UNIVERSIDAD A U T O N ~ M A

(1)

J

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UNIVERSIDAD A U T O N ~ M A

METROPOLITANA

DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOL~GICAS Y DE

u

SALUD SECRETARIA ACAD~MICA

A QUIEN CORRESPONDA:

Por medio de la presente se hace constar que la:

del Departamento de BIOTECNOLOGíA

de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud, asesoró el siguiente Servicio Social:

TfTULO "CONCENTRACIÓN DE PROTEíNAS A PARTIR DE ALUMNA DE LEÓN GUTIÉRREZ ADRIANA

MATRiCULA 88338505

LICENCIATURA INGENIERíA DE LOS ALIMENTOS PERIODO

Dra. CONCEPCIÓN KEIKO SHIRAI MATSUMOTO

CRUSTACEOS

POR MEDIO DE

LA

ULTRAFILTRACIdN"

JUNIO 29, 1998 A JUNIO 28,2000

Se extiende la presente para los fines que a la interesada convengan, en la Ciudad de México, Distrito Federal a veintisiete de julio del dos mil.

A T E N T A M E N T E , "CASA ABIERTA AL TIE

3)

m,

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SECRETARIO ACADÉMICO J

3

1

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UNIDAD IZTAPALAPA

(2)

NOMBRE:

MATRICULA:

TELEFONO:

LICENCIATURA

DIVISIÓN:

UN IDAD:

TRIMESTRE LECTIVO:

NOMBRE DEL PROYECTO:

TITULO DEL TRABAJO:

LUGAR DE REALIZACIÓN:

FECHA DE INICIO:

FECHA DE TERINACIÓN: CLAVE DE REGISTRO:

ASESOR:

ALUMNA:

ADRIANA DE LEÓN GUTIÉRREZ

88338505

53-79-78-25

ING. DE LOS ALIMENTOS

CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD

IZTAPALAPA

00-0

PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE PROTEASASAPARTIRDEDESECHOS DE CAMARÓN.

CONCENTRACIÓN DE PROTEINAS A PARTIR DE CRUSTÁCEOS POR MEDJO DE

LA

ULTRAFLITRACIÓN.

ÁREA DE BiOQUiMlCA

DE MACROMELÉCULAS S-130.

29 DE JUNIO 1998

(3)

"D' %

28 JUNIO DEL 2000

Dr.

J. GERARD0 SAUCED0 CASTEÑEDA

Director de

la

División de

C.B.S.

P R E S E N T E .

Comunico a usted que he revisado el proyecto final de Servicio Social titulado

realizado por la alumna Adriana De

León

Gutiérrez, con matricula número

88338505, de la licenciatura de ingeniería de los alimentos, manifestado que estoy conforme

con

el contenido.

"PWICACIÓN DE PROTEhAS DE CRUSTACEOS POR MEDIO DE LA ULTRAFILTRACiÓN"

A T E N T A M E N T E "CASA ABIERTA AL TIEMPO'

(4)

28 JUNIO DEL 2000

Dr.

J. GERARD0 SAUCED0 CASTAÑEDA

Director de la División de C.B.S.

P R E S E N T E.

La que suscribe Adriana De León Gutiérrer, alumna de la Universidad con matricula número 88338505, de la licenciatura de Ingeniería de los alimentos, me dirijo a usted para justificar

él

por que hago entrega del reporte de Servicio Social con fecha posterior a la originalmente señalada.

Esto se debió principalmente a que tuve que atender con mayor rapidez todas mis materias por el tiempo marcado en mi carta de prorroga y por el tiempo dedicado al Paquete Terminal de la carrera.

(5)

JUSTIFICACIÓN

Y

NATURALEZA

DEI,

PROYECTO

Aproximadamente 30-50 % de camarón es considerado como desecho, tal como cabezas, colas y esqueleto, se busca recobrar productos de alto valor agregado a partir del desecho de camarón que ha sido estabilizado por fermentación ácido Iáctica.

El propósito de este estudio en particular es investigar la recuperación de proteasas a partir de desechos fermentados de camarón usando ultrafiltración por ser este un proceso importante para la fraccionación de proteínas debido a su alta eficiencia y bajos costos. Ya que es una operación importante en la industria que no afecta a éstas, debido a que se

lleva a cabo bajo condiciones ambientales, por lo que, resulta una alternativa viable para la concentración de proteínas de origen marino de alto valor comercial, esto debido a s u alta

efiencia. (Bellara and Cui, 1997)

El camarón es excepcionalmente nutritivo.

Es un

alimento con un alto contenido de proteínas y bajo en grasas. Debe mencionarse que sólo el 50% del animal es comestible y que el restante 50% está constituido por el cefalotórax, mejor conocido como cabeza, que

no es comestible. Esto da idea a los volúmenes de desechos del camarón producidos en

México ya que este se encuentra entre los 15 primeros productores de camarón de granja a nivel mundial y segundo en América Latina después de Estados Unidos con grandes expectativas de mejorar

.

Actualmente en México hay poca informacibn acerca del aprovechamiento industrial y de la riqueza del cefalotórax de camarón en lo que respecta a sus componentes (proteína, agua, fibra, pigmentos, etc.) lo que lo convierte en una fuente susceptible a ser procesada para obtener subproductos útiles en la industria alimentaria

La contaminación por el desperdicio del camarón ha traído consigo increíbles problemas porque los depósitos y efluentes de descarga del proceso son costosos, en varios lugares al reducir el procesamiento de desechos o los usos altemativos para estos desechos están

ganando popularidad como medios en la industria

(INFOFISH

1991).

