Estudio de la fosforilación de eIF4E y del factor 4E-T en situaciones de estrés celular en cáncer de mama

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(2)   . . I .

(3)  . II . .

(4)   DepartamentodeBiologíayBioquímicaMolecular ‹†ƒ††‡‹‘“—À‹ ƒǡ ƒ —Ž–ƒ††‡‡†‹ ‹ƒ . EstudiodelafosforilacióndeeIF4Eydelfactor4EͲT ensituacionesdeestréscelularencáncerdemama . MemoriadeTesisDoctoralpresentadaporAlbaMartínezDíazparaoptaral gradodeDoctoraenlaUniversidadAutónomadeBarcelona.  TrabajorealizadoenelDepartamentodePatologíaMoleculardelHospital UniversitarioValld’Hebron,bajoladireccióndelDr.SantiagoRamónyCajal AgüerasydelDr.TrondAasen.  Barcelona,2014   Doctoranda Director  Codirector  Tutor     Alba  Santiago  Trond  Anna Martínez RamónyCajal Aasen Meseguer. III .

(5)  . IV . .

(6)                . Amispadresyabuelas, atiAgus, yenespecialamisyayos,AvelinoyFélix . . V .

(7) .   . VI . .

(8)               .  “Lacienciasecomponedeerrores, queasuvez, sonlospasoshacialaverdad”  ͲJulioVerne. VII .

(9)  . VIII . .

(10)      ÍNDICE . . IX .

(11) . X . .

(12) Índicedefiguras..............................................................................................................XVII Índicedetablas................................................................................................................XXI Abreviaturas....................................................................................................................XXV Resumen........................................................................................................................XXXI 1.INTRODUCCIÓN...........................................................................................................Ͳ3Ͳ 1.1Traducción(Síntesisdeproteínas)....................................................................................Ͳ3Ͳ 1.1.1Regulacióndelatraduccióncapdependiente............................................................Ͳ5Ͳ 1.1.2IniciodelatraduccióncapͲdependiente....................................................................Ͳ6Ͳ 1.1.2.1FactoresimplicadosenlaformacióndelcomplejoeIF4F....................................Ͳ7Ͳ eIF4E............................................................................................................................. Ͳ7Ͳ eIF4A............................................................................................................................ Ͳ7Ͳ eIF4G............................................................................................................................ Ͳ9Ͳ 1.2.eIF4E............................................................................................................................... .Ͳ10Ͳ 1.2.1FuncióndeeIF4E.......................................................................................................Ͳ12Ͳ 1.2.1.1eIF4EcomofactordeiniciodelatraduccióncapͲdependiente........................Ͳ12Ͳ 1.2.1.2eIF4EcomotransportadordemRNAsdenúcleoacitoplasma.........................Ͳ12Ͳ 1.2.1.3OtrasfuncionesdeeIF4E...................................................................................Ͳ13Ͳ 1.2.2RegulacióndeeIF4E..................................................................................................Ͳ13Ͳ 1.2.2.14EͲBPs................................................................................................................Ͳ14Ͳ 1.2.2.2RegulacióneIF4EvíaMnk1/2.............................................................................Ͳ15Ͳ 1.2.2.2.1Mnks...........................................................................................................Ͳ16Ͳ 1.2.2.2.2EfectosdelafosforilacióndeeIF4E............................................................Ͳ18Ͳ 1.2.2.3OtrasmodificacionesyregulacióndeeIF4E......................................................Ͳ19Ͳ 1.3Traducciónycáncer.........................................................................................................Ͳ20Ͳ 1.3.1eIF4Eycáncer...........................................................................................................Ͳ22Ͳ 1.3.1.1PapeldelafosforilacióndeeIF4Eencáncer.....................................................Ͳ24Ͳ 1.3.1.2eIF4Eencáncerdemama..................................................................................Ͳ25Ͳ 1.4Transiciónepiteliomesénquima(EMT)...........................................................................Ͳ26Ͳ 1.4.1Cadherinas................................................................................................................Ͳ27Ͳ 1.4.2PapeldeeIF4Eenlainvasiónymigracióncelular....................................................Ͳ30Ͳ 1.54EͲT............................................................................................................................... ...Ͳ31Ͳ 1.5.1Regulación4EͲT.........................................................................................................Ͳ31Ͳ 1.5.2Función4EͲT.............................................................................................................Ͳ31Ͳ 1.6Estréscelular....................................................................................................................Ͳ33Ͳ XI .

(13) 1.6.1Gránulosdeestrés(GS)............................................................................................Ͳ34Ͳ 1.6.2Processingbodies(PBs).............................................................................................Ͳ36Ͳ 1.6.2.1HUR(ELAVlikeRNAbindingprotein1).............................................................Ͳ37Ͳ 1.6.2.2Ago2...................................................................................................................Ͳ37Ͳ 1.6.3eIF4Eenestrés..........................................................................................................Ͳ38Ͳ 1.6.3.1eIF4Ey4EͲTenestrés........................................................................................Ͳ40Ͳ. 2.HIPÓTESISDELTRABAJO...........................................................................................Ͳ43Ͳ 3.OBJETIVOS.................................................................................................................Ͳ47Ͳ 4.MATERIALESYMETODOS.........................................................................................Ͳ51Ͳ 4.1.Cultivoscelulares............................................................................................................Ͳ51Ͳ 4.2.Recuentodecélulas........................................................................................................Ͳ52Ͳ 4.3.Construccióndelosplásmidos.......................................................................................Ͳ53Ͳ 4.4.Transformación...............................................................................................................Ͳ56Ͳ 4.5.AislamientodelDNA.......................................................................................................Ͳ57Ͳ 4.6Generaciónderetroviruseinfección..............................................................................Ͳ58Ͳ 4.7Generacióndelentiviruseinfección...............................................................................Ͳ59Ͳ 4.8TransfecciónconsiRNAS..................................................................................................Ͳ60Ͳ 4.9Estréscelular....................................................................................................................Ͳ60Ͳ 4.10Ensayoclonogénico.......................................................................................................Ͳ61Ͳ 4.11Ensayodemigracióncelular..........................................................................................Ͳ61Ͳ 4.12Ensayodeinvasióncelular.............................................................................................Ͳ61Ͳ 4.13EnsayoMTT....................................................................................................................Ͳ62Ͳ 4.14Deteccióndeapoptosis..................................................................................................Ͳ63Ͳ 4.15Extraccióndeproteínas.................................................................................................Ͳ63Ͳ 4.16Cuantificacióndeproteínas...........................................................................................Ͳ63Ͳ 4.17Westernblot..................................................................................................................Ͳ64Ͳ 4.18Inmunoprecipitación......................................................................................................Ͳ65Ͳ 4.19Ensayo7ͲMethylͲGTPͲSepharosapullͲdown.................................................................Ͳ66Ͳ 4.20Inmunocitofluorescencia...............................................................................................Ͳ67Ͳ 4.21Perfilpolisómico............................................................................................................Ͳ67Ͳ 4.22ExtracciónRNApolisomas.............................................................................................Ͳ68Ͳ 4.23SíntesisdecDNA............................................................................................................Ͳ68Ͳ 4.24PCRconretrotranscriptasa(RTͲPCR)atiemporeal.......................................................Ͳ69Ͳ 4.25Obtencióndemuestrasdetumores..............................................................................Ͳ69Ͳ XII .

(14) 4.26Inmunohistoquímicadelasmuestrastumorales..........................................................Ͳ70Ͳ 4.27Evaluacióninmunohistoquímicadetumores................................................................Ͳ70Ͳ 4.28Análisisestadísticodelasmuestrastumorales.............................................................Ͳ71Ͳ. 5.RESULTADOS.............................................................................................................Ͳ75Ͳ 5.1EstudioinvitrodelafuncióndelafosforilacióndeeIF4E...............................................Ͳ75Ͳ 5.1.1FosforilacióndeeIF4Eyresistenciaaestréscelular.................................................Ͳ76Ͳ 5.1.1.1LafosforilacióndeeIF4Eaumentalacapacidaddeformacióndecolonias......Ͳ76Ͳ 5.1.1.2 La fosforilación de eIF4E incrementa la resistencia a diferentes situaciones de estrés............................................................................................................................. Ͳ78Ͳ 5.1.1.3LafosforilacióndeeIF4Eprevienelaactivacióndelaapoptosis.......................Ͳ78Ͳ 5.1.1.4 La inhibición de la fosforilación endógena de eIF4E incrementa la sensibilidad a estrés............................................................................................................................. Ͳ80Ͳ 5.1.1.5ElmutanteeIF4EͲS209Dformaunoscuerposcitoplasmáticosconelevadaafinidad hacia4EͲT....................................................................................................................... Ͳ83Ͳ 5.1.1.6ElcomplejopeIF4E/4EͲTinteraccionaconlasproteínasHuRyAgo2...............Ͳ85Ͳ 5.1.1.7ElcomplejopeF4E/4EͲTjuegaunpapelimportantebajosituacionesdeestrésͲ 87 Ͳ 5.1.1.8 Ago2 y HuR juegan un papel importante junto al complejo peIF4E/4EͲT en la recuperacióncelular......................................................................................................Ͳ89Ͳ 5.1.1.9ElmutanteS209DdeeIF4Emedialasíntesisproteicadeciertasproteínastrasel estrés............................................................................................................................. Ͳ90Ͳ 5.2EstudioinvitrodelafuncióndeeIF4EͲTransporter(4EͲT)..............................................Ͳ93Ͳ 5.2.1Lasobreexpresiónde4EͲTincrementalamigraciónylainvasióncelular...............Ͳ96Ͳ 5.2.2Serequierelaunión4EͲT/eIF4Eparaqueseproduzcaunincrementoeninvasióny migración........................................................................................................................... Ͳ99Ͳ 5.2.3eIF4EtienequeestarfosforiladoenelcomplejoeIF4E/4EͲTparaqueseproduzcaun aumentoenlacapacidadmigratoriaeinvasivadelacélula...........................................Ͳ100Ͳ 5.3peIF4Eencáncerdemama............................................................................................Ͳ101Ͳ 5.44EͲTencáncerdemama................................................................................................Ͳ106Ͳ. 6.DISCUSIÓN..............................................................................................................Ͳ111Ͳ 6.1EstudiodelafosforilacióndeeIF4Eensituacionesdeestrés.......................................Ͳ111Ͳ 6.1.2LafosforilacióndeeIF4EincrementalaresistenciaaciertassituacionesdeestrésͲ 111 Ͳ 6.1.3LafosforilacióndeeIF4Eprevienelaactivacióndelaapoptosis............................Ͳ113Ͳ 6.1.4Elmutantefosfomiméticoforma unoscuerposcitoplasmáticosconelevadaafinidad hacia4EͲT......................................................................................................................... Ͳ113Ͳ. XIII .

(15) 6.1.5ElmutantefosfomiméticodeeIF4Emedialasíntesisproteicadeciertasproteínastras elestrés............................................................................................................................ Ͳ116Ͳ 6.2Estudioinvitrodelafunciónde4EͲT............................................................................Ͳ118Ͳ 6.2.1Serequierelaunión4EͲT/peIF4Eparaqueseproduzcaunincrementoeninvasióny migración......................................................................................................................... Ͳ120Ͳ 6.3peIF4Eencáncerdemama............................................................................................Ͳ122Ͳ 6.44EͲTencáncerdemama................................................................................................Ͳ123Ͳ. 7.CONCLUSIONES.......................................................................................................Ͳ127Ͳ 8.BIBLIOGRAFÍA..........................................................................................................Ͳ133Ͳ ANEXO.........................................................................................................................Ͳ147Ͳ AGRADECIMIENTOS....................................................................................................Ͳ179Ͳ. . XIV . .

