Efecto del extracto de bartonella bacilliformis sobre células madre de cordón umbilical humano

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. O Q. UI. M. IC. A. ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. IA. Y. BI. TESIS I. M. AC. “EFECTO DEL EXTRACTO DE Bartonella bacilliformis. FA R. SOBRE CELULAS MADRE DE CORDON UMBILICAL. IO TE. CA. DE. HUMANO”. AUTORES:. VIGO OLIVEROS, HERSON LENIN. BI. BL. SANDOVAL ANGULO, GLEND FRANCIS. ASESOR: Mg. JOSE LIZARDO CRUZADO RAZCO. TRUJILLO – PERÚ. 2012. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. INDICE. PAG:. M. IC. A. DEDICATORIA………....…………………………...…………3. O Q. UI. AGRADECIMIENTO…………………..……..………………..4. Y. BI. JURADO DICTAMINADOR………….……...……...………..5. AC. IA. PRESENTACIÓN………………..……..….…...………………6. FA R. M. RESUMEN………….…………………………………………...7. IO TE. CA. DE. ABSTRACT………………………...…………………………..8. I. INTRODUCCIÓN...................................................................9. BI. BL. II. MATERIAL Y MÉTODO...................................................13 III. RESULTADOS......................................................................23 IV. DISCUSIÓN...........................................................................30 V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………....................33. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA A, Dios Todopoderoso, por ser quien concede el privilegio de la. IC. A. vida, ser nuestro amigo incondicional al estar siempre a nuestro. O Q. UI. M. lado y ser mi guía en los momentos más difíciles y sentir que. BI. puedo recurrir a él en cualquier momento, y recordarnos siempre. FA R. M. AC. IA. Y. que somos seres humanos con virtudes y defectos.. DE. Así mismo, por habernos dado sus bendiciones, y esperamos. IO TE. recorrer. CA. estar más cerca de él día a día en el camino que nos falta por. BI. BL. Por ser infinitamente misericordioso, con su profundo amor y agradecimiento.. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. AGRADECIMIENTO Nuestro más sincero agradecimiento a nuestro asesor Mg.. IC. A. JOSE LIZARDO CRUZADO RAZCO por los conocimientos. UI. M. impartidos, el apoyo desmedido durante el desarrollo del presente. IA. Y. BI. O Q. trabajo científico y sus valiosos comentarios.. M. AC. Asimismo, hacemos extensivo a todas las personas que en su. FA R. debido momento nos brindaron su afecto, y su apoyo en la. DE. realización de nuestro informe y a nuestras amistades en general. IO TE. CA. por el afecto y el apoyo moral invalorable porque siempre nos. BI. BL. alentaron a seguir adelante.. GLEND FRANCIS SANDOVAL ANGULO. HERSON LENIN VIGO OLIVEROS. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UI. M. IC. A. JURADO DICTAMINADOR. Y. BI. O Q. Dra. Ana Elena Mantilla Rodríguez (Presidente).. M. AC. IA. Mg. José Lizardo Cruzado Razco (Miembro).. BI. BL. IO TE. CA. DE. FA R. Dr. Roberto Osmundo Ybánez Julca (Miembro).. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRESENTACIÓN. SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR: En cumplimiento con lo dispuesto por el reglamento interno de Grados y Títulos. A. vigente en la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de. IC. Trujillo, someto a vuestra consideración y elevado criterio profesional el presente. M. “EFECTO DEL EXTRACTO DE. UI. informe de Tesis I intitulado:. IA. Y. BI. CORDON UMBILICAL HUMANO”. O Q. Bartonella bacilliformis SOBRE CELULAS MADRE DE. AC. Es propicia la oportunidad para manifestar nuestro más sincero agradecimiento a. M. toda la Plana Docente de la Facultad de Farmacia y Bioquímica quienes en su meritoria. DE. FA R. labor de educadores nos orientaron durante nuestra formación profesional.. Agradecemos, asimismo, la desinteresada colaboración de quienes nos han. IO TE. CA. brindado su apoyo para la consecución de nuestro trabajo.. Dejamos a vuestra consideración Señores Miembros del Jurado, la calificación. BI. BL. del presente trabajo científico.. Trujillo, Julio del 2012. GLEND FRANCIS SANDOVAL ANGULO. HERSON LENIN VIGO OLIVEROS. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESÚMEN El presente trabajo estuvo orientado a determinar el posible efecto del extracto de membrana de Bartonella bacilliformis sobre receptores de membrana de células madre, podría inducir un proceso fisiológico en las. IC. A. células tratadas, induciendo la fosforilación del sistema inhibidor IƘβ en el. UI. M. citosol, lo que permitiría activar el complejo NF-Ƙβ y su translocación al. IA. Y. BI. O Q. núcleo celular, con la consecuente activación del sistema celular.. AC. El estudio se realizó con segmentos de cordón umbilical humano, se. FA R. M. procesaron por medios mecánicos utilizando medio Waymouth y. DE. colagenasa tipo I con la finalidad de liberar células madre. De las muestras. CA. procesadas se formo dos grupos testigo y problema, posteriormente se. IO TE. realizó el análisis espectrofotométrico de los sobrenadantes de dichos. BL. grupos con el fin de identificar el factor de crecimiento epidermal,. BI. utilizando una solución patrón de este último. PALABRAS. CLAVE:. Bartonella. bacilliformis,. NF-Ƙβ,. sistema. inhibidor IƘβ y células madre. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT. This study was designed to determine the possible effect of membrane extract of Bartonella bacilliformis on membrane receptors of stem cells,. IC. A. could induce a physiological process in the treated cells, inducing. UI. M. phosphorylation inhibitor IƘβ system in the cytosol, which would enable. O Q. NF-Ƙβ complex and its translocation to the nucleus, with subsequent. Y. BI. activation of the cellular system.. AC. IA. The study was conducted with human umbilical cord segments were. FA R. M. processed by mechanical means using half Waymouth and collagenase type. DE. I in order to release stem cells. Of processed samples was formed two. CA. control groups and problem analysis was performed subsequently. IO TE. spectrophotometric supernatants of these groups in order to identify the. BL. epidermal growth factor, using a standard solution of the latter.. BI. KEY WORDS: Bartonella bacilliformis, NF-Ƙβ, IƘβ inhibitor system and stem cells. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN. En la actualidad el interés por la utilización de las células madre, ha crecido de forma exponencial a raíz de la identificación, caracterización y aislamiento de las células madre embrionaria humanas y de las expectativas, de que ellas. A. podrían ser capaces de curar innumerables enfermedades gracias a su fisiología y. O Q. UI. M. IC. enorme potencial de diferenciación. 1. BI. Una célula madre es capaz de dividirse indefinidamente y diferenciarse a. Y. distintos tipos de células especializadas, morfológica y funcionalmente;. AC. IA. presentan además características que le permiten dividirse durante periodos. FA R. M. extensos sin especializarse o diferenciarse, mientras que en células del organismo la mitosis se presenta en periodos determinados. Uno, de los más. DE. importantes tópicos en el entendimiento de las células madre es la auto-. CA. renovación, requerida por todos los tipos de dichas células para persistir en el. IO TE. tiempo; estas se pueden clasificar según su potencial de diferenciación: las. BL. totipotenciales son capaces de producir tejido embrionario y extraembrionario;. BI. las pluripotenciales con capacidad de diferenciarse a tejidos procedentes de cualquiera de las tres capas embrionarias humanas y, por último, las multipotenciales capaces de diferenciarse a distintos tipos celulares procedentes de la misma capa embrionaria. 1, 2, 3. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Las clases de células madre más estudiadas hasta el momento son, las de origen embrionario y las células adultas, siendo estas últimas las más utilizadas por no generar problemas éticos para su uso. Las primeras son pluripotenciales, pudiéndose diferenciar a cualquier tejido del organismo, incluyendo tejidos somáticos (corazón, hígado, etc.) y germinales (ovocitos y espermatozoides).. A. Las segundas existen en el adulto, el feto y el cordón umbilical; con una. M. IC. capacidad proliferativa y un potencial de diferenciación menores que las. O Q. UI. embrionarias, son células multipotenciales, y se han podido identificar en casi. BI. todos los tejidos del organismo. Dentro del grupo de células madre adultas, las. Y. células hematopoyéticas han sido las más estudiadas, también han sido. AC. IA. estudiadas las células madre mesenquimales las cuales se encuentran repartidas. FA R. M. en el tejido conectivo de diversos órganos, como la medula ósea, sangre. DE. periférica, cordón umbilical, tejido adiposo, musculo esquelético, etc. 4,5,6,7. CA. La recolección y aislamiento de células madre mesenquimales (MSC), como. IO TE. las derivadas de médula ósea humana, requieren procedimientos de obtención. BL. invasivos, es por eso que se han comenzado a buscar fuentes alternativas de. BI. MSC humanas incluyendo el estroma del cordón umbilical. El cordón umbilical humano consta de tres componentes de tejido incluyendo la membrana amniótica, el estroma (gelatina de Wharton), y los vasos sanguíneos (dos arterias y una vena). La expresión de ciertos marcadores de células madre mesenquimales y embrionarias sugieren evidencia de su multipotencialidad; este potencial últimamente ha conducido a grupos de investigación a iniciar la evaluación de estas células en regímenes terapéuticos.. 8. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Existe la esperanza de que el potencial de las células madre para generar tejidos lleven al diseño de tratamientos para enfermedades como la enfermedad de Parkinson, Alzheimer, insuficiencia cardiaca, esclerosis múltiple, enfermedad de Huntington, lesiones de la médula espinal, así como el diseño de tejidos nuevos, tales como la piel, además del entendimiento de muchas formas de. A. cáncer. El haber podido mejorar las técnicas de cultivo de las células madre nos. los. factores. de. crecimiento. implicados. UI. funcional,. en. su. O Q. genómica. M. IC. brinda la posibilidad de estudiar sus aplicaciones en embriología humana,. BI. funcionamiento, descubrimiento de nuevos medicamentos, la toxicología, el. Y. transplante celular y la terapia génica. En un futuro cercano servirán de ayuda. FA R. M. AC. IA. para mejorar la calidad de vida y salvar vidas humanas. 1,3. La Enfermedad de Carrión, conocida también como Fiebre de la Oroya o. DE. Verruga peruana, fue conocida por culturas precolombinas de Perú y Ecuador,. CA. evidenciándose en el brote verrucoso que se halla representado en sus cerámicas. IO TE. como también en monolitos. Esta patología infecciosa ha sido descrita en zonas. BL. endémicas del Perú, entre los 800 a 3000 msnm y en algunas localidades de. BI. Ecuador y Colombia. Entre 2001 y 2004 se ha verificado que la enfermedad se ha ido expandiendo o reactivando en diversas regiones del Perú como Piura, Huánuco, La Libertad, Cajamarca, Amazonas, Ayacucho y Puno. Según la Oficina General de Epidemiología del Perú en el periodo 2004-2006, se han notificado 26189 casos procedentes de 16 departamentos, encontrándose que el 85,8% de los casos fueron reportados en los departamentos de Ancash, Cajamarca y La Libertad. Considerada como una enfermedad re-emergente, es. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. un problema de salud pública, siendo preocupante la endemicidad y casuística, y que hasta la fecha no existan medidas eficaces que permitan diagnosticar, controlar y prevenir esta enfermedad. 9,10, 11, 12,13. Se señalan dos periodos clásicos en esta enfermedad: el periodo anemizante o fiebre grave de Carrión y el periodo eruptivo, existe también un estadio. A. intermedio entre los dos, que fue denominado como periodo intercalar. En el I. M. IC. periodo, así denominado el primero de los mencionados, Bartonella baciliformis. O Q. UI. parasita las células endoteliales de los capilares sanguíneos y linfáticos donde se. BI. reproduce; la ruptura de dichas células, permite la liberación de abundantes. Y. microorganismos que van a invadir los hematíes circulantes, en el II periodo o. AC. IA. intercalar el germen se refugia en el interior de los tejidos humanos, señalándose. FA R. M. en sentido general al tejido retículo-endotelial. Meses y aun años después se presenta la etapa eruptiva (III periodo), caracterizado por una proliferación. DE. granulomatosa retículo-angioblastica difusa, que se extiende por todo el tejido. CA. conjuntivo en general, y en donde la manifestación más objetiva consiste en una. BL. IO TE. erupción verrucosa difusa que invade la piel y las mucosas. 14. BI. Los resultados obtenidos de este estudio, nos permiten afirmar que la presencia de un péptido o péptidos en el extracto de membrana de Bartonella bacilliformis, el cual actúa en las células madre del estroma de cordón umbilical humano; puede conllevar a la diferenciación de dichas células en células epidermales, para que en el futuro, estas a su vez puedan ser utilizadas para la regeneración del tejido epidérmico donde dicho tejido está dañado, como en el caso de los pacientes quemados.. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II. MATERIAL Y MÉTODO. 1.- MATERIALES Y EQUIPOS:. A. Material Biológico:. A. Segmentos de cordón umbilical humano, procedentes de la sala de. IC. . UI. M. operaciones del servicio de maternidad - Hospital Belén de Trujillo.. BI. Pool de cepas de Bartonella bacilliformis procedente del Laboratorio de. Y. . O Q. Departamento de La Libertad.. AC. IA. Toxicología de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad. . FA R. M. Nacional de Trujillo (UNT).. Extracto de superficie de membrana de Bartonella bacilliformis,. DE. elaborado en el Laboratorio de Toxicología de la Facultad de Farmacia y. BL. IO TE. CA. Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo (UNT).. BI. B. Material de Laboratorio: •. Tubos de ensayo estériles. •. Pipeta automática rango fijo 500 ul. •. Puntera universal para pipeta automática rango mínimo 5-200 ul. •. Frascos de vidrio transparente 250 ml estériles con tapa y boca ancha. •. Vasos de precipitación. •. Piceta de Plastico. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Mecheros de vidrio. •. Pinzas de disección estériles. •. Tijeras de disección estériles. •. Gotero simple. •. Viales Eppendorf estériles. •. Cocina eléctrica “Fomelsa”. •. Mortero homogenizador esteril. •. Botellas de vidrio transparente de boca angosta estériles. •. Tubos de centrifuga estériles. •. Asa bacteriológica. •. Matraces estériles de 150 y 250 ml. •. Viales estériles de boca ancha con tapas de gas. •. Pipetas Pasteur estériles. FA R. M. AC. IA. Y. BI. O Q. UI. M. IC. A. •. •. CA. Ampollas de agua para inyección estériles. Clotrimazol 1%. BI. BL. •. Agua destilada. IO TE. •. DE. C. Reactivos:. •. Ampollas de gentamicina sulfato. •. Solución fisiológica salina esteril. •. Medio de cultivo Waymouth MB 752/1 (Sigma Aldrich). •. Agar simple enriquecido. •. Solución de acido tricloroacético al 5%. •. Solución de fenol al 0.5%. •. Buffer fosfato 14. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. •. Acetona. •. Factor de crecimiento epidermal, humano, recombinante (Merck). •. Colagenasa, tipo I, Clostridium histolyticum (Merck). D. Equipos: Refrigeradora “Friolux”. •. Congeladora. •. Estufa “Memmert”. •. Centrifuga “Universal”. •. Espectrofotómetro UV/ Visible. Thermo – Genesys 10uv. •. Olla a presión “Standard”. •. Incubadora “Memmert”. •. Agitador magnético “Thermolyne”. DE. FA R. M. AC. IA. Y. BI. O Q. UI. M. IC. A. •. Mascarillas asépticas descartables. BL. •. Guantes médicos estériles de simple uso. IO TE. •. CA. E. Otros:. Jeringas estériles de 10 ml. BI. • •. Jeringas estériles de 1 ml. •. Jeringa esteril de 20 ml. •. Bolsa de diálisis. •. Algodón. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.- METODO:. DISEÑO DE CONTRASTACION Para contrastar la hipótesis se realizaron mediciones en el espectrofotómetro uv/ visible. Tomando en cuenta dos grupos de estudio:. A. Grupo testigo: preparado de células madre de cordón umbilical. IC. -. O Q. Grupo problema: preparado de células madre de Cordón umbilical de. BI. -. UI. M. humano sin el extracto de Bartonella bacilliformis.. AC. IA. Y. humano con el extracto de Bartonella bacilliformis. FA R. M. A. OBTENCION DE LAS MUESTRAS DE CORDON UMBILICAL. DE. Las muestras de cordón umbilical humano fueron recolectadas del Hospital. CA. Belén de Trujillo - Sala de operaciones del servicio de maternidad,. IO TE. procedente de gestantes cesareadas. Las muestras inmediatamente después de cada parto se colocaron en frascos de vidrio estériles, con tapa y boca ancha,. BI. BL. conteniendo medio de cultivo Waymouth suficiente para cubrir las muestras, 0.15 ml de antibiótico gentamicina y 0.15 ml de antimicótico Clotrimazol; estos dos últimos mantienen libre de contaminación a la muestra. Se mantuvieron dichos frascos, antes y después de la recolección, a una temperatura de 4 °C aproximadamente a fin de conservar el medio de cultivo.. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. B. TRABAJO EXPERIMENTAL 1. PREPARACIÓN DEL EXTRACTO DE SUPERFICIE DE MEMBRANA DE Bartonella bacilliformis. 1.1. 15. PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO En botellas de vidrio transparente de boca angosta estériles se. IC. A. acondicionó el preparado de agar simple enriquecido de naturaleza. O Q. UI. M. solida conjuntamente con la solución salina fisiológica estéril.. BI. 1.2 CULTIVO DE Bartonella bacilliformis EN MEDIO BIFÁSICO. IA. Y. Las cepas de Bartonella bacilliformis procedieron del Laboratorio de. AC. Toxicología de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad. FA R. M. Nacional de Trujillo (UNT); con dichas cepas se constituyó un pool que. DE. se cultivó en medio bifásico (agar simple enriquecido y solución salina. IO TE. CA. fisiológica estéril). Se incubó a 28º C durante 10 días.. 1.3 COSECHA DE Bartonella bacilliformis. BL. Se retiraron los frascos de cultivo de la incubadora; con el asa. BI. bacteriológica se frotó suavemente la superficie del medio con la finalidad de desprender las cepas adheridas al medio; la suspensión se trasvasó a tubos de centrífuga estériles y codificados. Se centrifugó a 3000 rpm durante 15 minutos; se eliminó el sobrenadante; se resuspendió el precipitado en suero fisiológico y nuevamente se centrifugó a 3000 rpm. Este proceso se repitió 5 veces con la finalidad de eliminar aquellas partículas del medio de cultivo que estuviesen presentes.. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 1.4. PREPARACIÓN DEL EXTRACTO DE SUPERFICIE DE MEMBRANA DE Bartonella bacilliformis. El precipitado obtenido en el paso anterior se trasvasó a un matraz estéril de 150 ml y se le agr egó 50 ml de una mezcla de 40 ml de solución de ácido tricloroacét ico al 5% más 10 ml de. IC. A. solució n de fenol al 0.5 %. Se somet ió a agit ación magnét ica. UI. M. durante 72 horas, después se llevó a centrifugación a 5000 rp m. O Q. durante 15 minutos. Con jer inga descar table de 20 ml se. Y. BI. extrajo el sobrenadante y se trasvasó a una bolsa de diálisis; se. IA. cerró hermét icament e la bolsa y se llevó a un matraz de 250 ml. M. AC. que contenía 100 ml de buffer fosfato a pH 7,3 y se agit o. FA R. magnét icamente. Cada 24 horas se fue eliminando el buffer. DE. fosfato. Este procedimiento se realizó hasta las 72 horas. E l. CA. dializado se trasvasó a viales estériles de boca anc ha con tapas. IO TE. de gas y se llevó a incubación a 37°C hasta la eliminación total. BI. BL. del líquido.. Purificación del extracto obtenido Se agregó a los viales, que contenían los extractos, 5mL de acetona; se agitó durante 20 minutos; se trasvasó a tubos de centrifuga y se centrifugó a 3000 rpm durante 15 minutos. Con pipetas Pasteur se eliminó la mayor cantidad de acetona. Después se incubó a 37º C hasta completar la evaporación de la acetona. 15. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2. PREPARACION DE LA SOLUCION ESTANDAR DE FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDERMAL (EGF) El contenido total (200 ug) de estándar liofilizado de Factor de crecimiento epidermal (EGF) humano recombinante del laboratorio Merck, se conservó a – 20°C, diluyéndose en su propio envase con 1ml. IC. A. de agua estéril para inyección.. UI. M. 3. PROCESAMIENTO DE LAS CELULAS MADRE DEL ESTROMA DE. IA. LAVADO DE CÉLULAS MADRE. AC. 3.1. Y. BI. O Q. CORDON UMBILICAL HUMANO 8. FA R. M. A cada pieza de cordón umbilical humano se le hizo un corte longitudinal con una tijera esteril hasta descubrir los vasos sanguíneos; luego se. DE. eliminó la sangre contenida en ellos apretándolos (extraer los vasos si. IO TE. CA. fuera posible) con ayuda de los dedos provistos de guantes; y también de pinzas estériles. Esta acción se realizó con la intención de evitar la. BL. contaminación, e interferencia de algunos elementos propios de la sangre,. BI. en el resultado final del estudio. Mediante cortes transversales se obtuvieron trozos de 3-5 cm, luego estos se colocaron en frascos de vidrio transparente estériles de boca ancha con tapa, inmediatamente se adicionó solución fisiológica salina esteril en cantidad suficiente con el objetivo de eliminar trazas de elementos sanguíneos asimismo 0.15ml de antibiótico gentamicina; y se lavó por unos minutos.. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Posteriormente. las muestras pasaron a otros frascos con las. características anteriores conteniendo medio Waymouth, 0.15 ml de antibiótico gentamicina y 0.15 ml de antimicótico Clotrimazol para su conservación.. Finalmente. al. no. utilizarse. algunas. muestras. inmediatamente, estas fueron guardadas a la temperatura ya mencionada. IC. LIBERACIÓN DE CÉLULAS MADRE. O Q. UI. M. 3.2. A. anteriormente (4°C). 8. BI. Se tomó un fragmento pequeño correspondiente al estroma de la Gelatina. Y. de Wharton de cordón umbilical humano de los frascos con muestra,. AC. IA. luego este se colocó en un tubo de ensayo estéril de gran diámetro; y con. FA R. M. una tijera estéril se lo trituró hasta obtener partes aun más pequeñas con el fin de aumentar así la superficie de acción y facilitar la digestión; el. madre.. CA. células. DE. producto pasó a un tubo de ensayo digestor estéril donde se liberaron las La. liberación se. inició. utilizando. el mortero. IO TE. homogeneizador; luego sin dejar de lado la acción del mortero hasta el. BL. final de este proceso; se añadió 1ml de medio Waymouth, 0.05 ml de. BI. colagenasa tipo I; y 0.05 ml de agua estéril para inyección, digiriéndose. de esta forma el colágeno del tejido conectivo del cordón umbilical. El contenido final se colocó en viales Eppendorf estériles (2 viales por cada fragmento procesado). Este procedimiento de liberación se repitió para cada fracción de muestra tomada de los frascos.. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 3.3 ENSAYO DEL EXTRACTO DE MEMBRANA DE Bartonella bacilliformis SOBRE LAS CELULAS MADRE.. Se tomaron 0.3 ml del preparado de extracto de membrana de Bartonella bacilliformis, guardado en viales estériles de boca ancha con tapas de gas; y se añadieron en uno de los dos viales que contenían el producto del. A. proceso de liberación de las células madre (esto se repitió para cada. M. IC. fracción procesada), constituyéndose así el grupo problema. Los viales. O Q. UI. que no contenían dicho extracto pasaron a constituir el grupo testigo.. ANÁLISIS ESPECTROFOTOMÉTRICO. ANALISIS DEL SOBRENADANTE DE CELULAS MADRE Y. FA R. 4.1. M. AC. 4.. IA. Y. BI. Finalmente los viales pasaron a incubación a 37 °C por 24 horas.. DE. OBTENCIÓN DE SU PERFIL GRAFICO EN LOS GRUPOS. IO TE. CA. TESTIGO Y PROBLEMA.. BL. Previa centrifugación durante 15 minutos, se tomó, con sendas jeringas. BI. estériles (1 jeringa por vial), el sobrenadante, tanto de los viales que contenían el preparado de la muestra testigo como problema, se colocaron en las cubetas del espectrofotómetro, y se diluyeron con agua para inyección esteril hasta que no presentasen color alguno (incoloro). Se realizaron las lecturas de los preparados mencionados, en el espectrofotómetro, con la finalidad de obtener sus perfiles graficos.. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 4.2. ANALISIS DE LA SOLUCION ESTÁNDAR DEL FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDERMAL Y OBTENCION DE SU PERFIL GRAFICO. Se tomó 0.4 ml de la solución estándar de factor de crecimiento epidermal (EGF) recombinante humano y se realizó la lectura en el. IC. A. espectrofotómetro con la finalidad de obtener su perfil grafico.. M. Composición del blanco para las lecturas espectrofotométricas. O Q. UI. Para la lecturas de las muestras en el espectrofotómetro se preparó un. BI. blanco para el grupo testigo constituido por: medio Waymouth,. Y. colagenasa tipo I y agua esteril; el blanco del grupo problema estuvo. AC. IA. compuesto de lo mismo que el anterior además de extracto de Bartonella;. FA R. M. finalmente el blanco para el estándar estaba formado por agua esteril para. IDENTIFICACIÓN. CA. 4.3. DE. inyección.. DEL. FACTOR. DE. CRECIMIENTO. IO TE. EPIDERMAL EN EL SOBRENADANTE DE LOS GRUPOS. BI. BL. TESTIGO Y PROBLEMA.. Se identificó, de forma cualitativa, la presencia del factor de crecimiento epidermal en los sobrenadantes; compararando la grafica o curva promedio de los grupos testigo y problema con el perfil de la grafica estándar.. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. III. RESULTADOS. Los resultados obtenidos de las muestras en estudio y del estándar liofilizado de factor de crecimiento epidermal (EGF) humano recombinante; se presentan en la tabla 1 y las figuras 1, 2, 3, 4, 5.. IC. A. La Tabla 1 expone las medidas de las longitudes de onda representativas de los. M. preparados de las muestras (número de muestras = 30), semejantes a la longitud. O Q. UI. de onda de la curva estándar, y el promedio de dichas medidas.. Y. BI. La Figura 1 representa la curva promedio correspondiente al grupo testigo.. AC. IA. La Figura 2 representa la curva promedio correspondiente al grupo problema.. FA R. M. La Figura 3 representa la curva correspondiente a la solución estándar de factor. DE. de crecimiento epidermal (EGF) recombinante humano.. CA. La Figura 4 representa la identificación de factor de crecimiento epidermal (EGF). IO TE. en el sobrenadante de las muestras. La curva signada con el número 1 corresponde al estándar (EGF). Las curvas signadas con los números 2 y 3 presentan un pico. BI. BL. similar al que se puede observar en el patrón a 278 nm de longitud de onda.. La Figura 5 representa una visión cercana de picos graficos no visibles en la figura 4.. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 1: Lecturas espectrofotométricas de las muestras procesadas. PROCESADO DE CELULAS MADRE. A IC M. O Q. UI. 283.89 284.53 283.91 284.67 283.66 284.08 282.83 284.48 282.78 283.86 284.71 284.31 283.75 282.93 284.40 282.97 284.79 284.66 283.97 282.98 283.51 282.90 283.88 284.17 283.53 284.89 284.92 284.90 282.80 284.54. BI Y IA AC. CA. DE. FA R. 281.36 277.04 281.59 278.19 277.66 280.95 279.00 278.38 277.09 278.95 277.65 279.75 281.39 281.01 277.69 277.03 277.31 277.49 279.92 278.39 281.77 277.78 278.06 278.21 279.81 279.33 279.17 278.41 278.11 281.78. GRUPO PROBLEMA ‫( ג‬nm). IO TE. BI. BL. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30. ‫( ג‬nm). M. Nº GRUPO TESTIGO. X: Promedio de muestras X. TESTIGO. = 279.009. X. PROBLEMA. = 283.94. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Figura 1: Lectura cualitativa espectrofotométrica del testigo. 6.00 5.5. 224.00 219.00 198.00. IC. A. Absorbance (AU). 5.0. M. 4.5. Q. UI. 4.0. BI O. 3.5. IA. 2.5. AC. A. Y. 3.0. 2.0. FA RM. 215.83 228.00 1.5 279.00. DE. 1.0 203.02. A. 0.5. TE C. 0.0. 250. 300. 350. 400. 450. 500. 550. 600. 650 nm. 700. 750. 800. 850. BI. BL. 190.0. IO. -0.50. 900. 950. 1000. 1050. 1100.0. Wavelength (nm). Blanco: Medio Waymouth + Colagenasa I, Clostridium histolyt icum + Agua estéril para inyección Muestra: Sobrenadante del preparado de celulas madre + Agua estéril para inyección. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Figura 2: Lectura cualitativa espectrofotométrica del problema 6.00 205.50 5.5. IC. A. 5.0. M UI Q BI O. 3.5. Y. 3.0 2.5. IA. A. 4.0. AC. Absorbance (AU). 4.5. FA RM. 2.0 1.5 227.13. 1.0. 283.97. DE. 210.09. A. 0.5. TE C. 0.0. -1.00 250. 300. 350. 400. 450. 500. 550. 600. 650 nm. 700. 750. 800. 850. BI. 190.0. BL. IO. -0.5. 900. 950. 1000. 1050. 1100.0. Wavelength (nm). Blanco: Medio Waymouth + Colagenasa I, Clostridium histolyticum + Extracto de membrana de Bartonella bacilliformis + Agua estéril para inyección.. Muestra: Sobrenadante del preparado de celulas madre + Agua estéril para inyección.. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Figura 3: Lectura cualitativa espectrofotométrica de la solución estándar del factor de crecimiento epidermal 1.53. Absorbance (AU). 1.4. IC. A. 1.3. UI. M. 1.2. Q. 1.1. BI O. 1.0. Y. 0.9. AC. 0.7. FA RM. A. IA. 0.8. 0.6. DE. 0.5. A. 0.4. TE C. 0.3. 278.00. IO. 0.2 382.93. -0.02 190.0. 250. 300. 350. 400. 450. BI. BL. 0.1. 500. 550. 600. 650 nm. 700. 750. 800. 850. 900. 950. 1000. 1050. 1100.0. Wavelength (nm). Blanco: Agua estéril para inyección. Muestra: Solucion estándar del factor de crecimiento epidermal recombinante humano. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Figura 4: Lectura cualitativa comparativa espectrofotométrica del estándar (1), problema (2) y testigo (3). 1.000 0.95 0.90. A. TESTIGO. IC. 279.00. 0.85. Q. 3. 0.70. Y. 0.65. IA. 0.60. AC. 0.55. FA RM. 0.50 0.45 210.09 283.97. DE. 0.40 0.35. A. 2. 203.02. TE C. 0.30. PROBLEMA. BI O. Absorbance (AU). 0.75. A. ESTANDAR. UI. 0.80. M. 227.13. 0.25. IO. 0.20. 278.00. 0.05. 1. BI. 0.10. BL. 0.15. 382.93. -0.017 190.0. 250. 300. 350. 400. 450. 500. 550. 600. 650 nm. 700. 750. 800. 850. 900. 950. 1000. 1050. 1100.0. Wavelength (nm). 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Figura 5: Lectura cualitativa comparativa espectrofotométrica con vista cercana del estandar (1), problema (2) y testigo (3) 1.000 0.95 0.90. A IC. 0.80. UI. 3. 0.65. Y. 0.60. AC. IA. 0.55 0.50. FA RM. 0.45 0.40 283.97. 0.35. DE. 2. 0.30. TE C. A. 0.25 0.20. 278.00. 0.10. BL. 1. IO. 0.15. 382.93. BI. 0.05 -0.017 230.0. PROBLEMA. BI O. 0.70. ESTANDAR. M. 279.00. 0.75. A. TESTIGO. Q. Absorbance (AU). 0.85. 240. 250. 260. 270. 280. 290. 300. 310. nm. 320. 330. 340. 350. 360. 370. 380. 390. 400.0. Wavelength (nm). 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IV. DISCUSION. En el procesamiento de 30 muestras de cordón umbilical humano, se han obtenido los resultados que se presentan en la Tabla 1 y se ilustran con las Figuras 1 y 2; en razón a nuestro objetivo, buscar información sobre el. A. posible efecto del extracto de membrana de Bartonella bacilliformis sobre. M. IC. receptores de membrana de células madre, el cual podría inducir un proceso. O Q. UI. fisiológico en las células tratadas. La Tabla 1 contiene los valores de. BI. longitud de onda de las lecturas espectrofotométricas de los sobrenadantes. Y. de los cultivos de las células tratadas y no tratadas con los extractos de. AC. IA. Bartonella bacilliformis; los picos que se observan en los trazados. M. espectrofotométricos son coincidentes con correspondiente a la solución. FA R. patrón de factor de crecimiento epidermal. Esto se puede ver mejor en la. CA. DE. Figura 4.. IO TE. Este hecho, nos permite afirmar que en el extracto que utilizamos debe. BL. estar presente un péptido o péptidos que al unirse a los receptores de. BI. membrana de las células madre, induzca la fosforilación del sistema inhibidor IƘβ en el citosol, lo que permitiría activar el complejo NF-Ƙβ y su translocación al núcleo celular, con la consecuente activación de sistemas celulares. Un gran número de diversos estímulos externos activan el NF-Ƙβ, y los genes cuya expresión está regulada por este factor; juegan un papel importante en la respuesta inmune, como la originada por algunas especies de Bartonella en células endoteliales, así también un rol significativo en el. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. stress oxidativo, apoptosis, proliferación, diferenciación y desarrollo de las células. Entre estos genes encontramos a los reguladores de la proliferación celular como las ciclinas y los factores de crecimiento.16, 17, 18. En la Figura 3 se revela la curva propia de la solución estándar de factor de crecimiento epidermal (EGF), con una longitud de onda de 278 nm. El. A. EGF por medio de su receptor situado en la membrana celular interviene en. M. IC. el transporte de iones, cambios morfológicos, estimulación del crecimiento,. O Q. UI. proliferación y diferenciación de múltiples células, ellos (EGF y su receptor). BI. han sido localizados en distintas células que componen la piel y tienen. Y. actividad mitógena para células endoteliales, epiteliales, fibroblastos y. FA R. M. AC. IA. queratinocitos. 19, 20. Las Figuras 4 y 5 contienen las curvas de identificación de factor de. DE. crecimiento epidermal (EGF), señalada como 2 para la muestra problema, y. CA. con 3 la que corresponde al testigo, estas presentan un pico característico de. IO TE. 283 y 279 nm de longitud de onda respectivamente, las cuales se encuentran. BI. BL. a la misma altura del pico de la curva signada como 1 (estándar) de 278 nm.. Todo lo mencionado nos acercaría a elucubrar la idea de secreción de EGF por las células madre mesenquimales del estroma de la gelatina de Wharton de cordón umbilical, ya sea con inducción o no de Bartonella bacilliformis, y del efecto que podría ocasionar en sí mismas (actividad autocrina); logrando generarse tejido epidermal. Ello se explicaría teniendo en cuenta que la actividad proliferativa y diferenciadora que ejerce el factor en. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. mención es no solo sobre células epiteliales sino también mesenquimales; y porque las acciones biologicas del EGF se inducen tras la unión a la molécula receptora, la cual se encuentra extensamente distribuida en numerosos tejidos de origen mesenquimal (mesodérmico) como el caso de los fibroblastos que forman la matriz extracelular de la dermis de la piel y en. A. donde se pueden encontrar factores de crecimiento. 21, 22. M. IC. Por otro lado sabemos que en las verrugas originadas por Bartonella. O Q. UI. bacilliformis durante la tercera y última fase de la enfermedad de Carrión,. BI. parece haber una neoformacion de tejido epidérmico, debido a la acción del. Y. factor de crecimiento epidermal (EGF), el cual podría ser sintetizado en. AC. IA. ciertas células estimuladas por péptidos presentes en la membrana de dicho. FA R. M. microorganismo. Esta nueva formación tisular está acompañada de las dos poblaciones celulares que componen la verruga: las células endoteliales y los. DE. dendrocitos dérmicos que son de origen mesenquimal y que expresan al. CA. factor XIIIa, HLA-DR, CD68 y al receptor del factor de crecimiento. IO TE. epidérmico, este ultimo probablemente implicado en generar el brote. BI. BL. verrucoso. 23. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 1. Prósper F, Verfaillie CM. Células madre adultas: características y perspectivas sobre su uso terapéutico. An Sist Sanit Navar [Revista en Internet]. 2003 [Acceso 3 de setiembre de 2011]; 26:345-56. Disponible en:. UI. M. IC. A. www.fundacionmhm.org/pdf/mono4/Articulos/articulo1.pdf. O Q. 2. Wagner S, Bernal J. Debate investigación con células madre: ¿crimen o. BI. cura? Rev Colomb Perspectiva [Revista en Internet]. 2008 [Acceso 20 de. IA. Y. julio de 2011]; 16:41-43. Disponible en:. FA R. M. AC. http://www.revistaperspectiva.com/archivos/revista/No%2016/debate.pdf. DE. 3. Giraldo J P, Madero J I, Ávila M, López C, Escobar M, Aparicio A,. CA. Ruiz J A. Las células madre. Rev Colomb Obstet Ginecol [Revista en la 2011]; 54(2): 87-96.. IO TE. Internet]. 2003 Junio [Acceso 17 de agosto de. BI. BL. Disponible en: http://www.scielo.org.co/scielo.php. 4. Salas Medina J. Obtención de cardiomiocitos a partir de CMMO:. evaluación de la diferenciación y funcionalidad para su utilización en cultivos en 3D. [Tesis Maestria]. México DF: Instituto Politécnico Nacional; 2010.. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 5.. Geijsen N, et al. Derivation of embryonic germ cells and male gametes from embryonic stem cells. Nature [Revista en Internet] 2003 December. [Acceso. 5. de. abril. de. 2012];. 427(6970).. Disponible. en. :. http://www.nature.com/nature/journal/v427/n6970/pdf/nature02247.pdf. 6.. 1Montalvo Valdivieso A. Evaluación genética y microanalitica de las. A. células madre de la gelatina de Wharton para su utilización en ingeniería. Flores-Figueroa E, Montesinos J, Mayani H. Células troncales. BI. 7.. O Q. UI. M. IC. tisular. [Tesis Doctoral]. Granada: Universidad de Granada; 2008.. IA. Y. mesenquimales: historia, biología, y aplicación clínica. Revista de. AC. Investigación Clínica [Revista en Internet] 2006 Septiembre-Octubre. FA R. M. [Acceso 14 de abril de 2011]; 58(5). Disponible en:. Can A, Balci D. Isolation, culture, and characterization of human umbilical. IO TE. 8.. CA. DE. www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0034. cord stroma derived mesenchymal stem cells. In: Mohan C. Vermuri et al. BI. BL. (eds.). Mesenchymal stem cells assay and applications. Methods in molecular biology, vol.698. [Revista en la Internet]. 2011 [Acceso 5 de. setiembre de 2011]. p.51-62. Disponible en: http://rd.springer.com/protocol/10.1007/978-1-60761-999-4_5#page-1. 9.. Garrido M. Características clínicas epidemiológicas de bartonelosis aguda y sus formas graves complicadas en pediatría en el Hospital General de. 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

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(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 22.. Marañes Gálvez C. Potencialidad queratinocitica de las células madre de la gelatina de Wharton para su utilización en ingeniería tisular. [Tesis Doctoral]. Granada: Universidad de Granada; 2010.. 23.. Saettone-León A. Verruga peruana. Dermatología Peruana. 2004; 14(2):. BI. BL. IO TE. CA. DE. FA R. M. AC. IA. Y. BI. O Q. UI. M. IC. A. 121 – 133.. 37 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

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