La captura y crianza de crustáceos recientemente ha mostrado un crecimiento constante,

debido al importante mercado internacional para estas especies. Como resultado, la producción de desecho, principalmente conchas, vísceras y pequeñas cantidades de residuos de came, se ha visto incrementado.

El destino del desecho producido es principalmente desalojado en campos y el drenaje, causando problemas ambientales.

(6)

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El desecho del camarón se descompone fácilmente debido a las enzimas proteolíticas presentes y a los procesos de degradación microbiológicos.

Las enzimas marinas no han sido estudiadas y aplicadas como las otras, auque son altamente eficientes a bajas temperaturas, tienen muy poca estabilidad térmica y son activas y estables a pH neutro o alcalino. Se han propuesto varias aplicaciones, por

ejemplo la producción de hidrolizados de pescado y crustáceos, saborizantes, producción de peptonas para medios bacteriológicos y extracción de quithas (Shirai y col,

1996).

Las aplicaciones de la Ultrafiltración en el pescado y en la industria de alimentos de mar

apenas empiezan a emerger, pero un incremento en el número de estudios publicados o patentados sugiere desarrollos significativos en los próximos años.

E l desarrollo de las técnicas por membrana, son de gran utilidad particularmente cuando el propósito es concentrar y purificar bajo condiciones no extremas, sustancias de alto

valor agregado como lo son enzimas, hormonas y proteínas sin usar calor o químicos (Jaquen y Quemeneur, 1995).

Desde el punto de vista ecológico, el proceso de Ultrafiltración ofrece una solución al serio problema de contaminación que generan los desperdicios de camarón en las zonas de

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(7)

La Ultrafiltración (UF) es una operación que emplea membranas especiales en

diferentes tipos de arreglos para separar macromoléculas en solución de contaminantes más pequeños, por medio de un gradiente de presión.

Un

sistema de Ultrafiltración puede ser empleado con distintos propósitos entre los cuales

se pueden mencionar:

-

Concentración de una solución diluida

Diafiltración de una solución con solutos indeseables pequeños

Purificación de una solución que contiene solutos indeseables grandes.

En la Ultrafiltración donde el objetivo es la concentración de una solución, la solución retenida es el producto deseado.

La Ultrafiltración se utiliza en la etapa de purificación de caldos biológicos, además de formar parte de un conjunto de operaciones de membrana empleadas en diferentes etapas de los procesos de bioseparación.

Para poder describir de una forma más precisa este método es necesario poder conocer un

poco más sobre lo que es en si una membrana, como fue descubierta su utilización para la

purificación, además de sus aplicaciones(Mc GregorJ986).

Una membrana es una barrera delgada (0.05- pm de grosor) a través de la cual los fluidos y solutos o partículas son transportadas selectivamente cundo se aplica una fuerza a través de la barrera.

La fuerza puede ser:

i) Un gradiente de presión tal como la osmosis inversa (RO) ultrafiltración (UF) o microfiltración (MF).

ii)

Un

campo electric0 tal y como la electrodiálisis (DE).

Las membranas de Ultrafiltración y Osmosis Inversa se caracterizan por su corte, que indica el peso molecular más pequeño de componente retenido a un coeficiente de

retención dado, generalmente 0.90, el peso molecular expresado

en

kiiodaltons (KD). Las

membranas de microfiltración se caracterizan por el diámetro principal del poro.

Una membrana puede ser gruesa o delgada, su estructura puede ser homogénea o heterogénea, el transporte puede se activo o pasivo, el transporte pasivo puede ser conducido por presión, diferencia de concentraci6n o temperatura, las membranas pueden ser naturales o sintéticas, pueden estar cargadas o neutrales. Para obtener mayor conocimiento las membranas pueden ser clasificadas de acuerdo

a

diferentes puntos, Ia primera clasificación es por su rigen como membranas biológicas o sintéticas. Esta es la

distinción más clara (Mulder 1991)

(8)

El transporte a través de la membrana toma lugar como resultado de una fuerza que actuando en las componentes individuales.

En

muchos casos el grado de permea~ión a

través de la membrana es proporcional a la fuerza conductora, como por ejemplo la velocidad flux-fuerza que puede ser descrita por una ecuación lineal fenomenológica. La proporcionalidad entre el flux (J) y la fuerza conductora es dada por:

Donde D es llamado coeficiente fenomenológico de difusión y (dCa/Dx) es la fuerza conductora como el gradiente de X (temperatura, concentración, presión) o a lo largo de la

coordenada

X

perpendicular a la barrera de transporte.

Las ecuaciones fenomenológicas

no

son dirigidas para describir el transporte de masa,

pero además tiene que ser utilizadas para describir el flux de calor, el flux de volumen, el flux de momentum y el flux eléctrico (TejedaJ995).

El

coeficiente fenomenológico relacionado flux y fuerza en conocido como el coeficiente de difusión (Ley de Fick). Utilizando este ecuación el proceso de transporte es considerado como un hecho microscópico y la membrana como una caja negra.

En

efecto la naturaleza

de la membrana determina el tipo de aplicación, rango de separación de las partículas microscópicas a la separación de las moléculas de un tamaxio y forma idéntica.