(16)     ÍNDICEDEFIGURAS YTABLAS. . XV .

(17) . XVI . .

(18) Índicedefiguras Introducción Figura1:Fasesdelatraducción…………………………………………………………………………………………..……Ͳ4Ͳ Figura2:OrganizacióndetripletesdelasecuenciadelmRNA…………………..………………………..……Ͳ5Ͳ Figura3:Mecanismodeiniciodelatraducción………………………………………………………………………..Ͳ8Ͳ Figura4:ModelodelasdosfuncionesconocidasdeeIF4E:exportacióndemRNAsytraducción capͲdependiente…………………………………………………………………………………………………………………….Ͳ14Ͳ Figura5:EsquemadelasvíasderegulacióndeeIF4E………………….………………………………………….Ͳ15Ͳ Figura6:Señalesdeidentidaddelcáncer……………………………………………………………………………….Ͳ21Ͳ Figura7:NiveleselevadosdeeIF4Eincrementanlatumorigénesis…………………………………………Ͳ23Ͳ Figura 8: Vía de activación de la invasión celular mediante el complejo NͲcadherina y FGFRͲ 1……………………………………………………………………………………………………………………………………………..Ͳ28Ͳ Figura9:Representaciónesquemáticadelosseislugaresdefosforilaciónde4EͲTporJNK……Ͳ31Ͳ Figura10:4EͲTmedialaimportacióndeeFI4Eanúcleo…………………………………………………………Ͳ33Ͳ Figura11:ModelohipotéticoentrelarelacióndeGSyPBs……………………………………………..…….Ͳ35Ͳ Figura12:ComponentesdelosPBsyGS………………………………………………………………………………..Ͳ36Ͳ Figura13:Esquemarepresentativodelroledelafosforilaciónde4EͲTenPBs……………………….Ͳ38Ͳ.  Materialesymétodos Figura14:CámaradeNeubauer……………………………………………………………………………………………..Ͳ53Ͳ Figura15:MapaderestricciónvectorpCS3MTypLPCX………………………………………………………….Ͳ55Ͳ Figura16:MapaderestriccióndelvectorpBABE……………………………………………………………………Ͳ56Ͳ Figura17:Mapaderestriccióndelvectorsh4EͲTͲpLKO.1Ͳpuro………………………………………………Ͳ57Ͳ.  Resultados Figura18:NivelesdelaexpresióndeeIF4EyMycͲtag……………………………………………………………Ͳ75Ͳ Figura19:EnsayodeproliferacióncelularmedianteMTT………………………………………………………Ͳ76Ͳ XVII .

(19) Figura20:Tinciónconcristalvioletadelensayodeformacióndecoloniasrealizadoenlaslíneas celularesMDAͲMBͲ231yHaCaT……………………………………………………………………………………………..Ͳ77Ͳ Figura21:Efectoenlaproliferaciónyresistenciacelulardediferentestiposdeestrés………….Ͳ79Ͳ Figure22:ActividadapoptóticamedidaconelensayodeluminiscenciacaspasaͲ3/7…………….Ͳ80Ͳ Figura23:WesternblotdelosnivelesdeeIF4Efosforilado(peIF4E)yeIF4E………………………….Ͳ80Ͳ Figura24:LainhibicióndelafosforilacióndeIF4Edisminuyelaresistenciaaestrés………………Ͳ81Ͳ Figura25:NivelesdepeIF4EenMEFWTyMEFKO………………………………………………………………..Ͳ82Ͳ Figura 26: La inhibición de la fosforilación de eIF4E inhibe la recuperación tras el tratamiento conarsénicoycisplatino…………………………………………………………………………………………………………Ͳ82Ͳ Figura27:ColocalizacióndelmutanteS209DenlaslíneascelularesMDAͲMBͲ231yHaCaTcon 4EͲT………………………………………………………………………………………………………………………………………..Ͳ84Ͳ Figura28:InmunoprecipitacióndeeIF4Ey4EͲT……………………………………………………………………..Ͳ85Ͳ Figura29:InmunofluorescenciaenlalíneacelularMDAͲMBͲ231conlasobreexpresióndeeIF4EͲ S209AyeIF4EͲS209D,de4EͲTconlosmarcadoresdeGS(TIAͲ1)yPBs(DCP1A)……………………Ͳ86Ͳ Figura30:Inmunoprecipitaciónde4EͲT,Ago2yHuR……………………………………………………………..Ͳ87Ͳ Figura31:Lainhibiciónde4EͲTendógenodisminuyelacapacidaddeS209Dderecuperarsetras unestréscelular……………………………………………………………………………………………………………………..Ͳ88Ͳ Figura32:EsnecesarialaunióndeeIF4Ea4EͲTyqueeIF4Eestéfosforiladoparaquesedéla recuperacióntraselestréscelular………………………………………………………………………………………….Ͳ89Ͳ Figura 33: 4EͲT por sí solo no permite la recuperación celular tras el tratamiento con arsénico………………………………………………………………………………………………………………………………….Ͳ89Ͳ Figura34:LainhibicióndeAgo2yHuRevitalarecuperacióncelulardelmutanteS209Dtrasel tratamientoconarsénico……………………………………………………………………………………………………….Ͳ90Ͳ Figura 35: eIFEͲS209D inhibe rápidamente la síntesis proteica tras el tratamiento con arsénico………………………………………………………………………………………………………………………………….Ͳ91Ͳ Figura 36: Se observa un incremento de la síntesis proteica en células que sobreexpresan el mutanteS209D……………………………………………………………………………………………………………………….Ͳ92Ͳ Figura37:QͲPCRdelmRNAdeCiclinaD1yMclͲ1delafracciónpolisomal…………………………….Ͳ93Ͳ Figura38:Nivelesbasalesde4EͲTenlasdiferenteslíneascelulares…………………………………......Ͳ93Ͳ Figura39:Lasobreexpresiónde4EͲTincrementalosnivelesdeNͲcadherina…………………………Ͳ94Ͳ Figura 40: Los marcadores de EMT Slug, Twist y Snail no se ven aumentados por la sobreexpresiónde4EͲT…………………………………………………………………………………………………………..Ͳ95Ͳ XVIII .

(20) Figura41:Lasobreexpresiónde4EͲTincrementalosnivelesdeMMP9yMMP3……………………Ͳ96Ͳ Figura42:EnsayodeproliferacióncelularmedianteMTTdelmutantede4EͲTY30A,4EͲTWTy sh4EͲT……………………………………………………………………………………………………………………………………Ͳ97Ͳ Figura43:Lasobreexpresiónde4EͲTconfieremáscapacidadmigratoria……………..…………….…Ͳ98Ͳ Figura44:MTTalas24horasconmitomicinaC……………………………………………………………………..Ͳ98Ͳ Figura45:Lasobreexpresiónde4EͲTconfieremáscapacidadinvasiva………………………………….Ͳ99Ͳ Figura46:Lainhibicióndel4EͲTendógenodisminuyelacapacidadmigratoriaeinvasivadelas células…………………………………………………………………………………………………………………………………….Ͳ99Ͳ Figura 47: La unión de 4EͲT y eIF4E es necesaria para el incremento en migración e invasión debidoa4EͲT………………………………………………………………………………………………………………………..Ͳ100Ͳ Figura 48: La fosforilación de eIF4E es necesaria para que la unión 4EͲT/eIF4E incremente la migraciónylainvasióncelular………………………………………………………………………………………………Ͳ101Ͳ Figura49:Inmunohistoquímicade4EͲT,peIF4EnuclearyHuR…………………………………………….Ͳ105Ͳ Figura 50: Análisis por western blot del grado de expresión de peIF4E y eIF4E en diferentes tumoresdelaserieclínicadeestudio……………………………………………………………………………………Ͳ106Ͳ Figura51:Inmunohistoquímicadelaexpresiónde4EͲT,YBͲ1,pYBͲ1,Ago2yNͲcaderinaendos tumoresdelaserieclínicadeestudio……………………………………………………………………………………Ͳ107Ͳ. Discusión Figura52:PosiblerelaciónentreGSyPBs…………………………………………………………………………..Ͳ116Ͳ Figura53:Modelodelaposiblevíadeactivacióndelainvasiónymigracióncelular…………….Ͳ121Ͳ . . XIX .

(21)  . XX . .

(22) Índicedetablas Introducción Tabla1:Descripcióndelosdiferentesfactoresdeiniciaciónyproteínasimplicadaseneliniciode latraducción…………………………………………………………………………………………………………………………….Ͳ9Ͳ Tabla2:EjemplosdeproteínasdeuniónaeIF4E…………………………………………………………………...Ͳ11Ͳ.  Materialesymétodos Tabla 3: Dosis del antibiótico puromicina utilizadas para la selección de las líneas celulares infectadas…….…………………………………………………………………………………………………………………………Ͳ59Ͳ Tabla4:Soluciónparaprepararelgelconcentrador………………………………………………………………Ͳ65Ͳ Tabla5:Soluciónparaprepararelgelseparador……………………………………………………………………Ͳ65Ͳ Tabla6:Anticuerposutilizadosparawesternblot………………………………………………………………….Ͳ66Ͳ Tabla7:Anticuerposprimariosutilizadosenlasinmunohistoquímicas…………………………………..Ͳ71Ͳ. Resultados Tabla8:Característicasdelaseriedetumoresdemamaanalizados…………………………………….Ͳ102Ͳ Tabla9:TestdecoeficientedecorrelacióndeSpearmandeeIF4Etotalyfosforilado(nucleary citoplasmático)condiferentescaracterísticasclínicoͲpatológicas…………………………………………Ͳ103Ͳ Tabla 10: Niveles de expresión de marcadores analizados en la serie clínica de 77 tumores de mama……………………………………………………………………………………………………………………………………Ͳ104Ͳ Tabla11:TestdecoeficientedecorrelacióndeSpearmandeeIF4Etotalyfosforilado(nucleary citoplasmático)con4EͲT,Ago2yHuR…………………………………………………………………………………..Ͳ104Ͳ Tabla12:Significanciaycoeficientedecorrelaciónde4EͲTconYBͲ1,pYBͲ1,Ago2,NͲcaderonay peIF4Enuclear………………………………………………………………………………………………………………………Ͳ106Ͳ . . XXI .

(23) . XXII . .

(24)      ABREVIATURAS. . XXIII .

(25) . XXIV . .

