Estratègies analítiques per a la determinació d’antimicrobians en aliments

179  Descargar (0)

Texto completo

(1)Estratègies analítiques per a la determinació d’antimicrobians en aliments Joaquim Chico i Rovira. . ADVERTIMENT. La consulta d’aquesta tesi queda condicionada a l’acceptació de les següents condicions d'ús: La difusió d’aquesta tesi per mitjà del servei TDX (www.tdx.cat) i a través del Dipòsit Digital de la UB (diposit.ub.edu) ha estat autoritzada pels titulars dels drets de propietat intel·lectual únicament per a usos privats emmarcats en activitats d’investigació i docència. No s’autoritza la seva reproducció amb finalitats de lucre ni la seva difusió i posada a disposició des d’un lloc aliè al servei TDX ni al Dipòsit Digital de la UB. No s’autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX o al Dipòsit Digital de la UB (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant al resum de presentació de la tesi com als seus continguts. En la utilització o cita de parts de  la tesi és obligat indicar el nom de la persona autora. ADVERTENCIA. La consulta de esta tesis queda condicionada a la aceptación de las siguientes condiciones de uso: La difusión de esta tesis por medio del servicio TDR (www.tdx.cat) y a través del Repositorio Digital de la UB (diposit.ub.edu) ha sido autorizada por los titulares de los derechos de propiedad intelectual únicamente para usos privados enmarcados en actividades de investigación y docencia. No se autoriza su reproducción con finalidades de lucro ni su difusión y puesta a disposición desde un sitio ajeno al servicio TDR o al Repositorio Digital de la UB. No se autoriza la presentación de su contenido en una ventana o marco ajeno a TDR o al Repositorio Digital de la UB (framing). Esta reserva de derechos afecta tanto al resumen de presentación de la tesis como a sus contenidos. En la utilización o cita de partes de la tesis es obligado indicar el nombre de la persona autora.. WARNING. On having consulted this thesis you’re accepting the following use conditions: Spreading this thesis by the TDX (www.tdx.cat) service and by the UB Digital Repository (diposit.ub.edu) has been authorized by the titular of the intellectual property rights only for private uses placed in investigation and teaching activities. Reproduction with lucrative aims is not authorized nor its spreading and availability from a site foreign to the TDX service or to the UB Digital Repository. Introducing its content in a window or frame foreign to the TDX service or to the UB Digital Repository is not authorized (framing). Those rights affect to the presentation summary of the thesis as well as to its contents. In the using or citation of parts of the thesis it’s obliged to indicate the name of the author..

(2) Facultat de Química Departament de Química Analítica Programa de doctorat Química Analítica del Medi Ambient i la Pol·lució. Tesi doctoral. ESTRATÈGIES ANALÍTIQUES PER A LA DETERMINACIÓ D’ANTIMICROBIANS EN ALIMENTS. Memòria presentada per JOAQUIM CHICO i ROVIRA per optar al títol de Doctor per la Universitat de Barcelona. Sota la direcció de Dra. MARIA DOLORS PRAT Dra. MERCÈ GRANADOS.

(3)

(4) La Dra. Maria Dolors Prat i Roura, catedràtica del Departament de Química Analítica de la Universitat de Barcelona, i la Dra. Mercè Granados i Juan, professora titular del mateix departament,. FAN CONSTAR. Que la present memòria titulada ESTRATÈGIES ANALÍTIQUES PER A LA DETERMINACIÓ D’ANTIMICROBIANS EN ALIMENTS ha estat realitzada sota la nostra direcció pel Sr. Joaquim Chico i Rovira en el Departament de Química Analítica de la Universitat de Barcelona i que tots els resultats presentats en la mateixa són fruit de les experiències realitzades pel citat doctorand.. Barcelona, maig de 2014. Dra. Maria Dolors Prat i Roura. Dra. Mercè Granados i Juan.

(5)

(6) AGRAÏMENTS. En primer lloc voldria agrair a la Dra. Mercè Granados i a la Dra. Mª Dolors Prat, directores d’aquesta Tesi, la seva orientació, bona disponibilitat i implicació en la feina realitzada en aquesta Tesi. Òbviament, sense elles la realització d’aquest treball no hauria estat possible. També elles són responsables sens dubte del meu creixement com a científic i professional de la química. També voldria agrair al Dr. Ramon Companyó les seves aportacions al llarg d’aquesta Tesi i la disponibilitat en tot moment a l’hora de col·laborar. Una gran part d’aquesta Tesi no s’hauria pogut realitzar sense la col·laboració amb l’Agència de Salut Pública de Barcelona a través del Dr. Francesc Centrich, cap del Servei de Química, a qui agraeixo profundament la oportunitat que em va donar de formar part del seu equip durant aquest temps. Al Toni Rúbies, qui va supervisar de ben a prop la feina realitzada, li vull agrair la paciència, la proximitat, el temps dedicat i el no tenir mai un “no” tot i el “trepidant” ritme de feina a l’Agència. I també agrair a tots els companys que van col·laborar en que el dia a dia fos d’allò més agradable, i fins i tot als que puntualment es van implicar directament en el treball realitzat per aquesta Tesi. I would also like to thank Dr. Frederique van Holthoon and Dr. Tina Zuidema for their supervision and for giving me the opportunity to work with them in such an important reference laboratory as RIKILT, in Wageningen, during my PhD stage. I think we all learned a lot about ion suppression. Sense cap mena de dubte es mereixen una menció especial els meus companys del grup de Fluorescència. En aquests 10 anys n’han passat molts, i la convivència amb ells al laboratori i fora d’ell m’ha aportat experiències molt enriquidores. Estic segur que amb un quants d’ells conservarem l’amistat al llarg del temps. He trobat un gran suport en vosaltres, companys d’aventures analítiques, de sopars, d’excursions, i de riures assegurats, entre moltes altres coses!.

(7) Al llarg dels anys he tingut la sort de creuar-me amb moltes persones en aquest edifici de la Facultat de Química que m’han aportat grans coses. Als meus amics de la carrera, molts d’ells doctors també, els agraeixo el suport que sempre m’han mostrat, i desitjo que l’amistat perduri com ho ha fet fins ara. Als amics “no-fluorescents” que he fet en el Departament de Química Analítica, els agraeixo les estones de compartir vivències i de suport mutu al llarg d’aquest camí. Durant la meva etapa professional també he tingut la sort de creuar-me amb gent magnífica, a qui agraeixo els bons consells professionals i personals, el suport i l’amistat. A ells també els dec una petita part d’aquesta Tesi. A tots els amics que poc tenen a veure amb la química els agraeixo la infinita paciència, la complicitat i la comprensió en les etapes de “reclusió” (especialment durant els darrers mesos). Em considero afortunat de tenir-vos a tots a prop i la vostra companyia, encara que en alguns casos sigui menys freqüent del que voldríem, de ben segur ha estat de gran ajuda a l’hora de culminar la Tesi. Finalment vull donar les gràcies a la meva família pel suport i el recolzament incondicionals en tot moment, també en la finalització d’aquest projecte..

(8) ÍNDEX.

(9)

(10) I-. RESUM ........................................................................................................ 1. II- OBJECTIUS................................................................................................. 5. III- INTRODUCCIÓ ........................................................................................... 9. 1-. 2-. AGENTS ANTIMICROBIANS D’ÚS VETERINARI.................................................. 11 1.1-. Presència en aliments d’origen animal i control en la cadena alimentària .. 12. 1.2-. Presència en el medi ambient ............................................................................ 17. 1.3-. Resistència bacteriana ........................................................................................ 18. COCCIDIOSTÀTICS I ANTIBACTERIANS .............................................................. 21 2.1-. 2.1.1-. Ionòfors .......................................................................................................... 23. 2.1.2-. No-ionòfors .................................................................................................... 24. 2.2-. 3-. Coccidiostàtics: ús i propietats ........................................................................... 22. Antibacterians: ús i propietats ............................................................................ 25. 2.2.1-. Penicil·lines .................................................................................................... 26. 2.2.2-. Tetraciclines .................................................................................................. 27. 2.2.3-. Macròlids ........................................................................................................ 29. 2.2.4-. Sulfamides ..................................................................................................... 29. 2.2.5-. Quinolones..................................................................................................... 31. ANÀLISI D’ANTIMICROBIANS EN ALIMENTS....................................................... 34 3.1-. Tractament de mostra .......................................................................................... 35. 3.1.1-. Sistemes d’extracció .................................................................................... 35. 3.1.2-. Sistemes de clean-up .................................................................................. 37. 3.1.3-. Sistemes que combinen extracció i clean-up ........................................... 43. 3.2-. Anàlisi cromatogràfica.......................................................................................... 44. 3.2.1-. Cromatografia de líquids acoblada a l’espectrometria de masses ....... 45. 3.2.2-. Quantificació .................................................................................................. 47. 3.2.3-. Validació ......................................................................................................... 48.