Cuando las particulas con un diámetro mayor de 100 pn tienen que ser retenidas, es posible utilizar una estructura de membrana abierta la resistencia hidrodinámica de tales membranas es más bajo y más pequeñas fuerzas conductoras son suficientes para obtener fluxes más altos (Jaque and Queméneur 1995).

Una vez establecido hasta este momento que es una membrana y su funcionamiento

podemos adentramos a lo que es en si la Ultrafiltración y enfocarla en la recuperación de proteínas.

La Ultrafiltración utiliza membrana microporosas generalmente asiméhicas o anisotropicas para separar macromoléculas y particulas, de moléculas pequeñas y solventes. Las membranas anisotrópicas son las más utiiizada en ultrafiltración debido a

que las membranas porosas convencionales poseen una estructura tortuosa que provoca retención irreversible de partículas dentro de la matriz lo que dificulta su limpieza y rehuso.

Las membranas anisotrópicas tiene dos capas características: Una película delgada y densa de 0.1 a

1.5m

de espesor y bajo la película una subestructura microporosa de 0.1-1 pm que

(9)

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Las membranas utilizadas por Ultrafiltración se caracterizan por su Peso Molecular de corte (PMC), el cual es el peso molecular del soluto globular que es retenido en un 90% por

la membrana. El PMC varía entre 500 y 1.000.000 para la mayoría de las membranas de ultrafiltración, lo cual representa la retención de partidas de 1 a 10.000 qm de tamaño. Las presiones características de la Ultrafiltración son moderadas en el rango de 100 a 500Kpa. Las capacidades características son del orden de 10-200 L/m-h (ai flujo

volumétrico por unidad de área de membrana se le conoce como flux y se utiliza para especificar equipos de Ultrafiltración.

En los procesos de separación por membrana como lo es de Ultrafiltración se producen

gradientes de concentración de los solutos de la proximidad de la membrana, causado "Polarización de la concentración", lo cual por un lado puede incrementar el flux de

soluto, y por otro disminuir el flux del solvente debido a un aumento de la resistencia al

flujo producida por esta barrera de concentración. Asimismo, puede ocasionar una resistencia adicional debido a que puede estimular la interacción del soluto con la membrana ocasionando que esta se incruste con soluto. El flux del solvente a través de la membrana puede ser incrementado significativamente utilizando flujo cruzado o tangencia1 en lugar de flujo de extremo-cerrado.

La teoría de la Ultrafiltración está orientada a tratar de predecir el flux en un sistema dado

en función de los parámetros de operación como son: presión, temperatura, concentración de la solución

v

velocidad tangencial.

Es

importante señalar que la teoría de la

Ultrafiltración es de aplicación limitada, pero es útil en la interpretación y ext~apolación de los datos experimentales, así como de guía para la operación de los equipos (Tejeda, 1995).

El principal parámetro de diseño de un sistema de Ultrafiltración para concentrar una solución es el área necesaria para lograr una concentración determinada en un tiempo

dado, bajo limitaciones de rangos de presión y temperatura tolerados por los equipos.

La tecnología de membrana y en especial el método de Ultrafiltración ofrece mucho potencial para el tratamiento (tal como concentración, fragmentación y purificación de materiales solubles e insolubles) de los productos del mar. Además ofrece las ventajas de obtener un mayor rendimiento de producto (se recupera una mayor cantidad de filtrado), disminuye costos de manejo y pérdida de producto, ya que reemplazar varias operaciones de la clarificación tradicional y mejorar la claridad del filtrado.

De cualquier forma, las membranas casi siempre son asociadas con otros métodos de separación, generalmente constituyendo un paso intermedio para valorizar (aumentar el

valor del mercado) y mejorar tratamientos de agua.

En

el futuro se espera que las técnicas por membrana resuelvan problemas ambientales y

alcancen la crecientemente y estricta legislación concerniente a la contaminación industrial en varios países.

En

nuestros días, los procesos de membrana siguen complementando el proceso

convencional de tratamiento de aguas residuales que tienen un alto contenido de sales y

(10)

ANTECEDENTES

Los tratados sobre el papel que otorga la tecnología de membrana (MF, UF, RO, DE). Su aplicación y potencialización en el campo de la industria del pescado ha sido estudiada durante ya varias décadas debido a su importancia en la aplicación de alimentos marinos

y en la amacultura (Pascal y col, 1990).

Las primeras investigaciones realizadas sobre el método de Ultrafiltración fueron realizadas por Germany en el aiio de 1930 aunque su desarrollo en diferentes t6cnicas.y

procesos fue en el año de 1960 en USA para la concentración de macromoléculas (Mulder, 1991)

En

1970, Forbes menciona la posibilidad de utilizar el método de Ultrafiltración para

analizar el agua de desecho después de ser cocido y prensado el pescado.

En

1980 en los E.U. se mostró interés sobre la técnica de Ultrafiltración como un método

alternativo para el tratamiento de alimentos marinos así como el de aguas de lavado. (Tejeda, 1995)

En 1984 en una revisión sobre la tecnologíii de membrana de flujo cruzado, se indico que

una compaiiía procesadora de pescado en Minesota usaba ultrafiltración para fraccionar las proteínas y aceites a partir de la salmuera y rehusaba la salmuera en el proceso.

