AI SLAMI EN TO Y CARACTERI ZACI ON DE Ba cillu s spp COMO FI JADORES BI OLOGI COS DE N I TROGEN O Y
SOLUBI LI ZADORES DE FOSFATOS EN DOS MUESTRAS DE BI OFERTI LI ZAN TES COM ERCI ALES
JEAN N Y PAOLA CUERVO LOZADA
PON TI FI CI A UN I VERSI DAD JAVERI AN A FACULTAD DE CI EN CI AS BASI CAS
CARRERA DE MI CROBI OLOGI A AGRI COLA Y VETERI N ARI A BOGOTA D.C
AI SLAMI EN TO Y CARACTERI ZACI ON DE Ba cillu s spp COMO FI JADORES BI OLOGI COS DE N I TROGEN O Y
SOLUBI LI ZADORES DE FOSFATOS EN DOS MUESTRAS DE BI OFERTI LI ZAN TES COM ERCI ALES
JEANNY PAOLA CUERVO LOZADA
TRABAJO DE GRADO
Present ado com o requisit o parcial para opt ar al t ít ulo de Microbiólogo Agrícola y Vet erinario
Direct or de Trabaj o de Grado
HERNANDO ALFONSO VALENCI A ZAPATA
Profesor Asociado del Depart am ent o de Biología, Facult ad de Ciencias Universidad Nacional de Colom bia, Sede Bogot á D.C.
2010
AI SLAM I EN TO Y CARACTERI ZACI ON DE Bacillus spp COMO FI JADORES BI OLOGI COS DE N I TROGEN O Y SOLUBI LI ZADORES DE FOSFATOS EN DOS M UESTRAS DE BI OFERTI LI ZAN TES COM ERCI ALES
JEAN N Y PAOLA CUERVO LOZADA
APROBADO
AI SLAMI EN TO Y CARACTERI ZACI ON DE Ba cillu s spp COM O FI JADORES BI OLOGI COS DE N I TROGEN O Y SOLUBI LI ZADORES DE
FOSFATOS EN DOS BI OFERTI LI ZAN TES COM ERCI ALES
JEAN N Y PAOLA CUERVO LOZADA
APROBADO
I NGRI D SCHULER., Ph.D Bact .M.SC., M Ed JANET ARI AS Decana Académ ica Direct ora
AGRADECI M I EN TOS
A DI OS QUI EN FUE MI GUI A CONSTANTE: AL PROFESOR HERNANDO VALENCI A POR SU CONFI ANZA, COLABORACI ON, PACI ENCI A Y AYUDA, A MI HI JO TOMAS, A MI PAPA, MI FAMI LI A Y A TODAS LAS PERSONAS QUE HI CI ERON POSI BLE ALCANZAR ESTE LOGRO TAN I MPORTANTE EN MI VI DA.
JEANNY PAOLA CUERVO LOZADA
N OTA DE ADVERTEN CI A
TABLA DE CON TEN I DO
Pagina
1. INTRODUCCION 1
2. JUSTIFICACION Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 2
3. MARCOTEORICO 3
3.1 Fijación biológica de Nitrógeno 4 3.1.1 Generalidades 4 3.1.2 La fijación asociativa de nitrógeno 5 3.1.3 Microorganismos fijadores biológicos de nitrógeno 5 3.2 Solubilización de fosfatos 5 3.2.1 Microorganismos solubilizadores de fosfato 6 3.3 El género Bacillus 7 3.3.1 Bacillus subtilis 8 3.3.2 Bacillus sphaericus 8 3.3.3 Bacillus firmus 9
4. OBJETIVOS 10
4.1 Objetivo general 10 4.2 Objetivo específicos 10 5. FICHA TECNICA DE LOS PRODUCTOS 11
5.1 KODIAK 11
5.1.2 MBE (Microorganismos biológicos efectivos) 12
6. METODOLOGIA 12
6.1.1 Aislamiento y caracterización de microorganismos 13 6.1.2 Descripción macroscópica 13 6.1.3 Descripción microscópica 13 6.2 Caracterización Bioquímica 13 6.3 Aislamiento y caracterización de cepas solubilizadoras de fosfato inorgánico 13 6.4 Aislamiento y caracterización de cepas Fijadoras biológicas de Nitrógeno 14 7. RESULTADOS Y DISCUSION 14 7.1 Aislamiento y caracterización de microorganismos 15 7.2 KODIAK 15 7.3 Microorganismos biológicos efectivos (MBE) 15 7.3.1 Características macroscópicas de C2 15 7.3.2 Características microscópicas de C2 16 7.3.3 Características macroscópicas de C3 16 7.3.4 Características microscópicas C3 8. Caracterización bioquímica Cepa K1 KODIAK 16 17 8.1.1 Caracterización bioquímica de Microorganismos biológicos efectivos (MBE) 18 8.1.2 Características y pruebas bioquímicas de C3 19 8.2 Aislamiento y caracterización de cepas solubilizadoras de fosfato inorgánico 20 8.3 Aislamiento y caracterización de cepas fijadoras de Nitrógeno 22
9. CONCLUSIONES 24
10. RECOMENDACIONES 25
11. BIBLIOGRAFIA 26
12. ANEXOS 28
1 . I N TRODUCCI ÓN
La producción de biofert ilizant es en el m undo nació a finales del siglo XI X baj o los est udios de Winogradsky, Waksm an y Lipm an, pioneros de la m icrobiología del suelo, al invest igar en los m icroorganism os su capacidad m et abólica para degradar nut rient es, considerándolos im port ant es en la fert ilización del suelo. El suelo agrícola cult ivado en el m undo, ha sido degradado por el m al m anej o de las práct icas agropecuarias. Colom bia vivencia est a problem át ica que afect a a la com unidad agrícola m undial, por lo que es necesario est ablecer invest igaciones que desarrollen un conocim ient o paralelo a la preservación de los ecosist em as con el uso de biofert ilizant es que han t om ado un papel im port ant e y se han realizado act ividades invest igat ivas y desarrollos a nivel em presarial, donde se incluyen las m et odologías de m uest reo, aislam ient o, selección y caract erización de m icroorganism os con funciones biológicas especificas, con el fin de generar product os com erciales, los cuales t am bién cuent an con pruebas de eficacia y est abilidad ut ilizadas con el obj et ivo de reducir cost os, int ensificar las int eracciones biológicas y benéficas de los procesos nat urales, prot eger la salud y m edio am bient e. Est a propuest a hace part e de un proyect o de invest igación en el área de Microbiología del Suelo con énfasis en ecología m icrobiana del Depart am ent o de Biología de la Universidad Nacional de Colom bia en el cual se realizan análisis en el cont rol de calidad de biofert ilizant es.