(11) 4- METODOLOGIES ANALÌTIQUES PER A COCCIDIOSTÀTICS I ANTIBACTERIANS .............................................................................................................. 51 4.1-. Coccidiostàtics ...................................................................................................... 51. 4.2-. Antibacterians........................................................................................................ 56. IV- RESULTATS I DISCUSSIÓ ....................................................................... 63. 5- DESENVOLUPAMENT DE MÈTODES PER A L’ANÀLISI D’ANTIMICROBIANS EN ALIMENTS ...................................................................................................................... 67 5.1-. Articles .................................................................................................................... 69. 5.1.1- Publicació 1: Restricted access materials for sample clean-up in the analysis of trace levels of tetracyclines by liquid chromatography. Application to food and environmental analysis ........................................................................... 69 5.1.2- Publicació 2: Use of gel permeation cromatography for clean-up in the analysis of coccidiostats in eggs by liquid chromatography-tandem mass spectrometry .................................................................................................................. 77 5.1.3- Publicació 3: High throughput method for antibiotic residue analysis by liquid chromatography-tandem mass spectrometry ........................................... 87 5.2-. Discussió ................................................................................................................ 98. 5.2.1- Ús dels materials d’accés restringit (RAM) per al clean-up en l’anàlisi de TCs en llet .................................................................................................. 98 5.2.2- Ús de la cromatografia de permeació amb gel (GPC) per al clean-up en l’anàlisi de coccidiostàtics en ous per LC-MS/MS ........................... 103 5.2.3- Desenvolupament d’un mètode multiclasse per a l’anàlisi de 39 antibacterians en múscul mitjançant LC-MS/MS ................................................... 108. 6- ESTUDI DE SUPRESSIÓ IÒNICA EN L’ANÀLISI DE TETRACICLINES EN PINSOS PER LC-MS ......................................................................................................... 115 6.1-. Publicació 4. Ion suppression study for tetracyclines in feed ...................... 117. 6.2-. Discussió .............................................................................................................. 126. V- CONCLUSIONS ...................................................................................... 133. VI- BIBLIOGRAFIA ........................................................................................ 137.

(12) ABREVIATURES I ACRÒNIMS. ACN. Acetonitril. ADI. Ingesta diària acceptable (acceptable daily intake). AEMPV. Agencia Española de Medicamentos y Productos Veterinarios. AMO. Amoxicil·lina. AMP. Ampicil·lina. ASPB. Agència de Salut Pública de Barcelona.  CC. Límit de decisió. CC. Capacitat de detecció. CE. Electroforesi capil·lar (capillary electrophoresis). CIP. Ciprofloxacina. CLO. Cloxacil·lina. CLOP. Clopidol. CMPV. Comitè de Medicines Per l’ús Veterinari (Comitte for Medicinal Products for Veterinary Use). CRM. Material de referència certificat (certified reference material). CTC. Clorotetraciclina. DAN. Danofloxacina. DIC. Dicloxacil·lina. DICL. Diclazuril. DIF. Difloxacina. DC. Doxiciclina. DCM. Diclormetà. DMC. Demeclociclina. EDAR. Estacions depuradores d’aigües residuals. EDTA. Àcid etilendiamintetraacètic (Ethylenediaminetetraacetic acid). EFSA. Autoritat Europea de Seguretat Alimentària (European Food Safety Authority).

(13) ELISA. Assaig d’immunosorbent conjugat amb un enzim (enzyme-linked immunosorbent assay). EMA. Agència Europea del Medicament (European Medicines Agency). ENR. Enrofloxacina. EPA. Agència de Protecció Ambiental dels Estats Units (US Environmental Protection Agency). ERI. Eritromicina. ESI. Ionització per electroesprai (electrospray ionization). EtAc. Acetat d’etil. ETH. Etopabat. FA. Àcid fòrmic. FDA. Administració d’Aliments i Fàrmacs dels Estats Units (US Food and Drug Administration). FL. Fluorescència. FLU. Flumequina. GC. Cromatografia de gasos (gas chromatography). GPC. Cromatografia de permeació per gel (gel permeation chromatography). HAL. Halofuginona. HCl. Àcid clorhídric. HFBA. Àcid heptafluorobutític. HILIC. Cromatografia líquida d’interacció hidròfila (hydrophilic interacction liquid chromatography). HLB. Equilibri hidrofil-lipòfil (hydrophilic-lipophilic balance). HPLC. Cromatografia de líquids d’alta resolució (high performance liquid chromatograpy). HRMS. Espectrometria de masses d’alta resolució (high resolution mass spectrometry). IP. Punt d’indentificació (identification point). IR. Infraroig. IS. Immunosorbent. JOS. Josamicina.

(14) Kow. Coeficient de partició octanol-aigua. LAS. Lasalocid. LC. Cromatografia de líquids (liquid chromatography). LLE. Extracció líquid-líquid (liquid-liquid extraction). LOD. Límit de detecció (limit of detection). LOQ. Límit de quantificació (limit of quantification). MAE. Extracció assistida per microones (microwave assisted extraction). MAD. Maduramicina. MAR. Marbofloxacina. MeOH. Metanol. MCs. Macròlids. MIP. Polímer d’empremta molecular (molecularly imprinted polymer). MMS. Patrons consistents en matriu enriquida abans de l’extracció (matrixmatched standards). MON. Monensina. MRL. Límit màxim de residu (maximun residue limit). MRM. Monitoratge múltiple de reacció (multiple reaction monitoring). MS. Espectrometria de masses (mass spectrometry). MS/MS. Espectrometria de masses en tàndem. MSPD. Dispersió de matriu en fase sòlida (matrix solid phase dispersion). NAR. Naransina. NIG. Nigericina. NOAEL. Nivell sense efecte advers observat (no-observed adverse effect level). NOR. Norfloxacina. OTC. Oxitetraciclina. OXA. Oxacil·lina. OXO. Àcid Oxolínic. PCs. Penicil·lines. PEN G. Penicil·lina G.

(15) PEN V. Penicil·lina V. PHWE. Extracció amb aigua calenta pressuritzada (pressurized hot water extraction). PI. Patró intern. PIP. Piperacil·lina. PLE. Extracció amb líquids pressuritzats (pressurized liquid extraction). PSA. Amines primàries i secundàries (primary and secondary amines). Qs. Quinolones. QqQ. Triple quadrupol. QuEChERS. Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe. RAM. Materials d’accés restringit (restricted acces materials). RASFF. Sistema d’Alerta Ràpida per Aliments i Pinsos (Rapid Alert System for Food and Feed). RON. Ronidazole. ROX. Roxitromicina. RSD. Desviació estàndard relativa (relative standard deviation). RSDr. Desviació estàndard relativa en termes de repetitivitat. RSDR. Desviació estàndard relativa en termes de reproductivitat. SAL. Salinomicina. SCP. Sulfacloropiridazina. SDMx. Sulfadimetoxina. SDX. Sulfadoxina. SDZ. Sulfadiazina. SFs. Sulfamides. SFX. Sulfisoxazole. SMM. Sulfamonometoxina. SMMS. Patrons consistents en matriu enriquida després de l’extracció (surrogate matrix-matched standards). SMPZ. Sulfametoxipiridazina. SMR. Sulfamerazina.

(16) SMTZ. Sulfametizole. SMX. Sulfametoxazole. SMZ. Sulfametazina. SPD. Sulfapiridina. SPI. Espiramicina. SQ. Sulfaquinoxalina. STZ. Sulfatiazole. SPE. Extracció en fase sòlida (solid phase extraction). TC. Tetraciclina. TCs. Tetraciclines. TFA. Àcid trifluoroacètic. TFC. Cromatografia de flux turbulent (turbulent flow chromatography). TOF. Temps de vol (time of flight). TRI. Trimetoprim. TYL. Tilosina. UE. Unió Europea. UV. Ultraviolat. UHPLC. Cromatografia de líquids d’ultra alta resolució (ultra-high performance liquid chromatography). VICH. Cooperació internacional en l’harmonització de requeriments tècnics per al registre de medicaments veterinaris (Veterinary International Cooperation on Harmonisation).

(17)

(18) I-. RESUM.

(19)

(20) Resum Els compostos antimicrobians són un dels grups de fàrmacs més utilitzats en l’àmbit veterinari; el seu ús està molt relacionat amb les pràctiques de la ramaderia intensiva. L’aplicació d’agents antimicrobians en aquest camp ha comportat importants avantatges, però també té efectes contraproduents, ja que pot implicar la presència de residus d’aquests tant en el medi ambient com en aliments d’origen animal, originant riscos de diferents tipus, com ara reaccions al·lèrgiques o creació de resistències bacterianes en els consumidors. Durant els anys 90 la UE va decidir ampliar i reforçar la legislació entorn a la seguretat alimentària i estendre els controls al llarg de tota la cadena alimentària. Així, els estats membres de la UE duen a terme actualment un gran nombre d’anàlisis en un nombre també molt extens i variat de mostres, i per aquest motiu es requereixen mètodes cada cop més ràpids i amb major capacitat d’anàlisi. En la present Tesi s’han desenvolupat metodologies per tal d’analitzar 5 famílies d’antibacterians (tetraciclines, quinolones, macròlids, sulfamides i penicil·lines) i un grup d’antiparasitaris, els coccidiostàtics, en diferents aliments d’origen animal. Els compostos seleccionats s’utilitzen àmpliament en veterinària. Els mètodes que s’han desenvolupat en aquesta Tesi es basen en la cromatografia de líquids, que és la tècnica més utilitzada per a l’anàlisi de residus en aliments. L’extracció dels anàlits, i sobretot la purificació dels extractes s’han considerat clàssicament com el coll d’ampolla dels mètodes analítics, ja que sovint és molt complicat obtenir extractes lliures de compostos interferents amb recuperacions satisfactòries. En aquest sentit, en dos dels mètodes desenvolupats s’ha avaluat l’ús de sistemes de purificació d’exclusió molecular per a l’eliminació de contingut macromolecular en matrius riques en proteïnes i lípids. En un d’ells es determinen 4 tetraciclines en llet mitjançant una purificació amb materials d’accés restringit en línia amb el sistema cromatogràfic i detecció per fluorescència. En l’altre mètode es determinen 9 coccidiostàtics en ous mitjançant una purificació per cromatografia de permeació en gel i determinació per cromatografia de líquids amb detecció d’espectrometria de masses en tàndem. En el tercer mètode desenvolupat s’han analitzat 39 antibacterians en múscul animal. En aquest cas amb una simple dilució després de l’extracció n’hi ha hagut prou per aconseguir extractes suficientment nets i poder quantificar els anàlits als nivells d’interès mitjançant cromatografia de líquids amb detecció d’espectrometria de masses en tàndem. Els mètodes desenvolupats s’han validat segons els criteris de la Decisió 657/2002 de la UE i s’han considerat adequats per als propòsits establerts. També s’ha realitzat un estudi de supressió iònica en l’anàlisi de tetraciclines en pinsos per cromatografia de líquids acoblada a l’espectrometria de masses en tàndem, 3.

