Efecto antibacteriano in vitro de los alcaloides totales extraídos de hojas de prosopis pallida (humb & bonpl ex willd ) kunth “algarrobo” frente a staphylococcus aureus y escherichia coli
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(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA. A esas personas importantes en nuestra vida, que siempre estuvieron listas para brindarnos toda su ayuda, ahora nos toca regresar un poquito de todo lo inmenso que nos han otorgado. Con todo nuestro cariño está tesis. IM. IC A. se la dedicamos a ustedes.. BI B. LI. O TE. C. A. D E. FA. R M. AC IA. Y. BI. O. Q U. Los autores. A nuestra asesora que en este andar por la vida, influyó con sus lecciones y experiencias en formarnos como unas persona de bien y preparadas para los retos que pone la vida, a ella le dedicamos cada una de estas páginas de nuestra tesis.. Los autores. -iEsta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. AGRADECIMIENTOS. Expresamos nuestros sinceros agradecimientos a todas las personas que nos ayudaron de. IC A. una u otra manera en el desarrollo de nuestra tesis y en especial a:. Q U. IM. Nuestros padres por darnos todo su apoyo incondicional.. O. A nuestra asesora Marilú Roxana Soto Vásquez por brindarnos la oportunidad de realizar. AC IA. Y. BI. este trabajo de investigación y guiarnos en el desarrollo del mismo.. R M. A la microbióloga Karina Soto Vásquez por brindarnos su apoyo en la parte experimental.. FA. A todas aquellas personas que de una u otra forma contribuyeron en la realización del. BI B. LI. O TE. C. A. D E. presente trabajo, nuestros más profundos agradecimientos.. Los autores. -iiEsta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. JURADO DICTAMINADOR. Dr. Segundo Guillermo Ruiz Reyes. R M. AC IA. Y. BI. O. Q U. IM. IC A. PRESIDENTE. MIEMBRO. BI B. LI. O TE. C. A. D E. FA. Dr. Edmundo Arturo Venegas Casanova. Mg. Marilú Roxana Soto Vásquez MIEMBRO. -iiiEsta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRESENTACIÓN. SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:. De conformidad con las disposiciones legales y vigentes de reglamentos de Grados y Títulos de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo –. IC A. La Libertad, sometemos a vuestro elevado criterio el presente trabajo de investigación. Q U. IM. titulado:. O. Efecto antibacteriano in vitro de los alcaloides totales extraídos de hojas de Prosopis. Y. BI. pallida (Humb. & Bonpl. ex Willd.) Kunth “algarrobo” frente a Staphylococcus aureus y. AC IA. Escherichia coli.. R M. Sea propicia esta oportunidad para manifestar el más profundo agradecimiento a nuestra. FA. Alma Mater y a toda su plana docente, por su meritoria labor de educadores y por la. A. D E. formación profesional que nos han brindado a través de sus enseñanzas.. O TE LI. jurado.. C. De manera muy especial agradecemos la valiosa colaboración de los señores miembros del. BI B. Dejamos de vuestra consideración Señores Miembros del Jurado, la respectiva calificación del presente informe.. Trujillo,…………………………de 2016. -ivEsta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE 1. Abstract…………………………..………………………………………………….... 2. Introducción……………………………………...………………………………….... 3. IC A. Resumen…………………………………..…………………………………………... Problema……………………………………………………….…………………..…. Q U. IM. 7. O. Hipótesis…………………………...………………………………………………….. AC IA. Y. BI. 7. Objetivos…………………………………………………………………………….... R M. 8. Material y método…………...………………………………………………………... D E. FA. 9. O TE. C. A. Resultados………………………………..………………………………………….... 17. BI B. LI. Discusión……………………………………….……………………………………... 14. Conclusión…………….………………………………………………………………. 20. Referencias bibliográficas…………………………………………………………...... 21. Anexos……………………………………………………………………………….... 26. -vEsta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN Numerosas son las investigaciones, a partir de fuentes naturales, que se realizan encaminadas a la búsqueda de nuevos compuestos con actividades biológicas; la ciencia moderna quiere conocer los principios activos responsables para procurar su síntesis o proponer modificaciones estructurales en busca de una mayor actividad. El objetivo del presente trabajo de investigación fue evaluar el efecto antibacteriano in vitro de los alcaloides totales de las hojas de Prosopis pallida frente a Staphylococcus. IC A. aureus y Escherichia coli. Para lo cual, las hojas fueron recolectadas del Bosque y. IM. Complejo Arqueológico el Cañoncillo del distrito de San José provincia de Pacasmayo. Q U. región La Libertad; ubicado a una altitud de 104 m s. n. m., a 07º 15' Latitud Sur y 79º 29'. BI. O. Longitud Oeste. Para la extracción de alcaloides se utilizó el método de fraccionamiento. Y. acido básico del extracto etanólico. A partir de 5 kg de hojas secas y pulverizadas se. AC IA. obtuvieron 0.8 g de alcaloides totales, obteniéndose un rendimiento de 0.016%. El efecto antibacteriano fue mediante el método modificado de pozos en agar; se empleó. R M. Staphylococcus aureus ATCC 13071 y Escherichia coli ATCC 25992. Se trabajó con. FA. concentraciones de alcaloides totales de 2.5 mg/ml, 5 mg/ml y 10 mg/ml disueltos en. D E. dimetilsulfóxido (DMSO) y cloranfenicol como control. Los halos de inhibición en. A. promedio frente a S. aureus fueron de 13.63 mm de diámetro a la concentración de 2.5. O TE. C. mg/ml, 16 mm de diámetro a 5 mg/ml y 18.38 mm de diámetro a una concentración de 10 mg/ml; para E. coli los halos de inhibición fueron de. 12 mm de diámetro a una. LI. concentración de 2.5 mg/ml, 14.13 mm de diámetro a 5 mg/ml y 15.38 mm de diámetro. BI B. para la concentración de 10 mg/ml. En conclusión los alcaloides totales extraídos de hojas secas de Prosopis pallida a las concentraciones de 2.5 mg/ml, 5 mg/ml y 10 mg/ml presentan efecto antibacteriano in vitro frente a Staphylococcus aureus y Escherichia coli.. Palabras. claves:. Efecto. antibacteriano,. alcaloides. totales,. Prosopis. pallida,. Staphylococcus