzcidn en' legu-

~ S S ~c c i disposltivos S de 2.ibson pcra pláritulzs.Asf ~ ? . S I C O se de-

.i

~l. .

. . ~ ~

txminÓ l a efectividad de l a s cepas midiendo=en ias p l b t u l a s e l

i._i ,r+¿,eno tota1,por peso follar,utillzando las

;.d~m& s e l l e v ó a ccibo e l conteo y pesada de l o s n6dulos no s o l 0 de

;;:s ioc-.lidedes ya IEencioria-ic, sino fie toiios J.OS c:.mgoc exi:.epimnta

..zj L~:pizn¿ados p a r F d i I : & . . i o r otra p..r8e

sc

1 s ? i u cl z.UccU8.50

I t Jsrres de LeonErd ''!

..

4

-

..-, dtkiiienio a Ins semillas ~ ' ; i l i z e d e s en 1 , ~ s pruebas

cie

iiive-aadero

3' c;npo.

Zn cc.ropo s e determin6 1,s capacidad p

eficiezcie

de life:rnkes cs

pas cüiiio inocuientcs, cmijxmhioias co:n d'iferiiit,es E?v:iics d e f+rtiii - " YCICió:l.

.:oi bese a l o s resultados obtenidos se s c l e c c i m a r o i l e s cepas

qur producieron un m y o r crecimiento en l o s vegetales para elaborar

.c:m +las l o s inoculantes. -... . ..

(15)

intro8.ucción

.

I

i ~ princF,üles c nutrirntes ve;etaAes que se u o r i v x i del. sueio

( .J,Z,K ) e l nitrógeno es indispensable y a que es e l elemento fun- damental de la molécula de p r o t e f n a y por lo &to es

un

componente

clave d e l protoplasma de animales ,plantas y microorganisnos.

S i n embargo9a pesar de su función c r f t i c a en la nutrición vege- t a l , e l nitr6aeno es asimilado c a s i completamente en estado inor&, Eico en forma de m o n i o O n i t r a t o . Por o t r o l a d o l a mayor parte de

l a s r a t e r i a l e s nitrogenados encontrasos en e l suelo o que se agre-

san

en forma de residuos vegetales es orgánioa y p o r l o tanto no .a-

¿a reserva natural de nitrógeno es e i aire atmosférico ( 80 $ de

B U conposición es e i nitrógeno ),pero i a moiécd.a &e e s t e elemento

es une de las más eetablea,slendo necesario e l roxper - I f . - m l é c u l a - ---

Gar8 h c c e r l a reaccionar con h l d r b ~ e n o para l a formación de amoniaco

..

?

:'

1 2

cio

'

F i j a c i ó n de nitrógeno "9siendo f a c t i b l e a n i v d Iiidustrlal me-

d i r m t e n i 3 t e s i s qufmlca ( Kétodo de Eaber

-

3osch ) que requiere de

5re.naes cantidades de energfa p a r e +itIsfacEr'las condiciones de

tea

oStenclÓn p o s t e r i o r de otros productos. Este proceso es llana-

i

4

Le f i j a c i ó n de nitrógeno tmblén puede ser lievoda. a c m o p o r dl- f-i-renies mlcroorgmismoe que tienen l a capacidad de t r a n s f o m a r el r ~ t r ó s e n o moiecuiar a formas asirrilables para l o s vegetales bajo coa

l l c i o n e s noinales cie p r e s i ó n y t e q e r a t u r a , e s t e proceso r e c i b e el

.~

-___

(16)

nombre de 'I Fijaci6n biológica de nitrógeno 'l.Dentro de este proca

so EB encuentra l a asoclacidn FAlzoblum

-

Isgirminosa que ha sido l a

in& estudiada.

(17)

i ro2-xolÓn de lnoculantes para leguminosas

LI con<i'iiuo eSotnPiieni0 de 1;s i'urii'ccs íi. :jLu-*S;:.:o,Cile cs 01

nuti*iente d e l suelo que requieren l o s s e r e s vivos en mayor cantidad

2- i r i necesidad de aumentar e l rendluilento de 1:s cultivos,ha colocB

do +, este elemento

Z s r t i i i d a d d e l suelo,ya que una marcada d e f i c i e n c i a de e s t e reduce l r r ~ r o d u c c l ó n y l a calidad de l a s cosechas-

en una posición c r í t i c a en l a producci6n y

en la

Jebido e que el suelo s o l o provee Una fracción del t o t a l d e l ni

-ir6;eno necesario para l a agricultura, e l r e s t a n t e debe s a t i s f a c e r c e

por medio de f e r t i l i z a n t e s qufrnicos,sbouos or_;&icos y a travée de

i j r i j a c i d n biol6@ca del nltróseno &tnosférico.( AiZ&CdZ?