(21) Resum mitjançant l’avaluació d’aquest efecte després d’aplicar diferents procediments de purificació a diferents tipus de pinsos. La supressió iònica és especialment crítica per a la quantificació de residus en matrius amb elevat grau de variabilitat de composició de la matriu, com els pinsos. S’han obtingut resultats prometedors quan s’empra un dels mètodes proposats, que obren la porta a futures investigacions en aquesta línia.. 4.

(22) II-. OBJECTIUS.

(23)

(24) Objectius Per tal de garantir la seguretat alimentària és imprescindible disposar de mètodes d’anàlisi que permetin un control eficient i fiable dels aliments. El nombre de mostres i d’anàlits que cal analitzar és molt elevat i es requereixen diferents tipus de metodologies, des de les més simples, que permeten un cribratge de mostres ràpid i efectiu, fins a les que impliquen les màximes prestacions que permet la tecnologia actual. Aquesta Tesi s’inscriu en aquest marc, i el seu objectiu global és la proposta de noves estratègies analítiques basades en la cromatografia de líquids i orientades al control de residus de fàrmacs veterinaris en aliments. En el cas de mostres que proporcionen extractes amb elevat contingut macromolecular, s’incideix en el tractament de la mostra previ a l’anàlisi cromatogràfica, especialment en l’etapa de purificació o cleanup. En altres casos, quan els extractes són més simples, és possible plantejar estratègies més senzilles i ràpides, que obvien el clean-up dels extractes.. Els objectius concrets han estat:. · Avaluació de sistemes basats en l’exclusió per grandària per al clean-up d’extractes de mostres d’aliments d’origen animal. En concret s’han estudiat la cromatografia de permeació en gel (GPC, de gel permeation chromatography) i els materials d’accés restringit (RAM, de restricted acces materials). · Avaluació de diferents estratègies de clean-up basades en l’extracció en fase sòlida per a la minimització de l’efecte de matriu en l’anàlisi de tetraciclines en pinsos mitjançant cromatografia de líquids i espectrometria de masses en tàndem .. · Desenvolupament de mètodes per a l’anàlisi de residus de fàrmacs d’ús veterinari en aliments d’origen animal:. -. Determinació de tetraciclines en llet mitjançant cromatografia de líquids amb detecció per fluorescència.. -. Determinació de coccidiostàtics en ous mitjançant cromatografia de líquids i espectrometria de masses en tàndem.. -. Determinació multiclasse d’antibacterians en mostres de múscul animal mitjançant cromatografia de líquids i espectrometria de masses en tàndem.. 7.

(25)

(26) III- INTRODUCCIÓ.

(27)

(28) Introducció 1- AGENTS ANTIMICROBIANS D’ÚS VETERINARI. Els compostos antimicrobians són un dels grups de fàrmacs més utilitzats en l’àmbit veterinari. Es tracta de substàncies que maten o inhibeixen el creixement de microorganismes, impedint la propagació d’infeccions causades per aquests. En funció del tipus de microorganisme sobre els que actuen es poden classificar en quatre grans famílies: antivírics, antifúngics o antimicòtics, antiparasitaris i antibacterians. Els antimicrobians poden ser d’origen natural, és a dir, produïts per microorganismes per tal de protegir-se d’altres microorganismes, o d’origen sintètic. El terme antibiòtic es refereix en sentit estricte als antimicrobians d’origen natural, però a la pràctica és molt habitual fer-lo servir en un sentit més ampli i englobar també els antimicrobians sintètics. L’ús d’agents antimicrobians en veterinària està molt relacionat amb les pràctiques de la ramaderia intensiva. S’utilitzen amb tres finalitats bàsiques: · Terapèutica (tractament de malalties diagnosticades). En aquest cas, s’administren a dosis altes i durant períodes de temps relativament curts. L’administració es du a terme per via oral o parenteral. · Profilàctica (prevenció de malalties). Aquesta pràctica és freqüent en la cria intensiva d’animals, ja que en aquestes condicions els animals són propensos al desenvolupament i contagi de malalties. L’administració en aquest cas sol ser a través de l’aigua de beguda o el pinso, i la dosi i la durada són variables.. · Promoció del creixement. L’administració de determinats antimicrobians en dosis baixes i continuades en el pinso fa que els animals guanyin pes de manera més ràpida. Aquest tipus de pràctica es va iniciar a mitjans del segle passat, amb l’addició d’oxitetraciclina i clortetraciclina als pinsos. Cal destacar que des de l’any 2006 l’ús d’antimicrobians amb aquesta finalitat està prohibit als països de la Unió Europea (UE) [1], però en canvi segueix vigent en d’altres països com per exemple Estats Units o Canadà.. És inqüestionable que l’aplicació d’agents antimicrobians en aquest àmbit ha comportat importants avantatges, que van des de l’obtenció d’animals més sans, fins a una gran eficiència en les taxes de producció d’aliments, amb un cost econòmic relativament. baix.. D’altra. banda,. l’ús. d’aquests. agents. també. té. efectes 11.

(29) Agents antimicrobians d’ús veterinari contraproduents, ja que pot implicar la presència de residus d’aquests tant en el medi ambient com en aliments d’origen animal, originant riscos de diferents tipus tant per als ecosistemes com per a la salut humana.. 1.1-. Presència en aliments d’origen animal i control en la cadena alimentària. Un cop el fàrmac és dins l’organisme de l’animal experimenta processos de distribució, metabolisme i excreció, que depenen en gran mesura de la naturalesa i les propietats del compost. Aquest fet comporta que, si no es respecten unes determinades pràctiques, l’aliment que prové de l’animal medicat i que arriba al consumidor pot contenir residus del fàrmac. Algunes de les causes més freqüents de la presència de fàrmacs d’ús veterinari en els aliments són:. ·. No respectar el temps d’espera legislat (o període de retirada) entre la darrera administració de fàrmac a l’animal i l’aprofitament de l’aliment provinent d’aquest. El temps d’espera depèn de la farmacocinètica del compost en l’animal i de l’aliment, i és d’obligat compliment per part del ramader.. ·. No identificar adequadament els animals tractats amb el fàrmac.. ·. Administració involuntària d’antimicrobians. La via més habitual és per contaminació creuada de pinsos medicats a pinsos no medicats. Aquest fenomen sol ocórrer en les fàbriques de pinsos (encara que també es pot donar en les granges) ja que les línies de producció per als dos tipus de pinsos són les mateixes.. ·. Ús fraudulent del fàrmac. Utilització de fàrmacs no autoritzats, sense prescripció veterinària, o a nivells més alts dels permesos.. La presència de residus d’antimicrobians en aliments d’origen animal pot tenir conseqüències directes en la salut humana, com ara reaccions al·lèrgiques o creació de resistències bacterianes. Així, es considera que la ingesta continuada de petites quantitats d’antimicrobians ha contribuït a la proliferació de soques bacterianes resistents a aquests fàrmacs. Aquest factor ha estat motiu de creixent preocupació durant els darrers anys, tal i com es comentarà a la secció 1.3. A part d’aquests efectes més immediats, els possibles efectes a llarg termini són encara desconeguts. 12.