2 . JUSTI FI CACI ON Y PLAN TEAM I EN TO DEL PROBLEM A
3 . M ARCO TEORI CO
Los biofert ilizant es son insum os biológicos de baj o cost o que sust it uyen t ot al o parcialm ent e a los fert ilizant es sint ét icos. El inst it ut o Colom biano Agropecuario I CA ( Resolución 00375 del 27 de febrero de 2004) define un inoculant e biológico com o un product o elaborado con base en una o m ás cepas de m icroorganism os benéficos que al aplicarse al suelo o las sem illas prom ueven el crecim ient o veget al o favorecen el aprovecham ient o de los nut rient es, en asociación con la plant a o su rizosfera. I ncluye ent re los product os elaborados con m icorrizas, rizobact erias pr om ot oras del crecim ient o veget al y los géneros Rhizobium sp, Frankia sp, Beij erinckia sp y bact erias fosfat o solubilizadoras ( I CA, 2004) .
Aut ores com o ( Vassilev et al., 2001) consider an que un inoculant e biológico es una preparación de m icroorganism os que pueden sust it uir parcia o t ot alm ent e la fert ilización quím ica. ( Roveda et al., 2007) .
Los biofert ilizant es se pueden aplicar en suelos degradados y donde la presencia de m icroorganism os han sido afect ada negat ivam ent e por el uso inapropiado de t écnicas agrícolas ( exceso de agroquím icos, t alas, quem as, ent r e ot ras) que han pr opiciado la degradación y han reducido su diver sidad y efect ividad. Adem ás, se debe inocular cuando exist en poblaciones alt as de m icroorganism os que no se asocien efect ivam ent e con la especie de la plant a cult ivada.
En t érm inos generales, los inoculant es se deben aplicar en suelos que present en deficiencia del nut rient e específico, cuando exist en ( baj as o alt as) de m icroorganism os que t engan baj a capacidad de colonización y/ o baj a eficiencia com o inoculant es, o suelos donde exist an cepas nat ivas del m icroorganism o o que sus poblaciones se hayan vist o seriam ent e reducidas por procesos de degr adación de suelos. ( Pankurt s et al,. 1997) .
arbusculares y cepas de Rhizobium asociadas con plant as de arvej a. ( Roveda et al., 2007) .
I CA- CORPOI CA t ienen una gran experiencia en biofert ilizant es com o
Rhizobium sp desde 1985, m icorrizas desde 1994, Azot obact er sp,
2000 y recient em ent e con bact erias solubilizadoras de fosfat o en el 2005.
Se ha observados los éxit os alcanzados en algunos países t ropicales Brasil, Cuba, Perú, I ndia, Filipinas ent re ot ros con la ut ilización de los biofert ilizant es, ha perm it ido su ext ensa aplicación en diferent es cult ivos de int erés com o la caña de azúcar, t rigo, arr oz, t om at e, algodón ent re ot ros con la reducción hast a del 50% de los fert ilizant es nit rogenados y fosfóricos convencionales con un increm ent o en los rendim ient os ent re el 15- 30% .( Peñar anda et al.,
2005) .
De la calidad y uso adecuado del biofert ilizant e depende la sost enibilidad de los agroecosit em as, acom pañados de ot ras práct icas sost enibles de m anej o agrícola, com o son la rot ación y sucesión de cult ivos, la siem bra de policult ivos, el cont rol biológico de plagas y enferm edades, la producción orgánica, los sist em as de cult ivo y preparación del suelo ent re ot ros.( Valero,2003) .
3.1 Fij ación biológica de Nit rógeno 3.1.1 Generalidades
La fij ación de nit r ógeno puede ser puram ent e abiót ica o biológica. En la prim era se form an óxidos com o consecuencia de la com bust ión de com puest os orgánicos, descargas eléct ricas que son arrast rados al suelo por la lluvia o am onio por el proceso indust rial Haber Bosch; en t ant o la fij ación biológica de nit rógeno ( FBN) es un proceso llevado a cabo por organism os procariot as en el N2 es reducido a am onio e incorporado a la biosfera.
nit rógeno generalm ent e es consider ado el nut rient e m ás lim it ant e para el crecim ient o de las plant as en su am bient e nat ural ( Bowen et al., 1994) .