I980

)

La

f i j a c i ó n biologlca de nitróaeno puede ser llevada a cabo por:

I

.-

Clanobacteriae

2.- Scicterias de vida l i b r e

;

.-

ks-oéie.cI-eftes--sinSióticas,compuee~as por *Une planOa y un rricroog

3.;ilniamo.

La

forna más econórnlca para el a g r i c u l t o r de proporcionar el mi- tr¿r;eno a las leguminoeas,ee

a

trave8 d e l uso de l a inoculacidn.

ki

$ir biosis Be i n i c i a cuando las bacterias inv%e.$ los pelos a b B O r V 8 a

t e a de las rafces,fow&ndoee unas pequefiae protuberancias llamadas ? . ~ r ! u l o s , s l t i o don& ~e l l e v e & cabo La SiEbiosis y l a fijacibn bio-

i?;rcti de nitrógeno. La r e i e c i ó n simbi6tice. ocurre a medida que l a

j r a n t a provee enersfa para las bacterias, t r a n s f o r m ndo estas e l nA

-

. -._- _ _

r:;,no atmosférico en evoniaco ( IGH ) que es netabolizado p o r l a

(18)

n

c

koldad de a d i c i o n w f e r t i l i z a n t e s cl suelo.

nÚn cuando cas1 todos l o a tipos de suelos contienen Rhiz obiirg, no

,e puede ciepender d a l a infeccidn provocada por lsie cepas natlvaa,ys

vue muchas localidades tienen en forma general una lofnlma p a t e de :epas conpietamente e f e c t i v a s ( ALFDLGVEB 1980 ) e

P o r l o t a n t o a p a r a compensar e s t a d e f i c i e n c i a se recolnienda el

ueq

\

2 e inoculantes,producto con una concentración elevada de r n l z o b m

niaecfiioos y efectivos pzra obtener al m&imo l o s beneiiclos de l a

.O! ,*sclbn blol¿gica d e l nitrógeno.

. .

. . . . ..

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(19)

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. . -. - ~ =-=I=----. . -. .~~ ~ .

Ac t l v i dadee a deearrollar

.

Apoyo en 1a.elaboraciÓn de inoculantee - en sus diferente8 fases; que ~~~ iniglican trabajo de laboratorio,invernaderO' y cmpo.

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(20)

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. . -,., LL 4<iIE i e s o . ~ r o l l ~ i d e s .

lapa l a producci6n de inoculantee s e llevan a cabo varias a c t i a 3auc-s que abarcan diferentes métodos ,y técnicas que s e describen a continuación.

I.- 2ima de muestras y aislamiento.

f . -

La

t m a de muestras y e l aislamiento a p a r t i r de n6duloe de

a-

-&

xiiiosa,

veza común, y Phaeeolug vulgaris, f r i j 01, se i i e v ó a cabo en l a s loc@idades de Parres D.F.,g Chalco &lo. de iK&:ico.La r.:eiodo lozfa s e p i d a fue l a descrita por Vincent JiN.

I975

l a cual se des-

c r i b e a continuaciífn:

S e escogen i a e piantas ieaimiinosaa que presenten un óptimo ciesarrolo extrayéndose del suelo con todo y raiz,procedlendo a la seleccidn de

i::s n6dulos tomando en cuenta

su

tmano y color,teniendo que s e r es-

.

. .

¿ O S ~ j r ~ n d ~ s ~r-irtsedOS-. - ~

2.- L o s n ó ~ u l o s ~ a e l i c c i o n a d o e s e corten :?e le. r a í z procurcindo que ' .

quede adherida una pequeiia parte de esta con el f i n de f a c i l i t a r BU

manipulación.

>.-

Se lava e l nddulo con e l propósito de elimi7ar e l exceso de

tis

Fra.

.:,.- xl nóc?ulo es introducido en alcohol e t f l i c o a l 95 O; en un

tiempo

EO m q o r de 30 segundos y lues0 se emerge en una solucidn.desinfec-. i m t e de HgGl a l 0 I ' durante

5

minutos.'TaLibi& se puede u t i l i z a r

t'i1::. soiucidn desinfectante de Mpoclorito de sodio a l '7

-

8

3.