(30) Introducció Després de les greus crisis alimentàries que van tenir lloc durant els anys 90, la UE va considerar que la seguretat alimentària havia de ser una de les seves principals prioritats. Així, l’any 2002 es va publicar el Llibre Blanc sobre seguretat alimentària [2] on es proposaven les directrius d’una nova política alimentària més proactiva i exigent. L’objectiu principal que es perseguia era la modernització de la legislació a través de l’establiment d’un conjunt de normatives, la creació d’entitats amb elevat coneixement científic en aquest entorn i els controls al llarg de tota la cadena alimentària (figura 1.1) fomentant la filosofia d’estendre la seguretat alimentària “des de la granja a la taula”.. Cria i alimentació del bestiar. Consum. Obtenció de l’aliment. Distribució. Emmagatzematge. Envasat. Processat. Figura 1.1. Processos que tenen lloc al llarg de la cadena alimentària de productes d’origen animal destinats al consum humà.. A partir d’aquí, es va publicar el Reglament 178/2002 [3], que estableix els principis generals comuns de la legislació i la seguretat alimentàries. Aquest reglament contempla la creació de l’Agència Europea de Seguretat Alimentària (EFSA, de European Food Safety Authority), entitat científica amb la missió d’informar i aconsellar sobre qualsevol aspecte relacionat amb la seguretat en matèria d’alimentació i pinsos. D’acord amb el Reglament 726/2004 [4], l’organisme regulador que s’encarrega de controlar la sortida al mercat dels medicaments veterinaris a la UE és l’Agència Europea del Medicament (EMA, de European Medicines Agency), que disposa d’un comitè especialitzat (CMPV, de Committee for Medicinal Products for Veterinary Use) que s’encarrega d’avaluar la qualitat, seguretat i eficàcia dels fàrmacs veterinaris. Amb aquest objectiu, per a cada fàrmac s’estableixen els següents paràmetres:. ·. Nivell amb efecte advers no observat (NOAEL, de no-observed adverse effect level).. ·. Nivell acceptable d’ingesta diària (TDI, de tolerable daily intake).. ·. Nivell màxim de residu (MRL, de maximum residue level).. ·. Temps d’espera. 13.

(31) Agents antimicrobians d’ús veterinari En la figura 1.2 es defineixen aquests paràmetres, i s’indiquen els procediments que es duen a terme per tal d’establir-los, descrits en el Reglament 470/2009 del Parlament Europeu [5].. PAS 1: DETERMINACIÓ DEL NOAEL El NOAEL és el nivell màxim de fàrmac que pot administrar-se sense que s’observin efectes adversos. S’estableix a partir d’estudis toxicològics del fàrmac i els seus metabòlits actius, i es du a terme amb animals de laboratori.. PAS 2: DETERMINACIÓ DEL ADI És la quantitat màxima de residu que pot ingerir una persona diàriament de manera segura durant tota la seva vida. S’estima dividint el NOAEL per un factor d’incertesa que engloba, entre d’altres, diferències entre espècies i entre individus.. PAS 3: DETERMINACIÓ DEL MRL És el nivell màxim permès legalment en un determinat aliment d’origen animal. S’estableix amb l’objectiu de no superar l’ADI, tenint en compte la quantitat diària mitjana que s’ingereix de l’aliment. És únic per a cada combinació matriu-aliment. PAS 4: DETERMINACIÓ DEL TEMPS D’ESPERA És el temps que cal esperar entre la darrera administració de fàrmac a l’animal i l’aprofitament de l’aliment, és a dir, el temps que triga l’aliment a presentar un nivell de fàrmac inferior a l’MRL. S’estableix mitjançant estudis farmacocinètics. Figura 1.2. Paràmetres que cal establir abans de comercialitzar un fàrmac veterinari (adaptat de [6]).. El llistat complet de fàrmacs d’ús veterinari i els seus MRLs es recull a l’Annex del reglament de la Comissió Europea Nº 37/2010 [7]. En aquest annex es mostren dues taules, una per a substàncies permeses (amb MRL establert o provisional) i una altra que fa referència a les substàncies prohibides, que són aquelles que es consideren perilloses per a la salut a qualsevol concentració.. 14.

(32) Introducció El Reglament 882/2004 [8] estableix les bases per a l’organització i implementació de controls analítics oficials que garanteixin la protecció del consumidor i el compliment de la legislació. Aquests controls, d’acord amb el principi “de la granja a la taula”, es duen a terme no només en els aliments que arriben al consumidor sinó també en els pinsos d’alimentació animal. En el marc d’aquest reglament, la EFSA va publicar a finals del 2012 l’informe tècnic sobre els resultats obtinguts durant el 2011 als països de la UE referent al control de residus de fàrmacs veterinaris i d’altres substàncies en productes alimentaris d’origen animal [9], amb un total de més de 700000 mostres analitzades. En la categoria d’agents antibacterians, es van trobar un 0.19 % de resultats amb nivells més alts del permès (és a dir, no conformes) en les gairebé 125000 mostres analitzades. En la taula 1.1 es mostra, segons l’aliment o l’espècie de la qual provenen, el nombre de mostres analitzades i el percentatge de resultats no conformes. Tal com s’observa, la mel és la matriu amb el percentatge més elevat de resultats no conformes (1 %), seguit dels teixits d’aviram (0.97 %), dels teixits provinents de bestiar oví (0.40 %), dels peixos de piscifactoria (0.35 %) i dels teixits de bestiar boví (0.30 %). Dins de la categoria “altres fàrmacs veterinaris”, els coccidiostàtics van ser la família de compostos amb un nombre més elevat de mostres no conformes (0.98 %) en les aproximadament 20000 mostres analitzades. En la taula 1.1 es mostren també el nombre de mostres analitzades de cada categoria i el percentatge de no conformes. Les mostres amb un percentatge més elevat de no conformes en coccidiostàtics són els ous (0,72 %). L’informe destaca que en els darrers anys s’ha produït un important descens en el percentatge de no conformes per a aquest grup d’antiparasitaris, especialment en el cas dels teixits d’aviram (2009: 2,05 %; 2010: 0,96 %; 2011: 0,22 %). L’informe atribueix aquest descens a l’entrada en vigor de la Directiva 2009/8/EC [10], que estableix MRLs en pinsos. La UE disposa també d’un sistema d’alerta ràpid per aliments i pinsos (RASFF, de Rapid Alert System for Food and Feed), creat en el marc del Reglament 178/2002 [3], que té per objectiu notificar als Estats Membres les alertes alimentàries. Es considera que hi ha una situació d’alerta quan es detecta que hi ha al mercat un aliment, pinso, o material relacionat que presenta un risc seriós i requereix d’una acció ràpida per part d’altres països a part del que dóna l’alerta.. 15.

(33) Agents antimicrobians d’ús veterinari Taula 1.1. Resum dels resultats de l’informe tècnic de la EFSA [9] pel que fa a antibacterians i coccidiostàtics (any 2011).. Antibacterians. Boví Porcí Oví Aviram Piscifactoria Llet Ous Mel. Coccidiostàtics. nombre de mostres analitzades. % mostres no conformes. nombre de mostres analitzades. % mostres no conformes. 24562 46507 9303 17987 1737 15471 4304 2128. 0,30 0,15 0,40 0,97 0,35 0,09 0,12 1,00. 1863 6423 846 7186 45 375 3480 10. 0 0,06 0,12 0,22 0 0 0,72 0. Taula 1.2. Alertes generades per la presència d’antimicrobians en aliments i la família d’aliments on s’ha donat cada alerta, segons l’informe del RASFF del 2010 [11].. Ivermectina Nitrofurà Oxitetraciclina Cloramfenicol Sulfamides Verd de malaquita Lincomicina Enrofloxacina Neomicina Estreptomicina Trimetoprim Quinolones Eritromicina Metronidazole. Nombre d'alertes. Prod. càrnics. Crustacis i prod. rel.. Mel. 19 13 6 5 4 4 3 2 2 2 2 1 1 1. 19 1 2 1 1. 12 1 2. 1. Peix i prod. de la pesca. Ous i prod. rel.. Altres. 2 2. 3 1. 3 3 1. 1 2. 2 2 1 1 1. En l’apartat d’alertes relacionades amb fàrmacs veterinaris, gairebé el 90 % impliquen agents antimicrobians. En la taula 1.2 es mostra un resum del nombre d’alertes reportades al RASFF durant l’any 2010 [11] per a aquest grup de compostos. El nombre més elevat d’alertes (19) correspon a la presència de l’antiparasitari avermectina en vedella procedent de Brasil. En els informes posteriors referents a 16.