El

destino común para los desperdicios de crustáceos es prhcipalmente la 'fabricación de

harinas empleadas para la alimentación animal. Sin embargo, es posible recuperar productos de alto valor agregado como las proteasas de tracto digestivo de camarón. Las proteasas que provienen de animales marinos presentan características distintivas, tales como la alta eficiencia a bajas temperaturas, baja estabilidad térmica v son activas-estables

a valores de pH neutros alcalinos. Las aplicaciones de proteasas de origen marino son

variadas, así pues tenemos que se utilizan para reducir la viscosidad en soluciones de proteínas, en la elaboración de concentrados proteicos, salsas de pescado, obtención de pigmentos (astaxantinas), eliminación de piel de pescado, producción de saborizantes, desproteinización de residuos quiíinosos (Franco Correa y col, 1998).

(11)

OB

J E W 0 GENERAL.

-

Recuperación de proteasas a partir de desechos de camarón por el método de

ultrafiltración

OB

J E W O S

PARfiCULARzS

-

Investigación bibliográfica de aplicación de técnicas de Ultrafiltración para la separación de proteínas en organismos marinos.

Aplicación de la técnica de ultrafiltración con la utilización de una membrana de corte molecular de 10 kDa para la retención de proteasas presentes en el extracto enzimático.

Determinación de balances de masa y proteínas durante e l proceso de Ultrafiltración.

-

(12)

I

ACTMDADES R E A t I W A S

Se tomo un curso que constaba en hacer una investigación minuciosa del catalogo de la

base de datos del sistema bibliotecario de la UAM por medio del cual se investigo las bases AQUATIC SCIENCIE AND FISHERIES ABSTRACTS (ASFA), APPPLIED SCIENCE AND TECHNOLOGY ABSTRACTS, FOOD SCIENCE TECHNOLOGY ABSTRACE, CURRENT CONTENTS. Estas bases contienen publicaciones Mcnicas y científicas además de cubrir el área de alimentos y tecnología aplicada

a

los mismos.

Enseguida se realizó la búsqueda de información por medio de esta base sobre artículos que trataran los temas de ultrafiltración así como sus aplicaciones más

actuales en Ia recuperación de proteínas en animales marinos.

Ce

realizó la obtención del hornogenizado mediante la obtención del hepatopancreas del camarón.

Se aprendió el fundamento de la técnica empleada y se aplico para la obtención de un

permeado y un retentado los cuales fueron valorados mediante la determinación de

proteína por el método de Lowry-Peterson utilizando como estándar Seroalbúmina bovina para seguir con un análisis cuantitativo de la actividad proteolítica empleando

el método de Kunitz.

Posteriormente estos resultados fueron analizados por medio de una balance de masa y proteína.

(13)

CACEíNA: Se _pesa

lg

de caseína y se le adiciona 50 ml. De solución reguladora con el pH

deseado ( 7pH ). Se calienta la caseína a _bañomaria con agitación por 20 min.

Y

se deja

enfriar.

HEMOGLOBINA: Se disuelven 2g de hemoglobina en 100ml. De buffer Universal ( ácido acético, ácido bútirico y ácido fosfórico ), con el pH deseado ( 2 pH ) se calienta

a

50°C

con

agitación manual ( varilla de vidrio ) y se mantiene a esta temperatura hasta que se disuelva. Después se enfría y ajusta el pH, se afora a 100ml.

Estas primeras determinaciones se hicieron con el fin de dominar todas estas técnicas para su aplicadn posterior en la determinación de proteasas por medio de la Ultrafiltración.

ACTIVIDAD

PROTEOLÍTICA

La actividad proteolítica consiste en hacer reaccionar a las proteasas de la hemoglobina o caseína el 1 % ( p/v ), 10 min. 50°C. La reacción es detenida con ácido Tricloro acético al 5

% (p/v), centrifugando y determinando absorbancia a 280 qm del sobrenadante. La

unidad de actividad enzimática se definió de acuerdo a kunitz (1947) como:

"La cantidad de enzima que produce un cambio en la absorbancia a 280qm. de 0.001 por

minuto a las condiciones descritas".

-

Se etiquetan las muestras de la siguiente forma:

Hb = Hemoglobina

Ca = Caseína

B = Blanco

T = Testigo

M = Muestra

B i H b & H b

TiHb _'Tz Hb

MiHb M2Hb

BiCa &Ca TI Ca TzCa

M i c a M2Ca

1 ml de sustrato ( Hb y Ca)

Dejar 5-10 min. Hasta que estén a 30°C

Adicionar 0.15 mI. de extracto a los Tubos Muestra y dejar incubando durante 20 min.

Parar la reacción adicionando 2 ml. de TCA al 5% a todos los tubos ( Blanco, testigo y muestra ).

Adicionar 0.15 ml. de extracto a los tubos testigo. Adicionar 0.15 ml. de buffer o agua a los tubos blanco. Mezclar

Distribuir en eppenderff o viales y centrihigar por 20 o 30 min. Tomar sobrenadante y leer en espectrofotómetro a

l.

= 280 qm.

(14)

DETERMINACIÓN DE PROTEfNA POR EL MÉTODO DE LOWRY

El método de Lowry modificado por Peterson (1977) se utiliza para determinar la cantidad total de proteína presente en una soIución, utiliza ceroalbúmina bovina (Sigma, San Luis Missouri) como proteína estándar en un intervalo de concentración de

O

a 200

mg/ml.

Permite un análisis cuantitativo usando una medida de absorbancia de luz visible (750

qm). El mecanismo atrás de la prueba es que se forma un complejo cobre-proteína además del reactante A. Después este se reduce con la adición del reactivo

B

para formar un compuesto instantáneamente azul. La intensidad del color está en proporción a la cantidad de proteína presente en la muestra original (Peterson 1977).