- -

L

~

- .~ . ~~ .

~ ~ ~ . . . ... ~~ ~ . . . .

(21)

i;? lcvan e n é r ~ F c ~ ~ e n t e , u t i l l z a n d o asua corriente o des.tilada,eg

~~ . - ..~~ ~

Gri 1 ~.~ ~.

5.- ñ1 nódulo es exprimido con pinzas de disección en l a forma más

a s e p t i c 2 p o s i b l e , extendiéndose e l jwo lechoso so'bre l a super?icle

ie ux o dos placas de. agar

-

le,vadura

-

manltol ( Fomiulaci6n en

tipsnlice )

.

7.- Incubar a 23 O c de 3 a 7 &as.

G u m 2 0 e l a i s l m i e n t o de 3hizobim de los n6daos no es inmeuiato

o se ' p e r t e de nódüi.0~ que han sido almacenados por un larso perio-

do de tiempo se recomienda.10 siguiente :

ni;i-ega un funaicida a l medio,que por l o ;Ienrr

O,OC2

/D

( ciclohexmina ),que ayuda a suprirnlr e l crecinlenLo de

honzos sobre todo cuando el aislamiento es de nóddos v i e j o s .

!

,..,

:I

~:

,

j

-4'

r~

-

. -. ..~ .

~ . . ~

1

-

..

Lcs n62ulÓs que i x n s i d o desecados deberán rehidratrrse con solu- : k

i

r:i.:, Eril:na y trEttorse de 12 m n w a a t e s l e s c r l t a .

. ..

2.11 .:";nerd s e recoi,:ien&a no b j z r i;-.anscurr-i.r u u c h o t.ieenipo de

ie, recoiecci6n a i ais1s;::iento ya que cuando esto pasa s e presentan

i?ro.:!iexaa de contaminaci6n y de creciniento. , .

(22)

rT

.-

Corscterfzación. i

cidn de Sram y prueba de cetolecteea,misntras que en e l invernadero

se hacen pruebes de nodulaclón en boiaas de crecimiento o con dís- ,I

;I

1 : ~ s ;

tivos

de Sibson pari. p l h t u l a s parcieltrento enceTrGdas. Zn est5 ;:

3

16lílt,in!o se p e r n l t e que l o s brotes de l a s plantas pueden crecer llbrs

zc:xte,nientras que l e s rafces eetan protegldae dentro de un tubo de ense.yo.

I

. E :i

(23)

C ar.t!.ct R r f s t i c a s de crecimi ent o.