(26) Abreviaturas  4EͲT:TransportadordeeIF4E(eIF4Etransporter) A:Adenina Ago2:Argonaute2 AMD:DegradacióndeelementosARE(AREͲmediateddecay) ARE:mRNAsquecontienenelementosARE(ricosenAU)(AUͲRichElements) ATM:ProteinkinaseataxiaͲtelangiectasiamutated ATP:Adenosíntrifosfato BclͲX:BͲcelllymphomaͲextralarge BIRC2:BaculoviralIAPrepeatcontaining2 BRSK2:BRserine/threoninekinase2 BSA:Albúminaséricabovina BTF3:Basictranscriptionfactor3 C:Citosina Cap:Guanosinatrifosfatometilada CDDP:Cisplatino CDK1:QuinasadependientedeCiclina1 CGP:N3Ͳ(4ͲFluorophenyl)Ͳ1HͲpyrazoloͲ[3,4Ͳd]pyrimidineͲ3,4Ͳdiamine CK1:Caseinkinase1 COXͲ2:Ciclooxigenasa2 CPE:Cytoplasmicpolyadenylationelement CPEB: Proteína citoplasmática de unión a elementos poliadenilados (Cytoplasmic polyadenylationelementbindingprotein) CRMͲ1:Chromosomalregionmaintenance1 CYFIP1:CytoplasmicFMR1Ͳinteractingprotein1 Dcp:DecappingmRNA DMSO:Dimetilsulfòxid DNA:Ácidodesoxiribonucleico dNTPs:Desoxinucleótidostrifosfato DTT:Ditiotreitol EDTA:Ácidoetilendiaminotetraacético EGF:Factordecrecimientoepidérmico(EpidermalGrowthFactor) eIF:Factordeiniciodelatraduccióneucariota(EukaryoticInitiationFactor) EMT:Transiciónepiteliomesénquima XXV .

(27) EMX2:Emptyspiracleshomeobox2 ERK:Quinasareguladoradeseñalesextracelulares(ExtracellularsignalͲregulatedkinases) FGF:Factordecrecimientodefibroblastos(FibroblastGrowthFactors) FGFR:Receptordelfactordecrecimientodefibroblastos(FibroblastGrowthFactorReceptors) FXR1:FragileXMentalRetardation,AutosomalHomolog1 G3BP:RasͲGAPSH3domainbindingprotein GDP:Guanosíndifosfato GFP:Proteínaverdefluorescente(GreenFluorescentProtein) GS:Gránulosdeestrés GTP:Guanosíntrifosfato HCL:Ácidoclorhídrico HEPES:Ácido2Ͳ[4Ͳ(2Ͳhidroxietil)Ͳ1ͲpiperacinilͲ(1)]etanosulfónico hnRNP:Heterogeneousnuclearribonucleoproteins HuR:ELAVlikeRNAbindingprotein1 IF:Inmunofluorescencia IHQ:Inmunohistoquímica IP:Inmunoprecipitación Jnk:QuinasascͲJunNͲterminal(JunNͲterminalkinase) KCL:Clorurodepotasio kDa:Kilodalton KI:KnockͲin KO:Knockout LB:CaldodeLisogenia(Lysogenybroth) LRRC:leucineͲrichrepeatprotein LSm1:U6smallnuclearRNAassociated MAPK:Proteínasquinasasactivadaspormitógenos(MitogenͲActivatedProteinKinase) MEF:Fibroblastosembrionariosderatón(MouseEmbryonicFibroblast) MEK:Proteínaquinasaactivadapormitógenos(MAPkinasekinase) Met:Metionina MgCl2:Clorurodemagnesio MKK1:Proteínaquinasaactivadapromitógenos(MitogenͲactivatedproteinkinasekinase) MMPs:Metaloproteinasasdelamatriz(Matrixmetalloproteinases) Mnk: Proteínas quinasas activadas por mitógenos que interaccionan con quinasas [(MitogenͲ ActivatedProteinKinase)ͲInteractingKinase] mRNA:RNAmensajero MTA1:Metástasisassociated1 XXVI .

(28) mTOR:Mammaliantargetofrapamycin MTT:(3Ͳ(4,5ͲdimethylthiazolͲ2Ͳyl)Ͳ2,5Ͳdiphenyltetrazoliumbromide) Myc:OncogénviralhomólogodeMielocitomatosisaviarVͲmyc Na3VO4:Ortovanadatodesodio NaAsO2:Arsenitodesodio NaCl:Clorurodesodio NaF:Fluorurodesodio NaOAc:Acetatodesodio NaPPi:Pirofosfatotetrasódico NES:Señaldeexportaciónnuclear(NuclearExportSignal) ng:Nanogramos NLS:Señaldelocalizaciónnuclear(NuclearLocalizationSignal) NMD:NonsenseͲmediatedmRNAdecay NPC:Complejodeporonuclear(nuclearporecomplex) NTP:Nucleótidotrifosfato OCT:Mediodecongelación(OptimalCuttingTemperatur) ODC:Ornitinadescarboxilasa PABP:ProteínadeunionaPolyͲA(Poly(A)Ͳbindingprotein) PBs:Processingbodies PBS:Tampondefosfatosalino(PhosphateBufferSaline) PCR:Reacciónencadenadelapolimerasa PERK:ProteinkinaseRNAͲlikeendoplasmaticreticulumkinase PI3K:Fosfoinositol3Ͳquinasas(phosphatidylinositol3Ͳkinase) Pkc:ProteínaquinasaC PKR:DoubleͲstrandedRNAͲdependentproteinkinasePKR PML:Progressivemultifocalleukoencephalopathy PMSF:fluorurodefenilmetilsulfonilo PP2A:Proteinphosphatase2A PSF:ProteinͲassociatedsplicingfactor PVDF:PolyvinylideneFluoride QͲPCR:PCRcuantitativa r.p.m.:Revolucionesporminuto Raf:ProteínaquinasaserinaͲtreonina RISC:ComplejodesilenciamientoinducidoporRNA(RNAͲinducedsilencingcomplex) RNA:Ácidoribonucleico ROS:Especiesreactivasdeoxigeno(ReactiveOxygenSpecies) XXVII .

(29) RQ:Métodocomparativo,estudiodelaexpresióndelosgenes(oPCR) RTͲPCR:PCRconretrotranscriptasainversa SDS:Dodecilsulfatosódico shRNA: Short hairping RNA. ARN de interferencia pequeño con conformación de horquilla, codificadoenunvectordeexpresión siRNA:SmallinterferenceRNA.ARNdeinterferenciapequeñoconconformaciónlineal SMN:Survivalofmotorneuron1 SUMO:SmallubiquitinͲlikemodifier T:Timina TBS:TrisBufferSaline TEMED:N,N,N',N'Ͳtetrametiletilenodiamina TIA1:TIA1cytotoxicgranuleͲassociatedRNAbindingprotein TNFͲɲ:Tumornecrosisfactorɲ Tris(Trizma):tris(hidroximetil)aminometano Triton:octylphenolethoxylate tRNA:RNAdetransferencia TͲTBS:Tween20enTBS TTP:Tristetraprolin U:Uracilo UTR:Regiónnotraducida(Untranslatedregión) UV:Ultravioleta VEGF:Factordecrecimientoendotelialvascular(VascularEndothelialGrowthFactor) VPg:viralproteingenomeͲlinked WB:westernblot WT:Wildtype Xrn1:5'Ͳ3'exoribonuclease1 YBͲ1:YͲboxbindingprotein1 ZEB:ZincfingerEͲboxͲbindinghomeobox ʅg:Microgramos ʅl:Microlitro . . XXVIII . .

(30)      RESUMEN. . XXIX .

(31) . XXX . .

(32) Resumen  En los últimos años se ha descrito la desregulación de la síntesis proteica en muchas enfermedades,estohaincrementadolainvestigacióndenuevosmecanismosquecontrolanla expresión génica, en particular a nivel del inicio de la traducción. La mayor enfermedad con alteraciones en la traducción de mRNAs es el cáncer, donde se han encontrado desregulados variosfactoresimplicadoseneliniciodelatraducción,incluyendoeleFI4E,eIF4Gy4EͲBPs. Hipotetizamosquelaregulacióndeliniciodelatraducciónesimportanteparalarespuestayla resistencia al estrés celular que ocurre durante el desarrollo del tumor. Nuestro estudio se centraenelfactordeiniciodelatraduccióneIF4E(ysuproteínadeunión4EͲT)encáncerde mama, donde se ha observado que elevados niveles de eIF4E se encuentran asociados con la malignidadyunpeorpronóstico.Lafosforilacióndelaserina209deeFI4Epareceseresencial paralaspropiedadestumorigénicasdeeIF4E.HemosanalizadoelroldelafosforilacióndeeIF4E en diferentes líneas celulares tumorales bajo diferentes situaciones de estrés como el tratamiento con arsénico (estrés oxidativo), la deprivación de nutrientes y el tratamiento con drogasquimioterapéuticas(cisplatino).Mediantelautilizacióndeunmutantehipofosforiladoy un mutante fosfomimético de eIF4E, observamos que la fosforilación de eIF4E aumentaba la resistenciacelulartrasunasituacióndeestrés,asícomoinhibíalaapoptosis,correlacionándose con un aumento de ciertas proteínas relacionadas con la proliferación, como es el caso de Ciclina D1, y un incremento de proteínas antiapoptóticas, como es el caso de MclͲ1. El tratamientoconarsénicoconduceaunbloqueomayordelatraduccióndeproteínasencélulas que expresan el mutante fosfomimético, una vez regresado a las condiciones normales la sobreexpresión de este mutante permite una recuperación más rápida de la síntesis de proteínasnormal. La sobreexpresión del mutante fosfomimético conduce a la formación de unos cuerpos citoplasmáticos que colocalizan con la proteína 4EͲT. Este complejo peIF4E/4EͲT también interaccionaconlasproteínasAgo2yHuR.Lainhibicióndelaexpresiónde4EͲT,HuRy/oAgo2, inhibelarecuperacióncelular,trasdeterminadassituacionesdeestrés,mediadaporpeIF4E. Debido que la interacción de eIF4E con 4EͲT parece ser esencial para la función de la fosforialción de eIF4E en respuesta a estrés, especulamos que este factor también juega un papelimportanteenelprocesotumorigénico.Enefecto,lasobreexpresiónde4EͲTincrementa losnivelesdeNͲcadherinaydelasmetaloproteinasasͲ3yͲ9.Aparteseobservaunincremento delamigracióneinvasiónalsobreexpresar4EͲT;porelcontrario,observamosunadisminución delainvasiónymigraciónalinhibirlaexpresiónde4EͲToalutilizarelmutantede4EͲTincapaz deunirseaeIF4Eo,cuandoinhibimoslafosforilacióndeeIF4E.Estosresultadosnosindicanque lainteracciónpeIF4E/4EͲTregulalainvasiónylamigracióncelular. Finalmente, realizamos unas inmunohistoquímicas de 77 tumores de mama. Se encontraron altos niveles de eIF4E y peIF4E, los cuales se correlacionaban con el tamaño del tumor. En el caso de 4EͲT, este correlacionaba con altos niveles de NͲcadherina, tal y como observamos in vitroalsobreexpresar4EͲT. En conclusión, hemos identificado el complejo peIF4E/4EͲT como un complejo regulador de la resistencia a estrés y de la invasión y migración celular. El estudio de este complejo ofrece nuevasoportunidadesterapéuticascontraelcáncer.  XXXI .

(33)  . XXXII . .

(34)      INTRODUCCIÓN . . Ͳ1Ͳ .

(35) .    . Ͳ2Ͳ . .