aureus, Escherichia coli. -1Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT There are numerous investigations, from natural sources, which are made aimed at finding new compounds with biological activities; modern science wants to know the active ingredients responsible to ensure their synthesis or propose structural changes in search of greater activity. The objective of this research was to evaluate the in vitro antibacterial effect of total alkaloids Prosopis pallida leaves against Staphylococcus aureus and Escherichia coli. The. IC A. leaves were collected from the forest and the Archaeological Complex Cañoncillo District. IM. San José, Province Pacasmayo, region La Libertad; located at an altitude of 104 m s. n. m.,. Q U. at 07º 15 'South Latitude and 79º 29' West Longitude. The basic method of acid. BI. O. fractionation of the ethanol extract was used for the extraction of alkaloids. From 5 kg of. Y. powdered dry leaves and were obtained 0.8 g of total alkaloids, obtaining a yield of. AC IA. 0.016%. The antibacterial effect was by the modified method of wells in agar; He was used Staphylococcus aureus ATCC 13071 and Escherichia coli ATCC 25992. We worked with. R M. concentrations of total alkaloids of 2.5 mg/ml, 5 mg/ml and 10 mg/ml dissolved in. FA. dimethylsulfoxide (DMSO) and chloramphenicol as a control. The inhibition halos on. D E. average against S. aureus were 13.63 mm in diameter at a concentration of 2.5 mg/ml, 16. A. mm to 5 mg/ml and 18.38 mm diameter at a concentration of 10 mg/ml; E. coli inhibition. O TE. C. halos were 12 mm in diameter at a concentration of 2.5 mg/ml, 14.13 mm diameter to 5. LI. mg/ml and 15.38 mm for the concentration of 10 mg/ml.. BI B. In conclusion the total alkaloids extracted from dry leaves of Prosopis pallida at concentrations of 2.5 mg/ml, 5 mg/ml and 10 mg/ml have in vitro antibacterial effect against Staphylococcus aureus and Escherichia coli.. Keywords: Antibacterial effect, total alkaloids, Prosopis pallida, Staphylococcus aureus, Escherichia coli.. -2Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I.. INTRODUCCIÓN:. Muchos de los avances terapéuticos del siglo pasado podrían perderse debido a la propagación de la resistencia a los antimicrobianos, la consecuencia es que muchas enfermedades infecciosas podrían volverse incontrolables y extenderse rápidamente por todo el mundo. Un informe publicado por la Organización Mundial de la Salud "Antimicrobial resistance: global report on surveillance 2014" puso de manifiesto que la resistencia a los antimicrobianos es un fenómeno generalizado que puede afectar a. IC A. cualquier persona de cualquier edad y país (1).. IM. La resistencia a los antimicrobianos (o farmacorresistencia) se produce cuando los. Q U. microorganismos, sufren cambios que hacen que los medicamentos utilizados para curar. BI. O. las infecciones dejen de ser eficaces. El fenómeno es muy preocupante porque las. Y. infecciones por microorganismos resistentes pueden causar la muerte del paciente,. AC IA. transmitirse a otras personas y generar grandes costos tanto para los pacientes como para la sociedad. La falta de empeño de los gobiernos en la lucha contra estos problemas, las. R M. deficiencias de la vigilancia y la reducción del arsenal de instrumentos diagnósticos,. D E. FA. terapéuticos y preventivos dificultan el control de la farmacorresistencia (2). Con el propósito de elaborar un mapa bacteriológico y su resistencia antibiótica en las. C. A. Unidades de Cuidados Intensivos (UCI) del Perú se llevó a cabo una revisión sistemática, y. O TE. de los artículos identificados, resultó que Staphylococcus aureus fue el microorganismo. LI. más prevalente en UCI, excepto en vías urinarias. La resistencia de S. aureus a oxacilina. BI B. fue de 62.8%, y a vancomicina 0.9% de resistencia intermedia (3). Entre el 1 de enero y 31 de diciembre de 2003 se evaluó el perfil de sensibilidad y resistencia de S. aureus en pacientes hospitalizados y ambulatorios que utilizaron los servicios de salud del Hospital Nacional Hipólito Unanue; se obtuvo un patrón de resistencia en pacientes hospitalizados de 32% a oxacilina, 35% a gentamicina, 10% a amikacina, 58% a ciprofloxacina; y con relación a la sensibilidad, se obtuvo 100% a vancomicina. En cuanto a los pacientes ambulatorios, se obtuvo porcentajes de resistencia de 21% a oxacilina, 32% a gentamicina, 8% a amikacina, 52% a ciprofloxacina; y se obtuvo 100% de sensibilidad a vancomicina (4). -3Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. De un total de 222 cepas comensales de Escherichia coli de origen fecal, en Lima - Perú, se buscó establecer el nivel de resistencia a antimicrobianos; las frecuencias de resistencia encontradas, frente a los antimicrobianos evaluados, fueron: ampicilina (62,6%), cotrimoxazol (48,6%), tetraciclina (43,0%) y cloranfenicol (15,8%). Destacan los elevados niveles de resistencia a quinolonas: 32% al ácido nalidíxico y 12% a ciprofloxacino. Estos elevados niveles hacia las quinolonas en cepas comensales aisladas en niños, realzan el uso extendido y el impacto de consumo de este tipo de antimicrobiano en la comunidad,. IC A. mostrando el riesgo potencial de su pérdida de utilidad en el área (5).. IM. El uso de las plantas con fines curativos se remonta al principio de la historia de la. Q U. humanidad. En la actualidad cientos de plantas son utilizadas en la medicina, pero la. O. ciencia moderna quiere precisar, comparar y clasificar las diversas propiedades, para. BI. agrupar a las plantas de efectos similares, conocer los principios activos responsables,. Y. separarlos de las plantas que lo contienen, determinar sus estructuras químicas, procurar su. AC IA. síntesis, proponer modificaciones estructurales y finalmente, dar a conocer a la humanidad. R M. los resultados de los estudios (6,7).. FA. El