~ .~

. .~

~~~ ~

ii

ie c u l t l v c c3n 13

. ..

.

i

!

1

u t l l i z a 3 o s para e l crecimiento de bcicterias,slEnüo l a levadura l e i'uen-

t e de crecimiento

m&

convenlente.Com0 fuente de carbono se usa p o r l o general e l manlto1,pudlendo s e r substituido p o r Glucosa, saoarosa,galas

i

'362 y mabinosa,estos dos Últloos u t i l i z a d o s pUra rLzobia: (fie l e n t o

,

. I

cr e c l r i ento. '\

3 medlo conplejo que se u t i l l z a conutmente basado en el extracto de

li

leva6ura ha s i d o dsi'inlcio FOP varias investi&cionss ( Vincent,IS70.Vlq

'i cent e t al.,IS79,Snerwood,I970 ) es conoclda ~OIIIO medio Levadura-l~lani-

produair una inhibicidn d e l crecimiento O una n o r f o l o z f a anomal( Ski=

er et a1..,1977

1.

a g u a s veces s e agrega r o j o congo,ei cuai tiñe a 10s

r'izobia~débilmente en t w i t 0 que l a s otres S2cterie.s t o n m . e l c o l o r con-.-.- .;.ryor l n t e n o i k d , p o r l o que e s t e colorante a p d a

c.

detectar contamlnan-

I6

'¿ol~.y .~.Lc.u1~-~9 inpor-t.an& no agregarle demasiada levadura que puede-. ~ . .

.i

i

.

~. 4.,es. !,

i.

: jl

C :

La f o m a c i 6 n de colonias en medio Ager-Levadura-~~i.ietol depende de s i le f o r m a de crecimbmto ea rápld+ o lente,pi'oCiucíendo l a s priseras,

tras que l a s se;unciae son ~rsainefite - 4 * . t ~ c ~ ~ s ~ - e c ~ ~ - € ~ I S ü ~ - Ii PO, !

I

t

,

c o l m i a s de 1-5 ~ í i l de dfametro en'uri lapso de '3-5 dfas a 23-28 c,mLen-

J. ~

circ:q*';tlendo e l sénero Lotononis e l n c u d produce c o l o i l i n s roeas.

(24)

1 1

.. -

-

. ~~

i T T

.-

G r i t e r i o de e f e c t i v i d a d y tratamiento de semillae.

._,_ . . . . ' :;ai3 , I ri'_-.-cto cn ?.:i..r~rr~&ero p:.ra &tt.i--- , . L ~ - m., l a efc.ctiv&

~~ 'iac d e &\izo31m para f i j a r nltrbseno ea a través de l a me~ici.6n del

nitróseno t o t d en plenta,peso f o i i a r , u t i l i z a n ü o

un

a i s p o s i t i v o CO-

nocido como

eriv:?se grande p w a contener 1 ~ s refces,un soporte i n e r t e y aec0,vey z-srulita o arella de ri'o y riego por Is parte I n f e r i o r con una solu-

ci6n n u t r i t i v a con el f i n de reducir l o s r i e s g o s de contaninación.

I' Jarra de Leonard modificada ",en e l que s e enplea

E l nitr6geno t o t a l e8 deteminado por e l método de Hjoldehl,y loa . .

n i v e l e s de nitrógeno en las plantas son comparados. con l o s eneayoe ;i:.tr.oj~nndos y con l o s testis;os,en b m e a l o s resultados

c i o n a n : l a s C Q Z S que kays-á~~ f::a¿o ~ L nayor L cawiüad de nitrógeno

. .

se selec-

-,

-

- -.

. . ,

~ .. c

Y eatae son llevadas e ensayoe

J E r r a de Leonard izodif'ic~da

_..-

a o t e l l a deafondada invertida 5.- &ens grueea de r f o

c

.-

,.;echa

.

.-

~ o i u c i h n u t r i t i v a 5.- Jarra

n

-

(25)

.

y c l s s i f i c a d a s por su peso. i

t

E .

: Son humedecidas con etanol a l

95

j% en un tiempo no meyor a 30 c: 1

1,

segndos.

5.'- b e smergen durante cinco ninutofi en HgCl2 e l 0.1 $.

4.- Son lavados con IO'camblos de a&a aestllada e s t é r i l para remo v e r e l HgC12.

5.-