(36) 1.INTRODUCCIÓN 1.1Traducción(Síntesisdeproteínas) Lasíntesisproteicaotraducciónpermiteenúltimotérminoquelainformacióngenética almacenadaenlasmoléculasdelosácidosnucleicosseplasmeenformadeproteínas,queson loscomponentesestructuralesyfuncionalesbásicosparalaorganizaciónyelfuncionamientode lacélula(GrayandWickens1998).Esdecir,eselprocesoporelcuallainformacióncontenidaen elRNA(ácidoribonucleico)mensajero(mRNA)estraducidaaproteínas.Esteprocesotienelugar enlosribosomasdelcitoplasmacelular.Estádivididoentresfases:lainiciación,laelongacióny la terminación (Figura 1). El inicio de la traducción requiere diferentes factores denominados eIFs (factores de inicio de la traducción en eucariotas) (Kozak 1999); estos factores actúan en conjuntoparaunir elribosomaaunmRNAypermiten queesteseaescaneadohastallegaral codóndeiniciodelatraducción(enun95%deloscasosAUG)(Kozak1984).Losribosomasson complejos macromoleculares formados por proteínas y RNAs ribosomales (rRNAs), los cuales están divididos en dos subunidades diferentes, la subunidad pequeña, con un coeficiente de sedimentaciónde40S(formadaporunasolamoléculaderRNAy33proteínasdiferentes)yla subunidad grande con un coeficiente de sedimentación de 60 S (formada por tres tipos de rRNAs:5S,28Sy5,8Sy49proteínasdiferentes);sufunciónesfacilitarlasíntesisdelpéptido utilizandolasecuenciadeaminoácidosdefinidaporelmRNA(DoudnaandRath2002). ElmRNAeselácidoribonucleicoquecontienelainformacióngenéticaprocedentedelDNA,es elresultadodelatranscripcióndeungencodificadordeunacadenapolipeptídicadeterminada, se trata de un ácido nucleico monocatenario. Determina el orden en que se unirán los aminoácidosdeunaproteínayactúacomoplantillaparalasíntesisdedichaproteína;también marca cuando empieza y acaba el proceso de traducción mediante codones de inicio y finalización de la traducción. La secuencia del mRNA está descrita por 4 bases nucleotídicas A (adenina), U (Uracil), C (Citosina) y G (guanina) y es leída por el ribosoma de forma unidireccionalentripletesensentido5’Ͳ3’.Elcodóndeiniciodelatraduccióngeneralmentees AUG y como codón de finalización de la traducción encontramos tres diferentes: UAG, UAA o UGA (Brenner, Stretton et al. 1965; Hinnebusch 2011). Las secuencias distales se denominan región 5’ no traducidas (5’UTR) o región 3’ no traducida (3’UTR) (Gingras, Raught et al. 1999)(Figura2). Ensuextremo5’terminalpodemosencontrarunaguaninametiladaoestructuraCap,m7GpppX (donde X es cualquier nucleótido) (Banerjee 1980); el grupo fosfato que se encuentra en el extremoterminal5’eseliminadomediantelaaccióndeunafosfatasacreándoseunextremo5’ difosfato, este extremo se une con GTP (guanosina trifosfato) para formar un enlace 5’Ͳ5’ trifosfato; seguidamente la guanina es metilada por una metiltransferasa formándose la estructuracap(KappandLorsch2004).Laestructuracapproporcionaunlugardeunióndelos factoresdeiniciodelatraducciónparaquesepuedaproducirlatraduccióncapͲdependiente,a parte,protegeelmRNAdeladegradaciónporexonucleasas. En el extremo 3’ terminal encontramos la cola poly(A), compuesta por un promedio de 250 residuosdeadenina(Wickens1990)confiereestabilidadalmRNA(Walther,WittopKoningetal. 1998)yfacilitalaunióndelosfactoresdeiniciodelatraducciónalforzarqueelmRNAtenga Ͳ3Ͳ .

(37) unaconformacióndebuclecerrado(MunroeandJacobson1990;TarunandSachs1995),estose logragraciasalaproteínadeuniónapoly(A)(PABPs),lacualseasociaconlacolapoly(A)ycon elcomplejoeIF4GͲeIF4E,elcualselocalizaenelextremo5’delmRNA. .   Figura 1: Fases de la traducción. A) proceso de inicio de la traducción donde intervienen las dos subunidadesribosomales,mRNAyeltRNA.B)Elongacióndelatraducción,incorporacióndeaminoácidos atravésdelosdoslugaresdeunión,AyP.C)Finalizacióndelatraducción(Murray,D.etal.1997). . Ͳ4Ͳ .

(38) La regulación del inicio de la traducción en eucariotas es debida a los factores de iniciación eucarióticos, conocidos como eIFs (eukaryotic initiation factor). Estos pueden ser un factor limitante en el inicio de la traducción. En ambientes donde estos factores se encuentran en concentracioneslimitadasalgunosmRNAscelularesyviralessepuedentraducirmedianteotro tipodetraducciónnodependientedecap,denominadatraduccióncapͲindependiente.Launión delribosomadependedeunaregiónespecíficadelmRNAdentrodel5’UTR,denominadaIRES (InternalRibosomeEntrySite)(PelletierandSonenberg1988). . Figura2:OrganizacióndetripletesdelasecuenciadelmRNA(McGrawͲHill2012).. 1.1.1Regulacióndelatraduccióncapdependiente El inicio de la traducción es un punto importante en la regulación de la expresión de muchosgenes.Suregulaciónesunpuntoimportantedeestudio,yaquesehavistocorrelación de alteraciones en la síntesis de proteínas con un gran número de enfermedades (Sonenberg and Hinnebusch 2009). La síntesis proteica es un proceso que consume elevados niveles de energía,porlotanto,necesitaestarregulado. La traducción envuelve tres etapas diferentes la iniciación, la elongación y la terminación. Aunquelatraducciónesreguladaencadaunadelasetapas,elpasolimitanteeslainiciación, que se centra en el reclutamiento de las subunidades ribosomales al mRNA. El inicio de la traducción envuelve la interacción entre RNAͲproteínas y proteínaͲproteína donde están implicados muchos factores. Los niveles celulares de los diferentes factores de inicio de la traduccióndifierenenlosdiferentestiposdecélulasytejidos;modulandolaactividaddeestos factoresseregulanlosratiosglobalesdelasíntesisproteica. Loscambiosqueregulaneliniciodelatraducciónsonmediadosporcambiosenelestadodela fosforilacióndelosfactoresdelatraducciónydeproteínasespecíficasdeuniónalRNA.Lasvías que controlan la capacidad traduccional se coordinan con las que controlan la actividad de factores de traducción y de esta manera se garantiza un control coordinado de la síntesis proteica.Elratiodesíntesisparaunaproteínaesproporcionaldelaconcentraciónylaeficiencia delatraduccióndelmRNA.(Hershey,Sonenbergetal.2012) El control de la síntesis proteica es una función homeostática fundamental de las células que están estrechamente asociadas a los estímulos extracelulares que impulsan el crecimiento celularylaproliferación,porlotanto,lasvíasmitogénicasdetransduccióndeseñalesconvergen Ͳ5Ͳ .

(39) con los factores de inicio de la traducción (Dobrikov, Dobrikova et al. 2011). Entre los mecanismos de control de la traducción capͲdependiente, destaca la regulación sobre los nivelesdeeIF4E(Vercapítulo1.2.2RegulacióndeeIF4E).EneliniciodelatraduccióneIF4Ese une a eIF4G, el dominio de unión es compartido por las proteínas de unión a eIF4E (4EͲBPs). Cuando estas proteínas están hipofosforiladas, se unen a eIF4E secuestrándolo de eIF4G e inhibiendo el inicio de la traducción. Mediante la activación de la vía PI3K/Akt/mTOR, en respuesta a factores de crecimiento y determinados estados de estrés celular, se produce la fosforilaciónde4EͲBP,elcualliberaeIF4Eysepuededareliniciodelatraducción(Harris,Chiet al.2006;Sonenberg2008).PorotroladolosnivelesdeproteínadeeIF4Esonbajosenlacélula, comparadoconotrosfactoresdeiniciodelatraducción.Debidoasusbajosnivelesdeexpresión y ser el único de los factores de inicio de la traducción que se unen directamente con la estructuracapdelmRNA,esunodelosfactoreslimitantesparalaunióndelcomplejoeIF4Fa Cap;porlotantounpuntoreguladorimportantedeliniciodelatraducción. A parte de la regulación por fosforilación, modificaciones postranscripcionales como la metilación, glicosilación o sumoylación pueden afectar al ratio de síntesis proteica, pero el efectodeestasmodificacionesnohasidoestudiadodeformaextensa. Una nueva área de estudio es la regulación de la traducción por microRNAs, estos pueden estimularladegradacióndeciertosmRNAsoafectaralasíntesisproteicadirectamente(Braun, Huntzingeretal.2012) 1.1.2IniciodelatraduccióncapǦdependiente El inicio de la traducción en eucariotas es un proceso en el cual se requiere el reclutamientodelasubunidad80SdelribosomaalmRNA,laidentificacióndelcodóndeinicioy el reclutamiento del tRNA iniciador a la subunidad pequeña del ribosoma 40 S. Es un proceso muy complejo que requiere varios factores, incluyendo el tRNA de transferencia que contiene unametionina(metͲtRNAimet),lassubunidadesribosomales40Sy60S,12factoresdeiniciode latraducciónyenergíaenformadeATPyGTP. Unpuntoimportanteenelprocesodeiniciodelatraduccióneslaformacióndelcomplejode preiniciación43S;requiereelreclutamientodeltRNAiniciador(metͲtRNAimet)alasubunidad40 Sdelribosoma.ParaelloserequierelaunióndeleIF2aGTPparaformaruncomplejobinario. EstecomplejoseunealmetͲtRNAimetformandoelcomplejoternarioeIF2/GTP/MetͲtRNA.eIF2 estácompuestaportressubunidadesɲ,ɴyɶ.LafosforilacióndeeIF2ɲenlaserina51estabiliza la unión a GDP impidiendo que eIF2 pueda reciclarse, por lo tanto se inhibe el inicio de la traducción(KappandLorsch2004).Unavezformadoelcomplejoternariojuntoaotrosfactores de iniciación (eIF1, eIF5 y eIF3) se unen a la subunidad 40 S para formar el complejo de preiniciación 43 S (Chaudhuri, Chowdhury et al. 1999; Majumdar, Bandyopadhyay et al. 2003; Bilanges and Stokoe 2007) (Figura 3 punto 1 y 2). El complejo 43 S recluta el extremo 5’ del mRNA.EstoesfacilitadoporelcomplejoeIF4F,elcualestáformadoportresfactoresdeinicio delatraducción:eIF4E,eIF4AyeIF4G. LaestructuracapdelmRNAsseuneconfactoresdeiniciaciónespecíficosantesdeasociarsecon elcomplejodepreiniciación.EnelprocesodereclutamientodelribosomaalmRNAjueganun papelmuyimportantevariasproteínas:PABP[poly(A)bindingprotein],eIF3ylaformacióndel complejoeIF4F;eIF4FregulalaunióndelmRNAalasubunidad43Syeselpasolimitantedel iniciodelatraducción,requierelainteraccióndeeIF4EconelcapdelmRNA.(Gingras,Raughtet Ͳ6Ͳ .