(34) Introducció l’activitat del 2011 i 2012 no es reporta cap alerta per presència de fàrmacs veterinaris en aliments.. 1.2-. Presència en el medi ambient. Una altra de les problemàtiques relacionades amb els fàrmacs d’ús veterinari és la seva introducció en el medi ambient a través dels fems generats a les granges i emprats com a adobs agrícoles. Aquests poden arribar a contenir quantitats rellevants de fàrmac, o d’algun metabòlit actiu, ja que l’absorció per part del tracte animal sovint és baixa [12]. A través dels fems, els fàrmacs poden arribar als sòls i un cop allà poden quedar-hi retinguts per fenòmens de sorció, lixiviar-se cap a les aigües subterrànies, transportar-se pel medi aquàtic (arribant fins i tot a les aigües de consum) o biodegradar-se. El destí dels fàrmacs en el medi, el qual determina el risc ambiental, és un tema complex en el que s’hi veuen implicats processos molt diversos i que depèn. bàsicament. de. les. propietats. físico-químiques. del. fàrmac,. de. les. característiques del sòl i de les condicions ambientals i climatològiques. Una altra via d’entrada dels fàrmacs al medi ambient, en aquest cas de manera directa al medi aquàtic, és a través del seu subministrament als peixos en les piscifactories. Tot i que les concentracions de fàrmacs que se solen trobar al medi són molt baixes, la seva presència continuada pot ocasionar canvis en els ecosistemes i efectes no desitjats en animals i humans, així com proliferació de microorganismes resistents. En els darrers anys s’han realitzat molts estudis relacionats amb la presència i comportament de fàrmacs veterinaris en el medi terrestre i aquàtic, i s’han publicat nombroses revisions [12-16] en aquest sentit. En alguns d’ells es recopilen dades que indiquen la presència de diferents antibacterians en sòls agrícoles, en concentracions de 8-67 g kg-1 per a macròlids, 1 - 11 g kg-1 per a sulfamides, 6 - 52 g kg-1 per a fluoroquinolones o 39 - 900 g kg-1 per a tetraciclines [12, 13]. Pel que fa a la presència en el medi aquàtic, la gran majoria de residus de fàrmacs que es detecten provenen del seu ús en medicina, a causa de la poca eficàcia de les estacions depuradores d’aigües residuals (EDAR) per eliminar aquest tipus de residus. En l’article de revisió de Fatta-Kassinos [16] es recullen un gran nombre d’estudis sobre la presència de fàrmacs en aigües superficials, subterrànies, residuals i efluents, on s’ha detectat presència d’un extens nombre de compostos en concentracions de l’ordre dels ng L-1. En el terreny legislatiu, la directiva de la UE 92/18/EEC [17] estableix que, abans de comercialitzar un medicament veterinari, cal avaluar els riscos potencials vers el medi 17.

(35) Agents antimicrobians d’ús veterinari ambient que pot causar. A més, l’any 2000 el VICH (de Veterinary International Cooperation. on. Harmonisation),. organisme. treballa. en. l’elaboració. de. guies. harmonitzades entre Estats Units, la Unió Europea i Japó, va elaborar una guia per a l’avaluació de l’impacte ambiental dels fàrmacs veterinaris [18]. Tot i així, per ara els fàrmacs únicament estan considerats com a contaminants emergents, ja que encara no hi ha prou coneixement sobre la seva presència ni sobre el seu impacte en el medi.. 1.3-. Resistència bacteriana. La resistència bacteriana prové de la simple selecció natural de bacteris amb mutacions que els permeten resistir a l’acció dels antibacterians. Aquest és un problema de salut pública de primer ordre, ja que les infeccions produïdes per bacteris tenen un elevat impacte en la salut humana arreu del món. Els mecanismes moleculars de generació de resistències en els bacteris són variats [19, 20].. ·. Inactivació enzimàtica: Aquest tipus de resistència afecta sobretot a -lactàmics, i està causada per l’aparició de -lactamases, enzims que trenquen l’enllaç amino de l’anell -lactàmic per produir metabòlits inactius.. ·. Modificació de la permeabilitat de la membrana cel·lular: En aquest cas apareixen mutacions estructurals en les proteïnes de membrana que fan que aquesta esdevingui impermeable al pas de l’antibacterià. Aquest mecanisme afecta a bacteris gram negatius enfront de cefalosporines i quinolones, entre d’altres.. ·. Disminució de la concentració intracel·lular de l’antibacterià: Determinades mutacions codifiquen l’estructura de proteïnes de membrana cel·lular interna amb activitat de bombes de flux invers, que són capaces d’expulsar l’antibacterià de la cèl·lula. Aquest mecanisme determina la resistència d’alguns bacteris gram positius a les tetraciclines.. ·. Modificació estructural de proteïnes “diana” ribosomals del bacteri: Alguns antibacterians s’uneixen a proteïnes diana, que són les encarregades de sintetitzar les proteïnes que el bacteri necessita per viure, i les inhibeixen. Si l’estructura de la proteïna diana muta de tal manera que l’antibacterià ja no s’hi. 18.

(36) Introducció pot unir, es crea la resistència. Entre d’altres, aquest mecanisme afecta a aminoglicòsids i macròlids.. La velocitat d’aparició de soques patògenes resistents es pot relacionar amb l’ús que es fa dels antibacterians. Per algun d’ells fins i tot han aparegut resistències generalitzades al cap de pocs anys que aquest hagués sortit al mercat. En la figura 1.3 es mostra, per a una selecció d’antibacterians, el temps transcorregut des de la seva introducció al mercat farmacèutic fins l’aparició del primer cas de resistència bacteriana. Tal com es pot veure, el temps mitjà d’aparició de resistències és de 8 anys [21].. Lipopèptids Oxazolidinones. Quinolones Glicopèptids Macròlids Aminoglicòsids Tetraciclines Amf enicols - lactames. Daptomicina Linezolid Norfloxacina Àcid Nalidíxic Vancomicina Eritromicina Kanamicina Estreptomicina Tetraciclina Cloramfenicol Amoxicil·lina Ampicil·lina Penicil·lina G 0. 5. 10 15 Temps (anys). 20. 25. 30. 35. Figura 1.3. Temps transcorregut des de la sortida al mercat fins l’aparició del primer cas de resistència bacteriana per a una selecció d’antibacterians [21].. Per tal de poder reduir el creixent impacte de la resistència bacteriana, durant els darrers anys s’ha iniciat una campanya de conscienciació de l’ús dels antibiòtics, tant a la població en general com als professionals de la salut, per a tractar de frenar-ne l’ús abusiu i inadequat. D’altra banda, també cal exercir un control de la ingesta d’antibiòtics a través d’aliments provinents d’animals medicats, i en aquest sentit la UE s’ha dotat d’una àmplia legislació que s’ha descrit en el capítol 1.1. Tot i aquest esforços per a combatre la resistència bacteriana, és clarament necessària la sortida al mercat de nous antibacterians de manera periòdica. La investigació de noves generacions d’antibacterians d’una mateixa família és una pràctica útil que n’allarga la durada, però a la llarga és insuficient, ja que el mecanisme. 19.

(37) Agents antimicrobians d’ús veterinari clàssic de llibreries de compostos de síntesi sembla que cada cop és menys fructífer en contrast amb l’esforç que s’hi dedica [22, 23]. Així doncs, el ritme de la medicina moderna fa que sigui necessària l’entrada a intervals regulars de noves famílies (és a dir, noves estructures químiques) d’antibacterians. L’estratègia més segura, tot i que més cara i que consumeix més recursos, passa pel descobriment de noves espècies de bacteris en la natura dels quals sigui possible aïllar noves substàncies antibiòtiques [24, 25]. En aquest sentit, la tendència actual va encaminada cap a la investigació de microorganismes dels fons marins, que semblen una font propícia de noves estructures amb activitat antibacteriana [26, 27]. Actualment, però, la investigació cap a nous antibacterians es troba en un punt difícil a causa del creixent esforç i inversió que requereix, lligat també a una combinació de factors com ara la disminució de pressupostos en I+D i la pèrdua d’interès de les empreses farmacèutiques en la investigació d’aquest tipus de compostos en favor dels medicaments que tracten malalties cròniques. A la figura 1.4 es mostra la clara tendència a la baixa pel que fa a l’aprovació de nous antibacterians, concretament en els aprovats per FDA (de Food and Drug Administration) dels Estats Units [28].. 16 14 12 10 8 6 4 2 0 1983 - 1987 1988 - 1992 1993 - 1997 1998 - 2002 2003 - 2007 Figura 1.4. Nombre de nous principis actius amb activitat antibacteriana aprovats per la FDA en diferents períodes de temps [28].. 20.

(38) Introducció 2- COCCIDIOSTÀTICS I ANTIBACTERIANS. A continuació ens centrarem en els antimicrobians que han estat objecte d’estudi de la present Tesi Doctoral. Aquests pertanyen a 5 famílies d’antibacterians i a un grup d’antiparasitaris, els coccidiostàtics, tots ells d’ús habitual al llarg dels darrers anys en pràctiques veterinàries. Els antibacterians s’utilitzen àmpliament en medicina veterinària arreu del món. A Espanya, l’Agencia Española de Medicamentos y Productos Veterinarios (AEMPV) situa en 1102 tones les vendes totals d’antimicrobians (com a principi actiu) durant l’any 2009 [29] per 1064 tones venudes a França, 514 als Països Baixos o 403 al Regne Unit [30]. En la figura 2.1 es mostren, per a 7 països de la UE, els percentatges de vendes de diferents famílies sobre el total d’agents antimicrobians venuts a cada país [29, 30]. Als països nòrdics, on el consum en general és força més baix, s’observa un clar predomini dels beta-lactàmics (bàsicament penicil·lines), seguits per les sulfamides, mentre que a la resta de països representats la família que predomina són les tetraciclines, seguides també per les sulfamides.. 60 tetraciclines 50 penicil·lines. % vendes. 40. sulfamides 30 macròlids. 20. aminoglicòsids. 10. quinolones. 0 Espanya. França Regne Unit. Països Baixos. Suècia. Noruega Finlàndia. Figura 2.1. Vendes d’antimicrobians en 7 països europeus l’any 2009 [29, 30].. Els coccidiostàtics són antiparasitaris molt usats en veterinària. Per a aquests compostos és difícil trobar dades de consum; a tall d’exemple citarem que les vendes al Regne Unit durant l’any 2009 es van situar en 234 tones, mentre que per a la resta d’antiparasitaris actius contra els protozous el consum va ser només de 3 tones [31].. 21.