Preparación de reactivos.

Reactivo A

Se prepara a partir de cuatro componentes.

Se adicionan cantidades iguales (250 mi.) de Carbonato Tartrato de cobre, Hidroxido de Sodio 0.08 molar, sulfato de Sodio Dodecyl al 10% y agua. Esto se puede mantener mezclado en una botella de ámbar por cuatro semanas.

La solución debe ser calentada en baño maria para disolver cualquier presiitado en la botella.

-

Para 250 ml. disuelva 25 gr. De Carbonato de Sodio en 50 ml. de agua destilada y agregue despacio mientras agita. 25 gr. De Sulfato de Cobre y 0.5 gr. De Tartrato de sodio y potasio

predisuelto

en

125 ml. de agua destilada. Se afora a 250 ml. en una matraz volumétrico.

-

25 gr. de dodecil sulfato de sodio al 10 % se afora con agua destilada en un matraz

volumétrico de 250 ml.

250 ml. de Tartrato Carbonato de cobre ( CTC ).

250 ml. de Dodecil Sulfato de Sodio ( SDS ).

-

Se disuelven 8 gr. De NaOH EN 200 ml. de agua destilada y se afora a 250ml. en una matraz volumétrico.

-

Los cuatro componentes se mezclan y se aforan en una matraz de 1000 ml. para posteriormente ser colocado en frascos de bnbar para evitar cualquier reacción por efecto de la luz.

250 ml. de Hidróxido de Sodio 0.08 molar.

(15)

Reactivo

B

El Foling Fenol es disuelto en agua destilada en una proporción 1 : 5

(1

de foling por 5 de

agua) y se mantiene refrigerado en una botella color ámbar.

Se debe tener cuidado con esta solución debido a su naturaleza cáustica, por lo que se recomienda ser preparada unos minutos antes de ser utilizada.

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA (Lowry

P.)

-

₂₅_{mg de proteína}(BSA Seroalbúmina bovina) se diluye en 250 ml. de agua destilada (0.025 gr. en 25 ml de agua).

Posteriormente se realiza la preparación de tubos.

-

Una vez etiquetados los tubos y con sus respectivas concentraciones de proteha se

agrega 1 ml. del reactivo A a la serie, agitando e incubando a 30 "C por 10 min.

0.5 ml. del reactivo

B

son adicionados a la serie una vez concluidos los

10

min. Esto con

agitación e incubando a 30 "C por 30 min.

Se lee en el espectrofotómetro a

750

qm (visible) utilizando como blanco el primer tubo

de la sene.

-

(16)

Se prosiguió con la realización de curvas patrón utilizando seroalbúmina bovina como

estándar hasta llegar al dominio total de la técnica.

PREPARACI~N

DEL EX?~RACTO ENZIMÁ'IICO

Con el dominio total de las técnicas antes mencionadas se realizo la preparación del

extracto enzimático para el cual se utilizaron cabezas de camarón que fueron adquiridas en la central de abasto de la Ciudad de México. Se eliminó el exoesqueleto y se extrajo el

tract0 digestivo (ñepatopáncreas, intestino, y estómago) de forma manual. El hepatopáncreas se homogenizo con buffer de fosfatos 10 _{molar (fosfáto dibásico}

y

monobásico de sodio, J.T. Baker, México) pH 7, en una proporción 1 : 4 de peso húmedo

/

volumen. Posteriormente, se filtro el líquido obtenido

en

una centrífuga a 15.000 g 10

min. A 4" C (BECKMAN JZMI, E.U.A.), el sobrenadante se u&ó para las siguientes etapas.

I,IOFILIZACI6N

Una vez que se ha obtenido el extracto enzimático u homogenizado, se congelo con

nitrógeno líquido y posteriormente se liofilizo (LABCONCO, Modelo 77510, E.U.A.) por aproximadamente 24 horas, hasta obtener un producto totalmente seco.

ULTRAFILTRACI~N

Para este proceso de purificación de proteínas se utilizo un flujo tangencial con membrana de corte de peso molecular de 10 kDa (Millipore E.U.) para evitar un gradiente de concentración por la proximidad de solutos en la membrana, obteniendo mediante este proceso un permeado y un retenido que hie determinado mediante un análisis

cuantitativo de la actividad proteolítica y se aplico el método de Lowry-P. para cuantificar

la

cantidad de proteína presente en la muestra.

(17)

RESULTADOS Y DISCUSIONES

El extracto enzimático es liofilizado para su concerva~ón y mayor manejo, sin que se vea

alterado

su

valor nutritivo y características organolépticas.

2 gr del extracto enzimático liofiíizado fueron resuspendidos en 200 mL de agua

destilada para ser concentrado por ultrafiltración con una membrana de corte molecular de 10 kDa y obtener así 113

mL.

del volumen inicial como permeado y 83 mL. como

volumen total del retentado con una perdida final de

4

ml.

U

LTRAFILTRACId

N

Fig 1. Aplicación de ia t b i c a d e Uitninitrsción

Se optimizaron las condiciones para la aplicación de la Técnica de Ultrafiltración

Retentado

Bomba Bomba de Pennudo

Recirculación 113 ml.