(40) al.1999).eIF3juegaunpapelmuyimportanteenelmantenimientodelaunióndelasubunidad grandedelribosomaytambiénseunealcomplejoeIF4F.(Figura3punto3). Una vez el complejo eIF4F y el complejo 43 S se han unido al mRNA, éste es escaneado en dirección 5’ – 3’. Posteriormente un cambio de conformación del complejo 43 S activa la hidrólisisdelGTP,permitiéndoseelreconocimientodelcodóndeiniciaciónydesencadenándose laliberacióndeeIF1yeIF2ͲGDP,locualpermiteelreclutamientodelasubunidadribosomal60S yqueseinicielasíntesisproteica(Kozak1989;Jaramillo,Deveretal.1991)(Figura3punto4y 5). A partir de este punto el metͲtRNAimet está unido al mRNA dentro de un lugar específico del ribosomallamadoP(lugardelpéptido),elotrolugar,A(aminoácido),serápordondeentrarán lossiguientestRNAscargadosconelaminoácidoconcretoentrandoenlafasedeelongaciónde latraducción. Enlatabla1semuestranlasdiferentesfuncionesdelosfactoresdeiniciodelatraducciónasí comodeproteínasimplicadasenlaregulacióndeestosfactores. 1.1.2.1FactoresimplicadosenlaformacióndelcomplejoeIF4F ‡ Ͷ eIF4E (ver capítulo 1.2 eIF4E) es la proteína que físicamente reconoce y se une a la estructuracapdelmRNAyesunfactorindispensableylimitanteparaquesepuedaproducirel inicio de la traducción capͲdependiente, es el factor menos abundante de todos los eIFs (Mochizuki, Oguroetal. 2005).Suactividadpuedeserreguladaporunaseriedeproteínasde unión,las4EͲBPs(eIF4EͲbindingproteins),enmamíferosencontramos3diferentes(4EͲBP1,4EͲ BP2y4EͲBP3),4EͲBP1eslamayoritariaenmamíferos;4EͲBPinteraccionaconeIF4Eenelmismo dominio de unión que eIF4G <XXXXLIdonde I es un residuo hidrofóbico y X cualquier aminoácido. Mediante esta unión 4EͲBP bloquea la unión de eIF4E a eIF4G, impidiendo así la traduccióncapͲdependiente(Mader,Leeetal.1995);otraproteínadeuniónpococonocidaes 4EͲT(vercapítulo1.54EͲT),lacualseencargadeltransportedeeIF4Edecitoplasmaanúcleo mediantesuuniónenelmismodominiodeuniónqueeIF4G(Dostie,Ferraiuoloetal.2000). ‡ Ͷ eIF4Aformapartedeunagranfamiliadeproteínas(másde28miembros)denominada DEADͲbox.Estasproteínasparticipanenvariosprocesosapartedelatraducción,incluyendoel splicingdepreͲmRNAs,biogénesisderibosomas,eldesarrollo,espermatogénesisyovogénesis. eIF4A es una proteína de 46 kDa que hidroliza el ATP y tiene actividad helicasa, desenrolla la estructurasecundariadelmRNAparapermitirelaccesodelassubunidadesribosomalesyque estaspuedanescanearelmRNAhastallegaralcodóndeiniciación;suactividadesestimulada poreIF4GyeIF4B(Rozen,Ederyetal.1990;Rogers,Komaretal.2002).Existentresisoformas en mamíferos: eIF4AI, eIF4AII y eIF4AIII (Gingras, Raught et al. 1999). Las isoformas humanas eIF4AIyeIF4AIIsonaltamentehomólogasysonfuncionalmenteequivalentes,peroseexpresan de forma diferente según el tejido celular y juegan diferentes roles durante el desarrollo (NielsenandTrachsel1988). Ͳ7Ͳ .

(41)   Figura3:Mecanismodeiniciodelatraducción.1)Disociacióndelcomplejoribosomal80Spreexistente promovidaporeIF6,elcualseunealasubunidad60S,eIF3yeIF1Aseunenalasubunidad40S.2)Unión delcomplejoternarioeIF3ͲGTPͲMetͲtRNAalasubunidad40Sformandoelcomplejodepreiniciación43S. 3)unióndelcomplejo43SalmRNA,necesarioqueelcomplejoeIF4FreconozcaelmRNAysedéhidrólisis deATP.4)Colocacióndelcodóndeiniciodelatraducciónendirección5’–3’.5)liberacióndelosfactores deiniciacióndelatraducción.6)Uniónelasubunidadribosomal60S.(Gingras,Raughtetal.1999).   Ͳ8Ͳ .

(42) FactordeIniciaciónyproteínas implicadasensuregulación. Actividad. eIFͲ1. ReposicióndemetͲtRNAparafacilitarlaunióndelmRNA. eIFͲ2. FormacióndeuncomplejoternarioeIF2ͲGTPͲMetͲtRNA. eIFͲ2A. AUGͲdependientedemetͲtRNAuniendoalribosoma40S. eIFͲ2B(tambiénllamadoGEF) factordeintercambiodel nucleótidoguanina. IntercambiodeGTP/GDPduranteelreciclajedeeIFͲ2. eIFͲ3,compuestode13 subunidades. Uniónsubunidadgrandedelribosoma. eIFͲ4Fcompuestopor3 UnióndelmRNAalasubunidad40S,actividadhelicasadel subunidades:eIFͲ4E,eIFͲ4A,eIFͲ RNA dependiente de ATPasa, la interacción entre la cola 4Gyporlomenos2factores poliAylaestructuracubierta(cap) adicionales:PABP,Mnk1(oMnk2) PABP:proteínadeuniónpoliA. UnelacolapoliAdelosmRNAs,permitelauniónaleIFͲ4G. eIFͲ4A. HelicasadeRNAdependientedeATPasa. eIFͲ4E. Reconocimientodecubierta5';frecuentementeencontrada sobre expresada en cánceres humanos, la inhibición de eIF4Eesactualmenteunblancoparaterapiascancerígenas. 4EͲBP(3formasconocidas). Cuando4EͲBPestadefosforiladoseuneeIFͲ4Eyreprimesu actividad, la fosforilación de 4EͲBP ocurre en respuesta a muchos estímulos de crecimiento conduciendo a la liberación de eIFͲ4E e incrementando la iniciación de la traducción. eIFͲ4G. ActúacomounabaseparaelensamblajedeeIFͲ4EyͲ4Aen elcomplejoeIFͲ4F. eIFͲ4B. Estimulalahelicasa,seunesimultáneamenteconeleIFͲ4F. eIFͲ5. Liberación de eIFͲ2 y de eIFͲ3, GTPasa dependiente del ribosoma.  Tabla 1: Descripción de los diferentes factores de iniciación y proteínas implicadas en el inicio de la traducción.. ‡ Ͷ  eIF4Gesunaproteínadeuniónquejuegaunpapelimportanteenelreclutamientodel ribosoma al mRNA. Hay dos isoformas en mamíferos, eIFGI y eIFGII, que son en un 46 % idénticas y funcionalmente homólogas, de 171 kDa y 176 kDa respectivamente. eIF4GI es constitutivamenteexpresadaaunaconcentraciónmáselevadaqueeIG4GII(Coldwell,Sacketal. 2012).LasdossoncapaceesdeiniciarlatraduccióncapͲdependiente.eIF4GIesimportanteenla proliferación, la actividad mitocondrial y es importante para la traducción de mRNAs relacionadosconesteproceso(Caron,Charonetal.2004;RamirezͲValle,Braunsteinetal.2008). Ͳ9Ͳ .

(43) Tienentresdominiosestructuralesfuncionales,queseencuentranconectadosentresí;lostres dominios interactúan con diferentes factores de inicio de la traducción. Contiene lugares de unión para eIF4E y PABP en el dominio NͲterminal; eIF4A y eIF3 en el dominio central de la proteína;yrealizaunafuncióndepuenteentreelribosomayelmRNA,encontrándoseellugar deuniónalRNAenelcentrodelaproteína,amas,eIF4Gestablececontactoconlacola3’poliA vía PABP (proteína de unión a la cola poliͲA). La asociación de PABP con eIF4G induce la recircularización del mRNA, esto aumenta la iniciación y la estabilidad del mRNA (Lamphear, Kirchwegeretal.1995;Imataka,Gradietal.1998).Porotroladotambiénencontramosunlugar deinteracciónaMnk(FukunagaandHunter1997)(vercapítulo1.2.2.2.1Mnks).Eldominiode unión a eIF4E es el más estudiado, contiene la secuencia YXXXXLI, donde I es cualquier aminoácidohidrofóbico.PorotroladoeIF4GreclutalamRNAhelicasaeIF4A.. 1.2.eIF4E eIF4E fue identificado por su habilidad de unirse a cap y promover el inicio de la traducción. (Sonenberg, Morgan et al. 1978). Es una proteína de 24 kDa, es esencial en el reconocimientodelaestructuracap5’presenteenlamayoríademRNAyenelreclutamiento delribosomaalmRNAeneliniciodelatraduccióncapͲdependiente(LazarisͲKaratzas,Montine etal.1990).ApoyandoestasevidenciasvieronquelaeliminacióndeeIF4Edeextractoscelulares dramáticamente reducía la traducción cap dependiente. Estos experimentos apoyaron fuertemente la evidencia de que eIF4E recluta el complejo eIF4F a la estructura cap. En consecuencia, el análisis mediante cristalografía de rayos X de eIF4E, reveló una estructura perfectamenteapropiadapararealizarestafunción(Marcotrigiano,Gingrasetal.1997).Sedice que eIF4E es un potenciador traduccional, aunque en la última década se ha descubierto que tambiénpuedeactuarcomorepresortraduccional(Rhoads2009). Debido a las funciones que desempeña en la célula, no es sorprendente que la secuencia primariadeaminoácidosdeeIF4Eseaaltamenteconservadaentodoslosorganismos.Mediante rayosXyresonanciamagnéticanuclear(NMR)handemostradoqueeIF4Etieneunaestructura flexibleenellugardeuniónacap,elnúcleodelaestructuraseasemejaaunguantedebeisboly elreconocimientodeCAPocurreenlapartecóncavamediantelainteraccióndedostriptófanos altamente conservados; por otro lado la mayoría de proteínas que interaccionan con eIF4E se unenporlacaraconvexadelaestructura(Rhoads2009). Ha sido estudiada en diferentes organismos, encontrándose una región evolutivamente conservadaenlaproteína,queconsisteentre160y170aminoácidosubicadosentrelaHisͲ37y laHisͲ200,losextremosNyCͲterminalsonmásvariables.Sehanencontrado411miembrosde la familia eIF4E en 230 especies, todos ellos tienen un contenido elevado en Trp. Se conocen diferentes isoformas, Arabidopsis thaliana no solo expresa eIF4E, también eIF(iso)4E y nCBP (Ruud, Kuhlow et al. 1998); Homo sapiens expresa un segundo miembro de la familia, 4EHP (Rom,Kimetal.1998);yC.elegansexpresatresmiembrosdelafamiliadeeIF4E,IFEͲ1,Ͳ2yͲ3 (JankowskaͲAnyszka,Lamphearetal.1998).Enel2005Joshietalagruparonalosmiembrosde lafamiliadeeIF4Eentresclasesdiferentessegúnlapresenciaderesiduoscorrespondientesa TrpͲ43yTrpͲ56: Clase1:Trpenlosdosaminoácidos.Enmamíferosseuneacap,eIF4Gy4EͲBPs. Ͳ10Ͳ .