Hoy en día cobra m ás valor, dent ro de cont ext o de la agricult ura sost enible, ya que se puede evit ar el uso exagerado de fert ilizant es nit rogenados con el consiguient e ahorro en el consum o de energía y la dism inución de la degradación del m edio. ( Arévalo, 2003) .
3.1.2 La fij ación asociat iva de nit rógeno
Hay m uchas invest igaciones en las cuales se ha com pr obado ot r a form a de relación, diferent e a la sim biosis, ent re fij adores de nit rógeno y plant as, est a es debida a diazot rofos de vida libre y asociados a raíces. Est e t ipo de asociación que usualm ent e no exhibe m odificaciones o cam bios m orfológicos de la plant a o hospedero o int eracciones genét icas específicas ent re la plant a y la bact eria t ales com o se observan en los nódulos de las raíces de las legum inosas. Las bact erias de vida libre fij adoras de nit rógeno que viven en la rizosfera y sobre la superficie de las raíces ut ilizan los exudados, secreciones com o recurso de carbono para obt ener energía ut ilizable para su crecim ient o y fij ación de nit rógeno, adem ás algunas bact erias pueden ocupar int ernos de las plant as ( endófit as) , crecer y llevar a cabo allí su act ividad.
3.1.3 Microor ganism os fij ador es biológicos de nit r ógeno ( diazot róficos)
Los m icroorganism os capaces de cat alizar el rom pim ient o del t riple enlace de nit rógeno y act ivarlo para que se com bine con ot ros elem ent os quím icos, com o el hidrogeno o el oxigeno, se les conoce con el nom bre de fij adores de nit rógeno o diazot rofos ( Mishust in et al., 1971) .
Dent ro de las bact erias de vida libre encont ram os especies de
Azospirillum , Clost r idium , Ent erobact er Alcaligenes, Pseudom onas,
Klebsiella, Bacillus. Num erosas invest igaciones en el ám bit o m undial
crecim ient o, increm ent an la respuest a a la fert ilización quím ica u orgánica.
3.2 Solubilizacion de Fosfat os
El fosforo se encuent ra en el suelo de m anera orgánica e inorgánica y cont inuam ent e se va t ransform ando, las form as inorgánicas del fosforo son pH dependient es, m ient ras que el fosforo orgánico depende de ot ros fact ores com o el clim a la veget ación, la t ext ura del suelo, pract icas de m anej o e irrigación.
La disponibilidad del fosforo est á cont rolada por la m ineralización e inm ovilización a t ravés de la fracción orgánica, la solubilizacion y precipit ación de fosfat o a form as orgánicas. La m ineralización es un proceso enzim át ico, en donde el gr upo de enzim as fosfat as cat alizan una variedad de reacciones que liberan fosfat os de com puest os orgánicos hacia la solución del suelo, est as fosfat asas son liberadas por m icroorganism os ext racelularm ent e. A part ir de est e m om ent o pueden ser t om adas por las plant as, inm ovilizado en las células m icrobianas o puede form ar com plej os inorgánicos insolubles ( Osorio, 2000) .
3.2.1 Microorganism os solubilizadores de fosfat o
La act ividad m icrobiana es de gran t ranscendencia, al solubilizar los fosfat os no disponibles para la plant a, los cuales se encuent ran baj o form as orgánicas e inorgánicas. La habilidad para solubilizar los fosfat os se encuent ra present es en abundant es m icroorganism os com o bact erias, levaduras, act inom ycet es y hongos de vida libre que han sido relacionados con el increm ent o en la disponibilidad de fosforo en el suelo. A t ravés de la aplicaciones de los biofert ilizant es a base de m icroorganism os solubilizadores de fosfat os, la disponibilidad de fosforo puede increm ent arse y el product o de su acción ( fosfat os soluble) puede ser absorbido eficient em ent e por las plant as. ( Rodríguez, 2002) .
Ent re los géneros bact erianos m ás est udiados por su capacidad para solubilizar fosfat os se encuent ran: Pseudom onas, Bacillus, Rhizobium , Burkholderia, Achrom obact er, Agrobact erium , Microccocus,
Aerobact er, Flavobact erium , Azot obact er y Er winia observando una
saprofit os del suelo t ales com o Aspergillus niger, Penicillium bilaii, P.
sim plicissim un, Trichoderm a harzianum , Cladosporium herbarum y
hongos m icorrizos, principalm ent e del genero Glom us ( Cunnim gham y Kuiak 1992, Dixon- Har dy et al., 1998) .
3.3 El género Bacillus
El género Bacillus pert enece a la fam ilia Bacilliaceae, es un género que hoy en día incluye m ás de 60 especies de bacilos. Est e género est á form ado por m icroorganism os bacilares Gram posit ivos, form adores de endosporas, quim ihet erot rofos que norm alm ent e son m óviles y rodeados de flagelos perit icos. Son anaerobios o aerobios facult at ivos son cat alasa posit ivos. Las células bact er ianas de est e género t ienen un am plio t am año que varia 0,5 a 2,5 µm x 1,2- 10 µm . Est e género se encuent ra com únm ent e en suelos y plant as donde t ienen un papel im port ant e en ciclo del carbono y el nit rógeno. Son habit ant es com unes de aguas frescas y est ancadas, son part icularm ent e act ivos en sedim ent os. ( Konem an, 2001) .