(39) Coccidiostàtics i antibacterians 2.1-. Coccidiostàtics: ús i propietats. Els coccidiostàtics són agents antimicrobians que s’empren per a la prevenció i tractament de la coccidiosi, una malaltia contagiosa causada per un paràsit unicel·lular del gènere Eimeria que afecta bàsicament el tracte intestinal dels animals. Les espècies animals amb més tendència a contraure aquesta malaltia són els conills i les aus, particularment si es troben en condicions de cria intensiva ja que la propagació és molt favorable en condicions d’estrès i en ambients càlids i humits. Els efectes de la infecció poden ser molt variats; lleus, com diarrea, pèrdua de pes o reducció de la producció d’ous, però en els casos més extrems pot arribar a causar hemorràgies i fins i tot la mort de l’animal [32]. En aquest marc, l’ús de coccidiostàtics es considera imprescindible amb finalitats preventives, i per això s’utilitzen com a additius de pinsos de manera habitual arreu del món. De fet, l’any 2006 la UE va prohibir, mitjançant el Reglament 1831/2003 [1], l’ús d’antimicrobians com a additius de pinsos excepte en el cas dels coccidiostàtics i dels histomonostats. Per a aquests grups, però, es va establir una moratòria del seu ús fins el 31 de desembre de 2012, amb la finalitat d’acabar també prohibint-los. En l’informe emès per la Comissió Europea el 2008 sobre l’ús d’aquests dos grups de substàncies com a additius [33], però, es considera que actualment l’ús dels coccidiostàtics com a additius és essencial en la cria de l’aviram i es desaconsella la seva retirada, tot i que amb el compromís de seguir treballant per trobar substàncies i tècniques alternatives per a la prevenció de la coccidiosi. Així, segons el registre d’additius de pinsos de la Unió Europea, actualment hi ha 11 fàrmacs amb activitat coccidiostàtica que estan permesos com a additius en pinsos [34]. Cada coccidiostàtic està permès només per a ús en pinsos destinats a determinades espècies animals i/o en determinats períodes de la vida de l’animal; la presència no autoritzada d’un determinat coccidiostàtic en un pinso, però, és possible a causa del fenomen inevitable de contaminació creuada. Així doncs, la UE va considerar necessari l’establiment de MRLs com a conseqüència d’aquest fenomen, tant en els pinsos [35] com en els aliments d’origen animal [36]. Tot i tenir una mateixa funció farmacològica, els coccidiostàtics comprenen un conjunt de fàrmacs amb estructures químiques i propietats molt diferents entre sí. Es divideixen en dos grans grups: els ionòfors, produïts de manera natural per processos de fermentació bacteriana, i els no-ionòfors, que són d’origen sintètic.. 22.

(40) Introducció 2.1.1- Ionòfors. Es tracta del grup de substàncies més utilitzat per la seva eficàcia i per ser altament refractaris al desenvolupament de resistències. Són molècules força complexes de massa molecular relativament elevada (650 - 900 Da) que consten de diversos anells de tetrahidrofurà i tetrahidropirà units entre ells. També tenen en comú la presència d’un grup carboxil lliure i de diversos grups funcionals amb àtoms d’oxigen que els confereixen propietats complexants de cations mono- i divalents (figura 2.2). Així, en presència de Na+, K+ Ca2+ o Mg2+, aquests grups es disposen al voltant del ió formant una estructura tancada amb una superfície externa hidròfoba que pot penetrar les membranes del paràsit i introduir-hi els ions. Això fa que es trenqui l’equilibri osmòtic de la cèl·lula, que, en no disposar de mecanismes osmoreguladors, es destrueix [32, 37]. A causa d’aquesta conformació amb els grups polars orientats cap a dins de l’estructura, són molècules molt poc solubles en aigua i tenen valors estimats de log Kow alts (entre 3-7) [38]. Són inestables en medis àcids.. SALINOMICINA (SAL) MADURAMICINA )MAD). LASALOCID (LAS) SEMDURAMICIN (SEM). NARANSINA (NAR). MONENSINA (MON). Fig 2.2. Estructura dels coccidiostàtics iònofors utilitzats en veterinària.. 23.

(41) Coccidiostàtics i antibacterians 2.1.2- No-ionòfors. Aquest grup engloba un nombre elevat de compostos sintètics, amb estructures químiques molt variades. Entre aquests hi trobem derivats de les triazines (diclazuril), de les quinazolines (halofuginona), de la guanidina (robenidina), de les quinolones (decoquinat), i de les carbanilides (nicarbazina). Aquest darrer és de fet una mescla equimolar de 4-4’-dinitrocarbanilida (DNC) i 2-hidroxi-4,6-dimetilpirimidina (HDP). Atès que la HDP es metabolitza i excreta molt més de pressa que la DNC, aquesta darrera és la que s’analitza en el control de residus en aliments. Aquests compostos, juntament amb els ionòfors, estan autoritzats com a additius en pinsos [1]. Altres substàncies d’interès dins del grup dels coccidiostàtics no-ionòfors són el clopidol, pertanyent al grup dels pirinidols, l’etopabat, derivat de l’àcid benzoic, i el ronidazole, pertanyent a la família dels nitroimidazoles, l’ús de les quals està prohibit a la UE des que es va demostrar el seu efecte potencialment cancerigen [39]. En la taula 2.1 es mostren les principals propietats físico-químiques estimades dels coccidiostàtics no-ionòfors esmentats [38]. En tractar-se d’estructures molt variades, l’interval de propietats és molt ampli; la molècula clarament més polar i soluble en aigua és el ronidazole; l’etopabat i el clopidol són casos intermedis quant a aquests paràmetres, mentre que la resta de compostos es poden considerar poc polars i molt poc solubles en aigua. Pel que fa als valors de pKa estimats que es presenten a la taula, la majoria corresponen a la desprotonació de grups amida o amino protonats.. Taula 2.1. Propietats químiques estimades de coccidiostàtics no-ionòfors. Font: SciFinder [38].. pKa1. pKa2. Log Kow. Solubilitat en aigua (g L-1). Clopidol (CLOP). 2,52. 5,50. 2,04. 1,7. Diclazuril (DICLA). 5,89. -. 3,48. 8,2 * 10-4. Etopabat (ETH). -. -. 1,53. 1,4. Robenidina (ROB). 5,75. -. 4,3. 3,7 * 10-3. Halofuginona (HAL). 8,7. -. 3,41. 3,7 * 10-2. Nicarbazina (NIC)*. 12,4. -. 3,74. 1,3 * 10-3. Decoquinat (DEC). 2,60. 9,81. 7,19. 1 * 10-4. Ronidazole (RON). 1,32. 12,99. -0,11. 11. *Propietats referides a la unitat DNC.. 24.

(42) Introducció Les estructures químiques dels coccidiostàtics no-ionòfors esmentats es mostren en la figura 2.3. CN. OH Cl. Cl. O. Cl. O. Cl. Cl. N. NH. N H. N N. CLOPIDOL (CLOP). O. DICLAZURIL (DICLA). O. O. O. ETHOPABATE (ETH). O O. N. N O. O H2N. N. RONIDAZOLE (RON). ROBENIDINA (ROB). 4,4’-dinitrocarbanilida. 2-hidroxi-4,6-dimetilpiridina. HALOFUGINONA (HAL). NICARBAZINA (NIC). DECOQUINAT (DEC). Fig 2.3. Estructura dels coccidiostàtics no-iònofors més rellevants.. 2.2-. Antibacterians: ús i propietats. Els antibacterians poden ser d’origen natural (produïts per bactèries o fongs) o bé obtinguts estrictament per síntesi química. En molts casos, a partir dels antibacterians naturals també se n’ha produït de semisintètics, introduint-hi modificacions en l’estructura química per tal d’ampliar l’espectre d’acció, reduir efectes secundaris o millorar característiques farmacocinètiques i farmacodinàmiques. El començament de l’època daurada dels antibacterians el va marcar el descobriment de la penicil·lina per Alexander Fleming l’any 1928. Des de llavors i fins als anys 70 la recerca i el descobriment de nous agents antibacterians, tant d’origen natural com sintètic, va anar en constant augment [20]. Els mecanismes d’acció pels quals es regeixen són molts variats: alteració de la permeabilitat de la membrana cel·lular, bloqueig de la síntesi d’àcids nucleics, impediment de la síntesi de la paret bacteriana, de la síntesi proteica, etc. En funció del nombre d’espècies bacterianes enfront de les que són actius, es poden classificar 25.

