Selección de extractos fúngicos extracelulares (EFE) con potencial para el control de Botrytis cinerea en tomate (lycopersicon esculentum mill)

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Texto completo

(1)

SELECCIÓN DE EXTRACTOS FÚNGICOS EXTRACELULARES (EFE)

CON POTENCIAL PARA EL CONTROL DE

Botrytis cinerea

EN TOMATE

(

Lycopersicon esculentum

Mill.)

DIANA CATALINA POVEDA PARRA

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial

Para optar al título de

MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Bogotá, D. C.

(2)

SELECCIÓN DE EXTRACTOS FÚNGICOS EXTRACELULARES (EFE)

CON POTENCIAL PARA EL CONTROL DE

Botrytis cinerea

EN TOMATE

(

Lycopersicon esculentum

Mill.)

DIANA CATALINA POVEDA PARRA

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial

Para optar al título de

MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL

Director: ALBA MARINA COTES PRADO Ph. D.

Codirector: ANDRÉS DÍAZ GARCÍA I.Q.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Bogotá, D. C.

(3)

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946

(4)

SELECCIÓN DE EXTRACTOS FÚNGICOS EXTRACELULARES (EFE)

CON POTENCIAL PARA EL CONTROL DE

Botrytis cinerea

EN TOMATE

(

Lycopersicon esculentum

Mill.)

DIANA CATALINA POVEDA PARRA

APROBADO

_____________________________________ __________________________________

ALBA MARINA COTES PRADO Ph. D. ANDRÉS DÍAZ GARCÍA I.Q.

Director

Codirector

______________________________________ __________________________________

MARIA CARIDAD DE GARCÍA MsC. MARÍA MERCEDES MARTÍNEZ

(5)

SELECCIÓN DE EXTRACTOS FÚNGICOS EXTRACELULARES (EFE)

CON POTENCIAL PARA EL CONTROL DE

Botrytis cinerea

EN TOMATE

(

Lycopersicon esculentum

Mill.)

DIANA CATALINA POVEDA PARRA

APROBADO

_______________________________________ _______________________________

ANGELA UMAÑA MUÑOZ M.Phil.

LUIS DAVID GÓMEZ M.

(6)

A Dios mi Director Principal porque me dio la visión y fortaleza necesarias cada día, Él y mi familia con su amor, apoyo y guía sabia me han enseñado que la perseverancia, la

(7)

AGRADECIMIENTOS

La autora manifiesta su gratitud a:

Dra. Alba Marina Cotes, por su enseñanza y por la oportunidad de formar el hábito

investigativo.

Andrés Díaz, por su enfoque y discusiones acertadas.

Carlos Andrés Moreno, por su asesoría.

Los estudiantes, profesionales y auxiliares del Laboratorio de Control biológico, por

su ayuda y colaboración.

Corpoica C.I. Tibaitatá por mostrarme posibilidades en un área que necesita ser

explorada, la investigación en la agricultura.

Mis Padres por su confianza y consejo sabio, a Moni mi hermana por su ayuda.

A todos aquellos que me acompañaron en esta carrera y me comunicaron sus

conocimientos y trabajos para la construcción de éste, su apoyo ha sido clave a lo

(8)

TABLA DE CONTENIDOS

Página

ÍNDICE DE TABLAS XI

ÍNDICE DE FIGURAS XII

RESUMEN

ABSTRACT 2

INTRODUCCIÓN 3

1. MARCO TEÓRICO 5

1.1 LOS MICROORGANISMOS COMO FUENTE DE METABOLITOS DE

INTERÉS 5

Biodiversidad Microbiana 5

Bioprospección: Proceso esencial en la investigación biotecnológica 7

Metabolitos Fúngicos en Medicina 9

Antibióticos 9

Anticancerígenos, Antidiabéticos e Inmunosupresores 12

Metabolitos Fúngicos en Alimentación e Industria 13

Metabolitos Fúngicos en Fitoprotección 14

Antibióticos 15

Enzimas 18

Volátiles 19

1.1.2 Metodologías empleadas para la bioprospección de metabolitos con

interés en fitoprotección 20

Bioprospección in vitro 20

Bioprospección in vivo e in planta 22

1.1.2.1Metabolismo secundario: Biosíntesis de productos naturales con

(9)

