El fabricante de productos cárnicos

Texto completo

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INTRODUCCION

..-

..

.

Antes del sacrificio, los tejidos comestibles de un animal sano se pueden considerar estériles. Se encuentran protegidos de la contaminación por la que funciona como Una cubierta casi perfecta. Normalmente, cualquier microorganismo que penetrase estas barreras serla destruido rápidamente por las defensas naturales del organismo. Tras el sacrificio, sin embargo, estos mecanismos quedan bloqueados, y los tejidos expuestos se hacen altamente perecederos.

(4

O)

Los tejidos animales quedan expuestos entonces a gran número de microorganismos como los de la piel o los del ttacto intestinal. (IO)

Tras el sacrificio las canales son enfriadas y después entra en los canales de distribución alimentarios. El despiezado y el recorte permiten a un gran número de microorganismos contaminar las superficies. (IO)

La refrigeración crea un medio selectivo

y

permite el crecimiento de sólo aqiieiloc microorganismos que son capaces de mliltiplicarse a temperaturas cercanas al punto de congelación del agua. El envasado al vacio de la carne con membranas impermeables al oxigeno se constituye en Una segunda limitación sobre el medio ambiente y permite el crecimiento de

un

número menor de microorganismos. El curado, el ahumado, el cocido, el escabechado y la fermentación son otros procedimientos que infltiyen en la naturaleza de la microflora alterante final. (IO)

El contraste con los microorganismos superiores, las bacterias incluyen un grupo de microorganismos extremadamente diverso. Varían ampliamente en cuanto a sus necesidades nutricionales, sus requerimientos de agua, oxigeno, pH, temperatura, etc. (IO)

Los

microorganismos termófilos son menos comunes en los productos cárnicos, se dan en ambientes con temperatura por encima de 40°C. Además, se pueden dar formas esporuladas de termófilos en episodios de alteración de carnes enlatadas o procesadas que no han sido enfriadas tras el tratamiento térmico o antes de su envasado o almacenamiento. (10)

La fermentación de la carne es un método que depende del metabolismo anaerobio de los azúcares, bien sean presentes o atiadidos, por bacterias productoras de ácido que hacen disminuir el pH del producto. Las bacterias ácido- lácticas que producen ésta fermentación están presentes como contaminantes de la carne con la que se elaboran estos productos, o son añadidos como cultivos puros tales como Lactobacillus o Pedioccocus.

El

fabricante de productos cárnicos fermentados dispone de una extensa variedad de cepas congeladas o líofilizadas. El objetivo es alcanzar un pH final de 4.6-5.0 suficiente para limitar el crecimiento microbiano. (IO)

El origen de los embutidos se pierde en la más remota antigüedad; se encuentran referencias especificas

a

ellos hasta 500 años antes de Cristo. Comenzaron a fabricar a escala familiar o artesana

lo

que resultó en un gran número de variedades asociadas con el nombre de los distritos o ciudades de donde procedían, por ejemplo Salamí de Génova, Salchichas de Turingia etc. (8)

(3)

los secos y semisecos, es consecuencia de las fermentaciones bacterianas sufridas, en tanto que en la manufactura de algunas salchichas, más comunes, como las tipo frankfurt, no juegan papel alguno las bacterias. (8)

Las salchichas frescas de cerdo. Bajo condiciones de refrigeración tienen una vida media más larga que las hamburguesas debido a que la sal inhibe el crecimiento de Pseudomonas, Moraxella y Acinetobacter. La conservación en refrigeración sin embargo puede desembocar en un agriado del producto debido al crecimiento de bacterias bcido-lacticas. Este sabor ácido, puede ser apreciado por algunos consumidores. También las salchichas Franckfurt de Bolonia U otros fiambres de carne. Aunque relativamente húmedos, la mayoría de estos productos tienen, vidas Sitiles en refrigeración de varias semanas, dependiendo de la intensidad del tratamiento térmico, de las condiciones higicirnicas en el envasado y de la temperatura de almacenamiento. Las temperaturas de procesado son generalmente silficientes para destruir las formas vegetaüvas. La alteración superficial en iiltima Instancia resulta del crecimiento de los microorganismos Gram positivos. (1 1)

Muchas de las bacterias alterantes pueden ser particularmente problemáticas debido a su capacidad de producir decoloraciones verdosas. Esta alteración se produce como consecuencia de la producción y acumulación de peróxido de hidrógeno procedente de la oxidación bacteriana de sustratos desconocidos en las carnes expuestas al oxigeno. El peróxido a su vez oxida los pigmentos cárnicos. Las bacterias responsables son todas las bacterias ácido- lacticas que no producen catalasa, el enzima que destruye el peróxido de hidrógeno. Las especies

más

implicadas en la decoloración son Lactobacillus viridescens y Leuconostoc sp. Las bacterias responsables de esta alteración tienen caracteristicas en común: Son psicrbtrofas, y as¡ capaces de crecer a temperaturas de refrigeración, toleran concentraciones de sal por encima del I O % , crecen tanto aerobia como anaerobiamente, pero producen H202 sólo en presencia de oxigeno, son catalasa (-) y son generalmente heterofermentativos.