Se colocan en agua d : z a n t e varias horas con e l f i n de que 68

eo: beban.

: I

I

j . - i3e pueden c o l o c z r . d l r e c t m e n t e dentro de los tubos de ensayo,

j u r a s de Leon&

,

papel f i l t r o húmedo pzra que germinen ,O en

c z j o s de p e t r i que contengan agar,invlrt$endolas para obtener gl&tulas con r a i c i l l e s derechas ;y unlforn?s, seirbrárido' e I B O C ~

i d o - inaediataaente.~

. .

LE mF.nira de inocular es l a de agregcr 0.5 r ; l do una solucldn

(26)

17.- Ehsayoa en campo.

A

-

_.

.,-*b'yJL :c f? 7 o r a t o r i o 17 en i--vsrne?zzo con S t i l e s tnnto

:<ara 12 identificacidn como para una primera evaluación de i s cap&

c l J , d sirnbiótioa de una determinada combinacibn Rhlzoblq

-

Huesped

B i n srnbprgo l o s resultados obtenidos a través de l o s eneayos de ce~p

1-0 leterminan la capacldad y e f i c i c n c i a real de una cepa como lno- culente y e s t o ea debido a que l a s condiciones existentee en e l auft

l o son mucho más complejes,por l o que el cOICPortamiento b a j o e s t a s

conciclones ( diferentes valores de píi, temperetwas, existenoie. de diferentes iones,coxrrpetencia entre cepas,etc.) tienen

un

meyor s i p . . L , i c a ~ o .1 .E práctico.

Para e l establecimiento de un en8eyo 8n campo se siguieron lo8 llniamientos que FZRITNEX ha deteraiioado,instructivc? anexo, eri este

t.t3 se.:Elan los objetivos, t i p o de f e r t i l i z a c i b n , t ~ e r ~ o de parcela expsriaientai -3- ei - _ diseiio - experimental que ee usaré,copo s e l l e v a r a a

cgbo la evaiuaciln y recozendaciones p a a e l mcneio c e el inoculante.

-

-.

t

(27)

HOJA IXFORhLATI',. A

-

Prusbac de selección en camp3 de c.-?as de Rhizobium

en el Estado de :

i

h

1.

-

Seleccionar cepas que bajo las cmdiciones prevalecientes en esta i;.;..:

para el cultivo de muestren capacidad

-

(28)

si&O cic sicmbra.

I

1

!

1

t

\

siguientes determinaciones: $ \

a).

-

Número de nóduloc par planta (5 plantas p r tratamiento)

1

I

i

8-

I

,Estas determinacion^s . . se efectuarán a los 45 dras de esta- Diseiio experimental.

-

El total de tratarnientos es de

,

el diseño cxpe-

rimental a emplear es I el de bloques al azar con cuatro repeticiones, cada parcela constará ae 5# surcos delOm, v de largo

.,

~ ~. ~.~ .

. . . . . . . . ..

..

..

(29)

1. -

E1

inarerial está distrib~ii~o ?n F:.suaes que coiiaideran.5 surcos

d ? 10 m de largo p a r a

ci>.Ur

rrat2rniento. Use un paquete p r tra-

tnmiciito y ci?cect-e ti c'i:':.::.:.

2.

-

Xnnténgase en lugar fri.s:o ( si e s pusible en refrigeracih) hasta

el momento de su empleo.

3.

-

Evite cualquier contacto entre Ics diferentes inoculantes para prevenir contaminaciones.

4.

-

Enjuague las manos con nlcoiiol csmún después de la a p l i c a c i h y

5.

-

Siembre priine.ro los trmnientcs que

no

lkvan inoculante, ,para

Es necesario proporcioiinr l a infcrmación solicitada en la hoja

.núrnei-o 1 a tiempo. *

-

siembra de cada cratainicnw cor1 r/inoculaiite.

evitar cbntnniinación. . ,

-

~.

~ ~ - ~ .

.

.~

o

e

(30)
(31)
(32)

FECH.4 OEERi'ACION '\