Taxonóm icam ent e según la segunda Edición del Manual Bergey's ( 1982) . El género Bacillus pert enece a la fam ilia I Bacilliaceae, del orden I Bacillales de clase t res Bacilli, del fillum BXI I I firm icut es del Dom inio bact eria. En la pr im era edición del género es claram ent e diverso desde el punt o de vist a fenot ípico y genot ípico. La diferenciación ent re especies del género Bacillus se cent ro en los result ados en la ferm ent ación de lact osa, sorbit ol, m anit ol, m elobiosis, hidrólisis de la urea, y descarboxilacion de la lisina.( Anderson et al.,2003) .
Más recient em ent e, los dat os de la secuencias de RNA se han em pleado para dividir géneros de Bacillus en al m enos cinco líneas diferent es. Ent re las especies m ás represent at ivas del genero Bacillus
se encuent ran B.alkalophilus, B ant hracis, B azot oform ans, B brevis,B cereus, B subt illis,B coagulans,B firm us,B insolit us,B lincheniform is,B
polim yxa y B t uringiensis ent re ot ros. ( Berge’ys ,2000) ( Bergey´ s
3.3.1 Bacillus subt ilis
División: Firm icut es Fam ilia: Bacilliaceae
Género: Bacillus
Especie: Bacillus subt ilis
Es una bact eria Gram posit iva, produce endospora las que son t erm orresist ent es y t am bién resist e fact ores físicos perj udiciales com o la desecación la radiación los ácidos y los desinfect ant es quím icos, produce enzim as hidrofilicas ext racelulares que descom ponen polisacáridos, ácidos nucleicos perm it iendo que el organism o em plee est os product os com o fuent e de carbono y
elect rones, producen ant ibiót icos com o la bacit ricina,polim ixina,gram icidina y circulina,ferm ent an la caseína y el
alm idón, vive dent ro de los lim it es de 55 a 70º C. Es un gran cont rolador biológico, Bacillus subt ilis prom ueve el desarrollo de las plant as y pr eviene las enferm edades del suelo causadas por
Sclerot ium rolfsii, Fusarium spp., Vert icillium spp, Sclerot inia
sclerot iorum , Phyt opht hora capsici, Pyt hium spp, y el nem at odo
nodulador de raíces (Meloidogyne spp) y Rhizoct onia solani, agent e causal de la enferm edad denom inada “ m al del t allit o” del algodonero. ( Calderón et al, .2002) .
3.3.2 Bacillus sphaericus
División: Firm icut es Fam ilia: Bacilliacea
Género: Bacillus
Especie: Bacillus sphaericus
Bacilo Gram posit ivo, aerobio est rict o incapaz de ut ilizar azucar es para su crecim ient o, en Agar Nut rit ivo crece en diferent es form as com pact as difundiéndose en el m edio. Algunas especies producen colonias rosa, se aísla a part ir de sedim ent os de rio, sedim ent o m arino, y algunos alim ent os. Algunas cepas son reconocidas por su pat ogenicidad cont ra larvas y m osquit os. ( Berge’ys ,2000) ( Bergey´ s ,1984) . Present a variedad de inclusiones las cuales son cuerpos elípt icos que no cam bian en apariencia en el paso del int est ino a la larva. Los m osquit os ingieren las bact erias y la t oxina alt era el funcionam ient o del int est ino del m osquit o, Es bicont rolador de larvas
de Anopheles Psudopunct ipennis y Culex Quinquefasciat u. ( Balow s,
1988) .
prot eínas de los recept ores o ácidos nucleídos y est abilización t érm ica de los lípidos basados en est r uct uras, com o la m em brana.
3.3.3 Bacillus firm us
División: Firm icut es Fam ilia: Bacilliaceae
Género: Bacillus
Especie: Bacillus firm us
Bact eria Gram posit iva, su endospora es en form a elipsoidal,
Bacillus firm us es considerada una rizobact eria prom ot ora del
crecim ient o veget al ( PGPR) fosfat o solubilizadora ya que aum ent a la disponibilidad de fosforo para las plant as. Se ha report ado com o bact eria com ponent e de la rizosfera del roble (Quer cus sp) que j unt o con ot ras especies B. brevis y de St rept om yces m ej oran la sanidad del árbol y est im ulan el crecim ient o de la raíz de canola ( Moham m ad
et al., 1993; Pet erm an et al., 2001) . Bacillus firm us es t am bién
4 . OBJETI VOS
4 .1 Obj et ivo genera l
Aislam ient o y caract erización de especies de Bacillus com o fij adores biológicos de nit rógeno o solubilizadores de fosfat os en dos biofert ilizant es com erciales.
4 .2 Obj et ivo específicos
Det erm inar la com posición biológica del inoculant e m icrobiano present e en el biofert ilizant e MBE
Com probar la viabilidad del inoculant e m icrobiano después de cuat ro años de alm acenam ient o, en condiciones am bient ales de Bogot á, usados en los biofert ilizant es KODI AK y MBE.
Evaluar la presencia de m icroorganism os solubilizadores de fosfat o inorgánico
Evaluar cualit at ivam ent e la act ividad de disolución ( solubilización) de fosfat os m inerales ( fosfat o t ricálcico) con base a la form ación de halo de solubilización en m edio de cult ivo sólido.