(44) Clase2:Enlaposición43podemosencontrarTyp,PheoLeuyenlaposición56Tyro Phe.Enmamíferossolouniónacapy4EͲBPs. Clase3:Enlaposición43encontramosunTrpyenla56Cys.Enmamíferossolounióna capyeIF4G. Cadaunodelostipostienediferentesgradosdeafinidaddeuniónacap,eIF4Go4EͲBPssegún la especie. En organismos que presentan varios miembros de la familia de eIF4E, se ha encontradoquesólounodeellosesubicuoyseencuentraexpresadoconstitutivamente,siendo ésteresponsabledelatraduccióncapdependiente;enmamíferoscorresponderíaaleIF4EͲ1.El restodeeIF4Essonactivosendiferentestejidos,endiferentesetapasdeldesarrollooseunena ciertosmRNAs.(Joshi,Cameronetal.2004;Joshi,Leeetal.2005;Rhoads2009) eIF4E fue inicialmente descubierto como un solo polipéptido, pero cuando fue encontradoencomplejoconeIF4Gfueredefinidocomounasubunidaddeunnuevofactorde iniciodelatraducciónenmamíferosdenominadoeIF4F.SonenbergyLawrencevieronqueeFI4E podíatenerotrasproteínasdeuniónapartedeeIF4G,lasdenominadas4EͲBPs(Pause,Belsham etal.1994).ElnúmerodeproteínasdeunióndeeIF4Econocidashaincrementadoenlaúltima década;muchasdelasnuevasfuncionesdeeIF4Eestánmediadasporlainteracciónconalgunas desusproteínasdeunión(Tabla2).  LalocalizacióndeeIF4Epuedesertantonuclearcomocitoplasmática.Enelcitoplasma puedeestarformandopartedelcomplejodeiniciodelatraducciónasícomoformandopartede los denominados processing bodies (PBs) o gránulos de estrés (GS) (Ferraiuolo, Basak et al. 2005; Parker and Sheth 2007). Según Topisirovic et al. el 68 % del eIF4E reside en el núcleo participando en el secuestro de ciertos mRNAs y su exportación (Culjkovic, Topisirovic et al. 2007). En el núcleo se ha encontrado tanto de forma difusa por el nucleoplasma como en cuerposnucleares,peronoseencuentraenelnucléolo(Lejbkowicz,Goyeretal.1992).  Proteínas eIF4G 4EͲBP1,Ͳ2,Ͳ3 Maskin 4EͲT Lipoxigenasa2 BTF3 Gemin5 Neuroregulina CYFIP LRRC EMX2 PML. Consecuenciasdeunión ReclutaeIF4AyelribosomaalmRNA ReprimelatraduccióncapͲdependiente ReprimelatraduccióndemRNASquecontienenCPE TransportaeIF4Ealnúcleo CompiteconeIF4GparaunirseaeIF4E CompiteporlaunióneIF4EaeIF(iso)4E Inhibelatraducción.CololalizaciónenPBs ReprimelatraduccióndemRNAsquecontienenCPE SeuneaeIF4Eenextractoscerebrales.Presenteensinapsis ModulapositivamentelaexportacióndemRNAsconlasecuencia4EͲSEde formadependientedeeIF4E ModulalasfuncionesdeeIF4Eeneldesarrollodelsistemanervioso DisminuyeeltransportedemRNAsdenúcleoacitoplasma.  Tabla2:EjemplosdeproteínasdeuniónaeIF4E. . Ͳ11Ͳ .

Figure

Figura�subunidades 1:� Fases� de� la� traducción.� A)� proceso� de� inicio� de� la� traducción� donde� intervienen� las� dos��ribosomales,�mRNA�y�el�tRNA.�B)�Elongación�de�la�traducción,�incorporación�de�aminoácidos�a�través�de�los�dos�lugares�de�unión,�A�y�P.�C)�Finalización�de�la�traducción�(Murray,�D.�et�al.�1997).��
Figura subunidades 1 Fases de la traducci n A proceso de inicio de la traducci n donde intervienen las dos ribosomales mRNA y el tRNA B Elongaci n de la traducci n incorporaci n de amino cidos a trav s de los dos lugares de uni n A y P C Finalizaci n de la traducci n Murray D et al 1997 . View in document p.37
Figura�delpromovida3:�Mecanismo�de�inicio�de�la�traducción.�1)�Disociación�del�complejo�ribosomal�80�S�preexistente�por�eIF6,�el�cual�se�une�a�la�subunidad�60�S,�eIF3�y�eIF1A�se�unen�a�la�subunidad�40�S.�2)�Unión�complejo�ternario�eIF3�GTP�Met�tRNA�a�la�subunidad�40�S�formando�el�complejo�de�preiniciación�43S.3)�unión�del�complejo�43S�al�mRNA,�necesario�que�el�complejo�eIF4F�reconozca�el�mRNA�y�se�dé�hidrólisisde�ATP.�4)�Colocación�del�codón�de�inicio�de�la�traducción�en�dirección�5’�–�3’.�5)�liberación�de�los�factoresde�iniciación�de�la�traducción.�6)�Unión�e�la�subunidad�ribosomal�60S.�(Gingras,�Raught�et�al.�1999)�
Figura delpromovida3 Mecanismo de inicio de la traducci n 1 Disociaci n del complejo ribosomal 80 S preexistente por eIF6 el cual se une a la subunidad 60 S eIF3 y eIF1A se unen a la subunidad 40 S 2 Uni n complejo ternario eIF3 GTP Met tRNA a la subunidad 40 S formando el complejo de preiniciaci n 43S 3 uni n del complejo 43S al mRNA necesario que el complejo eIF4F reconozca el mRNA y se d hidr lisisde ATP 4 Colocaci n del cod n de inicio de la traducci n en direcci n 5 3 5 liberaci n de los factoresde iniciaci n de la traducci n 6 Uni n e la subunidad ribosomal 60S Gingras Raught et al 1999 . View in document p.41
Figura�4:�Modelo�de�las�dos�funciones�conocidas�de�eIF4E:�exportación�de�mRNAs�y�traducción�cap�dependiente.�eIF4E�permite�la�traducción�de�mRNAs�con�la�estructura�cap�en�el�extremo�5’;�por�otra�parte�media� la� exportación� de� mRNAs� de� núcleo� a� citoplasma� mediante� la� su� unión� al� extremo� 3’� UTR� del�mRNA,� en� unas� secuencias� denominadas� eIF4E�sensitivity� elements� (4E�SE)� (adaptado� de� Carroll� and�Borden�2013).�

Figura 4.

Modelo de las dos funciones conocidas de eIF4E exportaci n de mRNAs y traducci n cap dependiente eIF4E permite la traducci n de mRNAs con la estructura cap en el extremo 5 por otra parte media la exportaci n de mRNAs de n cleo a citoplasma mediante la su uni n al extremo 3 UTR del mRNA en unas secuencias denominadas eIF4E sensitivity elements 4E SE adaptado de Carroll and Borden 2013 . View in document p.47
Figura�6:�Señales�de�identidad�del�cáncer.�La�ilustración�muestra�las�seis�capacidades�compartidas�en�la�mayoría�de�los�cánceres�(adaptado�de�Hanahan�and�Weinberg�2011).�

Figura 6.

Se ales de identidad del c ncer La ilustraci n muestra las seis capacidades compartidas en la mayor a de los c nceres adaptado de Hanahan and Weinberg 2011 . View in document p.54
Figura�incrementan2008).con 7:� Niveles� elevados� de� eIF4E� incrementan� la� tumorigénesis.� Niveles� elevados� de� eIF4E��la�traducción�de�los�niveles�de�los�mRNA�débiles,�los�cuales�codifican�proteínas�relacionadas��la�malignidad,�esto�incrementa�la�tumorigénesis�y�la�metástasis�(adaptado�de�Graff,�Konicek�et�al.��
Figura incrementan2008 con 7 Niveles elevados de eIF4E incrementan la tumorig nesis Niveles elevados de eIF4E la traducci n de los niveles de los mRNA d biles los cuales codifican prote nas relacionadas la malignidad esto incrementa la tumorig nesis y la met stasis adaptado de Graff Konicek et al . View in document p.56
Figura�incrementa 8:� Vía� de� activación� de� la� invasión� celular� mediante� el� complejo� N�cadherina� y� FGFR�1.� La�interacción�sinérgica�de�la�N�cadherina�con�el�receptor�de�factores�de�crecimiento�de�fibroblastos�(FGFR)��la�invasión�celular�mediante�la�secreción�de�MMP9�al�activarse�la�vía�MAPK/ERK,�y�la�motilidad�celular�mediante�una�vía�desconocida�(adaptado�de�Hazan,�Qiao�et�al.�2004).��
Figura incrementa 8 V a de activaci n de la invasi n celular mediante el complejo N cadherina y FGFR 1 La interacci n sin rgica de la N cadherina con el receptor de factores de crecimiento de fibroblastos FGFR la invasi n celular mediante la secreci n de MMP9 al activarse la v a MAPK ERK y la motilidad celular mediante una v a desconocida adaptado de Hazan Qiao et al 2004 . View in document p.61
Figura�exportación�9:�Representación�esquemática�de�los�seis�lugares�de�fosforilación�de�4E�T�por�JNK.�NES:�señal�de�nuclear;�NLS:�señal�de�localización�nuclear�(Cargnello,�Tcherkezian�et�al.�2012).�
Figura exportaci n 9 Representaci n esquem tica de los seis lugares de fosforilaci n de 4E T por JNK NES se al de nuclear NLS se al de localizaci n nuclear Cargnello Tcherkezian et al 2012 . View in document p.64
Figura��10:�4E�T�media�la�importación�de�eFI4E�a�núcleo.�4E�T�media�la�importación�a�núcleo�de�eIF4Emediante�su�unión�a�la�importina���,�una�vez�en�núcleo�4E�T�y�peIF4E�se�disocian�del�complejo�importina��� por� la� acción� de� Ran�GTP.� Una� vez� en� núcleo� 4E�T� es� exportado� a� citoplasma� mediante� la� víaCRM1/exportin�1�(Dostie,�Ferraiuolo�et�al.�2000).�
Figura 10 4E T media la importaci n de eFI4E a n cleo 4E T media la importaci n a n cleo de eIF4Emediante su uni n a la importina una vez en n cleo 4E T y peIF4E se disocian del complejo importina por la acci n de Ran GTP Una vez en n cleo 4E T es exportado a citoplasma mediante la v aCRM1 exportin 1 Dostie Ferraiuolo et al 2000 . View in document p.66
Figura�puedenLas11:�Modelo�hipotético�entre�la�relación�de�GS�y�PBs.�Las�flechas�discontinuas�indican�un�posible�destino�de�os�transcritos�nacientes�exportados�des�de�el�núcleo�al�citoplasma�en�una�situación�de�estrés.�� líneas� onduladas� representan� los� microtúbulos� y� su� posible� contribución� en� el� movimiento� de� los�gránulos�permitiendo�que�puedan�agregarse�y/o�el�movimiento�de�las�mRNPs�que�forman�parte�de�estos�y��encontrarse�en�diferentes�estados�(Buchan�and�Parker�2009).�

Figura pueden.