género Prosopis L. es utilizada en la práctica de la medicina tradicional; las hojas,. D E. semillas secas y resinas frescas son los productos empleados para aliviar la tos, dolor de. A. estómago, bronquitis, resfrió y heridas críticas. Prosopis L. es originalmente descrito. O TE. C. dentro de la familia Fabaceae, subfamilia Mimosoideae y comprende alrededor de 47 especies. Todas las especies son originarias de los territorios áridos y semiáridos de las. BI B. LI. Américas, con unas pocas excepciones en África y el sureste de Asia (8). En la costa norte del Perú, el género Prosopis L. está representado por tres especies: Prosopis affinis, Prosopis juliflora y Prosopis pallida; siendo Prosopis pallida la especie dominante en la costa del Perú. La ocurrencia fue documentada desde Tacna a Tumbes, principalmente en las zonas costeras de 0 – 1500 m s. n. m.; sin embargo, parece estar restringida a la región centro – norte del país, desde Áncash hasta Tumbes, incluyendo Amazonas. P. pallida tiene como nombres vulgares los de: algarrobo, algarrobo cholo, huarango, guarango, tacco (en quechua), ong (en yunga) (8,9,10).. -4Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Prosopis pallida es un árbol de hasta 18 m de alto, o arbustos de 3 a 4 m. Presenta espinas divaricadas, una sola en cada nudo de 1 a 4 cm de longitud; a veces hay ramas con espinas y sin ellas en la misma planta, las hojas son bipinnadas y alternas cuando son jóvenes, las inflorescencias son de 8 – 14.5 cm de largo, 23 mm de ancho y un espesor de 10 – 13 mm, con flores subsésiles amarillo – verdosas y con pétalos libres lineales lanceolados, de 2 a 3 cm de largo. El fruto es carnoso dulce, comprimido, de color amarillo paja, recto o algo curvado y apiculado, de 10 a 28 cm de longitud, 11 a 13 mm de ancho, 5 a 8 mm de. IC A. espesor (8).. IM. Las plantas son laboratorios naturales donde se biosintetiza una gran cantidad de sustancias. Q U. químicas, de hecho se les considera como la fuente de compuestos químicos más. O. importante que existe; dentro de ellos un considerable número de estudios han sido. BI. encaminados hacia la evaluación de actividades antimicrobianas en extractos y aceites. Y. esenciales de plantas medicinales y aromáticas. Para ello se han empleado las técnicas in. AC IA. vitro dada la sencillez y reproducibilidad de las mismas (11).. R M. Numerosas investigaciones, a partir de fuentes naturales, se realizan encaminadas a la. FA. búsqueda de nuevos compuestos con actividades biológicas. Un gran porcentaje de los. D E. principios activos está comprendido dentro de los llamados metabolitos secundarios; entre. A. estos metabolitos son comunes aquellos con funciones defensivas contra insectos, bacterias. O TE. C. y hongos, como son los alcaloides, aminoácidos no proteicos, esteroides, fenoles, flavonoides, cumarinas, quinonas, taninos y terpenoides. Existe gran variación en cuanto a. LI. la concentración de estos en la planta, lo común es que las mayores concentraciones de. BI B. estos tipos de compuestos se encuentren en hojas, flores y semillas (12). Dentro de los compuestos químicos de las hojas de P. pallida se ha identificado a los alcaloides. Los alcaloides son uno de los grupos de metabolitos secundarios más diversos encontrados en los organismos vivos; este grupo incluye alrededor de 15000 metabolitos secundarios y se encuentran aproximadamente en un 20% en las especies de plantas vasculares. Una gran cantidad de alcaloides han sido empleados en la medicina, y muchos de ellos aún son prominentes fármacos hoy en día (13,14).. -5Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Los alcaloides son compuestos nitrogenados de carácter básico, que tienen generalmente, una estructura compleja con varios heterociclos. En las plantas los alcaloides no suelen repartirse homogéneamente en todo el organismo, sino que se acumulan preferentemente en determinados puntos como hojas u cortezas. A consecuencia de su elevada basicidad, generalmente están en forma de sales de las bases alcaloideas (tartratos, malatos, citratos, oxalatos, etc.). Estas sales son solubles en agua, mientras que las bases libres son insolubles en agua y solubles en disolventes orgánicos no polares (15,16).. IC A. Casi todos los alcaloides no volátiles son sólidos; los volátiles son en su mayor parte. IM. líquidos y a menudo no contienen oxígeno. En su mayor parte los alcaloides son blancos y. Q U. cristalizables, aunque unos pocos son amorfos. Los alcaloides son solubles en alcohol,. O. cloroformo o benceno, algunos en éter y unos pocos en éter de petróleo. La mayor parte de. BI. ellos tiene actividad fisiológica y algunos son muy venenosos. En la mayoría de los casos. AC IA. Y. son sustancias medicinales importantes de las plantas de las que derivan (17). Los alcaloides, generalmente se sintetizan a partir de aminoácidos, tales como triptófano,. R M. tirosina, fenilalanina, lisina, arginina y ornitina, solos o combinados con terpenoides. Los. FA. alcaloides reaccionan con grupos aniónicos y grupos nucleofílicos de aminoácidos o de. D E. otras moléculas como receptores y enzimas, y sus efectos inhibitorios del crecimiento de. A. microrganismos están dados por su capacidad de intercalarse con el ADN, detener la. O TE. C. síntesis de proteínas, inducir la apoptosis e inhibir enzimas del metabolismo de. LI. carbohidratos (18,19).. BI B. Estudios referidos al género Prosopis L. han identificado diversos metabolitos secundarios; Ardoino et al (2013), realizó la caracterización fitoquímica de Prosopis flexuosa var. flexuosa (algarrobo) y Prosopis flexuosa var. depressa (alpataco), en el cual se confirmó la presencia de flavonoides, compuestos fenólicos, taninos, lípidos, grupos esteroidales y triterpenos, saponinas y alcaloides (20). Thakur et al (2014), evaluó la actividad antibacteriana de Prosopis juliflora; los resultados mostraron que, extractos