5 . FI CH A TECN I CA DE LOS PRODUCTOS
[image:18.612.143.472.148.269.2]5.1 KODI AK
Figura 1.Present acion del proct oduct o KODI AK
KODI AK es un biofert ilizant e que cont iene una select a cepa de
Bacillus subt ilis que inicialm ent e fue aislado de las plant as de
algodón. Subsecuent em ent e pruebas han dem ost rado su capacidad para prot eger las raíces de m uchas especies de plant as.
KODI AK es un agent e m icrobial que prot ege las plant as enferm as m ediant e m ecanism o com pet encia por espacio, sust rat o y ant ibiosis. Colonizando las raíces y creciendo a m edida que las plant as se desarrollan y proporcionando m ayor prot ección de la raíz at acando las enferm edades causadas por Fusar ium, Rhizoct onia, Aspergillus y así m ej ora la nodulación por Rhizobium .
5.1.2 MBE ( Microorganism os biológicos efect iv os)
Figura 2.Present acion del product o MBE El biofert ilizant e EMB es un product o art esanal que fue creado en el
año 2008 por em presarios de Medellín; donde se encuent ra un consorcio de m icroorganism os benéficos present es en la nat uraleza que pueden ser aplicados com o inoculant es para m ej orar la diversidad m icrobiana y veget al, adem ás es un pr oduct o que puede ser ut ilizado en pr ocesos de com post aj e y en el m anej o de residuos orgánicos, t am bién puede aum ent ar la vida út il de los pozos sépt icos, descom poner residuos de podas y j ardinería, para el t rat am ient o de est iércoles y est ablos.
La base t ecnológica del EMB es una m ezcla de diferent es t ipos de m icroor ganism os t odos ellos benéficos par a el m ej oram ient o de los suelos que poseen propiedades de ferm ent ación, pr oducción de sust ancias bioact ivas, com pet encia y ant agonism o con pat ógenos, t odo lo cual ayuda a m ant ener un equilibrio nat ural ent re los m icroorganism os que conviven en el ent orno, t rayendo efect os posit ivos sobre la salud y bienest ar del ecosist em a. Com posición: Agua, Melaza orgánica, sacarina, fruct osa, dext rosa y cult ivos m icrobianos su vida út il es de 120 días.
6 . MATERI ALES Y METODOS
6.1.1 Aislam ient o y caract erización de m icroorganism os
Para el aislam ient o de los m icroorganism os evaluados en los biofert ilizant es: KODI AK y Microorganism os Biológicos Efect ivos ( MBE) , se realizó prim ero cuant ificación en m edio SPC o Agar placa de cont eo est ándar, m ediant e el m ét odo de cuant ificación de células viables en series de diluciones decim ales y siem bra en superficie, por duplicado. Las placas se incubaron a 37° C por 24 a 72 horas ( Madigan et al., 1998) . Post eriorm ent e se seleccionaron los diferent es t ipos de colonias y se sem braron por est riado y agot am ient o en agar nut rit ivo para la obt ención de cult ivos puros.
6.1.2 Descripción m acroscópica
Se describió la m orfología de la colonia, t am año, color, borde acom pañada de regist ros fot ográficos.
6.1.3 Descripción m icroscópica
Se aplicó la coloración de Gram y coloración para endosporas bact erianas ( Shaeffer- Foult un) , para det erm inar t ipo de pared y la m orfología de las células bact erianas, así com o el t ipo de agregación, m ediant e observación m icr oscópica a 100x y 1000x.
6.2 Caract erización Bioquím ica
A cada cepa se le realizo una caract erización de pruebas fisiológicas y bioquím icas con base crit erios expuest os en la lit erat ura ( Holt et al.,
1984, Pat riquin et al., 1983.De Polli et al., 1986, Baldani et al., 1986, Tarr et a.,l 1979,Dobereiner,et al., 1988) . Se seleccionar on las siguient es pruebas: Oxidasa, Cat alasa, ferm ent ación de Glucosa Lact osa, Malt osa, Manit ol, Arabinosa. Xilosa, Hidrólisis de Caseína, Hidrólisis del alm idón, crecim ient o en NaCl al 7% , asim ilación de Cit rat o, SI M ( H2S, I ndol, Movilidad) , Voges- Proskauer, ( pr oducción de acet oina o 2,3 but anodiól) , reducción de Nit rat os, Ureasa, licuefacción de la gelat ina, para det erm inar el género de los m icroorganism os aislados.
6.3 Aislam ient o y caract erización de cepas solubilizadoras de fosfat o inorgánico
seleccionaron colonias bact erianas que crecieron acidificando el m edio de cult ivo y form ando un halo t ransparent e alrededor de la colonia, indicando la producción de fosfat os t ricálcico o act ividad solubilizadora.
6.4 Aislam ient o y caract erización de cepas Fij adoras biológicas de Nit rógeno
Para el aislam ient o de bact erias fij adoras de Nit rógeno se realizo a part ir de las colonias seleccionadas ant eriorm ent e y se sem braron por agot am ient o en m edio NFB, el cual es un m edio select ivo carent e de Nit rógeno com binado. Según Renie ( 1988) , el m edio t iene una fuent e com binada de carbono que le per m it e recuperar m ayor cant idad de diferent es m icroor ganism os diazot róficos y donde solo crecen los que poseen el com plej o enzim át ico de la nit rogenasa,( N-asa) , que perm it e reducir el nit rógeno at m osférico y ut ilizarlo en su m et abolism o. Se procedió a la descripción m acroscópica de las colonias con el fin de evaluar las caract eríst icas m orfológicas en el m edio de cult ivo solido. La caract erización m icroscópica incluyo t inción de Gram . ( Madigan et al., 1998) .