Las11 Modelo hipot tico entre la relaci n de GS y PBs Las flechas discontinuas indican un posible destino de os transcritos nacientes exportados des de el n cleo al citoplasma en una situaci n de estr s l neas onduladas representan los microt bulos y su posible contribuci n en el movimiento de los gr nulos permitiendo que puedan agregarse y o el movimiento de las mRNPs que forman parte de estos y encontrarse en diferentes estados Buchan and Parker 2009 . View in document p.68
Figura�12:�Componentes�de�los�PBs�y�GS.�En�amarillo�están�señalados�los�componentes�que�comparten�ambos�tipos�de�gránulos�(adaptado�de�Buchan�and�Parker�2009).�

Figura 12.

Componentes de los PBs y GS En amarillo est n se alados los componentes que comparten ambos tipos de gr nulos adaptado de Buchan and Parker 2009 . View in document p.69
Figura�estos.activa13:�Esquema�representativo�del�role�de�la�fosforilación�de�4E�T�en�PBs.�Tras�el�estrés�oxidativo�se��JNK,�la�cual�media�la�fosforilación�de�4E�T�y�incrementa�su�acumulación�en�PBs�y�el�crecimiento�de��JNK�pude�regular�la�formación�de�PBs�mediante�la�fosforilación�de�4E�T�(Cargnello,�Tcherkezian�et�al.�2012).�
Figura estos activa13 Esquema representativo del role de la fosforilaci n de 4E T en PBs Tras el estr s oxidativo se JNK la cual media la fosforilaci n de 4E T y incrementa su acumulaci n en PBs y el crecimiento de JNK pude regular la formaci n de PBs mediante la fosforilaci n de 4E T Cargnello Tcherkezian et al 2012 . View in document p.71
Figura�14:�Cámara�de�Neubauer.�A)�Imagen�de�los�cuadrantes�de�la�cámara�de�Neubauer.�B)�Dirección�decontaje� de� las� células� dentro� de� un� cuadrante� de� la� cámara� de� Neubauer� (Technical� Note� �� NeubauerChamber�Cell�Counting,�Celeromics).��

Figura 14.

C mara de Neubauer A Imagen de los cuadrantes de la c mara de Neubauer B Direcci n decontaje de las c lulas dentro de un cuadrante de la c mara de Neubauer Technical Note NeubauerChamber Cell Counting Celeromics . View in document p.86
Figura�digestión15:�Mapa�de�restricción�vector�pCS3MT�y�pLPCX.�A)�Se�extrajo�eIF4E�con�el�Myc�tag�mediante�la�digestión� HindII� y� EcoRI.� B)� eIF4E�Myc�tag� se� clono� dentro� del� vector� retroviral� pLPCX� mediante� la��HindII�y�EcoRI.�
Figura digesti n15 Mapa de restricci n vector pCS3MT y pLPCX A Se extrajo eIF4E con el Myc tag mediante la digesti n HindII y EcoRI B eIF4E Myc tag se clono dentro del vector retroviral pLPCX mediante la HindII y EcoRI . View in document p.88
Figura�17:�Mapa�de�restricción�del�vector�sh4E�T�pLKO.1�puro.�

Figura 17.

Mapa de restricci n del vector sh4E T pLKO 1 puro . View in document p.90
Figura�MBexpresión18:�Niveles�de�la�expresión�de�eIF4E�y�Myc�tag.�Por�western�blot�vemos�niveles�similares�de�la��de�los�dos�mutantes�de�eIF4E�y�del�eIF4E�endógeno�(25KDa)�en�la�línea�celular�HaCaT�y�MDA��231;�en�la�línea�celular�MDA�MB�468�vemos�una�expresión�de�los�mutantes�de�eIF4E�inferior�al�eIF4E�endógeno,�viéndose�una�menor�expresión�del�mutante�S209A;�en�la�línea�celular�HeLa�se�observa�una�menor�expresión�de�los�mutantes�de�eIF4E,�siendo�esta�menor�en�el�caso�del�mutante�S209D.�

Figura M.

Bexpresi n18 Niveles de la expresi n de eIF4E y Myc tag Por western blot vemos niveles similares de la de los dos mutantes de eIF4E y del eIF4E end geno 25KDa en la l nea celular HaCaT y MDA 231 en la l nea celular MDA MB 468 vemos una expresi n de los mutantes de eIF4E inferior al eIF4E end geno vi ndose una menor expresi n del mutante S209A en la l nea celular HeLa se observa una menor expresi n de los mutantes de eIF4E siendo esta menor en el caso del mutante S209D . View in document p.108
Figura�19:�Ensayo�de�proliferación�celular�mediante�MTT.�No�se�observa�una�diferencia�significante�en�la�proliferación�entre�los�dos�mutantes�de�eIF4E�y�GFP�en�ninguna�de�las�cuatro�líneas�de�estudio.�Media�del�resultado�de�tres�experimentos.�

Figura 19.

Ensayo de proliferaci n celular mediante MTT No se observa una diferencia significante en la proliferaci n entre los dos mutantes de eIF4E y GFP en ninguna de las cuatro l neas de estudio Media del resultado de tres experimentos . View in document p.109
Figura� 20:� Tinción� con� cristal� violeta� del� ensayo� de� formación� de� colonias� realizado� en� las� líneas�
Figura 20 Tinci n con cristal violeta del ensayo de formaci n de colonias realizado en las l neas . View in document p.110
Figura�HaCaT).HaCaTcélulaslas(significativo(significativo�21:�Efecto�en�la�proliferación�y�resistencia�celular�de�diferentes�tipos�de�estrés.�En�MDA�MB�231�y��se�observa�un�incremento�de�la�resistencia�con�el�mutante�S209D�tras�el�tratamiento�con�arsénico��a�las�48�horas�en�las�dos�líneas�celulares),�la�falta�de�nutrientes�(significativo�a�las�72�horas�en��dos�líneas�celulares)�y�cisplatino�(significativo�a�las�48�y�72�horas�en�MDA�MB�231�y�a�las�72�horas�en��En�el�caso�de�las�MDA�MB�468�y�HeLa�el�mutante�S209D�confiere�más�resistencia�al�tratar�las��con�arsénico�(significativo�a�las�24�y�48�horas�en�las�dos�líneas�celulares)�y�con�falta�de�nutrientes��a�las�48�y�72�horas�en�MDA�MB�468�y�a�las�72�horas�en�HeLa).�Significativo�si�*�<0,05,�**<�0,01�y�***<0,001.�

Figura HaCaT.

HaCaTc lulaslas significativo significativo 21 Efecto en la proliferaci n y resistencia celular de diferentes tipos de estr s En MDA MB 231 y se observa un incremento de la resistencia con el mutante S209D tras el tratamiento con ars nico a las 48 horas en las dos l neas celulares la falta de nutrientes significativo a las 72 horas en dos l neas celulares y cisplatino significativo a las 48 y 72 horas en MDA MB 231 y a las 72 horas en En el caso de las MDA MB 468 y HeLa el mutante S209D confiere m s resistencia al tratar las con ars nico significativo a las 24 y 48 horas en las dos l neas celulares y con falta de nutrientes a las 48 y 72 horas en MDA MB 468 y a las 72 horas en HeLa Significativo si 0 05 0 01 y 0 001 . View in document p.112
Figure�2caspasas� 22:� Actividad� apoptótica� medida� con� el� ensayo� de� luminiscencia� caspasa�3/7.� Se� observa� una�disminución�significativa�en�la�activación�de�la�apoptosis�al�sobreexpresar�el�mutante�S209D�con�respecto�al� mutante� S209A� y� el� control� GFP,� el� cual� no� muestra� una� activación� de� la� apoptosis� al� tratar� con�arsénico.�El�incremento�se�da�a�los�90�minutos�tras�el�tratamiento�con�arsénico�y�se�ve�incrementado�a�las�� horas;� a� las� 24� horas� tras� el� tratamiento� se� restablecen� los� niveles� normales� de� activación� de� las��3�y�7.�Significativo�si�*�<0,05,�**<�0,01.�
Figure 2caspasas 22 Actividad apopt tica medida con el ensayo de luminiscencia caspasa 3 7 Se observa una disminuci n significativa en la activaci n de la apoptosis al sobreexpresar el mutante S209D con respecto al mutante S209A y el control GFP el cual no muestra una activaci n de la apoptosis al tratar con ars nico El incremento se da a los 90 minutos tras el tratamiento con ars nico y se ve incrementado a las horas a las 24 horas tras el tratamiento se restablecen los niveles normales de activaci n de las 3 y 7 Significativo si 0 05 0 01 . View in document p.113
Figura�condicionescon 23:� Western� blot� de� los� niveles� de� eIF4E� fosforilado� (peIF4E)� y� eIF4E.� A)� MDA�MB�231� en�� normales� (CN),� con� tratamiento� de� arsénico� (NaAsO2)� y� con� tratamiento� de� cisplatino.�Incremento�de�la�fosforilación�de�eIF4E�con�los�dos�tipos�de�estrés,�disminución�de�la�fosforilación�al�tratar��el�inhibidor�de�las�Mnk1/2.�B)�HaCaT�en�condiciones�normales�y�arsénico.�Incremento�de�peIF4E�al�tratar�con�arsénico.�Disminución�de�la�fosforilación�al�tratar�con�el�inhibidor�de�las�Mnk1/2.�
Figura condicionescon 23 Western blot de los niveles de eIF4E fosforilado peIF4E y eIF4E A MDA MB 231 en normales CN con tratamiento de ars nico NaAsO2 y con tratamiento de cisplatino Incremento de la fosforilaci n de eIF4E con los dos tipos de estr s disminuci n de la fosforilaci n al tratar el inhibidor de las Mnk1 2 B HaCaT en condiciones normales y ars nico Incremento de peIF4E al tratar con ars nico Disminuci n de la fosforilaci n al tratar con el inhibidor de las Mnk1 2 . View in document p.113
Figura�peIF4E25:�Niveles�de�peIF4E�en�MEF�WT�y�MEF�KO.�El�tratamiento�con�CGP�57380�reduce�los�niveles�de� en� las� MEF� WT� pero� no� de� forma� tan� drástica� como� en� el� caso� de� las� MEF� KO,� las� cuales� nopresentan�niveles�de�peIF4E�endógeno.�

Figura peIF4.