.

Microorganismos saprofitos, preferentemente como la flora lactobacilar, con

(8)

su intenso potencial glucolítico, origina por ejemplo en los embutidos escaldados, y especialmente en los cocidos, una rápida acidificación como flora responsable de descomposición del mismo. (8)

Pero si se utiliza el ácido láctico con

el

fin de conservar al embutido se enconrro, que se nan aeieciaao oiieieiiit1~ ciwuua GII la UC~~UII~~IIIIII~WUII GII 1 0 9

siguientes condiciones.

A

una concentración de 1.25% (vol./vol.), en Un

tratamiento con ácido láctico, el conteo de colonias aerobicas (3 días a

30°C

y

5

días a 17%) fueron reducidos

un

0.8 log10 UFC comparado con un conteo inicial aproximado de 3.0 log10 UFClcm2 en carne control. Sin embargo, la reducción se incrementó a 1.31ogIO UFC a 14 dias después de muerto el animal, indicando algunas demoras en el efecto del ácido láctico. En una muestra en la cual se redujo hasta el 50% de enterobacterias aproximadamente.

(4)

(4)

Las bacterias ácido-lácticas son un grupo anaerobico, aerotolerantes, Gram-positiyas, no esporuladas en forma de raíz o cocoide, usualmente son no móviles, ellas utilizan carbohidratos fermentativos y forman ácido láctico como producto final. Estas se dividen en homo y heterofermentativas; las bacterias lácticas homofrementativas, producen ácido láctico a partir de azúcares hexosas, pero también produce tanto láctico corno hcido acético a partir de azúcares pentosas. Las bacterias lácticas son en general catalasa negativas, estas se subdividen tradicionalmente en cuatro géneros: Lactobacillus, Leuconostoc,

Pediococcus y Streptococcus.

Los

lactobacilos son un importante grupo asociado

con la carne. Los lactobacilos hornofermentativos son divididos principalmente en dos grupos, las Slrepfobactenas, con crecimiento a 15%, y las Therrnobacteh, con poco crecimiento a

15%.

(6)

Un método alternativo para producir ácidos orgánicos

in

situ, especialmente el láctico, es promoviendo

y

controlando la fermentación Iactica en la carne. (6)

El uso de Lactobacillus y Pediococcus como un método que se ha utilizado para preservar carne desde hace varios años, por medio de caldos inoculados en

los que crecen bacterias ácido lácticas. La vida de anaquel es incre.mentada por la producción de compuestos bacteriostáticos como el ácido láctico, que es tan bueno en la competición por

el

sustrato, que

las

bacterias lácticas sostienen con los rnicroorganismos patógenos e infecciosos. (6)

La actividad antibacterial de las bacterias ácido-lácticas pueden ser causantes de la disminución del DH Dor la presencia del ácido láctico producido, los bactenofagos y algunas bacteiiosinas son sintetizadas por las bacterias. (3)

Las bacterias lácticas poseen la capacidad de deteriorar a las salchichas tipo Viena empacadas al vacio, aunque al aplicarles un cocimiento efectivo (en un tiempo de 70 min. A una temperatura de

72%)

son incapaces de sobrevivir, pero se vuelve a recontaminar la superficie con el manejo inadecuado del producto y su empacado. (2)

El control del aumento del deterioro que provocan las bacterias productoras de ácido láctico en la carne procesada se dificulta, ya que esta bacteria es psicrotrofa, microaerofilica y resistente a los nitritos, sal y humo. La inactivación a altas temperaturas por la pasteurización que se lleva acabo al empacar es sin embargo una medida factible para su control y para aumentar la vida de anaquel de las carnes procesadas empacadas al vaclo. (2)

. .

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.

..

,. 1, , . ..I

I , .

. , I . ,~ ,

(5)

-

. OBJETIVOS

Objetivo general: Se llevará a cabo el aislamiento de bacterias Lácticas térmoresistentes de los embutidos cárnicos.

Objetivos específicos.

-

Conocer las bacterias Iácticas ooco productoras de ácido que se _ - encuentren presentes en los embutidos &rnlws.

-

Identificar las bacterias lácticas poco productoras de ácido y además que resistan temperaturas de 70°C.

-

Identificar las cepas de bacterias Iácticas por medio de pruebas bioquímicas.

METODOLOGIA

Paso O

Preparación de la materia prima (salchichas del supermercado) con las siguientes caracteristicas: que sean frescas, esto quiere decir que se encuentre dentro de su periodo de consumo. Las salchichas se muelen y diluyen en agua destilada y estéril.

Paso 1

Se inoculan los microorganismos en medios selectivos para bacterias lácticas (MRS).