7 . RESULTADOS Y DI SCUSI ON
7.1 Aislam ient o y caract erización de m icroorganism os
[image:21.612.112.522.538.600.2]A cont inuación se present an los result ados de la cuant ificación y caract erización de los aislam ient os obt enidos en agar SPC ( St andar d Plat e Count ) de las m uest ras de los dos biofert ilizant es en est udio. ( Tabla.1) .
Tabla 1. Cuant ificación de células viables en los biofert ilizant es. KODI AK Y MBE en agar placa de cont eo
Se aislar on t res t ipos de colonias codificadas así: Colonia 1 ( K1) y colonias 2 y 3 ( C2 y C3) de los product os KODI AK y MBE respect ivam ent e.
Biofert ilizant e Colonias ufc g- 1 o ufc
m L- 1
KODI AK ( polvo seco) K1 18 x105
7 .2 KODI AK
[image:22.612.200.403.438.607.2]Cepa K1. Macroscópicam ent e se observaron colonias de 2 a 4 m m de diám et ro de form as redondas, lisas, de bor de ir regular consist encia crem osa en placa en placa de Agar Nut rit ivo. ( Figur a.3) .
Figura. 3 Colonias de la cepa K1
Microscópicam ent e: se observan bacilos Gram posit ivos de 0.8 µm de diám et ro por 2 a 3 µm de largo con borde redondeado, esporas esféricas y cent rales ( Figura 4) .
7 .3 Microorganism os biológicos efect ivos ( MBE)
Para el biofert ilizant e MBE en Agar Nut rit ivo se observaron dos t ipos de colonias de apariencia ram ificada caract eríst icas de algunas especies pert enecient es al género Bacillus.
7.3.1 Macroscópicam ent e: C2 Colonias de 2 a 4 m m de diám et ro, irregulares de consist encia crem osa. Present an color beige oscuro y con pr oducción de pigm ent ación rosado claro hacia el cent ro de la colonia ( Figur a 5) .
Figura. 5 Fot ografía de colonias de la cepa C 2
[image:23.612.214.400.486.608.2]7.3.2 Microscópicam ent e: C 2 Se observan bacilos Gram posit ivos, de 1 µm de ancho por 1.5 a 5 µm de largo, se present aron esporas esféricas que se sit úan en la part e t erm inal del esporangio y le dan un aspect o de raquet a. ( figur a. 6)
Figura 6. Microfot ografía de la cepa C2. 1000X
Figura 7. Colonias de la cepa C3
7.3.4 Microscopicam ent e C3: Se observan bacilos Gram posit ivos de 0.6 a 0.9 µm de diam et ro por 1.2 a 4 µm de largo en form a de cadena, esporas elipsoidal en posición cent ral.( Figura.8) .
[image:24.612.199.408.366.554.2]8. Car act erización bioquím ica Cepa K1 KODI AK
Tabla 2. Caract eríst icas y pruebas Bioquím icas para la cepa K1
Prueba Rea cción Reacción a t inción de
Gram
+
Crecim ient o anaeróbico - Posición de la espora Cent ral
Oxidasa - Cat alasa + Ferm ent ación de la
Glucosa
+
L- arabinosa + D- xilosa + D- Manit ol -
Hidrólisis del alm idón +
Hidrólisis de la caseína +
Hidrólisis de la Urea -
Movilidad + Ut ilización del Cit rat o +
Reducción de Nit rat o +
Crecim ient o en NaCl al 7% +
Crecim ient o a pH 5.7 -
Hidrólisis de la Gelat ina +
Vosges- Proskauer +
En el biofert ilizant e KODI AC se aisló una cepa que present o t inción de Gram posit iva, con endospora cent ral y crecim ient o aeróbico, cat alasa posit iva, present a hidrólisis del alm idón y reduce los nit rat os, no produce indol, form a escasa cant idad de acido sulfúrico, present a crecim ient o en NaCl al 7% , t iene reacción posit iva Voges Proskauer, es m anit ol negat ivo y ut iliza el cit rat o,( Tabla 2) . Por base a los result ados ant eriores la cepa K1 corresponde Bacillus subt ilis ( Ber gey’s, 2000) .
Según Gonzales y Fragozo 2002, señalan que la bact eria Bacillus
subt ilis no es pot encialm ent e pat ógena, no produce endot oxinas y
biofungicida. Bacillus subt ilis se ha ut ilizado para el cont rol biológico
de Phyt opht hora infest ans, Phyt opht hora soj ae y P. capsici en suelos
infest ados por el pat ógeno en cult ivos de frij ol y t om at e. ( Filippov y Kuznet zova ,1994) . I nvest igaciones recient es m uest ran que Bacillus
subt ilis, no solam ent e inhibe al pat ógeno, sino que adem ás,
prom ueve el crecim ient o de la raíz y la plant a, e increm ent an el cont enido de lípidos, t riglicéridos y est erol en las hoj as del t om at e ( Nem ec et al., 1998) . Del m ism o m odo se ha ut ilizado en el t rat am ient o de sem illas de cereales, algodón y m aíz. En general
Bacillus subt ilis es ut ilizado com o un organism o ant agonist a en
aplicaciones agronóm icas.