1.2 IMPORTANCIA DEL TOMATE (Lycopersicon esculentum Mill.) 25

1.2.1 Principales patologías del Tomate 25

1.3 MOHO GRIS: Botrytis cinerea 26

1.3.1 Generalidades del Agente Etiológico del Moho Gris. 26

1.3.2 Características Microscópicas y Macroscópicas de Botrytis cinerea. 27

1.3.3 Epidemiología y Ciclo de Vida del Fitopatógeno B. cinerea 28

Diseminación del Patógeno 28

Ciclo de Infección de Botrytis cinerea 29

1.4 CONTROL DEL MOHO GRIS (Botrytis cinerea) 31

1.4.1 Control Químico 31

1.4.2 Metabolitos fúngicos reportados para el control de B. cinerea 33

1.4.3 Características de los metabolitos fúngicos utilizados para fitoprotección 33

2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 35

2.1FORMULACIÓN DEL PROBLEMA. 35

2.2 JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN. 35

3. OBJETIVOS 37

3.1 OBJETIVO GENERAL. 37

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS. 37

4. MATERIALES Y MÉTODOS 38

4.1 PRODUCCIÓN DE LOS EXTRACTOS FÚNGICOS EXTRACELULARES

(EFE) 38

4.1.1 MICROORGANISMOS Y MEDIOS DE CULTIVO 38

Cepas nativas de hongos filamentosos 38

Colección de trabajo de los Hongos 38

Obtención de los Extractos Microbianos 39

(10)

4.2 ENSAYOS in vitro. 40

4.2.1 Suspensión de conidios de Botrytis cinerea. 40

4.2.2 Lectura de las Placas 41

4.2.2.1 Curva de Calibración para Botrytis cinerea 42

4.2.2.2 Actividad Antifúngica de los Extractos (EFE) 42

4.2.3 Análisis Estadístico 43

4.3 ENSAYOS in planta. 44

4.3.1 Selección del Bioensayo 44

4.3.2 Evaluación de los Extractos Fúngicos Extracelulares (EFE) seleccionados 45

4.3.2.1 Material Vegetal 45

Inoculación en Foliolos de Tomate. 45

4.3.3 Análisis Estadístico 46

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 48

5.1 MICROORGANISMOS Y MEDIOS DE CULTIVO 48

5.1.1 Cepas nativas de hongos filamentosos 48

5.1.2 Producción de los Extractos Fúngicos Extracelulares (EFE) 53

5.2 ENSAYOS in vitro 59

5.2.1 Efecto de los extractos fúngicos (EFE) sobre la inhibición de la

germinación de B. cinerea 59

5.2.2 Cuantificación de la densidad óptica en relación con el efecto de los

extractos fúngicos (EFE) sobre la inhibición de la germinación de B. cinerea 74

5.3 ENSAYOS in planta 85

5.3.1 Selección del Bioensayo 85

5.3.2 Evaluación de la actividad antifúngica de los extractos en ensayos

in planta. 86

(11)

7. RECOMENDACIONES 95

8. REFERENCIAS 96

(12)

ÍNDICE DE TABLAS

Página

Tabla 1. Taxonomía de Botrytis cinerea 28

Tabla 2. Morfoespecies recuperadas de los tubos de agar 48

Tabla 3. Morfoespecies recuperadas de los viales en aceite 51

Tabla 4. Características de los EFE provenientes de las morfoespecies

suelo 1 56

Tabla 5. Características de los EFE provenientes de las morfoespecies

suelo 2 57

Tabla 6. Características de los EFE provenientes de las morfoespecies

suelo 3 58

Tabla 7. Efectos potenciales de los extractos con actividad antifúngica

sobre la germinación de B. cinerea 68

Tabla 8. Características de los EFE pertenecientes al grupo de inhibición

alta de la germinación de B. cinerea y sus correspondientes

extractos producidos en el otro medio de cultivo 69

Tabla 9. Delta de diferencias de la densidad óptica para cuatro longitudes

de onda 74

Tabla 10. Valores de densidad óptica para diferentes concentraciones

de B. cinerea 75

Tabla 11. EFE producidos en el medio Czapeck-Dox, empleados para la

calibración 78

Tabla 12. EFE producidos en el medio YMG, empleados para la

calibración 80

Tabla 13. Relación entre el porcentaje de inhibición de la germinación de

B. cinerea y la densidad óptica, obtenido con los extractos

49 y 56 82

Tabla 14. Porcentajes de severidad y eficacia para los tratamientos EFE

(13)

ÍNDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1. Estructura del metabolito paclitaxel 12

Figura 2. Estructura del antidiabético L-783,281 13

Figura 3. Estructura de la gliotoxina 15

Figura 4. Estructura de la glisoprenina C, neobulgarona D y scytalol D 17

Figura 5. Fotografías macroscópicas de diferentes morfoespecies de los

suelos 1, 2 y 3 49

Figura 6. Fotografías macroscópicas de diferentes morfoespecies de los

suelos 1, 2 y 3 50

Figura 7. Fotografías microscópicas de diferentes morfoespecies 52

Figura 8. Fotografías de algunos de los extractos producidos 53

Figura 9. Agrupamiento del efecto inhibitorio de los EFE producidos en

el medio Czapeck-Dox 59

Figura 10. Agrupamiento del efecto inhibitorio de los EFE producidos en

el medio YMG 60

Figura 11. Tubos germinales cortos de B. cinerea en presencia de algunos

EFE 63

Figura 12. Concentración del contenido citoplasmático de conidios de

B. cinerea en presencia de algunos EFE 64

Figura 13. Tubos germinales secundarios y terciarios de B. cinerea en

presencia de algunos EFE 64

Figura 14. Agrupamiento del efecto inhibitorio de los EFE producidos en

Czapeck-Dox pertenecientes a los grupos de inhibición media

y alta 66

Figura 15. Agrupamiento del efecto inhibitorio de los EFE producidos en

YMG pertenecientes a los grupos de inhibición media y alta 67

Figura 16. Fotografías de los extractos del grupo de inhibición alta 69

(14)