Paso

2

Las bacterias qué se puedan aislar, solo serán capaces de producir cantidades pequeñas de ácido láctico. Las cuales se identificaran midiéndoles el pH por medio del siguiente método:

Determinación de

pH:

Pesar 109 de muestra.

Añadir 100mL de agua destilada y moler en la licuadora durante 1

.

Estandarizar el pH en el potenciómetro con buffer de fosfatos con Flltrar

la

mezcla de carne en manta de cielo para eliminar

el

tejldo

Despub de leer el pH de

la

carne, enJuagar

el

electrodo con 1-

2-

3-

4-

minuto.

pH

de

6.0.

conectlvo.

agua destilada.

DeterminaciÓn de acidez

(6)

2- Filtrar la muestra en manta de cielo para eliminar el tejido conectivo. Colocar el filtrado en un matraz de 250mL y aforar con agua destilada.

3- Tomar 25mL de esta solución y colocarla en un matraz Erlenmeyer de 150mL. Añadir 75ml de agua destilada.

4- Titular con NaOH 0.01 N, usando fenolftaleína como indicador. Esta determinación debe hacerse por triplicado.

5-

Se prepara un blanco con 100mL de agua destilada.

6- Informar % de Acido láctico: (7)

% de ácido láctico

=

VíNaOH) X NíNaOH) X Mea.lác. Láctico) X F X 100 peso de la muestra

Paso 3

Las bacterias que se aislaron se caracterizaran con diferentes pruebas bioquímicas para cerciorarse que en realidad sean bacterias Iácticas para continuar con el siguiente paso.

Paso 4

Una vez seleccionadas las cepas de bacterias lácticas productoras de poco ácido: se inocularán en un medio preparado para su crecimiento constando del agar MRS, para lograr sólo el crecimiento del inoculo de bacterias Iácticas seleccionadas. Este caldo después de ser inoculado e incubado se le aplicaran diferentes tratamientos térmicos en diferentes tiempos como

lo

indica la tabla:

Posteriormente las bacterias

Iadicas

se guardardan en congelación para su conservación.

ACTIVIDADES REALIZADAS

Durante la realización de

la

parte práctica

del

proyecto se llevaron acabo las siguientes actividades:

(7)

-

Posteflormente, se tomaron

1

mL de esa solución y se agregaron en Otros 9

mL de agua se le asignó dilución 10e-2, de igual manera otros I mL. de la dilución IOe-2 se mezclaron nuevamente en 9 mL. para la dilución 1Oe-3. Con estas diluciones (10e-I, 10e-2, 10e-3) se trabajó sembrAndose en placa de agar MRS, para el aislamiento de

las

bacterias ácido-Iácticas, a las cuales se les adicionó 0.1 mL. de cada dilución con una pipeta estéril (el sembrado se realizó por duplicado). Dentro de la caja en el agar, con una varilla de Vidrio y su punta curva, se extiende el liquido agregado (O.lmL. de la solución), tales cajas se incubaron durante 48 horas.

Después de transcurrido el tiempo de incubación de las cepas, éstas se depositan con una asa bacterlológica con ambiente estéril en dos tubos con caldo MRS para asegurar la selección y crecimiento de sólo bacterias ácido-lácticas; incubandose al igual que al tubo definido como blanco (sin inoculo), hasta llegar a una densidad Óptica de uno aproximadamente. Los tubos se retiraban de la estufa donde se incubaron, y en medio ambiente aséptico se vaciaban dentro de celdas para espectrofotómetro perfectamente limpias, con pipetas estériles, todo esto para leer en el espectrofotómetro la densidad óptica, a una longitud de onda de 640 nanómetros de luz visible. Era entonces cuando el caldo inoculado estaba listo para adicionarse en

un

matraz que contenía caldo MRS estéril, dicho paso se hace al 10% del inoculo; es decir por ejemplo, si se tienen 70mL. de caldo estéril, se adicionan 7mL. de caldo inoculado de bacterias Iácticas, incubándose de la misma manera que los tubos antes mencionados (hasta una densidad óptica de aproximadamente uno).

Una ves alcanzada la densidad Óptica del caldo en el matraz, éste se adiciona a carne de cerdo previamente picada (cabe mencionar que la cantidad de carne y caldo se saca previamente por el número de mediciones tanto de % de ácido láctico como de DH. Que se realicen). El caldo inoculado debe cubrir completamente la came

y

dejarse reposar en un lapso de 30 minutos. Posteriormente se pesa la came que se remojó en el caldo inoculado y simultáneamente se pesa tambibn carne sin inoculo que sirve como testigo. Ambas muestras de carne; inoculadas y testigo se dividen en pesos de 20 gramos y se guardan en bolsas de polietileno para depositarlas en refrigeración, a una temperatura de 4°C aproximadamente.