en una concentración de 100 mg/ml inhibieron significativamente el crecimiento de todas las bacterias del ensayo, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus -6Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. aureus,. Staphylococcus. epidermidis,. Streptococcus. pyogenes,. Salmonella. typhi y Salmonella typhimurium (21). Dos Santos et al (2013), evaluó la actividad antimicrobiana in vitro de extractos enriquecidos de alcaloides de vainas de Prosopis juliflora. El extracto básico clorofórmico (BCE), cuyos componentes principales eran juliprosopine (juliflorine), prosoflorine y juliprosine, mostraron actividad antibacteriana Gram-positiva contra Micrococcus luteus (MIC = 25 µg/ml), Staphylococcus aureus (MIC = 50 µg/ml). y Streptococcus. IC A. mutans (MIC = 50 µg/ml) (22).. IM. Bussmann et al (2010), estudió la actividad antibacteriana de las plantas medicinales del. Q U. norte de Perú, y reportó actividad antibacteriana del extracto etanólico de Prosopis pallida. BI. O. contra Staphylococcus aureus al formar un halo de inhibición de 15 mm de diámetro.. Y. Posteriormente (en el año 2011) evaluó la toxicidad potencial de extractos de las plantas. AC IA. medicinales utilizadas en la medicina tradicional en el norte de Perú, mostrando niveles de baja toxicidad de los extractos acuosos y alcohólicos de Prosopis pallida (LC 50 > 10000. FA. R M. μg/ml) (23,24).. D E. Sandoval y Zuñiga (2015) evaluaron el efecto antibacteriano in vitro del extracto fluido de hojas de Prosopis pallida frente a Staphylococcus aureus, demostrando que Prosopis. C. A. pallida 10 mg/ml tiene efecto antibacteriano in vitro frente a Staphylococcus aureus al. BI B. LI. PROBLEMA:. O TE. formar un halo de inhibición de 14.2 mm de diámetro (25).. ¿Tiene efecto antibacteriano in vitro los alcaloides totales extraídos de hojas de Prosopis pallida frente a Staphylococcus aureus y Escherichia coli? HIPOTESIS: Los alcaloides totales extraídos de hojas de Prosopis pallida presentan efecto antibacteriano in vitro sobre Staphylococcus aureus y Escherichia coli.. -7Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. OBJETIVOS: Objetivo general: . Evaluar el efecto antibacteriano in vitro de los alcaloides totales extraídos de hojas de Prosopis pallida frente a Staphylococcus aureus y Escherichia coli.. Objetivos específicos: Determinar el efecto antibacteriano in vitro de los alcaloides totales extraídos de. IC A. . hojas de Prosopis pallida frente a Staphylococcus aureus a las concentraciones. Q U. O. Determinar el efecto antibacteriano in vitro de los alcaloides totales extraídos de. BI. . IM. de 2.5 mg/ml, 5mg/ml y 10 mg/ml.. Y. hojas de Prosopis pallida frente a Escherichia coli a las concentraciones de 2.5. BI B. LI. O TE. C. A. D E. FA. R M. AC IA. mg/ml, 5mg/ml y 10 mg/ml.. -8Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II.. MATERIAL Y MÉTODO:. 2.1. Materiales y equipos 2.1.1. Material biológico: . Material botánico: Se utilizó 5 kg de hojas de Prosopis pallida, recolectadas del distrito de San José – Pacasmayo.. . Material microbiológico: Cepas de Staphylococcus aureus ATCC 13071 y Escherichia coli ATCC 25992, proporcionados por el Hospital Belén de Trujillo.. Materiales de uso común en laboratorio. IM. . IC A. 2.1.2. Material de vidrio:. Autoclave. . Balanza analítica. . Balanza triple brazo. . Baño maría. . Cocina eléctrica. . Estufa. Y AC IA R M. FA. D E. 2.1.4. Reactivos y solventes:. BI. O. . Q U. 2.1.3. Equipos e instrumentos:. Ácido clorhídrico 3 %. . Dimetilsulfóxido. . Cloroformo. . Alcohol 95o. BI B. LI. O TE. C. A. . . Ácido acético glacial. . Subnitrato de bismuto. . Yoduro de potasio. . Hidróxido de amonio. . Agua destilada. 2.1.5. 0tros materiales . Papel indicador de pH. -9Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2. Método 2.2.1. Recolección de la muestra: La especie Prosopis pallida se recolectó del Bosque y Complejo Arqueológico el Cañoncillo del distrito de San José, provincia de Pacasmayo, región La Libertad; ubicado a una altitud de 104 m s. n. m., a 07º 15' Latitud Sur y 79º 29' Longitud Oeste. La recolección de la especie se realizó por el método convencional o clásico de herborización, seleccionando el material en el campo y verificando que esté en buenas condiciones (27).. IC A. 2.2.2. Identificación y determinación taxonómica de la especie:. IM. Se llevó un ejemplar de la planta al Herbarium Truxillense (HUT) para su. Q U. identificación y se depositó con el código N° 57951 (ver anexo N° 1) (27).. O. 2.2.3. Preparación de la muestra:. Y. BI. Selección de la muestra: El material vegetal recolectado fue transportado al. AC IA. laboratorio de Farmacognosia de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, en donde se eliminó las sustancias. R M. extrañas presentes en el material vegetal.. FA. Lavado de la droga: Luego de la separación de las sustancias extrañas, se. D E. procedió a lavar el material vegetal con agua destilada, seguido de una. A. desinfección utilizando hipoclorito de sodio a una concentración de 200. O TE. C. ppm durante 5 minutos. Posteriormente se realizó un enjuague con suficiente agua destilada estéril, esto es para retirar los residuos de. LI. hipoclorito.. BI B. Secado: Una vez lavado las hojas se procedió a adecuar la droga en bolsas de papel Kraft con orificios, posteriormente se colocó en la estufa a una temperatura de 40 °C y se realizó la determinación de peso cada 24 horas hasta valores constantes. Pulverización: Una vez secada las hojas se pulverizó con ayuda de un mortero. Tamizaje: El material obtenido de la pulverización, se pasó a través de los tamices Nº 2, 1.2, 0.7, 0.3, y se trabajó con el tamiz N° 0.7.. -10Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Almacenamiento: El polvo de las hojas se guardó en frascos de vidrio de color ámbar de boca ancha (27). 