Figura 18. Morfoespecies productoras de los extractos del grupo de

inhibición alta 72

Figura 19. Curva de calibración para B. cinerea, concentración vs.

densidad óptica 75

Figura 20. Disposición espacial de los tratamientos evaluados en una placa

de microtitulación de 96 pozos 76

Figura 21. Modelo de calibración lineal entre la densidad óptica y el porcentaje

de germinación para los EFE producidos en Czapeckl-Dox 79

Figura 22. Modelo de calibración lineal entre la densidad óptica y el

porcentaje de germinación para los EFE producidos en YMG 79

Figura 23. Incidencia B. cinerea en el modelo de foliolos de tomate 85

Figura 24. Incidencia B. cinerea en el modelo de tallos de tomate 86

Figura 25. Fitotoxicidad sobre foliolos de tomate en presencia del EFE 49 87

Figura 26. Fitotoxicidad sobre foliolos de tomate en presencia del EFE 66 87

Figura 27. Progreso moho gris sobre foliolos de tomate 88

Figura 28. Curva de progreso incidencia moho gris sobre foliolos tomate 88

Figura 29. Porcentaje de incidencia del moho gris en el día 19 89

Figura 30. Fotografías del área foliar con moho gris en presencia de los

tratamientos evaluados 90

Figura 31. Progreso severidad moho gris sobre foliolos expresado en

UABC 90

Figura 32. Porcentaje de severidad del moho gris en el día 19 91

(15)

RESUMEN

Los hongos filamentosos presentes en zonas tropicales como el Amazonas, proveen

fuentes potenciales de compuestos con actividad para inhibir la germinación de

hongos fitopatógenos durante su ciclo de infección. Este tipo de alternativas

permitirá el control de brotes epidemiológicos como el producido por el moho gris B.

cinerea, durante la pre y postcosecha en cultivos de importancia agrícola, como el

tomate. Por otra parte, en la actualidad se han desarrollado técnicas de

bioprospección de alta eficiencia en el formato de placas de microtitulación de

96-pozos para evaluar el efecto de extractos crudos o moléculas puras sobre la

fisiología, morfología o actividad de microorganismos de importancia clínica,

agrícola e industrial. Dicho efecto puede ser cuantificado relacionando la

observación directa por microscopia del fenómeno con la densidad óptica obtenida

en un lector de ELISA. Por tanto, el objetivo de este trabajo fue seleccionar

extractos fúngicos extracelulares (EFE) que inhibieran la germinación de B. cinerea

in vitro e in vivo mediante el empleo de una técnica de microtitulación. Se emplearon

cepas de hongos filamentosos aisladas previamente del Amazonas para la

producción de extractos fúngicos extracelulares (EFE) en dos medios de cultivo,

Czapeck-Dox y YMG. Los EFE fueron evaluados en placas de microtitulación de

96-pozos para cuantificar la inhibición de la germinación de 5 x 105 conidios.ml-1 de

B. cinerea, relacionando la germinación del hongo observada mediante microscopia

óptica con la densidad óptica a 405 nm. En total, 22 extractos (15 producidos en el

medio YMG y 7 en Czapeck-Dox), lograron inhibir la germinación de B. cinerea en

más del 60% en comparación con el testigo patógeno. De estos, cuatro EFE

codificados como 49, 56, 66 y 158, producidos por las morfoespecies 44 (Penicillium

sp.), 223 (Beauveria sp.), 110 (Aspergillus sp.) y 150 (Phialophora sp.)

respectivamente, en los medios YMG y CD, presentaron inhibiciones de la

germinación de B. cinerea entre el 85% y 90%. De los cuatro extractos

seleccionados in vitro, dos de ellos presentaron actividad fitotóxica en las hojas de

tomate y el extracto 56 presentó la mayor actividad sobre foliolos de tomate

(16)

ABSTRACT

Filamentous fungi from tropical ecosystems as the Amazonas, possess potential

sources of compounds with activity to inhibit germination of fungal phytopathogens

during their infection cycle. These alternatives allow to control epidemic outbreaks

produced by the gray mould B. cinerea, during pre- and postharvest of importance

agricultural cultives as the Tomato. Nonetheless, currently high-troughput

bioprospection techniques have been developed based on the 96-well microtitre

plate format to evaluate the effect of crude extracts, or pure molecules over the

physiology, morphology or activity of clinical, industrial and agricultural

microorganisms. Such effect may be scored considering the direct observation by

optical microscopy with optical density obtained in ELISA´s microplate reader.