Estas bolsas se sacaron de una por una, tanto testigo como inoculada,

el

peso de cada bolsa se divide en dos paries de 10 gramos cada una para el análisis de % de ácido láctico y el de pH. (

Los

métodos de % ácido láctico y pH, se mencionan en la metodología)

Las mediciones se hicieron regularmente cada tercer día. Además esto re realizó por quintuple, para el aislamiento de cinco cepas diferentes.

(8)

.

-

crecer en tubos con rosca y que tenían agar inclinado MRS para SU

inmediata refrigeración.

En la caracterización se utilizaron las siguientes pruebas bioquímicas:

..

Prueba de la decarboxilasa

-

Prueba de la catalasa

L Prueba de motilldad

-

Prueba de reducción de nitrato Prueba de agar hierro y azúcar Prueba de reslstencia a la sal

Prueba de crecimiento en ausencia de oxígeno

-

-

-

Tambihn se Utilizó para la identificación la tinción de Gram.

Decarboxilasa: Esta prueba se usó para medir la capacidad enzimática de Un organismo para decarboxilar

un

aminoácido para formar una amina, con la consiguiente alcalinidad.

.

Esta prueba se fundamenta porque la decarboxilación que ocurre es el proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas decarboxilasas específicas son capaces de atacar a los aminoácidos en su grupo carboxilo

H), dando una amina o una diamina y anhidtido carbónico.

Las enzimas decarboxilasas son numerosas y cada una es especifica para un sustrato determinado, hay tres decarboxilasas importantes utilizadas para la identificación bacteriana son la lisina, la ornitina, y la arginina. Estas decarboxilasas son enzimas adaptativas o inducidas, son formadas por un organismo solamente cultivadas en medio ácido en presencia de un sustrato especifico, y los productos de la decarboxilación provocan una desviación del pH hacia la alcalinidad. La decarboxilación esta limitada a aquellos aminoácidos que poseen por

lo

menos un grupo químicamente activo que no sea una amina (-NH2) o un grupo carboxilo (-COOH), y la descomposición de los aminoácidos se

produce anaeróbicamente.

,

El aminoácido L-lisina sufre la descarboxilación para dar cadaverina (una diamina) y anhídrido carbónico por acción de la enzima especifica lisina-decarboxilasa.

Pruebas Bioquímicas

NHz-CH2-(CH2)2-CH-NH2-COOH ---+NH~-CHZ-(CHZ)PCHZ-NH~

+

coz

LlSlNA CADAVERINA

I

Se utilizó el medio de cultivo preparado (AHL) que contiene el

-

Se pesa la cantidad de medio necesaria con

I

aminoácido L-lisina, para observar la decarboxilación, con el cambio de color del medio.

exactitud.

I

(9)

* Se rehidrata con agua destilada y, se calienta Para su esterilización se lleva a 121°C durante 15

La incubación, como tiempo máximo es de 24 horas. suavemente hasta la disolución del poivo.

minutos dentro de los tubos con tosca, para una mejor

-

' Visualización de la prueba.

-

(9)

Catalasa: Se realizó para la comprobación de la presencia de la enzima catalasa.

Esta enzima se encuentra en la mayoria de las bacterias aerobia y anaerobias facultativas que contienen citocromo. Por

lo

general, los organismos que no poseen el sistema citocromo carecen también de la enzima catalasa y por

lo

tanto

no

pueden descomponer el peróxido de hidrógeno. La mayoría de las bacterias anaerobias poseen la enzima peróxidasa en lugar de la catalasa. Sin embargo, Doelle afirma que la prueba de la catalasa no es especifica y puede interferir en la acción de las enzimas peroxidasas.

anto las catalasas como las peroxidasas entran en la clasificación ica general de hidroperoxidasas. La catalasa es una hemoproteína: el grupo prostético está formado por cuatro átomos de hierro trivalente (Fe++*-ferrico) por moléculas que retienen su estado idado durante la

roducto terminal oxidativo de la descomposición aeróbica de los azucares. La flavoproteina reducida reacciona directamente con el oxigeno gaseoso por medio de la reducción de electrones, para formar peróxido de hidrógeno, y no por acción directa entre el hidrógeno y el oxigeno molécular.

La descomposición del perbxido de hidr6geno se produce a través de la accibn de

2

enzimas:

1)

Catalasa (oxidoreductasa del peróxido de hidrógeno), y

2)

una peroxidasa, nicotinamida adenindinucleótico (NAD) reducido, nicotinamida adenindinucleótico fosfato (NADP) reducido, citocromo C,

o

glutatión. En la descomposición del peróxido de hidrógeno una molécula actija como el sustrato y la otra como

un

dador; el sustrato reducido por loa átomos de hidrógeno cedidos por el dador, da como resultado un sustrato reducido y un dador oxidado.

ad enzimática.

El

peróxido de hidrógeno se forma como

un

HzOz

+

H

0

_----

+

Hz02

+

0 2 A Gasliberado Sustrato

H O

Dador

Dos

moléculas

de

perbxido ' de hidrógeno

Para esta prueba se utiliza perbxido de hidrogeno ai 30%.