A L I M E N T A C ~ ~ N

0.01 grl mi ( 200 ml )

Gmf 1 Diagrama de cambio de Flux con respecto al tiempo

0.014 o'o16

1

P----

-

0.012

5

i 0.01

3

0.0%

I

2

0.008

=

0 . w

5

0.002

O 5 10 15 20 25 30 3s

(18)

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En la gráfica 1 se aprecia la disminución del Flux definido como el flujo por unidad de área con respecto al tiempo debido a la polarización que existe en la membrana.

En

los procesos de separación por membrana como lo es la ultrafiltración se producen

gradientes de concentración de los solutos en la proximidad de la membrana causando "Polarización de la concentración" lo cual puede disminuir el Flux debido a un aumento de la resistencia ai flujo producida por esta barrera de concentración (Tejeda, 1995)

Otro factor que controla principalmente la velocidad del flujo de los solutos en las membranas es su composición química (o estructura molecular) la cual debe retener eficazmente los solutos y poseer una vida útil muy larga. Las membranas empleadas para la aplicación de esta técnica se fabrican principalmente de acetato de celulosa, de una mezcla de ésteres de celulosa (acetato-propionato-butirato), de poliacrilonihilo, y de poliaminas o poliuretanos. Estos materiales son muy estables y de una gran resistencia mecánica, lo que les permite soportar presiones de trabajo sin que se modifique su

permeabilidad. Los principales factores que determinan las propiedades de las membranas son el material empleado y el método de fabricación (Fellows, 1994).

Para este efecto se aplico una membrana de corte nominal de peso molecular de 10 @Da) por ser útil particularmente en soluciones concentradas de proteínas.

Cabe mencionar que el principal parámetro de un sistema de ultrafiltracibn para

concentrar una solución es el área necesaria para lograr una concentración determinada en

un tiempo dado, en este sistema el área se mantuvo constante (600 cm ) para apreciar principalmente la disminución del flujo con respecto al tiempo.

D E T E R ~ I N A C I ~ N D E ACTIVIIM~D PROTEOL~TICA

El análisis cuantitativo de la actividad proteolítica en el extracto crudo retenido y permeado se determino mediante ei método de Kunitz (1946) el cual define la unidad de actividad enzimática como " La cantidad de enzima que produce

un

cambio en la

absorbancia a 280

n m

de 0.001 por minuto en las condiciones descritas, por lo que fue

necesario tener previamente los dos sustratos (caseína

p H

7 y Hemoglobina

p H

2) en opümas condiciones así como al reactivo TCA (ácido tricloro acético) para que

no

existiera

ningún tipo de interferencia en las concentraciones que pudieran modificara los resultados.

(19)

La

siguiente tabla (4) muestra los resultados obtenidos y se puede observar una mayor

actividad en caseína que en hemoglobina esto puede deberse a que las proteasas provenientes de animales marinos presentan características específicas hies como eficiencia alta a bajas temperaturas, especificidad al sustrato y son activas y/o estables a

valores de pH neutros y alcalinos (Franco y coi., 1998). El pH utilizado en caseína es-de 7

lo que hace que la enzima sea mas activa o estable y que presente mayor afinidad por este sustrato. El pH de acción de la enzima es un criterio importante que debe ser considerado.

La proteasa elegida debe funcionar bien en el

p H

del sustrato en el que se va aplicar.

La proteasa es definida como la enzima hidroiítica que cataliza el rompimiento de uno o más enlaces peptidicos en las proteínas.

La actividad de una enzima se ve reflejada por la cantidad de proteína que se encuenka en una solución y la acción de esta enzima según la definición de Kunitz produce un cambio en la absorbancia a 280

nm

de 0.001 por minuto.

Las proteasa debe ser suficientemente activa y estable a la temperatura del proceso. La temperatura a la cual fueron sometidos los dos sustratos fue de 30 "C por lo que la temperatura no se puede considerar como un factor que haya irúiuido en los resultados

por tratarse de una temperatura media, sin embargo las proteasas marinas presentan mayor eficiencia a bajas temperaturas.

~~ __ __ -~ . . ~~ ~ ~

151.39 3.29

LIOFLIZADO 145.67 3.17

PERMEADO 29.19 18.05 128.87 79.7

2273 514.26 3255

-IDO 359.01

_ _

~ ~_____ ~

-

_._

En

esta también se aprecia la misma tendencia en el caso del permeado, en observar una

mayor actividad de la enzima por la caseína que por la hemoglobina, sin embargo la actividad de estas enzimas no muestran diferencias tan significativas en los dos sustratos;

(20)

P u r ~ * ~ ~ , , , ~ i m i i , ~ r i t t ~ i rtiiii icm (1, pr~~it,~\i+,a ipsrt(r il< <I, +I 111 * < I t iilnlitri>ll

Es importante mencionar y puntualizar todos los factores que intervienen para la obtención de los resultados presentados en esta tabla; un punto importante que se considera también en los sistemas de ultrafiltración son las membranas que se emplean ya

que estas se caracterizan por su peso molecular de corte, el cual es el peso molecular del soluto globular que es retenido en

un

90% por la membrana.

Este

peso varía entre 500 y

1.000.000, io cual representa la retención de partículas de 1 a 10.000 nm de tamaño. Para

estas determinaaones se utiiiio una membrana de corte de peso molecular de 10

kDa

lo que implica que la membrana permitió el paso de aquellas moléculas cuyo peso molecular fue menor o igual a i poro de la membrana, reteniendo aquellas moléculas de mayor peso

(21)

DETERMIMCI~N DE

mmím

CURVA PATRON LOWRY

I

#TUBOS

I

Abs.