Therefore, the objective of this investigation was to select extracellular fungal

extracts (EFE) that inhibited B. cinerea germination in vitro and in vivo through the

microtitration technique. Strains of filamentous fungi isolated previously from the

Amazonas, were used and grown for the production of the extracellular fungal

extracts (EFE) in the Czapeck-Dox and YMG media. EFE were tested on the 96-well

microtitre plates to estimate inhibition of germination from B. cinerea 5 x 105

conidia.ml-1 which was related between optical microscopy with optical density at

405nm. Twenty two extracts (15 produced on YMG medium and 7 on Czapeck-Dox

medium), inhibited conidial germination of B. cinerea up to 60% as compared to the

pathogen. From of these ones, four EFE codified as 49, 56, 66 and 158, produced by

the morphospecies 44 of Penicillium sp., 223 of Beauveria sp., 110 of Aspergillus sp.

and 150 of Phialophora sp., respectively, on YMG and CD media, showed

germination inhibition of B. cinerea ranged between 85% and 90% after 16 h. From

these four extracts selected against B. cinerea two of them showed phytotoxic

activity over tomato leaves, and was only the EFE 56 that showed the highest

activity in vivo upon tomato leaves reducing severity of gray mould at 74 % after 19

(17)

INTRODUCCIÓN

Los hongos filamentosos representan gran parte de la diversidad macro y

microscópica universal, con aproximadamente más de 250.000 especies, y más de

3.000 productos derivados de su metabolismo, identificados hasta la fecha. De

algunas de estas cepas y metabolitos, no se conocen todas sus propiedades y

actividades específicas, reflejando aún un amplio campo de interés para su

exploración e investigación. Esto es especialmente relevante en aquellos

microorganismos aislados de zonas megadiversas de nuestro país como el

Amazonas, donde la microbiota fúngica y productos derivados todavía no han sido

explorados ni explotados.

Adicionalmente, dentro del reservorio de productos naturales, existen varios

metabolitos fúngicos que han demostrado su utilidad en fitoprotección de cultivos,

debido tanto a sus efectos directos sobre los fitopatógenos, como a los efectos

indirectos sobre la planta. Esto es debido a que, estos pueden inhibir el desarrollo

de estructuras de infección y de penetración del patógeno, o actuar como inductores

de respuestas de defensa en el huésped, protegiendo en ambos casos a la planta

de los efectos deletéreos de los hongos fitopatógenos.

Las disminuciones en el rendimiento en muchos casos, también son una

consecuencia del desarrollo de resistencia por parte de los patógenos a los agentes

químicos de control tradicionalmente empleados, reduciéndose el efecto de los

agroquímicos y por ende ocasionando la persistencia de estas cepas dentro de los

cultivos. Como resultado de lo anterior se han presentado numerosos brotes

epidemiológicos de impacto económico, como los reportados para el moho gris una

enfermedad ocasionada por Botrytis cinerea, un patógeno de alto riesgo en lo

concerniente al manejo de resistencia, por su capacidad para adaptarse con

(18)

Botrytis cinerea es un hongo necrótrofo y polífago que causa serios daños y

pérdidas en un amplio rango de cultivos de frutales, vegetales y ornamentales en

todo el mundo, genera pérdidas significativas ya que puede infectar y destruir hojas,

tallos, flores y frutos, durante la producción y el almacenamiento. Desencadena un

impacto negativo con repercusiones económicas, tanto por su distribución,

versatilidad como por sus características únicas de patogenicidad dentro del ciclo de

infección, porque es capaz de desarrollar estructuras de penetración especializadas,

así como una matriz extracelular cuya función es la adhesión en la superficie de la

planta, que junto con un amplio espectro de enzimas potencian su ingreso y acción

en el huésped, desencadenando efectos letales para los cultivos. El tomate

(Lycopersicon esculentum Mill.) se ve afectado por varios problemas fitosanitarios

dentro de los que también se encuentra la enfermedad del moho gris causada por

B. cinerea.

Tradicionalmente, el control de B. cinerea se ha realizado a través de aspersiones

químicas, se estima que el mercado de productos anti-Botrytis en los últimos años,

ha alcanzado alrededor de los US $ 15-25 millones. Sin embargo, existe el riesgo de

la aparición y el establecimiento de cepas resistentes de Botrytis sp. a dichos

químicos; creándose la necesidad de buscar otro tipo de estrategias de control del

moho gris, tales como los metabolitos fúngicos que representan una alternativa

natural. Estos beneficios potenciales pueden ser descubiertos mediante procesos de

bioprospección de algunas cepas de hongos filamentosos y de los metabolitos

(19)

1. MARCO TEÓRICO

1.1 LOS MICROORGANISMOS COMO FUENTE DE METABOLITOS DE

INTERÉS.

Biodiversidad Microbiana.