FECIIA DE SIEAlBRA

!

.

.

l!

'

REP.

. . .~

~~ __

. -

. ~.

.~

2: REP.

3: ,REP.

4: REP. i

, 8

k~

i

1..

..

LABORES REALIZADAS AL CULTn'O ,

f "i

. .

i : .FORMA Y,/O PRODUCTO !

I

F . E C

H

A

i

-

i

___. ~ . ._ .

. -... ..

~-

ACLARE0

DESI-IIERBES

CONTROL PLAGAS

-_._

OTRAS OBSERVACIONES: -

(33)

~ ~.~ ,'

. ,

. - y :~v.;:i:~c!í:; d . ~ 1 inocd.i.:it::.

.. .

Las cepas que han demostrado

k n

iogrzdo rendimientos por lo

una buena nodulacidn en campo y que menos comparables a l o s testigo8 f e r t i l i z a d o s s e Boleccionan para l a produccidn de inocuiantes.

LL r e q u i s i t o fundamental de un Inoculante ea l a de proporclonm a Is semilla un n h e r o e u f i c i e n t e de r i z o b i a aproplados,pera atmen t a r l a s posibllidades de una buene. nodulacrl6n.

Le

producción gene- raliiente es un proceso de dos ettqas:

I.- 3 e s e r r o l l o d e l rizoblo en

un

medio liquido

2.- r1Sep;raciin de l a turba.

Z1 r i z o b i o se crece en medio l i q u i d o agitado mecanicamente y 88-

reado y una vez que alcance su mtbimo crecimiento se mezcla aséptl-

cúmrnie con l a turba, l a cucl he sido preulemente molida, tzmízada,

:iiutr:.iizacia y e s t e r i i i z a ú a .

a

cuitivo se agrega en s u f i c i e n t e

:,m:idc3. p w e que 18 mezcla alcance una hmedad d e l 45

-

50 $

.

_ _

_ -

La

turba debe mantenerse en contfnuo moviniento mientras ae le eqrega e i caido,para e v i t a r que acforclen ~ & s .

t

..

m a vez mezclada se coloca en~bcndejas y s e cubre con p o l l e t l - .~

~ ~.

-

l e r i a , F i , r a e v i t a r un 8eczdo excesivo,durmte 24 l-iorss. A e s t a etapa

.. ..

-

. - . 7 , L L - G ~ I O C E cono " S:aduracl6n 'I.

- .

. . . ...

>or úitimo s e irezcie. riuevmente y se envasa ea, b o i s r s de p o l i e t i . . .

. . . . .

(34)

Peso sec: de parte aerea (ma) de Vicia Villosa, en e l primer corte, promedio d& cinco plantas.variedad Veza común, inoculada con

diversa8 cepas de iihizoblum Legumlnosarum sembrada en pares.

D.F. 1985.

1. 53 2. 55

3 . 56

4. 57

5. 58 5. 59

7. 14 8. 17 9. 18

10. N-F 11.0-P 12.0-0-0 I 101.5 99.7 101.7 93.2 92. 84.5 79.4 90.9 125.4 135.9 95.7

79 .á

I I:

82 “1

110 “8

90.2 87.1 92.1

104.4

111.8

124 e 9

91<,2

107 3

75-1 9‘2.8

I11

80 .r(

100.9 10ó .8

81.5 98.3 85.7 65.9 98 65.4 110.3 715.3 81.6 I V 105.4 11j1.6 d.9 65.2 89.1 119.6 81.6 51.5 75 -5 47.9 89.1 87.6 92.425 103.25 go .g 81.75 92.875 98.55 84.675

91 325

9 9 . 3 7 j .

100.35

83.3

(35)

Peso seco de noduloe (mg) de V I C I B V e l l o s a , en e l pi’irrer corte,

promedio Be cinco plentee. Variedad Veza común, l!,oculada con

dlvereae cepas de RhlzoSIum Lepmlnosau.;c, s e r b r d e en pares.

D.F. 1985.

I I1 I TI I

v

x

1. 53 2. 55 3. 56

.T. 57

5- 58

3. 59 7. 14 8. 17 9. 18

3.2

2 -5

3 - 1

1 .ó

3.7 3.2 1. 2.1 4.9 5.1 3.5 5.5 3 ;4

3.4 1.9 3-8 3.8 4.4 4.6 4 93

4.4

4.ó

4.7

2 -7 6.6

6 - 3

2.9 5.9 5.6 5.4 3.4 5.7 8.9 5.7 6.3 5.1

4 -7

4 -05

4.5 3.25 4.375 4.172

4 275 4.625 4.325

10 .K-P

o

.2 2.9 3.2 5.8 2.525

11 .c-P 2.3 4.6 5.3 6.5 4.675

(36)

.~~ .

. +

: .... z.1:: - 3 3 .