2.2.4. Preparación del extracto etanólico bruto: 5 kg de hojas desecadas, pulverizadas y tamizadas fueron maceradas con etanol al 95% a temperatura ambiente durante 72 horas. Posteriormente, el material se filtró y se sometió a una nueva extracción durante el mismo período. Las soluciones extractivas, fueron combinadas para luego ser concentradas en Baño María a una temperatura de 50 °C hasta obtener un residuo viscoso, llamado. IC A. extracto etanólico bruto (EEB) (28).. IM. 2.2.5. Obtención de la fracción de alcaloides totales:. Q U. El EEB fue tratado con solución de ácido clorhídrico al 3% bajo agitación. BI. O. mecánica y se filtró a través de papel filtro, la porción insoluble fue desechada. Y. cuando no presentó reacción positiva para la prueba de alcaloides con. AC IA. Dragendorff; la porción acuosa ácida fue tratada varias veces con cloroformo. La fase de cloroformo se evaporó dando un residuo oleoso, este material,. R M. llamado fracción de cloroformo obtenida a pH ácido, fue descartado cuando. FA. dio negativo para la presencia de alcaloides. La fase acuosa ácida se hizo. D E. básica, desgrasada en frio, con una solución de hidróxido de amonio a pH 8 y. A. se extrajo con cloroformo hasta presentar reacción negativa con el reactivo. O TE. C. Dragendorff. La fase de cloroformo obtenida a pH alcalino, fue concentrada y se llamó fracción de alcaloides totales (FAT). Posteriormente la FAT se. LI. disolvió con cantidad suficiente de dimetilsulfóxido para su ensayo. BI B. microbiológico (28).. 2.2.6. Ensayo microbiológico: Se realizó por el Método modificado de pozos en agar (29). Tratamiento de la muestra: A partir de la fracción de alcaloides totales, se preparó disoluciones de 2.5 mg/ml, 5 mg/ml y 10 mg/ml; empleando como solvente dimetilsulfóxido (DMSO).. -11Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Preparación del cultivo microbiano (Cultivo Overnight) Se preparó el cultivo a partir de las cepas bacterianas que están en reserva criogénica mantenidas a -80 °C y luego se procedió a la siembra e incubación de los microorganismos en las condiciones específicas para cada género. Microorganismos empleados en el ensayo microbiológico: Bacterias. Código ATCC. 1. Staphylococcus aureus. 13071. 2. Escherichia coli. IC A. No. IM. 25992. Q U. Procedimiento. BI. O. Se procedió a la siembra a partir de los cultivos overnight 100 μl en el. Y. centro de la placa Petri de 90x14 mm y se realizó un vertido de 25 ml de. AC IA. agar (MacConkey o Tripticasa de Soya) sobre ella. Se homogenizó y se dejó solidificar bajo corriente de flujo. La concentración final de la población. R M. bacteriana estuvo alrededor de 1x107 UFC/ml.. máximo. cuatro. pozos,. los. cuales. estuvieron. distribuidos. D E. como. FA. En una placa de 90 mm de diámetro se realizó, con ayuda de un sacabocado,. A. uniformemente a unos 15 mm del borde de la placa. Posteriormente se. O TE. C. sellaron con 0.1 ml del mismo agar, para evitar la dispersión de las muestras.. LI. Finalmente, se colocaron 200 μl de las muestras diluidas (2.5 mg/ml, 5. BI B. mg/ml y 10 mg/ml), del control (cloranfenicol 5 µg/ml). y del blanco. (DMSO) en cada perforación. Para lograr una mayor difusión de las muestras se dejó reposar por unos minutos a temperatura ambiente, finalmente se incubó las placas a 37 °C, por un periodo de 24 h (29).. 2.2.7. Lectura de los resultados: Después de 24 horas de incubación, se midió el diámetro de cada halo o zona de inhibición (incluido el diámetro del pozo) y se expresó en milímetros. Las mediciones se realizaron colocando una regla sobre el reverso de la placa (29). -12Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.8. Análisis estadístico de los datos: Se realizó un análisis estadístico con la variable dependiente diámetro y como variable independiente, tratamiento. Para determinar el efecto antibacteriano se utilizó el análisis de varianza para un diseño completamente al azar y considerando un nivel de significancia de 0.05; asimismo se usó la prueba de Duncan considerando un nivel de significancia de 0.05. Un valor de p < 0,05 fue considerado como significativo. El procesamiento estadístico de los datos se realizó mediante el programa. IC A. informático SPSS (Statistical Package for Social Sciences) versión 22 para. IM. Windows; así mismo, se contó con el apoyo de una hoja de cálculo de Excel. BI B. LI. O TE. C. A. D E. FA. R M. AC IA. Y. BI. O. Q U. 2010 (20).. -13Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESULTADOS. BI B. LI. O TE. C. A. D E. FA. R M. AC IA. Y. BI. O. Q U. IM. IC A. III.. EEB: Extracto etanólico bruto SAA: Solución acuosa ácida FCA: Fase de cloroformo obtenido a pH ácido SAAD: Solución acuosa alcalina desgrasada FAT: Fracción de alcaloides totales SAB: Solución acuosa alcalina. Figura 1. Fraccionamiento ácido-base del extracto etanólico de hojas de Prosopis pallida.. -14Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 1. Medida de los halos de inhibición producidos por exposición de los alcaloides totales de las hojas de Prosopis pallida frente a Staphylococcus aureus (ATCC 13071) y Escherichia coli (ATCC 25992). Halo a las 24 horas.. Microorganismos. Q U. Concentración de alcaloides totales. IM. IC A. Halo de inhibición (mm). Blanco. Cloranfenicol DMSO. AC IA. Y. BI. O. (mg/ml). Control. 5. 10. FA. R M. 2,5. 5 µg/ml. D E. Staphylococcus aureus. 13.63±0.518* 16.00±0.000* 18.38±0.518*. 29.25±0.463*. 0. 26.13±0.354*. 0. LI. O TE. C. A. ATCC 13071. BI B. Escherichia coli. 12.00±0.00*. 14.13±0.354* 15.38±0.518*. ATCC 25992. *: Promedio del halo de inhibición de 8 placas y desviación estándar.. -15Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(22) BI B. LI. O TE. C. A. D E. FA. R M. AC IA. Y. BI. O. Q U. IM. IC A. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Figura 2. Diagrama de barras para el efecto de las diferentes concentraciones de alcaloides totales de Prosopis pallida sobre el crecimiento in vitro de Staphylococcus aureus y Escherichia coli.. -16Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IV.. DISCUSIÓN. Numerosas son las investigaciones, a partir de fuentes naturales, que se realizan encaminadas a la búsqueda de nuevos compuestos con actividades biológicas. Un gran porcentaje de los principios activos están comprendidos dentro de los llamados metabolitos secundarios, entre estos metabolitos son comunes aquellos con funciones defensivas contra insectos, bacterias y hongos, como son los alcaloides (12). El fraccionamiento ácido-base del extracto etanólico de 5 kg de hojas secas y pulverizadas. IC A. de Prosopis pallida dio lugar a 0.8 g de alcaloides totales (Figura 1), el porcentaje de. IM. rendimiento del extracto fue de 0.016%. Este hallazgo no se pudo correlacionar con. Q U. investigaciones anteriores en la especie Prosopis pallida, sin embargo, existen trabajos. BI. O. referentes en Prosopis juliflora, Tabosa et al (2000), en el cual se reportó un porcentaje de. Y. rendimiento de 0.025% para la extracción de alcaloides totales empleando como solvente. AC IA. una solución etanólica (28).. R M. Las diferencias en el porcentaje de rendimiento es debido a que los metabolitos. FA. secundarios se inducen cuando las plantas son expuestas a condiciones adversas tales. D E. como: el consumo por herbívoros, el ataque por microorganismo, la competencia por el espacio de suelo, la exposición a la luz solar, la composición y concentración de los. C. A. diferentes nutrientes y otros tipos de estrés abióticos; además, no todos los metabolitos se. O TE. encuentran en todos los grupos de plantas, sino que su producción pude estar restringida a. LI. una determinada familia de plantas, a un género, o incluso a algunas especies; en el caso de. BI B. Prosopis pallida y Prosopis juliflora, los reportes muestran valores cercanos (diferencia de 0.009%) en el porcentaje de rendimiento de alcaloides totales; a pesar de esto, pueden existir variaciones entre las mismas especies, Dos Santos et al (2013), obtuvo un porcentaje de rendimiento de 0.13% para la especie Prosopis pallida, la diferencia de estos resultados, pese a ser de la misma especie, pueden deberse a los diferentes medios ambientales a los cuales están sometidos durante su desarrollo (18,22,28,30). En la tabla 1 se presentan las medidas de los halos de inhibición producidos por exposición de los alcaloides totales de las hojas de Prosopis pallida frente a Staphylococcus aureus (ATCC 13071) y Escherichia coli (ATCC 25992); así tenemos, para Staphylococcus -17Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. aureus la concentración de 2.5 mg/ml mostró una media de 13.63 mm de diámetro, la concentración de 5 mg/ml una media de 16 mm de diámetro y la concentración de 10 mg/ml una media de 18.38 mm de diámetro; para el caso de Escherichia. coli la. concentración de 2.5 mg/ml mostró una media de 12 mm de diámetro, la concentración de 5 mg/ml una media de 14.13 mm de diámetro y la concentración de 10 mg/ml una media de 15.38 mm de diámetro. El experimento de control de disolvente (DMSO) utilizado para la preparación de las concentraciones de alcaloides totales no mostró inhibición de las bacterias, lo que indica que fueron los alcaloides totales en sí y no el disolvente el que. IC A. inhibió el crecimiento de las bacterias de prueba, además, el efecto es dosis dependiente,. IM. debido a que la concentración de 10 mg/ml tuvo un efecto mayor que la concentración de 5. Q U. mg/ml y este, un efecto mayor a la de 2.5 mg/ml. El cloranfenicol mostró diámetros de. BI. O. inhibición variables contra las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Al comparar las. Y. medias de los halos de inhibición de los diferentes grupos, mediante el análisis de varianza. AC IA. (ANOVA), se obtuvo un p-valor menor de 0.05; esto significa que hay diferencia estadística entre los resultados de los grupos de intervención, y al hacer la prueba post hoc. R M. (Anexo 6) se observó que la diferencia existe entre los diferentes grupos de intervención;. FA. estos resultados mostraron que las tres concentraciones de los alcaloides totales. D E. presentaron actividad antibacteriana (que podría ser bactericida o bacteriostática). C. A. estadísticamente significativa frente a Staphylococcus aureus y Escherichia coli (21,22).. O TE. Los resultados mostrados no se pudieron corroborar con investigaciones en la especie. LI. Prosopis pallida, debido a la carencia de artículos publicados en torno a esta especie, sin la actividad. BI B. embargo, en Prosopis juliflora, Dos Santos et al (2013), evaluó. antimicrobiana in vitro de extractos enriquecidos con alcaloides, cuyos componentes principales fueron juliprosopine (juliflorine), prosoflorine y juliprosine; exponiendo como resultado actividad antibacteriana Gram-positiva contra Staphylococcus aureus (MIC = 50 µg/ml ) y ausencia de actividad frente a Gram-negativos (Escherichia coli) (22). Los valores más altos del diámetro del halo de inhibición (13.63±0.518; 16.00±0.000; 18.38±0.518) fueron exhibidos en S. aureus, mientras que E. coli presentó los halos de menor diámetro (12.00±0.00; 14.13±0.354; 15.38±0.518). Shachi et al (2011), observó que en Prosopis juliflora los alcaloides de piperidina están presentes en todas las fracciones -18Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. activas de esta especie; el mecanismo de acción de los alcaloides piperidínicos sobre las bacterias Gram-positivas se deben a su alta citotoxicidad generada mediante el bloqueo de los canales de calcio en la membrana celular, y las características anfóteras de estos alcaloides irrumpen en la estabilidad de la pared celular. Esto explicaría el porqué las bacterias Gram-positivas, que poseen una gruesa capa de pared celular, presentaron una sensibilidad mayor que bacterias Gram-negativas (31). La actividad antibacteriana en Gram-negativas, se debe