1

(22)

T A B U DE RESULTADOS

La siguiente tabla muestra los multados obtenidos mediante la aplicación del método de Lowry

modificado p o r Peterson (297) el cual se u t i l i para determinar la cantidad totai de proteína presente en una solución, utilizando seroalbúmina bovina como proteína estándar en un intervalo

de concentración de O

-

200 mg/mL.

Tabla 5. Cuantificación de proteína p o r el método de Lowry P. para el extracto fresco, liofüizado, permeado y retenido utiiizando seroalbiímina bovina como proteína estándar.

* Operación de renJbdos A#nciice 1

En esta tabla se puede apreciar que la mayor concenl~ación de proteína se encuentra

en

el

extracto fresco e l cual al ser sometido por el proceso de liofilización presenta una ligera perdida; sin embargo, para el retenido se observa una mayor concentración de proteína

como es de esperarse ya que el objetivo que se busca con la aplicación de este tipo de téaiicas en el que se emplean membranas especiales es la concentración de una solución en la cual ia solución retenida es el producto deseado.

Pig 3 Balance General de proteína

B A L W C E DE PROTEíN.4

Liofllizado . . . . .. . . . Permeado (113 mi) (0.2265 mg/mi)

(2OOmi) (0.9622 mg/ml)

b

. , . .. ~ . . .

' . .. -b Retenido

(83 mi) (0.6981 &mi)

L = P + R

(200ml) (0.9622 m g d ) = (113 mi) (0.2265 mg/ml) + (83 mi) (0.6981 rng/td)

(192.44 mg ) = 25.59 mg + 57.94 mg

(23)

T. I n - 7 n",

,m,, 1 ,

, ,.

r,:rlll,,,, 1 ~ ~ 1 , 1 ,,iri, t,,r:,,,,, ii.!, ~ l , . , w , i , ,,<,,.,,t I . 1r1i8 t l b < I ~ u l,~,.~!,,~'.,iii.,r,~,,

a '!\

~

I '.!I

. . I 1

I S ! .

, . I . '

' 1

La Fig. 2 muestra el balance general de proteína en el cual se puede apreciar U M perdida

considerable (4.4%) con respecto al valor inicial, tales perdidas pueden ser originadas por varias causas como

la

formación de espuma en la corriente de alimentación y/o la

interacción del soluto con la membrana ocasionando que en esta se incruste el soluto formando barreras de concentración (Tejeda,

1995)

así como mermas de volumen debido

al manejo de las muestras provocando decrementos significativos en las determinaciones.

! !I

?'Ti,

.

,,A

Tabla 6. Muestra los resultados obtenidos p o r el método de Lowry utiüzando seroalbumina ' bovina

(24)

La aplicación de este tipo de procesos es U M manifestaabn más de la posibilidad de

emplear desechos considerados como desperdiaos en la recuperación de productos de alto valor agregado útiles para el hombre.

La ultrafiltración es una tecnica muy útil ya que en el campo de

la

industria ha sido

estudiada durante ya vanas décadas por su importancia en

la

aplicación de alimentos y recuperación de proteínas, que además es un método rápido, barato y eficiente.

Con la aplicación de esta téaiica de ultrafiltración se llego a la recuperación de proteasas a

(25)

Las recomendaciones para proyectos similares son las siguientes:

1. Profundizar y entender los términos que se utilizan para comprender lo que se

esta haciendo y el porque de cada determinación.

2. Es recomendable que la preparación de los sustratos se lleve paso a paso todas las

indicaciones ya que de estos depende en gran medida la obtención de un buen

resultado.

3.

Son

muy importantes los tiempos de incubación ya que de estos depende la

interacción que exista entre las proteasas y los sustratros.

4. El control del pH para los sustratos es determínante ya que si no es el adecuado se

puede intervenir las reacciones dando resultados fallidos.

5. El etiquetado de las muestras es importante por lo que se debe hacer de forma cuidadosa.

6. El reactivo B se debe manejar con cuidado por su naturaleza cáustica, además es

recomendable que su preparación sea unos minutos antes de ser utilizada.

7. El reactivo A debe mantenerse en refrigeración con frascos ámbar para evitar

cualquier tipo de reacción por efecto de la luz.

(26)

APENDICE 1

ACTIVIDAD PROTEOLfTICA EN HEMOGLOBINA P A R A E L EXTRACTO LIOFILIWDO

I

#TuBOc

I

Abs.

I¡

CALCULOS

UAF% M - T/(O.l5m1)(20min) Donde

H= Muesha

T= TerOgo

0.15s mi. de extracto en los tubos muesha

20 min= Tiempo deincubaadn

UAe= UAp

mg ml

3.17

U A e - U A p - d.& = 3297

Mg/ml O.%Zmg mg.min

ml

MI -Ti = 0.0795

-

0.0693 -0.oO34 (0.ijmi) (ZGmin) 3ml.mjn ml.min

uAP3= 2

ml.min

3 í u 0.8730 =3.17 ml.min

(27)

UAPx=

137.68f

a 7.99 =145.67

ml.min

Mdmi

e96pmp mg.min

ml

UAe= 151.39

mg.min

Tabla 1. Muestra los resultados obtenidos de la Unidad de actividad proteolitica y específica del extracto iiofilizado utilizando como sustratos caseha y hemoglobina

EXIRACTO ACIMDAD PROTEOL~ITCA 'ACTIVIDAD ESPEC~~CA ' ' .