De las ocho cepae aisladas de culi3z3 de Parres D.F.,solzmente

RhizobiLuq 1 emnn~nosariurq en l a lo- cinco aprobaron l a s pruebas r e a l i - z e . 3 ~ 6 en 1nvernadero.Con estas se procedio junto con otras cuetro ccpzs procedientes de diferentes localidades de l a repiblica a eva- l u a r s u comportamiento en campo. Se probaron en Vlciz v l l l o s g , v e r i s

uail

veza conún. *

L i dlse,io e x p e r b e n t s 1 que s e escogió f u é e l Oe bloques el azar con cuatro repetlclones. Ceda parceie. conet6 de cinco BUTCOS de diez

:;,ct:-os de ierso. ¿a có,paciiici. y e f i c i e n c i a de

ii

y fijar nitrbgeno se comptir6 con una dosis de f e r t i l i z a c i ó n de 40 Hg. ....

de Ritrbgeno p o r hectárea. -

I I

LZ evaluación se i l e v 6 a cabo haciendo l a s sisuientes cietemina-

n 3 c.c ,

u - _ i - i /

.

I E J O seco de nódulo8

Y r s o seco de l a parte f o l l a r

iribero de nódulo8

3efi'jiiiri ento.

-

~~

3 e s t e s nueve cepas,solamente t r e s mostraron un rendimiento por

IC ::.ZZOS i f u a l a l o s tratri>ientoe fertilizados C O ~ nitrógeno. Siendo por lo tanto, l a s escoglC?is pera. l a producción de inoculantes.

-. .. . . . .

\\

.~

I

\

i

1 :

(37)

ll

1 -

\ \\

B

?

t

.~

I.

Los resultadoe obtenidos muestran l a posiñílidad de eliminar l a

.:iiciÓn de f e r t i l i z a n t e s nitrogenados en e l cultivo de l a s l e g & i n o ~ ~ .

t '

-

~ ~~

1

Y = ? S y s u s t i t u i r i o s por inocuiantes especific8s,~rayendo

esto

consigo

i n considerable abatirolento en l o a costos de produccidn.

i ! t 8, ! 1 _i_. . . .. . ~-.-

. ." .

..

..

. . . ~ ~. . . ~

. - --___. -II

~~ ~.

. .

1 ~

i

~.. - . -.

i

(38)

rlexander ?!.,1?80 .Xicrobiolo-;fa d e l suelo.John Viileg an0 Sons .Se- guncia edicibn.K&ico.

3ri11 t4inston J. ,1977.FiJeci6n b i o l ó g i c a de1 n i t d g e n o atGssférico.

..:i:::.?c%c y desarrollo.17 :

-

40.

:e.staiieda 3eyes h d r o , 19,34.Dleeiio de experimentos aplica8oe.Edito-

rial i'ri i i a s

,

segunda ecii c i ón

.

:.réxi c o.

; XI .z::

:

.

L. ai2d L. ;, .7. iirt on, 1975. U o q e t i b f lldad & e

331

z ob:- :eo oni-

-. >ai con protectores químicos de senili;;s.figonoi::g. Jo~imai.~3>7 : 0C7-

-, :.

(39)

H

ccrnt

;.:-.,

I982.L:itrogen Fixation i n Lesumes.Ach2enlc Prre8.Mew :or.-.

-ii

i

. !

-

.

...

.- . . . . -

(40)

rrpéndi ce

.

’\

(41)

ie;uLlinosas de mayor consuio en México

conservación de l a s cepas

.;u:ntif I caoi

6n.

.-

(42)

I/

10.0 gr

4.0 ,r

0.5 g

0.2 gr 0.1 C;r

15.0 g r

10.0 m i 501. zcuosa I:MO IOCO.0 01

El rojo congo B e e s t e r i i i z a por separado.

L i i:ieCiio se ajusta a PE! 6.8

-

7.Lt J s e c s t e r i l i z ’ a a I 5 l b

-

I21

O

i:

.~

. - ? ). I -

-

un’pe-*eo üri3. minutos.

Xedio Jensen pere. plentae.

!

I

(43)

3olv.ci6n d e oligoelenentos.

b a c t e r i a s toman e l c o l o r con mclyor intensidad por l o que se u t i l i z a para

Xzul d e Bronotinol.

i

23

eoiuci6n alcohólica a i 0.5 $,5 uL.,sirve para ínostrar utia diminución :21 px nicror :a 7 . ',

1 ..

t::

(44)

~~

~.

.

~~ ~~.

~ ~ .. ~~ ~