[image:26.612.141.461.297.577.2]8.1.1 Caract erización bioquím ica de Microorganism os biológicos efect ivos ( MBE)
Tabla 3. Caract eríst icas y pruebas bioquím icas de la cepa C2
Prueba Reacción
Reacción a Tinción de Gr am
+
Posición de la espor a Cent ral Cr ecim ient o anaer óbico -
Cat alasa + Oxidasa + Fer m ent ación de Glucosa -
L- ar abinosa - D- xilosa - D- Manit ol - Hidrólisis del alm idón -
Movilidad - Hidrólisis de la caseína d
Ut ilización del Cit r at o - Reducción de Nit r at o - Cr ecim ient o en NaCl al 7% d Cr ecim ient o a pH 5.7 - Hidrólisis de la Gelat ina + Hidrólisis de la Ur ea +
Vosges- Proskauer -
d. r eacción débil
Ent re las aplicaciones de cepas de Bacillus sphaericus, dada su alt a pat ogenicidad cont ra algunas larvas de m osquit os, es su efect o larvicidas de insect os ( Poinar y Thom as, 1978: Maldigan et al., 2000) Por ot ra part e, invest igaciones sobre el cont rol de los m osquit os hem at ófagos han t enido gran influencia en el cam po de la salud pública, por el im port ant e papel que cum plen en la t ransm isión de enferm edades al hom bre. Se conocen alrededor de 150 especies de m osquit os, de las cuales 43 son del género Anopheles. ( Calderón et al., 1995) . Ent re ellos se encuent ran los vect ores de m alaria, y el rest o corresponde al grupo de los Culicíneos que incluyen los géneros
Culex, Aedes, Sabet hes, vect ores de encefalit is equina, dengue y
fiebre am arilla silvest re, respect ivam ent e. Según la OMS ( 1999) , las larvas de m osquit os de los géneros Psorophora y Culex son m uy suscept ibles a Bacillus sphaericus, seguido por los géneros Mansonia,
Anopheles y Aedes, en orden decrecient e. Las larvas de Culex t ienen
un nivel de suscept ibilidad m uy elevado, del m ism o orden que su suscept ibilidad a los larvicidas quím icos de uso corrient e. Bacillus sphaericus es un buen cont rolador biológico ha m erecido el m ayor apoyo y at ención en t odo el m undo ( OMS, 1982) bact erias esporógenas han dem ost rado ser m ás específicas en su t oxicidad cont ra organism os blancos que ot ros insect icidas.
8.1.2 Tabla 4 Caract eríst icas y pruebas bioquím icas de C3
Prueba Reacción Reacción a Tinción de Gram +
Posición de la espora cent ral
Crecim ient o anaeróbico -
Cat alasa + Oxidasa - Ferm ent ación de la Glucosa +
L- arabinosa - D- xilosa - D- Manit ol +
Hidr ólisis del alm idón +
Hidr ólisis de la Gelat ina +
Movilidad +
Hidr ólisis de la caseína +
Ut ilización del Cit rat o -
Reducción de Nit rat o d
Crecim ient o en NaCl al 7% +
Crecim ient o a pH 5.7 -
Hidr ólisis de la Gelat ina +
Vosges- Proskauer -
La cepa C3 present o t inción de Gram posit iva, endospora en form a elipsoidal, crecim ient o aeróbico, ut ilizo la glucosa y m anit ol pero no arabinosa ni xilosa, hidrolizaron el alm idón y la caseína, crecim ient o lent o en NaCl al 7% , crecim ient o lent o en ausencia de oxigeno, especialm ent e en nit rat o, sin reducción del cit rat o. Por t odo lo ant erior la cepa en cuest ión se det erm inó t axonóm icam ent e com o
Bacillus Firm us ( Bergey´ s, 1984; Bergey´ s, 2000) . ( Tabla 4) . Bacillus
firm us pert enece al grupo I I , al cual pert enecen t am bién B,
t rhurigenesis, B subt ilis, B m egat erium ent r e ot ras. Se ha report ado com o bact eria com ponent e de la rizosfera del roble (Quercus sp) , que j unt o con ot ras especies B. brevis y de St rept om yces m ej oran la sanidad del árbol y est im ulan el crecim ient o de la raíz de canola ( Moham m ad et al., 1993; Pet erm an et al., 2001)
8.2 Aislam ient o y caract erización de cepas solubilizadoras de fosfat o inorgánico
De las t res cepas aisladas, K1, C2, C3, en los dos biofert ilizant es no se seleccionaron bact erias fosfat o solubilizadoras, debido a que no present aron halos de solubilización y los bacilos aislados no t uvieron la capacidad de acidificar el m edio y probablem ent e no t ienen act ividad fosfat o solubilizadora. ( Figura.9) . No obst ant e no se puede afirm ar cont undent em ent e que ninguna cepa no present e capacidad solubilizadora de fosfat os inorgánicos, cuando no se realizó la prueba de solubilización en m edio líquido, m ediant e m ét odo con espect rofot om et ría, considerado de m ayor valides, com parado con el m edio SRS agarizado ( Whit elaw , 1999) . Al respect o son int eresant es los result ados regist rados por Roger et al., ( 1996) , quienes encont rar on en rizósfera de arroz, una cepa de B. firm us
A B C
Figura 9. A) Fot ografía de colonias de la cepa K1 B) . Colonias de la cepa C2. C) Colonias de cepa C3.