Los microorganismos son una gran fuente de recursos biotecnológicos porque tanto

bacterias como hongos poseen una maquinaría enzimática y una composición

genética y fisiológica diversa, haciéndolos atractivos para la investigación, mediante

programas de búsqueda y exploración. Procesos que han permitido descubrir un

amplio número de especies, distribuidas en la mayoría de ecosistemas terrestres y

acuáticos, así como un potencial de compuestos microbianos. Hawksworth y

Rossman (1987) estiman, que existen al menos 1,5 millones de hongos en nuestro

planeta, donde para ese año, el 10% de la microbiota (100.000 especies) estaba

descrita. Pero, según datos de Selitrennikoff, en 2001, el número ha incrementado a

250,000 especies identificadas, un 25% de la población, lo que significa que aún

queda un 75% de nuevos géneros y biotipos por caracterizar. Sin contar con que, el

número de especies continúa creciendo, especialmente con el hallazgo de los

hongos endofíticos, con aproximadamente 1 millón de especies (Dreyfuss y

Chapela, 1994 citado por Strobel y Daisy, 2003), reflejando la diversidad de este

grupo de organismos asombrosos y extremadamente versátiles, porque además del

incremento en su número, se presume que con cada nueva especie se pueden

encontrar nuevos productos naturales y biomoléculas asociadas (Strobel y Daisy,

2003), de las cuales también es necesaria su identificación.

Demain (1999) reporta que existen 100,000 productos naturales, donde alrededor

(20)

los hongos filamentosos, significando aproximadamente 2,640 sustancias con

propiedades antimicrobianas. El 78% restante, se divide entre los producidos por

bacterias filamentosas (66%) y no filamentosas (12%), confirmando al grupo de los

actinomycetes, especialmente al género Streptomyces, como la principal fuente de

antibióticos a nivel mundial (Strobel y Daisy, 2003).

El número de antibióticos derivados de fuentes fúngicas, pertenece a los más de

3,000 metabolitos producidos por esta microbiota (IBWF, 2005), con diferencias

tanto en sus estructuras químicas y moleculares, como las funciones que realizan,

las cuales no siempre son conocidas (Calvo et al., 2002).

Como se mencionó anteriormente, muchos de los metabolitos descritos se derivan,

de bacterias y hongos filamentosos que son habitantes del suelo (Fravel, 1988).

Encontrándose una marcada influencia del ecosistema, de donde se aísla el

microorganismo, sobre la tasa de producción de sustancias fúngicas, porque en su

microhábitat, el microorganismo desarrolla interacciones benéficas o negativas

(Atlas y Bartha, 2002) que posiblemente pueden resultar en un efecto inductor o

supresor, de la producción de sustancias antibióticas (Fravel, 1988). Investigaciones

realizadas por el IBWF (2005) basadas en el supuesto que los hongos nunca viven

solos, y por tanto se ven influenciados por las relaciones con otros organismos,

demuestran que existe una mutua inducción entre hongos, para la producción de

metabolitos secundarios, especialmente entre hongos que presentan el mismo

hábitat, porque cepas de Penicillium sp. inducen la producción de strobilurina en

Oudemansiella mucida, que a su vez incrementa la síntesis de crisogina en P.

notatum, en comparación a la inoculación de la misma cepa en un medio de cultivo

diseñado para su fermentación. Evidenciándose una diferencia de rendimiento para

aquellas cepas que se cultivan en medios de producción frente a las mismas pero

en condiciones naturales. Este fenómeno también se ha observado para algunos

basidiomycetes, que produjeron compuestos bioactivos, cuando se cultivaron en

medios enriquecidos, bajo condiciones de laboratorio, pero donde el porcentaje de

cepas productoras (50%) no fue comparable a los obtenidos al propiciar el

(21)

producen antibióticos para suprimir el crecimiento de hongos que compiten por

sustrato o espacio (IBWF, 2005).

Este tipo de diferencias observadas al cultivar un microorganismo a escala de

laboratorio frente a las condiciones nativas, comprueba la influencia de los factores

abióticos y bióticos en la gran biodiversidad microbiana, que se ha desarrollado

como respuesta a las características que le proporciona el medio ambiente,

conllevando a la expresión y desarrollo de un sinnúmero de estrategias para poder

conservar su hábitat y nicho, dentro de un determinado ecosistema (Atlas y Bartha,

2002; Fravel, 1988; IBWF, 2005). Motivo por el cual se observan microorganismos

(bacterias y hongos) que pueden vivir en condiciones adversas o extremas, bien sea

de temperatura (-12°C a >110°C), radiación (ionizante, UV, luz visible), presión

(atmosférica, hidrostática, osmótica), salinidad, actividad de agua (0,60-1,00), pH (0,

ácidos y 13, básicos) y potencial redox, entre otros (Atlas y Bartha, 2002).

Todas estas características, también revelan el potencial biotecnológico de la

microbiota en general, porque todos los factores moleculares, enzimáticos,

metabólicos y estructurales, que le confieren resistencia y que suceden en

respuesta al escenario, son deseables para su aprovechamiento en diversos

procesos de interés industrial y económico, por la producción de pigmentos,

enzimas, polímeros, lípidos, ácidos, sales y demás derivados del reservorio

metabólico y bioquímico de los microorganismos.