~~~~~~ . ~~.~ ~~ ~ . ~ ~ .

~.

. ,

..

~ ~ ~ - ~ ~ f i ~ ~ : ó n . - d e - ~ Q - . ~ -~ ~ . _ _ ~ . . . ~ - . ~~ ..

... . . .. .. . .

,!

!

. .

(45)

I.- Preparar e l f r o t l s :

Con e l asa previamente esterilizada en-sl mechero, dejando er@&

i

a r , s e toma l a muestra y se a p l i c a en e l centro de un portaobjetoe,

s i esta es lfquida se extiende a l o l a r s o y ancho,se seca al aire

y se f i j a con l a flama del mechero.

2.- C&rlr l o p f r o t i s cog c r l a t s l - v i o l e t a dhrmte UT. rolnuto.

\

I

i

porta-o-;jetos ~~~ ~~ ~ ... -con m a co-miente .. ~ . . . ~ ~ suzve ~ ~ Oe . . azua ~

.

. .

!

i

4.- A p l i c a r lu-;ol,yodoyoduro,dejendo peri-mecer este un minuto. ~ ~~.

~~

~~ ~

~~~~ - ~ -~ _ _ _ _ . ~ ~ ~~

5.- Laver como en 3.

~ .~

1

E.- Aplicar e l decolorsnte alcohol-cetona hasta que la t i n t u r a no .-

f l u y a .

7.- Lavar como en 3. ~~

8 .-Cubrir ‘ l o s f r o t i s con safranlnk durante 30 segundos

j

__

.. ~_.__

... . ~. .~ - ~ . .

~ . ~ 9.- Lavar y dejar eeoar al aire. .~

~ I _ ~~ I O

.-

Observar .ceda f r o t l s utillzendo e l l e n t e deLimer&h d e l

(46)

dentro de l a alimentación aon :

Nombre Científico

~ m s e o1 us vulnarla

Lena gsculentq

--

?ism sativuq

-

V W

fELd@

---

Cicer arietinm

sa

h?l4eer

i'achvrhizus 3rOsUQ

. . .. _ _ -.

DI i a explotación . asropecuaria y

. - ~. ..-_I

-

F.

-

Norribre COm&

Frijol c m h

Lenteja Chícharo Haba Garbanzo &ver j

6n

Jicama

en l a iLiduetria :

(47)

.-

Gonservecion. . -

. ~~ ~ ~~~~ ~

- c.!lricnr 6.e :? r in.2lixiari.o sori los m& csniunientea p o r su

para l a conservación ..aún ~. . ~~~

sircpiicidad y no presentan d i f i c u i t d , e i

cuondo s e mantengan a temperatura ambiente durante s e i s rr.eseb;mieB

t r a e que a baja8 temperaturae,2 Oa,de almacenamiento se pueden 0%

. . , .

i.

i

i

seTv;:,r' los c u l t i v o s h a s t a 3.0s e.rIos. La evaporación puede reaucirce : ~ . t i l l z a n d o tubos con tapas. de roma.

Ctra foi??na de preservar loa cultivos es e través de l a dosecaci6n

*'.

.. . i .

que me.ntiene LE c u l t i v o en condiciones geneticmente eetkbles. Sin

er;ibery;o 1::s rizobia,como l a mayorfa de las bacterlas grzm(-),son rg

4

i: :iv;.rente sensibles e l a .desecaciIn,>or l o

debF-,br

~. ~ _ _ a y P ? G r . ;' una cantidad a l t a de microorgenismos al i n í c i o de 18 desecación.

aentro de i a deeecación existen varios métodos coii~o:

i i o f i i i zación

r e r l e s de porcelana

-,.io desecado

.. .

(48)

. ~~

~ ~~ . -.~.;__..~ui.ntific ación. . .

5 , p cci'. 9

-.,.

. -

L,. -,>.*-b .^._

~ . .

2: r;.zc>iu

...-

c i r V ;.cru,-;i ie3 y no viablcs,pue- Cis i l e v w e a cabo por medio de la observacl6n microsc6pica,por turbl--

. . . _ - A 2 % 9

. ~-~ ~

~ ~~ ~~ -

_ _ _ _ . ~ . . ... ..

r . .

. ' I

i

dez(riide l a sustancia c e i d e r t o t a i ) , c o n t e o en p i m a y l e recuperaci6n ;

0. tráves de una s e r i e de d i l u c i o n e s ( d e L e ~ 1 n a n el nifmero de r l e o b i a .,:;vos y.

L El método

más

d i r e c t o pe.ra determinar e l núínero t o t a l de b a c t e r i a s

?', c o n s i s t e en usar una cámara de recuentos de Petroff-Hausser;en este es

::rcesario toner en cuenta e l lfmite de aplicecidn,ias dlLuciones efec- I

tutidas y l a cantidad de campos a contar.

~ , ' 8

& & - - i

¿a e s ' ¿ i i s c i S n de le turbkdez es converdente .psmyme&k+=+&-

i

~~~~ .-

"I:

t o t a l y puede s e r referida-, a i peso seo0 de i a e células o en condicio- nes dei'lnidas,al número de células.

-I conteo de r i z o b i a viables--pusde s e r p0r:Paies y I.;isra(ei? c a j a por I

.Z:otaj,

.i en.placa y conteo i n d i r e c t o p 3 r ihfecci6n. de plantas.Este Último

cn3.e de l a capacidad de ulla cepa de r l z 0 b J o e s g e c f f i c a ;>ma producir

n63,ulos en una especie determinada. de lepminosas y se asuxe que una cC1ul.a l e Rilizobium tnduce en los slreiedores d e l a rciz un n i v s l poblg .:::c?ne.l s u f i c i e n t e pera poder causar l a nogulaci6n(Srockriell ed al. ,1975). senclalmente en d t o d o consiste en l a inoculaci6n de plantaa pr-eba,cre

cizriñ,o aseptlcamente,con alfcuotas de una serle de'diluciones de una cg

I , - . c ?ro3~r'.n ,n&ero Be r i z o S i a en IC Z I U S Q ~ ~ X I p e d o s c r caicuic.do de i a

~ r o p o r c i b n de n 6 d ~ ~ o s fomaaos en l a s plentas en cada dilución y puede l i e v a s e a cabo p o r RQ(n6ne.k n k s ~ probable) y p a r las tablas. ' deFisher

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