(43) Coccidiostàtics i antibacterians com a antibacterians d’ampli espectre o d’espectre reduït, però la manera més comuna de classificar-los és per la seva estructura química. Les famílies més importants que es coneixen són: ·lactames · Tetraciclines · Sulfamides · Macròlids · Quinolones · Aminoglicòsids · Lincosamides · Nitrofurans · Nitroimidazols · Quinoxalines · Amfenicols · Lipo- i glicopèptids. A continuació es farà una breu descripció de l’acció i algunes propietats de les famílies estudiades en la present Tesi Doctoral.. 2.2.1- Penicil·lines Les penicil·lines (PCs) formen part del grup d’antibacterians -lactàmics, juntament amb les cefalosporines. La primera penicil·lina (Penicil·lina G o benzilpenicil·lina) es va aïllar per primer cop l’any 1929 del fong Penicillium notatum. Posteriorment es van aïllar altres penicil·lines d’origen natural i se’n van obtenir d’altres de semisintètiques. En l’actualitat existeixen una gran varietat de penicil·lines amb diversitat d’espectres d’activitat. Són compostos amb masses moleculars entre 300-500 Da, amb una estructura bàsica que consta de dos anells condensats: un heterocicle tiazolidínic i un anell betalactàmic unit a una cadena lateral (figura 2.4). L’anell betalactàmic competeix amb el substrat natural dels enzims responsables de la síntesi del peptidoglicà, que conforma la paret cel·lular bacteriana. Aquest anell és també responsable de l’estabilitat relativament baixa d’aquests compostos, que són termolàbils i inestables en medis àcids [40]. La majoria de penicil·lines són compostos àcids ja que contenen un grup carboxil, amb valors de pKa que oscil·len entre 2.4-2.7. L’ampicil·lina i l’amoxicil·lina tenen també 26.

(44) Introducció propietats bàsiques a causa de la presència d’un grup amino (pKa entre 7.2-7.4) [41]. La seva solubilitat en aigua és baixa (0.2-1.3 g L-1 segons valors estimats). Els valors de Log Kow oscil·len entre 1.5-3 i indiquen que són molècules moderadament apolars [38]. L’estructura de les penicil·lines més utilitzades en veterinària es mostra en la figura 2.4.. AMOXICIL·LINA (AMO). AMPICIL·LINA (AMO). PENICIL·LINA V (PEN V). OXACIL·LINA (OXA). CLOXACIL·LINA (CLO). DICLOXACIL·LINA (DIC). PENICIL·LINA G (PEN G). Fig 2.4. Estructura de les penicil·lines més utilitzades en veterinària.. 2.2.2- Tetraciclines. Les tetraciclines (TCs) provenen del bacteri Streptomyces ssp., i presenten activitat antibacteriana d’ampli espectre. Actuen inhibint la biosíntesi de proteïnes a través de la seva unió a la unitat 30s ribosomal. Estructuralment tenen en comú la presència d’un esquelet tetracíclic, de tipus naftacè-carboxamida (figura 2.5), i les seves masses moleculars estan entre els 400-500 Da. Presenten diversos centres estereogènics, l’estereoquímica dels quals resulta fonamental per a la seva activitat biològica. La primera molècula d’aquesta família que es va descobrir va ser la clortetraciclina (CTC), l’any 1944. Posteriorment es va aïllar l’oxitetraciclina (OTC). La tetraciclina (TC) i la doxiciclina es van obtenir de manera semisintètica a partir de CTC i OTC, respectivament.. 27.

(45) Coccidiostàtics i antibacterians Les tetraciclines presenten diferents equilibris àcid-base, amb tres valors de pKa al voltant de 3.3, 7.5 i 9.4 [41]. En la figura 2.5 es mostren els grups funcionals responsables d’aquestes propietats.. pKa3. pKa1 pKa2. Figura 2.5. Estructura bàsica de les tetraciclines amb els grups implicats en les propietats àcidbase.. La seva solubilitat en aigua és baixa (< 0.2 g L-1 segons propietats estimades). Els valors de Log Kow es troben al voltant d’1 i indiquen que són molècules relativament polars [38]. Tenen tendència a actuar com a agents complexants, formant quelats relativament forts amb cations di- i trivalents. Les estructures de les quatre TCs utilitzades en veterinària i estudiades en la present Tesi es mostren en la figura 2.6.. OXITETRACICLINA (OTC). CLORTETRACICLINA (CTC). TETRACICLINA (TC). DOXICICLINA (DC). Fig 2.6. Estructura de les tetraciclines utilitzades en veterinària.. 28.

(46) Introducció 2.2.3- Macròlids. Els macròlids (MCs) són antibacterians que actuen inhibint la síntesi proteica en unirse a la subunitat 50S del ribosoma bacterià. El primer compost fou descobert el 1952 en una soca de Streptomyces eruthraeus, i va ser anomenat eritromicina. La resta de compostos que formen part d’aquesta família d’antibacterians són també d’origen natural o bé semisintètics obtinguts a partir dels naturals [20]. Presenten una estructura comuna d’anell lactònic macrocíclic de 14-16 baules unit a un o varis sucres mitjançant enllaços glicosídics, amb masses moleculars entre 650 i 1000 Da aproximadament. Són bases febles, amb valors de pKa que oscil·len entre 7.5-9, molt solubles en els solvents polars orgànics més comuns (metanol, acetonitril, acetat d’etil, cloroform) [41], i amb una solubilitat estimada en aigua molt variable: des dels 2.5 g L-1 de la josamicina (JOS) fins als 87 g L-1 de la tilosina (TYL). El log Kow va des del 0.6 per a la TYL fins al 4.73 per a la JOS [38]. L’estructura dels MCs més utilitzats en veterinària es mostra en la figura 2.7.. 2.2.4- Sulfamides. Les sulfamides (SFs) són antibacterians sintètics, obtinguts per primera vegada durant la dècada de 1930 a partir de derivats de la indústria dels colorants. Es tracta d’una família molt àmplia, d’extensa aplicació en veterinària, i també una de les que ha provocat més casos de resistència bacteriana. Estructuralment són amides d’àcids sulfònics, amb pesos moleculars entre 250-350 Da. El seu efecte és bacteriostàtic, i el seu mecanisme d’acció es basa en la seva analogia estructural amb l’àcid paraaminobenzoic, precursor de l’àcid fòlic, necessari per a la producció de nucleòtids i per al creixement del bacteri. Així, les sulfamides bloquegen un dels enzims implicats en la síntesi d’aquest àcid. Sovint les SFs s’administren juntament amb un altre principi actiu, el trimetoprim (TRI), la qual cosa proporciona una acció sinèrgica, ja que el TRI actua bloquejant un altre dels enzims implicats en la ruta de síntesi de l’àcid fòlic [20]. La majoria de SFs són força solubles en solvents moderadament polars com l’acetonitril, l’etanol o el cloroform, i són poc solubles en solvents orgànics no polars. La solubilitat en aigua és baixa (0.3-2 g L-1, paràmetres estimats). Presenten dos equilibris àcid-base, el primer d’ells associat a l’amina primària (pKa entre 1 i 2.5) i el segon associat a la desprotonació del grup amido (pKa entre 5.5 i 7.5). Són substàncies poc lipòfiles amb valors de Log Kow estimats entre 0 i 1 [38]. L’estructura 29.

(47) Coccidiostàtics i antibacterians d’algunes de les SFs d’ús veterinari més freqüents i del TMP es mostren en la figura 2.8.. TILOSINA (TYL) ERITROMICINA (ERI). TILMICOSINA (TIL). OLEANDOMICINA (OLE). JOSAMICINA (JOS). ESPIRAMICINA (SPI). KITASAMICINA (KIT). Fig 2.7. Estructura dels macròlids utilitzats més freqüentment en veterinària.. 30.

(48) Introducció. SULFADIMETOXINA (SDMx). SULFAMETAZINA (SMZ). SULFAQUINOXALINA (SQ). SULFATIAZOLE (STZ). SULFADIAZINA (SDZ). SULFAMETIZOLE (SMTZ). SULFAMETOXIPIRIDAZINA (SMPZ). SULFAPIRIDINA (SPD). SULFADOXINE (SDX). SULFACLOROPIRIDAZINA (SCP). SULFAMETOXAZOLE (SMX). SULFAMERAZINA (SMR). SULFISOXAZOLE (SFX). SULFAMONOMETOXINA (SMM). TRIMETOPRIM (TRI). Fig 2.8. Estructura d’algunes de les sulfamides utilitzades en veterinària.. 2.2.5- Quinolones. La família de les quinolones (Qs) comprèn també un nombre elevat de compostos, tots ells d’origen sintètic. S’hi troben des de compostos amb espectre d’aplicació limitat fins a d’altres de molt ampli espectre. Són compostos aromàtics heterocíclics derivats de la 4-oxo-1,4-dihidroquinoleïna amb un grup carboxílic en la posició 3, un grup cetona en la posició 4 i un àtom de nitrogen en la posició 1 (figura 2.9). Unit a aquest àtom de nitrogen s’hi troba un substituent (R1), que sol ser una cadena alquílica, lineal o cíclica, o un grup aromàtic. Aquest substituent és necessari per a l’activitat biològica de la molècula. El seu interval de masses moleculars va entre 230 i 450 Da.. 31.