CASE~NA HEMOGLOBINA CASEÍNA HEMOGLOBINA

UAe/ UAe/

~ ~ - ~. ~- ~ . ~ - ,

-~

LJOFILIZADO

J

145.67 3.17 151.39 3.29

~ ~.. . - . .~ . ~ . . . . ~ . ~ ...

APÉNDICE 2

ACTMDAD PROTEOLfI'ICA EN HEMOGLOBINADELPERMFADOOBTENIDOPOR ULTRAFJ.IXXACI6N

Hemoglobina] Z8Onm

0 . W

0 . m

0.6511

M2 0.6658

M3 0.6532

Blanco

I

0.0032

I

~. . . ..

__

-

.---u

-

- _.__. .

~. ~

. .. ~ _

UAP=

M

-

T/(O.l5m1)(20min)

Donde

M i Mu- T= Testigo

O J t k mldeexhaaoenloshibosmu~ 20 silun limp de irrubaci'ón

UAe= UAp

mg

ml

u r n = 18.93

(28)

ACTMDAD PROTEOLiTICA EN CASEiNA DEL PEñMEADO OBTENIDO POR ULTRAFILTPACI6N

CALCULOS

uAp= M

-

T/(O.l5m1)(20min) Donde

M i Muerha

T= Testigo

0.1s- mideextractoenloshibosrnuestra 20 mins Tiempo de ircubaaún

4.u

ml

-

Ó.0176

u m 1 =

*-

00

0.001 ml.mlli

uAPs= 31.13

Illl.mil

U r n =

23.57*

u 5.62 = 29.19

d.min

UAe= 128.87

q.""

(29)

."...

iTi

opLcuLos

UAPX M

-

T/(O.l5ml)(ZOmin) Donde

M = Muestra T= Testigo

O.lS= ml. de extracto en los hiboJ muestra

20 mlm= linnpodeincubaaón

UAe= UAp

mg ml

. .

0.0193

uAn=

M-

19.36

0.001 ml.min

u r n = ml.min

uw3=

a

ml.min

UAPx= u 5.51 = 22.73

ml.min

UAe= 32.55

mg.min

ACTIVIDAD PROTEOLfTICA EN CASEÍNA DEL RETENTADO OBTENIDO POR ULTRAEILTRACIÓN

(30)

_.

' f ,,

! '

UAI% M

-

T/(O.l5m1)(20min)

Donde

M = Muestra T= Testigo

0.153 d.deexuacto~ilc6hiLnsmuesha

20 mln= Tiempo de irubatih

ml: ml

M i - n -i.w-o.m-w

( 0.15d) (illmin) 3 mi.& d.&

-

o.om

um1= ml.nM- 3-

u r n = 340.13

0.001 d m i n

dmin

UAPX=

343.83i

u 15.18 ~359.01 d.&

UAe= 492.57 mg.&

(31)

APÉNDICE 4

DETERMINACIÓN DE PROTEíNA PARA EL "EXTRACTO FRESCO DE CAMARÓN"

____ __---

CALCULOS

Rasultados obtenidos de la cum pair57 pa el métcdo de L O W

r =0.9907 y = m x + b

b = 0.0362 MI= 1.30860 .o362 =32.29

rn = 0.0386 x=y-b/rn 0.0386

M2= 1.2910-0.0362 = 32.50

0.0386

xmi= 32.39pgirnl

MI= _0.36840.0362= 8.61

0.0386

M2= 0.3596-0.0362 = 8.37

0.0386

XMZ= 8.49pgirnl

x

X

=

1.022 mghnl

20.44X( 50) = 1022 vgirni

CONCENTRACIÓN DE PROTEíNA PARA EL *' EXTRACTO LIOPILIZADO"

...

Blanco

M2 0.0693

0.0713

..

CALCums

r = 0.9907

b = 0.0362

m= _0.0386 y = mx+b

x=y-blrn

xl=0.07950.0362 = 1.1217

0.0386

U= 0.06950.0362 = 0.8575

0.0386

U=0.07150.0362

0.0386

(32)

CONCENTRACIÓN DE PROTISíNA POR LOWRY PARA EL PERMEADO

CALCULOS

Resubdas mtenidas de la cum pahár pa el m # d O de Lamy

r =0.9907

b = 0.0362

m4.0386 y = m+b

x=y-b/rn

Dilución 1 2 5

X I =

o.42560.0362

= 10.0880

0.0386

x2= 0.35680.0362 = 8.3056

O. a386

U= 0.35490.0362 = 8.2554

0.0386

x4= 0.414~0.0362 = 9.7875

0.0386

x%- =&g@

0.0386 9.06w X 25 =226.5

X= 0.2265mglml

(33)

xi= 0 4237 -üi.üSi = 10 0388 00386

~ 0 4 8 8 5 0 0 3 9 =117124

o o386

u=&gEQ.@z =IO9689

x 4 = 0 ~ 0 ? 6 2 =84818

x5-03M18o0362 =-

00386

o o386

00386 109622X50=69811

TABLA DE RESULTADOS T<)TALES

x

=

0.6981 mgimi

. .~ ~

. . . .. ACTMD . ..

A D ECPECÍFICA

1

DETERhfINACi6N DE

(34)

m

BELIARA. S.R. y CUI.

z.

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