a que los alcaloides poseen la. IC A. capacidad de intercalarse con el ADN, de detener la síntesis de proteínas, inducir la. IM. apoptosis e inhibir las enzimas del metabolismo de carbohidratos. La interacción de estos. Q U. alcaloides con el ADN, las proteínas y enzimas de la transcripción, contribuye a los efectos. BI. O. tóxicos contra estas bacterias. (20,24).. Y. Teniendo en cuenta que los alcaloides totales presentaron tendencia a inhibir el crecimiento. AC IA. de Staphylococcus aureus y Escherichia coli, la acción antibacteriana mostrada debe evaluarse incluyendo el aislamiento de cada uno de los alcaloide presentes en Prosopis. R M. pallida, por lo cual, se recomienda continuar con ensayos de actividad biológica más. FA. específicos, para permitir obtener resultados más completos, a fin de determinar si estos. D E. compuestos pueden llegar a convertirse en nuevos antibióticos y/o en compuestos plantilla. BI B. LI. O TE. C. A. para el diseño de nuevos medicamentos antibacterianos (21,23,32).. -19Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. V.. CONCLUSIONES. 1. Los alcaloides totales extraídos de las hojas de Prosopis pallida presentaron actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus y Escherichia coli a las concentraciones de 2.5 mg/ml, 5 mg/ml y 10 mg/ml.. 2. El porcentaje de rendimiento de la extracción de alcaloides totales de las hojas de. BI B. LI. O TE. C. A. D E. FA. R M. AC IA. Y. BI. O. Q U. IM. IC A. Prosopis pallida fue de 0.016%.. -20Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. VI.. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 1. Organización Mundial de la Salud [Internet]. Ginebra: OMS [actualizado Abr 2015;. citado. 10. Nov. 2015].. Disponible. en:. http://www.who.int/features/factfiles/antimicrobial_resistance/es/ 2. Organización Mundial de la Salud [Internet]. Ginebra: OMS [actualizado 16 Mar 2011; citado 10 Nov 2015]. Disponible en: http://www.who.int/features/qa/75/es/ 3. Izquierdo G, Chirinos J, Alfaro C, Soriano C. Resistencia antibiótica de bacterias de. IC A. causantes. infecciones. 2012. [Citado. 10. Nov. 2015];. 15(3):135-140.. Q U. línea]. IM. en unidades intensivos del Perú: revisión sistemática. Rev Per Soc Med Intern [en Disponible. en:. BI. O. http://sisbib.unmsm.edu.pe/BVRevistas/spmi/v15n3/resistencia_antibiotica.htm#Re. Y. sumen. AC IA. 4. Mamani E, Luján D, Pajuelo G. Perfil de sensibilidad y resistencia de Staphylococcus aureus. Experiencia en el Hospital Nacional Hipólito Unanue.. R M. An Fac Med [en línea] 2006 [Citado 10 Nov 2015]; 67(2):120-124. Disponible en:. FA. http://www.scielo.org.pe/pdf/afm/v67n2/a04v67n2.pdf. D E. 5. Pons M, Mosquito S, Ochoa T, Vargas M, Molina M, Lluque A, et al. Niveles de. A. resistencia a quinolonas y otros antimicrobianos en cepas de Escherichia coli. C. comensales en niños de la zona periurbana de Lima, Perú. Rev perú med exp salud. O TE. publica [en línea] 2012 [Citado 10 Nov 2015]; 29(1):82-86. Disponible en:. LI. http://www.scielo.org.pe/pdf/rins/v29n1/a12v29n1.pdf. BI B. 6. Hernandez R, Gally M. Plantas medicinales. México: Árbol Editorial; 1981. p. 7-8. Disponible. en:. http://books.google.com.pe/books?id=PwvTU-. CE6mIC&printsec=frontcover&dq=PLANTA+MEDICINALES&hl=es&sa=X&ei =e9Q9UuuaHYL88gTTsoHYDA&ved=0CDkQ6AEwAg#v=onepage&q=PLANT A%20MEDICINALES&f=false 7. Lock O, Investigación fitoquímica. Perú: Pontificia Universidad Católica del Perú; 1994. p. 1-2.. -21Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
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(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 29. Rojas J, García A, López A. Evaluación de dos metodologías para determinar la actividad antimicrobiana de plantas medicinales. BLACPMA [en línea] 2005 [Citado. 21. Nov. 2015];. 4(2):28-32.. Disponible. en:. http://www.redalyc.org/pdf/856/85640204.pdf 30. Arias M, Angarita M, Aguirre A, Restrepo J, Montoya C. Estrategias para incrementar la producción de metabolitos secundarios en cultivos de células vegetales. Rev Fac Nal Agr Medellín [en línea] 2009 [Citado 23 Abr 2016]; Disponible. en:. http://www.scielo.org.co/pdf/rfnam/v62n1/a15v62n1.pdf. IC A. 62(1):4881-4895.. IM. 31. Shachi S, Verna S. Antibacterial properties of Alkaloid rich fractions obtained from. Q U. various parts of Prosopis juliflora. IJPSR [en línea] 2011 [Citado 23 Abr 2016];. BI. O. 2(3):114-120. Disponible en: http://www.ijpsr.info/docs/IJPSR11-02-03-07.pdf. metabolitos. secundarios. aislados. de. dos. especies. del. AC IA. vitro de. Y. 32. Patiño O, Prieto J, Lozano J, Lesmes L, Cuca L. Propiedades antibacterianas in. género Zanthoxylum (Rutaceae). Scielo [en línea] 2011 [Citado 23 Abr 2016];. BI B. LI. O TE. C. A. D E. FA. R M. 45(3):431-438. Disponible en: http://scielo.sld.cu/pdf/far/v45n3/far12311.pdf. -25Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ANEXOS. BI B. LI. O TE. C. A. D E. FA. R M. AC IA. Y. BI. O. Q U. IM. IC A. Anexo 1. Certificado botánico de identificación y determinación taxonómica de la especie Prosopis pallida.. -26Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo 2. Lugar de recolección de la muestra, Bosque y Complejo Arqueológico el. BI B. LI. O TE. C. A. D E. FA. R M. AC IA. Y. BI. O. Q U. IM. IC A. Cañoncillo.. -27Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo 3. Recolección, preparación del extracto etanólico bruto y obtención de la fracción. BI. O. Q U. IM. IC A. de alcaloides totales.. Fig.2. Procesamiento de la muestra.. BI B. LI. O TE. C. A. D E. FA. R M. AC IA. Y. Fig.1. Recoleccion de la muestra.. Fig.3. Fraccionamiento ácidobase del extracto etanólico, dirigido a la obtención de alcaloides totales.. Fig.4. Obtención de la fracción de alcaloides totales.. -28Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(35) O. Q U. IM. IC A. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. R M. AC IA. Y. BI. Fig.5. Diferentes disoluciones (2.5 mg/ml, 5 mg/ml y 10 mg/ml), a partir de la fracción de alcaloides totales, empleando como solvente dimetilsulfóxido (DMSO).. FA. Anexo 4. Ensayo microbiológico de los alcaloides totales extraídos de hojas de Prosopis. BI B. LI. O TE. C. A. D E. pallida frente a Staphylococcus aureus (ATCC 13071) y Escherichia coli (ATCC 25992).. Fig.1. Ajustando con solución fisiológica al patrón de turbidez de McFarland N° 0.5 (108 UFC/mL) los microorganismos.. Fig.2. Colocación de 25 ml de Agar MacConkey y Agar Tripticasa de Soya.. -29Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(36) IC A. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Fig.4. Colocación de 200 µl de los alcaloides totales en los pozos de excavación.. BI B. LI. O TE. C. A. D E. FA. R M. AC IA. Y. BI. O. Q U. IM. Fig.3. Preparación de las diluciones de las muestras.. Fig.5. Placas Petri con halos de inhibición después de ser incubadas.. -30Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(37) BI. O. Q U. IM. IC A. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. BI B. LI. O TE. C. A. D E. FA. R M. AC IA. Y. Fig.6. B: Blanco; C1: Concentración de P. pallida 2,5 mg/ml; C2: Concentración de P. pallida 5 mg/ml; C3: Concentración de P. pallida 10 mg/ml frente a Escherichia coli (ATCC 25992). Agar MacConkey.. Fig.7. Halos de inhibición del cloranfenicol frente a Escherichia coli (ATCC 25992). Agar McConkey. -31Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(38) BI. O. Q U. IM. IC A. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. BI B. LI. O TE. C. A. D E. FA. R M. AC IA. Y. Fig.8. B: Blanco; C1: Concentración de P. pallida 2,5 mg/ml; C2: Concentración de P. pallida 5 mg/ml; C3: Concentración de P. pallida 10 mg/ml frente a Staphylococcus aureus (ATCC 13071). Agar Tripticasa de Soya.. Fig.9. Halos de inhibición del cloranfenicol frente a Staphylococcus aureus (ATCC 13071). Agar Tripticasa de Soya.. -32Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo 5. Medida de los halos de inhibición producidos por exposición de los alcaloides totales de las hojas de Prosopis pallida frente a Staphylococcus aureus (ATCC 13071) y Escherichia coli (ATCC 25992). Halo a las 24 horas.. Microorganismo. HALOS DE INHIBICIÓN* (mm) Concentración de alcaloides totales. Cloranfenicol. DMSO. IC A. (mg/ml) 5. 10. 5 µg/ml. 12. 14. 16. 26. 12. 14. 16. 12. 14. 15. Escherichia coli. 12. 15. 15. ATCC 25992. 12. 14. 15. 12. 14. 12. 14. 12. 0. 26. 0. 26. 0. 15. 26. 0. 16. 26. 0. 14. 15. 26. 0. 14. 16. FA. 18. 30. 0. 14. 16. 18. 29. 0. 16. 18. 29. 0. 16. 18. 30. 0. 14. 16. 19. 29. 0. 13. 16. 18. 29. 0. 13. 16. 19. 29. 0. 13. 16. 19. 29. 0. BI. Y. AC IA. R M. D E. A. C O TE. BI B. LI. ATCC 13071. Q U 26. O. 0. 14. aureus. 0. 27. 14. Staphylococcus. IM. 2,5. Leyenda: DMSO: Dimetilsulfóxido * Incluye diámetro del pozo. -33Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(40) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Anexo 6. Análisis estadístico de diferentes concentraciones de alcaloides totales de las hojas de Prosopis pallida frente a Staphylococcus aureus (ATCC 13071) y Escherichia coli (ATCC 25992). DESCRIPTIVOS 95% del intervalo de confianza para la media Mínimo. estándar. inferior. superior. 8. ,00. ,000. ,000. ,00. ,00. b.. 8. 12,00. ,000. ,000. 12,00. c.. 8. 14,13. ,354. ,125. 13,83. d.. 8. 15,38. ,518. ,183. e.. 8. 26,13. ,354. Total. 40. 13,53. 8,452. a.. 8. ,00. b.. 8. 13,63. c.. 8. 16,00. d.. 8. 18,38. e.. 8. Total. Máximo. 0. 0. 12,00. 12. 12. 14,42. 14. 15. 14,94. 15,81. 15. 16. 25,83. 26,42. 26. 27. 1,336. 10,82. 16,23. 0. 27. ,000. ,000. ,00. ,00. 0. 0. ,183. 13,19. 14,06. 13. 14. ,000. ,000. 16,00. 16,00. 16. 16. ,518. ,183. 17,94. 18,81. 18. 19. 29,25. ,463. ,164. 28,86. 29,64. 29. 30. 40. 15,45. 9,522. 1,506. 12,40. 18,50. 0. 30. O. BI Y. AC IA. FA. R M. ,125. ,518. IM. a.. IC A. Límite. Q U. Límite. D E. Desviación. O TE. LI. 2. C. A. 1. Media. BI B. N. Leyenda: 1. Halos de Escherichia coli (ATCC 25992) 2. Halos de Staphylococcus aureus (ATCC 13071) a. DMSO b. Prosopis pallida 2.5 mg/ml c. Prosopis pallida 5 mg/ml d. Prosopis pallida 10 mg/ml e. Cloranfenicol 5 µg/ml. -34Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(41) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRUEBA DE HOMOGENEIDAD DE VARIANZAS Estadístico de. df1. df2. Sig.. Levene 9,606. 4. 35. ,000. Halos S. aureus. 27,058. 4. 35. ,000. BI. O. Q U. IM. IC A. Halos E. coli. AC IA. Y. ANOVA Suma de. gl. R M. cuadrados. Dentro de grupos. C. A. Total. 4. 695,588. 6716,017. ,000. 3,625. 35. ,104. 2785,975. 39. 3530,650. 4. 882,663. 5884,417. ,000. 5,250. 35. ,150. 3535,900. 39. LI. Dentro de grupos. BI B. aureus. O TE. Entre grupos Halos S.. Sig.. D E. Halos E. coli. F. cuadrática. 2782,350. FA. Entre grupos. Media. Total. -35Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
(42) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRUEBAS POST HOC Halos Escherichia coli Duncana Tratamiento. Subconjunto para alfa = 0.05 N. 1. DMSO. 8. ,00. Prosopis pallida 2.5. 8. 2. 3. 4. 5. 12,00. 8. Prosopis pallida 10. 8. 14,13. 15,38. IM. Prosopis pallida 5 mg/ml. IC A. mg/ml. Q U. mg/ml. 1,000. 1,000. BI. 1,000. Sig.. O. 8. Cloranfenicol 5 µg/ml. 26,13 1,000. 1,000. FA. R M. AC IA. Y. Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a. Utiliza el tamaño de la muestra de la media armónica = 8,000.. D E. Halos Staphylococcus aureus. A. Duncana. O TE LI. DMSO. BI B. Prosopis pallida 2.5 mg/ml. Subconjunto para alfa = 0.05. C. Tratamiento. N. 1. 8. ,00. 8. Prosopis pallida 5 mg/ml. 8. Prosopis pallida 10. 8. 2. 3. 4. 5. 13,63. 16,00 18,38. mg/ml Cloranfenicol 5 µg/ml Sig.. 8. 29,25 1,000. 1,000. 1,000. 1,000. 1,000. Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a. Utiliza el tamaño de la muestra de la media armónica = 8,000.. -36Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.
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