E25 Niveles de peIF4E en MEF WT y MEF KO El tratamiento con CGP 57380 reduce los niveles de en las MEF WT pero no de forma tan dr stica como en el caso de las MEF KO las cuales nopresentan niveles de peIF4E end geno . View in document p.115
Figura�significativoyproliferaciónarsénicotratamiento 26:� La� inhibición� de� la� fosforilación� de� eIF4E� inhibe� la� recuperación� tras� el� tratamiento� con��y�cisplatino.�A)�En�condiciones�normales�a�las�72�horas�vemos�una�disminución�significativa�de�la��en�las�MEF�KO�con�respecto�las�MEF�WT.�Tras�tratar�con�arsénico�observamos�un�incremento��en�la�viabilidad�celular�en�las�MEF�WT�a�partir�de�las�24�horas,�en�el�caso�del�tratamiento�con�cisplatino� las� células� MEF� WT� son� más� resistentes,� siendo� significativo� a� partir� de� las� 48� horas.� B)� El�� con� CGP� 57380� de� las� MEF� WT� parece� no� afectar� a� la� proliferación� celular,� viéndose� una�disminución,�no�significativa,�a�las�72�horas;�CGP�57380�las�hace�más�sensibles�al�tratamiento�con�arsénico��cisplatino,�en�ambos�casos�significativo�a�partir�de�las�24�horas.�Significativo�si�*�<0,05,�**<�0,01.�
Figura significativoyproliferaci nars nicotratamiento 26 La inhibici n de la fosforilaci n de eIF4E inhibe la recuperaci n tras el tratamiento con y cisplatino A En condiciones normales a las 72 horas vemos una disminuci n significativa de la en las MEF KO con respecto las MEF WT Tras tratar con ars nico observamos un incremento en la viabilidad celular en las MEF WT a partir de las 24 horas en el caso del tratamiento con cisplatino las c lulas MEF WT son m s resistentes siendo significativo a partir de las 48 horas B El con CGP 57380 de las MEF WT parece no afectar a la proliferaci n celular vi ndose una disminuci n no significativa a las 72 horas CGP 57380 las hace m s sensibles al tratamiento con ars nico cisplatino en ambos casos significativo a partir de las 24 horas Significativo si 0 05 0 01 . View in document p.115
Figura�Inmunofluorescenciadecon 27:� Colocalización� del� mutante� S209D� en� las� líneas� celulares� MDA�MB�231� y� HaCaT� con� 4E�T.�de�la�expresión�de�4E�T�endógeno�(canal�rojo)�y�de�la�expresión�de�los�dos�mutantes�eIF4E�marcados�con�el�Myc�tag�(canal�verde)�a�un�aumento�de�60�X.�El�mutante�S209D�colocaliza�enunos�cuerpos�citoplasmáticos�con�4E�T�en�las�dos�líneas�celulares;�no�observándose�esta�colocalización�el�mutante�S209A.�
Figura Inmunofluorescenciadecon 27 Colocalizaci n del mutante S209D en las l neas celulares MDA MB 231 y HaCaT con 4E T de la expresi n de 4E T end geno canal rojo y de la expresi n de los dos mutantes eIF4E marcados con el Myc tag canal verde a un aumento de 60 X El mutante S209D colocaliza enunos cuerpos citoplasm ticos con 4E T en las dos l neas celulares no observ ndose esta colocalizaci n el mutante S209A . View in document p.117
Figura�entreendógeno28:�Inmunoprecipitación�de�eIF4E�y�4E�T.�A)�El�ensayo�de�inmunoprecipitación,�en�MDA�MB�231,�con� anticuerpo� anti�Myc�tag� contra� eIF4E�S209A� y� eIF4E�S209D� demuestra� una� específica� interacción��eIF4E�S209D�y�4E�T�(C:�input;�CB:�control�negativo,�proteína�G�sefarosa;�IP:�inmunoprecipitación).�B)� Inmunoprecipitación� de� la� línea� celular� MDA�MB�231� con� peIF4E� y� eIF4E.� A� la� derecha� inputs�correspondientes�al�10�%�del�lisado�total.�El�tratamiento�con�arsénico�incrementa�la�fosforilación�del�eIF4E��e�incrementa�su�interacción�con�4E�T,�el�tratamiento�con�CGP�57380�reduce�esta�interacción�tanto�en�condiciones�normales�como�al�combinarlo�con�el�tratamiento�de�arsénico.�
Figura entreend geno28 Inmunoprecipitaci n de eIF4E y 4E T A El ensayo de inmunoprecipitaci n en MDA MB 231 con anticuerpo anti Myc tag contra eIF4E S209A y eIF4E S209D demuestra una espec fica interacci n eIF4E S209D y 4E T C input CB control negativo prote na G sefarosa IP inmunoprecipitaci n B Inmunoprecipitaci n de la l nea celular MDA MB 231 con peIF4E y eIF4E A la derecha inputs correspondientes al 10 del lisado total El tratamiento con ars nico incrementa la fosforilaci n del eIF4E e incrementa su interacci n con 4E T el tratamiento con CGP 57380 reduce esta interacci n tanto en condiciones normales como al combinarlo con el tratamiento de ars nico . View in document p.118
Figura�eIF4EaumentoObservamos29:�Inmunofluorescencia�en�la�línea�celular�MDA�MB�231�con�la�sobreexpresión�de�eIF4E�S209A�y�S209D,� de� 4E�T� con� los� marcadores� de� GS� (TIA�1)� y� PBs� (DCP1A).� Tratamiento� con� NaAsO2.Observamos� el� 4E�T� endógeno� en� el� canal� rojo� y� los� marcadores� de� PBs� y� GS� en� el� canal� verde� a� un�de�60�X.�Al�sobreexpresar�el�mutante�S209D�4E�T�no�colocaliza�con�el�marcador�de�GS�TIA�1.�una�colocalización�parcial�con�DCP1A,�marcador�de�PBs.�

Figura eIF4.

EaumentoObservamos29 Inmunofluorescencia en la l nea celular MDA MB 231 con la sobreexpresi n de eIF4E S209A y S209D de 4E T con los marcadores de GS TIA 1 y PBs DCP1A Tratamiento con NaAsO2 Observamos el 4E T end geno en el canal rojo y los marcadores de PBs y GS en el canal verde a un de 60 X Al sobreexpresar el mutante S209D 4E T no colocaliza con el marcador de GS TIA 1 una colocalizaci n parcial con DCP1A marcador de PBs . View in document p.119
Figura�solosefarosa 30:� Inmunoprecipitación� de� 4E�T,� Ago2� y� HuR.� En� MDA�MB�231.� A)� Realizamos� una�inmunoprecipitación�de�los�mutantes�de�eIF4E�mediante�el�pull�down�del�Myc�tag;�se�observó�que�tan��el�mutante�fosfomimético�interaccionaba�con�Ago2�y�HuR�(C:�input;�CB:�control�negativo,�proteína�G�;�IP:�inmunoprecipitación)�B)�Inmunoprecipitación�anti�Ago2,�unión�con�4E�T,�HuR�y�peIF4E�en�condiciones�normales�y�con�el�tratamiento�con�arsénico,�no�se�observa�unión�al�tratar�las�células�con�el�inhibidor�CGP�57380�tanto�en�condiciones�normales�como�bajo�el�estrés�producido�por�el�arsénico.�
Figura solosefarosa 30 Inmunoprecipitaci n de 4E T Ago2 y HuR En MDA MB 231 A Realizamos una inmunoprecipitaci n de los mutantes de eIF4E mediante el pull down del Myc tag se observ que tan el mutante fosfomim tico interaccionaba con Ago2 y HuR C input CB control negativo prote na G IP inmunoprecipitaci n B Inmunoprecipitaci n anti Ago2 uni n con 4E T HuR y peIF4E en condiciones normales y con el tratamiento con ars nico no se observa uni n al tratar las c lulas con el inhibidor CGP 57380 tanto en condiciones normales como bajo el estr s producido por el ars nico . View in document p.120
Figura�proliferaciónendógeno.estrésmutanteinhibicióntratamiento 31:� La� inhibición� de� 4E�T� endógeno� disminuye� la� capacidad� de� S209D� de� recuperarse� tras� un� celular.� A)� Western� blot� de� 4E�T� en� los� mutantes� de� eIF4E� con� el� sh� 4E�T.� Observamos� una� elevada� de� la� expresión� endógena� de� 4E�T� en� el� control� GFP� y� el� mutante� S209D,� con� el� S209A� la� inhibición� de� 4E�T� no� resulta� tan� elevada.� B)� No� observamos� diferencias� en� la�celular�entre�los�diferentes�mutantes�de�eIF4E�y�el�control�al�inhibir�la�expresión�del�4E�T� La� inhibición� de� 4E�T� disminuye� la� capacidad� del� mutante� S209D� de� recuperarse� tras� el�con�arsénico.�Significativo�si�*<0,05�y�**<0,01.�
Figura proliferaci nend geno estr smutanteinhibici ntratamiento 31 La inhibici n de 4E T end geno disminuye la capacidad de S209D de recuperarse tras un celular A Western blot de 4E T en los mutantes de eIF4E con el sh 4E T Observamos una elevada de la expresi n end gena de 4E T en el control GFP y el mutante S209D con el S209A la inhibici n de 4E T no resulta tan elevada B No observamos diferencias en la celular entre los diferentes mutantes de eIF4E y el control al inhibir la expresi n del 4E T La inhibici n de 4E T disminuye la capacidad del mutante S209D de recuperarse tras el con ars nico Significativo si 0 05 y 0 01 . View in document p.121
Figura�33:�4E�T�por�sí�solo�no�permite�la�recuperación�celular�tras�el�tratamiento�con�arsénico.�Tanto�la�sobreexpresión� de� 4E�T� como� de� su� mutante� incapaz� de� unirse� a� eIF4E� no� favorecen� la� recuperación�celular�tras�el�tratamiento�con�arsénico.�
Figura 33 4E T por s solo no permite la recuperaci n celular tras el tratamiento con ars nico Tanto la sobreexpresi n de 4E T como de su mutante incapaz de unirse a eIF4E no favorecen la recuperaci n celular tras el tratamiento con ars nico . View in document p.122
Figura�recuperacióntras 32:� Es� necesaria� la� unión� de� eIF4E� a� 4E�T� y� que� eIF4E� esté� fosforilado� para� que� se� dé� la�tras�el�estrés�celular.�El�mutante�de�eIF4E�incapaz�de�unirse�a�4E�T�inhibe�la�recuperación� el� tratamiento� con� arsénico.� El� doble� mutante� incapaz� de� unirse� a� 4E�T� y� fosfomimético� tambiéninhibe�la�recuperación�tras�el�estrés.��
Figura recuperaci ntras 32 Es necesaria la uni n de eIF4E a 4E T y que eIF4E est fosforilado para que se d la tras el estr s celular El mutante de eIF4E incapaz de unirse a 4E T inhibe la recuperaci n el tratamiento con ars nico El doble mutante incapaz de unirse a 4E T y fosfomim tico tambi ninhibe la recuperaci n tras el estr s . View in document p.122
Figura�tras 34:� La� inhibición� de� Ago2� y� HuR� evita� la� recuperación� celular� del� mutante� S209D� tras� el�tratamiento�con�arsénico.�Mediante�el�ensayo�de�MTT�observamos�que�la�proliferación�de�la�línea�celular�MDA�MD�231�al�utilizar�un�siRNA�control�no�se�ve�afectada�en�ninguno�de�los�mutantes�de�eIF4E�ni�en�su�control�GFP.�Al�inhibir�Ago2�y�HuR�mediante�su�siRNA�no�se�observa�una�recuperación�del�mutante�S209D��el�tratamiento�con�arsénico.�Significativo�si�**<0,01�y�***<0,001.�
Figura tras 34 La inhibici n de Ago2 y HuR evita la recuperaci n celular del mutante S209D tras el tratamiento con ars nico Mediante el ensayo de MTT observamos que la proliferaci n de la l nea celular MDA MD 231 al utilizar un siRNA control no se ve afectada en ninguno de los mutantes de eIF4E ni en su control GFP Al inhibir Ago2 y HuR mediante su siRNA no se observa una recuperaci n del mutante S209D el tratamiento con ars nico Significativo si 0 01 y 0 001 . View in document p.123

Referencias

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