(10)

.

I

-

del peróxido de hidrógeno sobre las colonias depositadas, observando de inmediato la reacción. (9)

hdotilidad: BLiscando determinar si un microorganismo es móvil O

inmóvil.

Las bacterias tienen motilidad por medio de sus flagelos, que se encuentran principalmente entre los bacilos (bacterias en forma de bastoncillo); sin embargo algunos formas de cocos son inmóviles. Los organismos no móviles carecen de flagelos.

Cultivo.- Ingredientes:

.

-

Extracto de carne 39

-

Cloruro de sodio 59

-Agua destilada 1OOOmL

-

Peptana 1 og

-

Agar 49

Su preparacibn es la siguiente:

-

Rehidratando con agua destilada.

-

Se calienta de una manera suave hasta su

Se distribuye en tubos con rosca, una cantidad de

-

Se meten los tubos en autoclave, para su

-

Enfriandose en posición vertical. La incubación es por 24 horas. (9)

-

Se pesan las cantidades de manera exacta.

disolución.

5mL por tubo.

esterilización a 121"C, durante 15 minutos.

-

-

Reducción de Nitrato: Se utilizó para determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos o en nitrógeno libre.

De alguna manera, la reducción del nitrato (NOf) en nitrito (NOT) y en gas nitrógeno (Nz) tienen lugar generalmente en condiciones anaeróbias, en las cuales un microorganismo obtiene su oxígeno del nitrato. El oxigeno sirve como un aceptor de hidrógeno, por ejemplo, el aceptor final de protones y electrones. La mayoría de las bacterias aeróbicas son anaerobios facultativos y sólo pueden reducir el nitrato en ausencia de oxígeno. Esta respiración anaeróbica es

un

proceso de oxidación por

el

cual las sustancias inorgánicas, especialmente nitrato y sulfato proporcionan, oxigeno para que sirva como aceptor de electrones para suministrar energía. En la reducción del nitrato, los citocromos bacterianos transportan electrones a moléculas aceptoras específicas.

Reducción del nitrato en nitrito.

NOs

+

2e-

+

2 H +

---+

NOz-

+

HzO

Nitrato Nitnto

Medio.- Ingredientes:

-

Extracto de came 39

(11)

-

Nitrato de potasio l g

-Agua destilada 1OOOmL

-

Agar 129

El

modo de preparación es el siguiente:

-

Las cantidades se pesan conforme Se muestra en el

Se hidrata con agua destilada.

Se calienta hasta lograr su disolución.

Vaciar en tubos de manera aproximada 5mL por tubo.

Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

-

Los tubos se colocan en una semiinclinación para poder sembrar en ai parte inclinada en la superficie y en la parte restante inocular por punción, hasta 2cm de profundidad.

Posterior a su inoculación se incuba unas 24 horas para un mejor resultado.

Agregar reactivos de nitrato, antes de hacer l a interpretación.

prospecto.

-

-

-

-

-

-

Preparación del reactivo, ácido sulfanilico al 0.8%. Ingredientes:

a) Acido sulfanílico (ácido paraamino bencensulfonico) b) Acido acético (5 N), 30%

Preparación:

8g 1 OOOmL

-

Disolver el ácido sulfanílico en menos de 1000mL de

Traspasar la solución a un frasco volumétnco de un ácido acético 5 N.

litro y agregar acido acbtico 5

N

hasta 1000mL

-

-

Guardar en frasco ámbar.

Este se agrega directamente al cultivo. (9)

Aoar Hierro

v

Azúcar: Determinando asi la capacidad de un microorganismo de atacar un hidrato de carbono específico incorporado en un medio de crecimiento básico, con producción o no de gases, junto con la determinación de posible producción de ácido sulfhídrico.

s e fundamenta básicamente por ser

un

medio diferencial en tubo que sirve para

un

doble fin: 1) determinación de las fermentaciones de

los

hidratos de carbono, y

2)

determinación de ácido sulfhídrico. Un organismo

,

puede utilizar diversos substratos incorporados en

el

medio; los diferentes

substratos metabolizados son utilizados para la diferenciación entre varios grupos, géneros o especies.

(12)

de Embden-Meyerhof, utilizado tanto por los aerobios como por los anaerobios para dar el intermediario clave, ácido pirúvico. A SU vez, este

ácido esdegradado por medio del ciclo de Krebs, por 10s aerobios o los anaerobios facultativos, para dar

cozi

HzO

y

energía. Ambos ciclos,

den etapas en serie que producen muchos intermediarios; en cada ntervienen enzimas especificas. La lactosa, es

un

disacárido formado por dos unidades de monosacáridos: glucosa y galactosa.