Bioprospección: Proceso esencial en la investigación biotecnológica.

El conocimiento de la biodiversidad y del potencial de un microorganismo, se define

a través del estudio de sus propiedades fisiológicas, metabólicas y bioquímicas así

como de los diferentes metabolitos sintetizados, lo cual se logra mediante la

realización de pruebas exploratorias para encontrar dentro de grandes poblaciones

(Guarro et al., 1999), aquellos organismos que posean las características

(22)

La bioprospección da a la investigación una línea de tendencia, que puede resultar

en el desarrollo de nuevos productos naturales, de bioplaguicidas, o bien de

fungicidas, dependiendo del caso. Esquema de producción, que según el

Laboratorio de Control Biológico de Corpoica (C.I. Tibaitatá), comprende procesos

biológicos, tecnológicos y legales.

En los procesos biológicos, se concentran las exploraciones primarias, con las

etapas de aislamiento, selección y caracterización de microorganismos o de los

productos de síntesis, perfilando el potencial existente y haciendo de esta fase de la

investigación, el fundamento dentro de la consecución de nuevos productos. Porque

después de descubrir y seleccionar factores de interés, se continúa con los

siguientes procesos tecnológicos para el registro, comercialización y demás etapas

legales del producto.

La bioprospección de metabolitos secundarios de origen microbiano, ha permitido

identificar nuevas moléculas biológicamente activas. Esta práctica ha sido frecuente,

desde el siglo XVIII y el pasado, mediante la exploración de extractos de

fermentación microbiana con actividad antibiótica (Higgs et al., 2001). Desde, las

investigaciones realizadas por científicos visionarios como A. Fleming y S.

Waksman, resultado en el conocimiento de la mayoría de la microbiota actualmente

identificada y en el descubrimiento de algunos metabolitos, que ingresaron en la era

de los antibióticos, con la penicilina (1929) y la estreptomicina (1943), derivada de

Penicillium sp. (Atlas y Bartha, 2002; IBWF, 2005) y Streptomyces sp.

respectivamente, como los primeros metabolitos secundarios utilizados como

medicamentos con aplicaciones clínicas.

Además de las aplicaciones en salud humana, de los metabolitos secundarios

derivados de fuentes microbianas, se ha descubierto el gran potencial, de los

hongos filamentosos y de sus diferentes compuestos de biosíntesis, en diferentes

arenas. Encontrándose que esta microbiota comprende una colección de

microorganismos industrialmente muy importantes, por ser una rica fuente de

metabolitos secundarios (Calvo et al., 2002; Nieminen et al., 2002; Singh et al.,

2000; Thines et al., 2004) y de su prospección resultan grandes posibilidades de

(23)

nuevas enfermedades en humanos, plantas y animales (Strobel y Daisy, 2003),

entre otras implicaciones futuras.

Metabolitos Fúngicos en Medicina.

Antibióticos.

Al explorar un amplio rango de hongos filamentosos, se han encontrado compuestos

orgánicos de bajo peso molecular, que a bajas concentraciones son deletéreos tanto

para el crecimiento como para el desarrollo de actividades metabólicas de otros

microorganismos (Fravel, 1988), los cuales se conocen como agentes

antimicrobianos o antibióticos, que pueden ser utilizados en medicina y salud

humana frente al creciente aumento de nuevas enfermedades microbianas así como

de cepas resistentes a los medicamentos, expresado por una amplia variedad de

bacterias y hongos patógenos.

Encontrándose compuestos con estructuras y modos de acción diversos, como lo

reportado por Singh y colaboradores (2000), durante la selección de extractos de

fermentación fúngica, donde encontraron un nuevo diterpenoide, el

guanacastapeno, con actividad bactericida frente a S. aureus y E. faecium,

resistentes a los fármacos, meticilina y vancomicina, tradicionalmente empleados

para su control. En ese mismo año, Nose y col., aislaron dos nuevos antifúngicos

PF1163A y B, de un caldo de fermentación de Penicillium sp., que mostraron una

potente actividad inhibitoria del crecimiento de Candida albicans, al interferir en la

biosíntesis de ergosterol. Estos resultados son interesantes, porque se podrían

utilizar este tipo de compuestos, para reemplazar los azoles y polienos que

presentan deficiencias en el tratamiento de varias micosis e infecciones sistémicas,

ocasionadas por hongos y levaduras oportunistas, en pacientes inmunodeprimidos;

infectados por el VIH o que han recibido quimioterapia.

Igualmente, el hongo filamentoso Acanthostigmella sp. aislado del jardín botánico de

Nueva York, USA, puede ser utilizado en terapias con estos mismos pacientes,

(24)

CJ-los hongos C. albicans, C. neoformans y A. fumigatus (Watanabe et al., 2001),

patógenos de alto riesgo. Clavariopsis aquatica, un hongo hiphomycete, también

sintetiza compuestos deletéreos, para A. fumigatus y otras especies como A. niger

y C. albicans, conocidos como clavariopsinas A y B, depsipéptidos de carácter

cíclico, encontrados por Kaida y colaboradores (2001).