(49) Coccidiostàtics i antibacterians. Fig 2.9. Estructura bàsica de les quinolones.. Són compostos d’acció bactericida, i el seu mecanisme d’acció principal radica en la inhibició de la transcripció del DNA bacterià, interferint en l’enzim DNA-girasa, que intervé en els mecanismes de desplegament de la doble hèlix del DNA [20]. La primera quinolona que es va sintetitzar fou l’àdic nalídixic l’any 1962. Altres Qs de primera generació destacables són l’àcid oxolínic (OXO) i la flumequina (FLU). Aquestes presenten un grup carboxílic amb un valor de pKa al voltant de 6. Posteriorment se’n van desenvolupar diverses generacions. La millora introduïda més destacable va ser a partir de l’any 1978, quan es van començar a sintetitzar Qs amb un àtom de fluor unit a la posició 6 de l’anell base, conegudes com fluoroquinolones (FQs). L’addició d’aquest grup funcional va permetre millorar la farmacocinètica i ampliar el seu espectre d’aplicació. Les FQs més usades en l’actualitat, a més, presenten un heterocicle nitrogenat, generalment derivat de la piperazina, en la posició 7. Aquestes presenten característiques amfòteres a causa de la presència del grup carboxil de l’estructura principal (pKa entre 5 i 6) i l’amina de l’anell piperazinil (pKa entre 8 i 9). Així doncs la forma zwitteriònica predomina a valors de pH entre 6 i 8 [41]. La solubilitat estimada en aigua és relativament baixa (0.05-3 g L-1), però són fàcilment solubles en medis àcids i bàsics. Els valors de Log Kow estimats indiquen que són substàncies no gaire lipòfiles (0.6-2) amb alguna excepció, com la marbofloxacina (MAR), que posseeix un log Kow de -0.61 [38]. Són força solubles en dissolvents de polaritat mitjana - alta com el metanol o l’acetona. Tenen tendència a formar quelats amb ions di- i trivalents a través del grup carboxil i l’oxigen del grup cetona contigu [40]. L’estructura de les Qs estudiades en aquesta Tesi es mostra en la figura 2.10. Cal destacar que, tot i que la CIP és un antibacterià d’us humà, és alhora un metabòlit de la ENR, i per tant també cal analitzar-lo en els mètodes de control d’antimicrobians en aliments.. 32.

(50) Introducció. CIPROFLOXACINA (CIP). MARBOFLOXACINA (MAR). DANOFLOXACINA (DAN). ENROFLOXACINA (ENR). NORFLOXACINA (NOR) SARAFLOXACINA (SAR). FLUMEQUINA (FLU). ÀCID OXOLÍNIC (OXO). DIFLOXACINA (DIF). Fig 2.10. Estructura de les quinolones estudiades en la present Tesi.. 33.

Figure

Figura 1.1. Processos que tenen lloc al llarg de la cadena alimentària de productes d’origen animal destinats al consum humà

Figura 1.1.

Processos que tenen lloc al llarg de la cadena alimentària de productes d’origen animal destinats al consum humà p.30
Figura 1.3. Temps transcorregut des de la sortida al mercat fins l’aparició del primer cas de resistència bacteriana per a una selecció d’antibacterians [21]

Figura 1.3.

Temps transcorregut des de la sortida al mercat fins l’aparició del primer cas de resistència bacteriana per a una selecció d’antibacterians [21] p.36
Figura 1.4. Nombre de nous principis actius amb activitat antibacteriana aprovats per la FDA en diferents períodes de temps [28]

Figura 1.4.

Nombre de nous principis actius amb activitat antibacteriana aprovats per la FDA en diferents períodes de temps [28] p.37
Figura 2.1. Vendes d’antimicrobians en 7 països europeus l’any 2009 [29, 30].

Figura 2.1.

Vendes d’antimicrobians en 7 països europeus l’any 2009 [29, 30]. p.38
Fig 2.2. Estructura dels coccidiostàtics iònofors utilitzats en veterinària.

Fig 2.2.

Estructura dels coccidiostàtics iònofors utilitzats en veterinària. p.40
figura 2.3.

figura 2.3.

p.42
Fig 2.4. Estructura de les penicil·lines més utilitzades en veterinària.

Fig 2.4.

Estructura de les penicil·lines més utilitzades en veterinària. p.44
Figura 2.5. Estructura bàsica de les tetraciclines amb els grups implicats en les propietats àcid-base

Figura 2.5.

Estructura bàsica de les tetraciclines amb els grups implicats en les propietats àcid-base p.45
Fig 2.6. Estructura de les tetraciclines utilitzades en veterinària.

Fig 2.6.

Estructura de les tetraciclines utilitzades en veterinària. p.45
Fig 2.7. Estructura dels macròlids utilitzats més freqüentment en veterinària.

Fig 2.7.

Estructura dels macròlids utilitzats més freqüentment en veterinària. p.47
Fig 2.8. Estructura d’algunes de les sulfamides utilitzades en veterinària.

Fig 2.8.

Estructura d’algunes de les sulfamides utilitzades en veterinària. p.48
Fig 2.9. Estructura bàsica de les quinolones.

Fig 2.9.

Estructura bàsica de les quinolones. p.49
Fig 2.10. Estructura de les quinolones estudiades en la present Tesi.

Fig 2.10.

Estructura de les quinolones estudiades en la present Tesi. p.50
Fig 3.2. Esquema de partícules poroses d’un material polimèric de GPC, en que s’observa el procés d’exclusió per grandària

Fig 3.2.

Esquema de partícules poroses d’un material polimèric de GPC, en que s’observa el procés d’exclusió per grandària p.57
Fig 3.1. Esquema d’una partícula d’un MIP i les cavitats de reconeixement específic per a l’anàlit que presenta en la seva superfície

Fig 3.1.

Esquema d’una partícula d’un MIP i les cavitats de reconeixement específic per a l’anàlit que presenta en la seva superfície p.57
Fig. 3.3. Representació d’una partícula de sílice porosa d’un material RAM ADS. Figura extreta de [84]
Fig. 3.3. Representació d’una partícula de sílice porosa d’un material RAM ADS. Figura extreta de [84] p.59
Fig 3.5. Seqüència de les etapes en un procés de tractament de mostra QuEChERs.

Fig 3.5.

Seqüència de les etapes en un procés de tractament de mostra QuEChERs. p.60
Fig 5.1. Sistema RAM-LC. A l’esquerra les dues columnes estan desconnectades, mentre que a la dreta es mostra la vàlvula de 6 ports (V2) en la posició que connecta les columnes en línia

Fig 5.1.

Sistema RAM-LC. A l’esquerra les dues columnes estan desconnectades, mentre que a la dreta es mostra la vàlvula de 6 ports (V2) en la posició que connecta les columnes en línia p.117
Fig. 5.2. Ruptura de la OTC i la TC en el RAM C4 utilitzant com a fase mòbil H2O:ACN (95:5).
Fig. 5.2. Ruptura de la OTC i la TC en el RAM C4 utilitzant com a fase mòbil H2O:ACN (95:5). p.118
Fig. 5.3 . Cromatogrames obtinguts a partir d’una solució patró de TCs en el sistema LC i en el sistema RAM-LC
Fig. 5.3 . Cromatogrames obtinguts a partir d’una solució patró de TCs en el sistema LC i en el sistema RAM-LC p.119
Fig 5.4. Recuperacions d’extracció emprant acetonitril i acetat d’etil.

Fig 5.4.

Recuperacions d’extracció emprant acetonitril i acetat d’etil. p.122
Figura 5.5. Recuperacions globals i desviacions estàndard associades, obtingudes amb el mètode GPC-LC-MS/MS

Figura 5.5.

Recuperacions globals i desviacions estàndard associades, obtingudes amb el mètode GPC-LC-MS/MS p.123
Figura 5.7 Comparació de les recuperacions obtingudes en aquest Tesi amb les del mètode en què s’empra acetonitril enlloc de metanol [183]

Figura 5.7

Comparació de les recuperacions obtingudes en aquest Tesi amb les del mètode en què s’empra acetonitril enlloc de metanol [183] p.126
Figura 5.8. Relació senyal anàlit / senyal P.I. per a la TC i la TYL en les 4 matrius de múscul animal (n = 3)

Figura 5.8.

Relació senyal anàlit / senyal P.I. per a la TC i la TYL en les 4 matrius de múscul animal (n = 3) p.130
Figura 6.1. Esquema dels procediments de tractament de mostra emprats en els mètodes 1 i 2

Figura 6.1.

Esquema dels procediments de tractament de mostra emprats en els mètodes 1 i 2 p.144
Figura 6.2. Ràtios del senyal en extracte i en dissolvent, expressades en percentatge, obtingudes amb el mètode 1

Figura 6.2.

Ràtios del senyal en extracte i en dissolvent, expressades en percentatge, obtingudes amb el mètode 1 p.145
Figura 6.3. Ràtios del senyal en extracte i en dissolvent, expressades en percentatge, obtingudes amb el mètode 2

Figura 6.3.

Ràtios del senyal en extracte i en dissolvent, expressades en percentatge, obtingudes amb el mètode 2 p.145
Figura 6.4. Grups ionitzables i especiació de la TC en funció del pH [220].

Figura 6.4.

Grups ionitzables i especiació de la TC en funció del pH [220]. p.146
Figura 6.5. Esquema del procediment de tractament de mostra seguit en els mètodes que empren cartutxos de mode mixt per al clean-up

Figura 6.5.

Esquema del procediment de tractament de mostra seguit en els mètodes que empren cartutxos de mode mixt per al clean-up p.147
Figura 6.6. Representació de les ràtios de senyal en extracte respecte al senyal en dissolvent, expressat en percentatge, mitjançant els mètodes 3 (A) i 4 (B)

Figura 6.6.

Representació de les ràtios de senyal en extracte respecte al senyal en dissolvent, expressat en percentatge, mitjançant els mètodes 3 (A) i 4 (B) p.148

Referencias

Actualización...