En la capa profunda del cultivo, existen condiciones anaerobias por

las cuales es metabolizada la glucosa a través del ciclo de Embden- Meyerhof, en ATP y el intermediario clave, ácido pírúvico, que después es convertido en varios productos finales estables; ácido láctico ylu otros ácidos orgánicos, aldehldos, alcoholes, COZ,

HZ

y energía.

GLUCOSA Acldos orgánicos

Ciclo de Embden Aldehidos

Meyerhof Alcoholes

Y energía

Anaeróbico COZ

+

HZ

Se utiliza medio agar hierro triple azúcar.

-

Se pesan las muestras de manera exacta. Su rehidratacibn es con agua destilada Se calienta suavemente hasta su disolución

-

Se vierte en tubos con rosca I

La esterilización es en autoclave a 115OC por

-

-

1

-

i

I

espacio de 15 min.

-

Con una inclinación se ponen a enfriar

-

La inoculación debe realizarse con asa

-

bacteriológica lincubarse por 24 horas a 36OC. (9)

Crecimiento en ausencia de oxígeno: Se utilizó para observar el crecimiento sólo de las bacterias anaerobias o aerobias facultativas.

Esta prueba se basa en utilización o

no

del oxigeno presente en el medio de crecimiento. Las principales bacterias con este modo especifico de .crecer en las cuales se cuentan las bacterias productoras de ácido láctico; que crecen tanto en ambientes con 0 2 presente o en ausencia del

mismo.

..

La manera

en

que llevó acabo tal prueba fue la siguiente. Cultivo.- Ingredientes:

-

Agar MRS

52.2

g

-

Agar bacteriológico 3%'

I

-

Agua destilada 1 OOOmL I

Se prepara de la siguiente manera:

-

Se pesan las cantidades de manera exacta.

su

calentamiento es suave hasta su disolución.

-

Rehidratando con agua destilada.

(13)

-

Se esteriliza en autoclave a 121°C por espacio de

Se vacía en cajas de petri previamente estériles. Inoculándose con asa en forma de estrias.

Se incuba a temperatura ambiente durante 48 horas 15 minutos.

-

-

-

en una cámara de vacío a -15 Kg./cm*.

Resistencia a la sal: Se utilizó para determinar la resistencia de un microorganismo a cantidades de elevadas de cloruro de sodio.

Se basa especlficamente, a tolerar cantidades importantes de sal y que su capacidad de crecer y reproducirse en condiciones adversas para su desarrollo.

Modo de empleo:

El

cultivo es similar al anterior con la salvedad de contener 6.5% de cloruro de sodio y se incuba a 36°C durante 24 horas.

También se llevó acabo la tinción Gram para la determinación de su morfologia:

Tinción de Gram: Se utilizó para encontrar las características moríológicas de las bacterias ya que se pueden observar utilizando microorganismos vivos o muertos

La tinción de las bacterias puede realizarse ijnicamente para revelar la forma, tamaño y arreglo de las celulas, para

lo

cual se puede aplicar una solución de colorante, esto se conoce como tinción simple. También se puede adquirir información adicional acerca de la morfologla y composición qutmica de las bacterias mediante el uso de tecnicas de tinción diferencial.

Lista de reactivos. 1

.-

Cristal violeta 2.- Colucibn de lugol

3.- Solución decolorante alcohol-cetona 4.- Safranina.

Procedimiento: Preparación de Frotis:

a) Tener las cepas de las bacterias listas.

Prender el mechero y esterilizar el asa al rojo vivo.

Enfriar el asa y tomar la muestra bajo condiciones estériles.

Colocar en el centro de un portaobjetos una gota de agua

Cubrir el frotis con dos gotas de cristal violeta durante un minuto. Lavar el exceso de colorante con agua destilada.

Cubrir

el

frotis con dos gotas de solución de lugol durante un b)

c) d)

a) b) C)

destilada y extender perfectamente la muestra. Tinción de las bacterias:

(14)

d)

e)

Lavar perfectamente con agua destilada.

Aplicar el colorante hasta que se observe que no fluye más

Lavar con agua nuevamente.

aplicar dos gotas de safranina durante 30 segundos. Lavar y tintura.

9

9)

h) Observar al microscopio. dejar secar al aire.

PRUEBA DE TERMORRESISTENCIA

En lo que a termorresistencia se refiere, se utilizó caldo MRS, 10mL para cada tubo (estos que contengan rosca), el caldo debe ser estéril, se inocularon cepas de bacterias lacticas aisladas, recién activadas de los tubos que se encontraban en refrigeración. Los tubos con caldo se inoculaban con dos asadas, depositándose en el caldo, para cada tubo e incubandose por las horas que fueran necesarias para alcanzar la densidad óptica aproximada a uno. Una vez alcanzado dicho parámetro se sacan los tubos de la estufa de incubación, se preparó un batio maria con temperatura controlada para sumergir los tubos en el agua caliente a estas temperaturas 40, 50, 60 y 70°C durante 510 y 15 minutos. Terminado el paso anterior, se procedió a sembrar el caldo tratado por las temperaturas anteriores, para medir el grado de sobrevivencia de la cepa involucrada. Utilizando O.lmL del caldo para cada caja (estas se hacen por duplicado) para cada temperatura dada y con SU respectivo tiempo de exposición al calor. El caldo una vez depositado en la caja petri y distribuido de manera homogénea con una varilla de vidrio con carácter de estéril. Las cajas se incubaron un tiempo de 48 horas para observar algún crecimiento preferentemente en las bacterias con una temperatura y tiempo mayor de exposición, donde entonces pueda hacerse

un

contéo claro de colonias.