Otro compuesto que también podría ser empleado, es un nuevo antibiótico

CJ-17,665, derivado de Aspergllus ochraceus (Sugie et al., 2001) que inhibe cepas

bacterianas resistentes, como las mencionadas inicialmente, causantes de serios

problemas de salud pública. Chu y colaboradores en el 2003, también encontraron

dentro de cientos de extractos, dos antibióticos (Sch -484129 y -484130) de

naturaleza glicolipídica y acción frente a cepas de Saccharomyces como de

Aspergillus.

La mayoría de estos nuevos metabolitos tienen estructuras complejas con

propiedades únicas, como queenslandon, una micotoxina de la familia de las

zearalenonas (fórmula C20H26O8, estructura aromática, grupo ceto y éster carbonil,

E-configuración), encontrada dentro del grupo de las naftoquinonas, al que también

pertenece un complejo de tres altersolanoles (A, B, C), todos derivados de

Chrysosporium queenslandicum, un hongo patógeno aislado de una muestra de

suelo colectada en Egipto (Hoshino et al., 2002). Queenslandon, tiene además de

su función lactona, un fuerte espectro de actividad biológica contra bacterias y

hongos patógenos, como M. luteus, B. subtilis, A. alternata, P. chrysogenum, A.

nidulans y P. variotii, entre otros (Hoshino et al., 2002).

FR901469 es otro nuevo antimicrobiano (Fujie et al., 2000) que también presenta

una estructura y función de interés, porque es uno de los 40 miembros de las

lipopeptidolactonas macrocíclicas, con 12 aminoácidos y motilidad

3-hidroxipalmitolil, que interfiere con las enzimas encargadas de la síntesis de 1,3-β -glucanos, los cuales son componentes esenciales de la pared celular de hongos

patógenos de importancia clínica, como C. albicans y Aspergillus sp.. Este espectro

de actividad es ideal, porque no existen enzimas similares en las células de los

mamíferos (Fujie et al., 2000), que puedan ser inhibidas durante los tratamientos

(25)

selectivo y específico dentro de vías metabólicas de los hongos patógenos, es la

Khafrefungina, aislada de un micelio estéril perteneciente a un hongo endofítico.

Porque la Khafrefungina, inhibe la síntesis de esfingolípidos en etapas claves para

su consecución (Mandala et al., 1997).

Hasta el momento, se han relacionado algunos de los antibióticos con espectro de

actividad prospectiva frente a bacterias y hongos patógenos, pero existen dos

inhibidores de proteasa, los ácidos citónicos A y B, aislados de la fermentación en

estado sólido de hongo endofítico Cytonaema sp. que presentan un modo de acción

llamativo, por la inhibición del citomegalovirus humano (Strobel y Daisy, 2003).

De todos los compuestos mencionados, se hace necesario no solo evaluar su

actividad biológica sino la citotóxica o genotóxica (Nieminen et al., 2002; Watanabe

et al., 2001) debido a que, muchos de estos productos se emplearán como fármacos

para humanos. Es así como algunos de ellos están en fase exploratoria, en

laboratorio, para conocer su posible toxicidad (Hoshino et al., 2002), mientras que

otros se encuentran en las últimas etapas dentro del desarrollo de nuevos

productos, como el caso de los lipopéptidos FK 463 y WF 11899A, derivados cepas

de hongos filamentosos que fueron clasificadas dentro de dos grupos, los

Coleomycetes e Hiphomycetes (Hino et al., 2001). Cabe resaltar que, muchas de las

cepas productoras de metabolitos secundarios, con potencial prospectivo

encontradas en procesos de selección, no han sido clasificadas porque se

desconoce su género y especie.

Los antibióticos de la clase de los β-lactámicos, ya han sido comercializados y son un ejemplo destacado para la biotecnología, por su producción industrial por

fermentación, desde hace 50 años, y porque actualmente estos antibióticos,

particularmente penicilinas y cefalosporinas representan en el mundo productos de

importancia biotecnológica con ventas mundiales de alrededor de US$ 15 billones,

aproximadamente el 65% del mercado total de antibióticos en el mundo (Elander,

2003). Muchos de estos antibióticos han sido modificados químicamente mediante

un proceso conocido como semisíntesis, desde 1974 (Demain, 1981).

(26)

materias primas, la mayor parte de industrias se están moviendo hacia el este, con

China, Corea e India como los países más favorecidos (Elander, 2003).

Además de los antibióticos, existen otro tipo de metabolitos fúngicos con actividad

prospectiva en medicina, pero con otros modos de acción diferentes, como los

mencionados a continuación.

Anticancerígenos, Antidiabéticos e Inmunosupresores.