Est os result ados se dieron probablem ent e a que los m icroorganism os evaluados no t om aron com o fuent e de fósforo el fosfat o t ricalcico, el cual act úa com o fuent e inorgánica de fósforo cuyo m ecanism o es la solubilización y producción de ácidos orgánicos generados por la degradación bact eriana de la fuent e de carbono. Según Kpom blekou y Tabat abai( 1994) ,la act ividad fosfat o solubilizadora est á det erm inada por la capacidad bioquím ica m icrobiana de producir ácidos or gánicos que por m edio de los grupos carboxílicos quelan cat iones unidos a fosfat o convirt iéndolos en form as solubles, aunque la producción de ácidos orgánicos es uno de los m ayores responsables en est e proceso, no es el único m ecanism o para solubilizar fosfat os. ( Figura.9) .
Tam bién es im port ant e afir m ar que en las condiciones experim ent ales aplicadas no se puede afirm ar que los m icroorganism os carezcan de capacidad solubilizadora del fosfat o t ricálcico, pues est a act ividad t am bién depende de la fuent e de nit rógeno ut ilizada y puede variar si es de nit r at o o de am onio ( N- NO3 o N- NH4) . En el caso part icular se ut ilizó sulfat o de am onio.
8.3 Aislam ient o y caract erización de cepas fij adoras de Nit rógeno Con respect o a los fij adores biológicos de Nit rógeno. La cepa de
Bacillus firm us, aislada en el m edio de NFB cont enida en el
[image:29.612.108.500.66.234.2]A B
Figura. 10 A) Colonias de Bacillus firm us en NFB B) Microfot ografia de bacilos Gram posit ivos 100X.
Un resum en de los análisis m icrobiológicos realizados a los product os biofert ilizant es, con dos años de alm acenam ient o, con especial at ención a la presencia y viabilidad de m icroorganism os de los grupos funcionales, fij adores biológicos de nit rógeno y solubilizadores de fosfat os inor gánicos se aprecia en la siguient e ( Tabla 5.)
Tabla 5. Microorganism os aislados en m edio NFb para fij adores biológicos de nit rógeno y SRS para solubilizadores de fósfor o inorgánico a part ir de los product os biofert ilizant es KODI AK y MBE.
Microorganism o o cepa
Fij adora Biológica de N it rógeno
Solubilizadora de fosfat o inorgánico
[ Ca3( PO)4]
Bacillus subt ilis K1 - ( - ) halo. ( + )
acidificación
Bacillus firm us C2 C2 ( MBE) ( - ) halo. ( + )
acidificación
Bacillus sphaericus
C3
- ( - ) halo. ( + )
[image:30.612.101.508.440.563.2]9 . CON CLUSI ON ES
Las dos m uest ras de los biofert ilizant es evaluados, KODI AK y MBE se caract erizaron por present ar m icroor ganism os endosporados, especies de Bacillus, los cuales perm it ieron una viabilidad del los inoculant es m icrobianos m ayor a cuat ro años de alm acenam ient o en condiciones am bient ales de Bogot á. En el biofert ilizant e KODI AK se aisló una sola especie, Bacillus
subt ilis. Lo que concuerda con la com posición, de una
población pura, dada en la et iquet a del product o.
El product o EMB cont iene dos inoculant es pert enecient es a cepas de Bacillus sphaericus y Bacillus firm us, no indicados en la com posición de la et iquet a y reconocidos en la lit erat ura en el biocont rol de larvas de insect os y fit opat ógenos respect ivam ent e.
La cepa de Bacillus firm us, aislada en el m edio de NFb cont enida en el biofert ilizant e EMB, present a capacidad pot encial com o fij adora biológica de nit rógeno.
1 0 . RECOMEN DACI ON ES
De la present e invest igación surgen las siguient es recom endaciones: Para verificar con cert eza la especie se recom ienda ut ilizar un
sist em a analít ico de ident ificación rápida para Bacillus API 50 CHB y en lo posible pr uebas de ident ificación m olecular .
Realizar evaluaciones cuant it at ivas en Medio Liquido y det erm inar la capacidad de solubilizacion de fosfat os inorgánicos.
Evaluar los biofert ilizant es ut ilizados en est e est udio a nivel de cam po y det erm inar sus beneficios a nivel del crecim ient o y producción de las plant as.
1 1 . BI BLI OGRAFI A
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1 2 . AN EXOS
Medios de cult ivo ut ilizados par a est a invest igación 1 . Medio de cult ivo ( SRS)
Medio par a el aislam ient o de m icroorganism os solubilizador es de fosfat o de acuerdo a Sundar a Rao & Sinha,( 1963) . El m edio SRS no llev a indicador de pH, cont iene el fosfat o t rialcico pr ecipit ado ( no soluble) y por lo t ant o no disponible.
Com ponent es en g. L- 1
( NH4) SO4 0.5 KCL 0.2 MgSO4.7H2O 0.3 MnSO4.H2O 0.004 FeSO4.H2O 0.002 NaCl 0.2 Glucosa 10.0 Ext ract o de Levadura 0.5 Ca3( PO4)2 5.0 Agar 16.0 Agua dest ilada 1000 m l
Púrpura de brom ocr esol ( opcional) 0.1 g. 2 . Medio select ivo para N FB
Caldo de cultivo selectivo para asilar bacterias fijadoras de N2. Com ponent es en g. L- 1