Cepas para su posterior uso.

Terminado el aislamiento

y

caracterización, las cepas se guardaron

Conservación de las cepas: (medio leche) de la siguiente manera:

-

Leche descremada 1 oog

-

Extracto de levadura 59

-

Carbonato de calcio 1 og

-

Glucosa 1 og

-Agua destilada 1 OOOmL

-

PH 7

(15)

del medio leche, por 3mL de cultivo de bacterias lácticas en caldo, se mezclan y se guardan en congelación.

ación de las cepas: (medio MRS)

~ Caldo MRS estéril

-

Inocular con cada cepa e incubar por 24 horas. En pequeños tubos de plástico (pelets) de I m L

-

Se mezclan suavemente y se guardan en

-

adicionar 0.5mL de glicerol y 0.5mL de caldo inoculado.

CANZADOC

AI terminar el proceso de la parte práctica, se lograron cumplir los os trazados desde el inicio. Al poder aislar las bacterias resistentes que necesitábamos y que éstas, a SU vez cumplieran;

entre los productos de su metabolismo hubiera una baja cantidad láctico, como se pretendió desde

un

inicio.

ambién se cumplió la tarea de reconocer y caracterizar las bacterias Iácticas; éste objetivo se llegó a cumplir gracias a que las pruebas bioquimicas realizadas en el segundo lapso de la parte práctica del proyecto eran las adecuadas.

Se logró conocer el dificil comportamiento de las bacterias tácticas; las cuales presentan tanto en su crecimiento, asi como también en los productos de su metabolismo, como la cantidad de ácido láctico producido y en el tiempo de su desarrollo y multiplicación.

(16)

-

mediciones de la carne tanto inoculada/como la carne

,. I

*

-

\ .'

-

2 2 . . .

.;

-

1.5

o 1 , , -

-

0.5 .

I) resulta1 control.

-w- Control Inoculada

ntes de

Medición de pH ' .

!? c

2 8

___

Inoculada

E 6

-

m 4

0 2 .

l J 0 I

n 1 2 3 5 7 9

1 -Control

Dias

las

(17)

, . :.

1'

.

os de análisis de 16

~

dias y con 8 muestreos, de la cepa 2.

Medición de'pH

Io

:-Control I

a

E

-

a 5 i Inoculada'

___. .

_--

5

I O

-2

0

U

O

O 2 4 6

9

1 1 1 3 1 6

%.

Días

Producción de acidez

O

i 4 Control

0.5

1

, . . . Inoculada

. .

o

0 2 4 6 9 1 1 1 3 1 6 ~

s

,

Días :

, . .

,

, ,

, .

!

(18)

con un n h e r o de 5 muestreos.

de análisis de 6 dias

Produción de acidez

1

-

_-,

-a-- Conlrol Inoculada

y

0.5

2 3 4 5 6

Dias

i

.

! <

Gráfica V: La curva de producción de ácido se manifiesta desigual, en la que al final, después de pasar el periodo de disminución, vuelve a repuntar.

I

.

Medición de

pH

I

i

I m

'

I

-

Control

1

inoculada

~ - . .

(19)

, , ,

Medición de

pH

I

I

.' .i +Control

I

-

Inoculada J

.

2 4 6

Días

n

. .

, .

.~ .. ! ,

$ ,

Gráfica VIII:

El

comportamiento de las líneas se describe como regular, ~ . ' '

donde el comportamiento si se compara con la gráfica,ant ior la producci6 ácido se mantiene pero el pH de este gráfico dishinuye.

(20)

Producción de acidez

.E

2

-Control

--

. A

o - 1

1.

- !

Inoculada

2

1.5

$

0.5

- 0

s

3 5 7 11 14

-

Días

Gráfica IX: El comportamiento observado en la linea de produc-.5n es el esperado; con una cierta producción y aumento mínimo de ácido láctico y al final el decaimiento en la cantidad del ácido, por el deceso de los microorganismos.

Medición

de

pH

E 8

a

m

U

P

-

a 2

I O I

3 5 7 11 14

Dias

Gráfica X: La tendencia de pH obsewada es hacía arriba m pauta, de una producción de ácido Iáctico y tal vez la producción de productos del metabolismo de los rnicroorganismos.

(21)

. , 1 ,

. , .

Tabla 1: Se muestran las formas de cada cepa estudiada en el presente análisis,

así como también los resultados de la tinción de Gram. . , !

, ,' . .

(22)

-

RESULTADOS DE LA PRUEBA DE TERMORRESISTENCIA

:

40°C, 5OoC 60°C 5 Minutos CIC CIC CIC

10 Minlitos' CIC CIC CIC 15Mihutos CIC, CIC CIC

CEPA I

40°C 50°C 60°C 70°C

70°C NIC NIC NIC

.

40°C 50°C 60°C 5Minutos CIC CIC CIC 10Minutos CIC CIC CIC 15 Minutos CIC CIC CIC

70°C NIC NIC

N E

CEPA 4

40°C 50°C 6OoC 70°C 5Minutos CIC CIC CIC CIC 10Minutos CIC CIC CIC CIC 15Minutos CIC CIC CIC CIC

CEPA 5

40°C 50°C 60°C 7OoC 5Minutos CIC CIC CIC CIC

10 Minutos CIC CIC CIC CIC 15 Minutos CIC CIC CIC NIC

(23)

DISCUSION

viene

a

añadirse que, cuando se acentúa el picado, la contaminación de la masa es, por lo común, más intensa, y, al ser mayor el número de particulas troceadas, la superficie interna expuesta a la acción bactenana es mucho mhs grande.' (1) Por consiguiente algunas de las cepas, pudieron haberse desarrollado mas que otras

y

la producción de élácido orgánico en cuestión aumentó o disminuyó según sea el caso. Cabe mencionar que la carne de cerdo 'contiene una cantidad de carbohidratos fermentables de 0.3%." (5)

En cuanto al pH. Los comportamientos son variados, tal Vez pudo deberse a que los ácidos producidos eran no solamente el W d o láctico, sino la producción de otros ácidos orgánicos; para enriquecer el comentario se cita lo siguiente "Con esto hay que contar especialmente cuando se multiplican en gran cantidad microorganismos de acción acidificante intensa que forman ácidos de mal sabor u olor desagradable"(1) además, no solo

los

aeúcares pueden producir

los

ácidos

que se miden con el potenciómetro, si no "también a partir del metabolismo de las profelnas

y

grasas pueden generarse

ácido^.^

(1)Esto

sucede

por

lo

comentado producen quizás en menor cantidad, pero Igual o más fuertes que el láctico, lo cual hiciera influir en la medición del potendomefro. Ejemplo fiel es que, en

las

muestras control donde creció una gran cantidad de bacterias de todo tipo,

los

I

1

1

1

1

1 anteriormente (por la cantidad de azúcar dispuesta en la came). Los ácidos s e

b

(24)

n haber afectado de manera inusual la , ,

anto a SU comportamiento se

ia result6 . contundente para nuestros ber cual era .la teecistencia al calor de las aban desde, el inlcb ,mismo del proyect

Las. pruebas bioquimicas, lograron aportar algunos resultados valiosos, que se tomaron para'una parcial identificaci6ni junto con la tinción de Gram. Con lo.

Cepa

1

Lactobacillaceae o Pediococcaceae. Cepa

21

Lactobacillaceae o Pediococcaceae. Cepa 3; Lactobacillaceae o Pediococcaceae. Cepa 4; Lactobacillaceae

Cepa 5; Streptococcaceae o Leuconostoceae.

;

. .

cuál las cepas aisladas se podrían localizar en los siguientes géneros: . .

(25)

-

. .

I

presente proyecto de investigación, mos' decir que tanto los análisis realizados; como los conocimientos yudan a despejar la gran Incógnita que encierra la complejidad del hto"de las bacterias Iácticas, por eso algunos autores separan tales microorganismos 'de los demás, dedicándoles

un

estlidio aparte. Los objetivos trazados desde el principio han sido cubiertos, tal vez con algunos problemas,

pero ai firi y al cabo fueron solucionados.

En 'cuanto a las ' bacterias Iácticas, mencionaremos que los subgéneros

podrían conocerse I mediante otros anáiisis

y pruebas

más detalladas.

. ' Las pruebas ¿e térmoresistencla podrían darnos el punto de partida para la .

utilización de algunas de las bacterias que en éste proyecto se aislaron, ya que lograron' resistir casi de manera favorable la temperatura y tiempo de cocimiento de los embutidos, en los cuales, se podrían controlar tanto el desarrollo, como el e las bacterias, para la producción de bactetiostáticos como el ácido acteriosinas que ayuden al embutido a aumentar ciertamente su Vida que(, a temperaturas de almacenamiento similares a la del am

j . , .

I

I

'

. , , ,

\ , ,

. . . . .

(26)

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Figure

Tabla  1:  Se muestran las formas de cada cepa estudiada en el presente análisis,

Tabla 1:

Se muestran las formas de cada cepa estudiada en el presente análisis, p.21

Referencias

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