De la revisión realizada por Strobel y Daisy (2003), se puede inferir que muchos de

los metabolitos fúngicos descubiertos son de interés para su aplicación en humanos,

especialmente algunos aislados de hongos endofíticos, porque se han encontrado,

entre otros, compuestos anticancerígenos, como el Paclitaxel (Figura 1) y algunos

de sus derivados, que representan el principal grupo de fármacos de este tipo,

producidos por estos microorganismos, llegando a ventas de billones de dólares a

nivel mundial.

Figura 1. Paclitaxel (Strobel y Daisy, 2003)

Paclitaxel, ha sido aislado de varios hongos endofíticos alrededor del mundo, p. Ej.

T. andreanae y nuevas especies como Seimatoantleriumtepuiense, en Venezuela

(Strobel et al., 1999; Strobel y Daisy, 2003).

Además de los beneficios mencionados, este compuesto ha sido empleado para

tratar otras enfermedades en tejidos humanos y también presenta actividad frente a

(27)

Lee y colaboradores 1996, citado por Strobel y Daisy (2003), aislaron de una cepa

de Pestalotiopsis microspora, el ácido toreyanico una quinona dímerica citotóxica y

selectiva, empleada también como agente anticancerígeno.

En 1999, Zhang y col. encontraron, de una muestra de hongos nativos de selvas del

África (Kinshasa, República democrática del Congo), un metabolito

L-783,281(Figura 2) de Pseudomassaria sp., que actúa de manera similar a la

insulina y por ende, puede utilizarse en nuevas terapias para la diabetes, ya que a

diferencia de la insulina, este compuesto puede ser administrado oralmente porque

no es destruido en el tracto digestivo y además, ha demostrado una reducción de

los niveles de glucosa en la sangre, en ensayos realizados en ratones.

Otro descubrimiento sobresaliente para la medicina, ha sido la ciclosporina, aislada

de Tolypocladium inflatum (Borel y Kis, 1991, citado por Strobel y Daisy, 2003), así

como otros metabolitos fúngicos con modo de acción parecido (IBWF, 2005; Strobel

y Daisy, 2003), que actúan de forma similar a los inmunosupresivos empleados en

la actualidad en pacientes que han sido transplantados, para prevenir el rechazo a

los injertos. Lo cual, abre un amplio espectro, para el desarrollo de nuevos

fármacos, dentro de los que también se pueden contar algunos metabolitos que

presentan, actividad antitumoral (Strobel y Daisy, 2003), acción frente a la

hipercolesterolemia (IBWF, 2005), entre otros.

Figura 2. Estructura del antidiabético L-783,281 aislado de Pseudomassaria sp.

(Zhang et al., 1999. Science)

Metabolitos Fúngicos en Alimentación e Industria.

Los hongos filamentosos también han sido empleados para la elaboración de una

(28)

y celulasas, entre otras, que aceleran diversos procesos industriales. Utilizándose

para la degradación de materiales (p. ej. papel, residuos vegetales, grasas),

obteniéndose productos y subproductos de interés. Beneficios que se derivan de la

versatilidad de los microorganismos para aprovechar los materiales y recursos

existentes en el ambiente.

Descubriéndose, un sinnúmero de enzimas de fuentes fúngicas; amilasas

encontradas en varios cultivos de Aspergillus sp. como la α-amilasa de A. oryzae (Pedersen y Nielsen, 2000); pectinasas (Endo- y Exo- Poligalacturonasas PG) en A.

awamori (Blandino et al., 2002); Celulasas (β- glucosidasas, β−1-4 glucanasas) producidas por varias cepas de Aspergillus, Phoma, Fusarium y Trichoderma (Atlas

y Bartha, 2002), proteasas y lipasas.

La mayoría de estos metabolitos fúngicos son empleados en la industria de

alimentos para la fabricación de bebidas alcohólicas, edulcorantes, jugos, quesos

madurados y en la producción detergentes, enzimas, entre otros.

Además, de las enzimas fúngicas, el ácido cítrico derivado de la fermentación de

Aspergillus niger (Demain, 1981), ha demostrado ser uno de los metabolitos más

importantes en varios alimentos, por su carácter acidulante y conservante.

Metabolitos Fúngicos en Fitoprotección.

Muchos de los metabolitos fúngicos utilizados como agentes de biocontrol de

microorganismos fitopatógenos, presentan diferentes modos de acción específicos o

no específicos, y comprenden tanto agentes líticos, enzimas, compuestos volátiles y

otras sustancias tóxicas, siendo considerados como mecanismos de antibiosis,

según Fravel (1988). A continuación, se enumeran algunos de los metabolitos

fúngicos utilizados en fitoprotección, que han sido agrupados dentro de estos

(29)

Antibióticos

Desde los años 50´s, existen varios reportes (Fravel, 1988) que mencionan la

producción de metabolitos fúngicos para el control de ciertas enfermedades

ocasionadas por fitopatógenos. Como la gliotoxina (Figura 3) (Wright, 1956 citado

por Fravel, 1988) producida por Trichoderma viride (G. virens), para el control de

Pythium, patógeno que induce volcamiento en plantas.

En 1962, Barnett y col. (referido por Fravel, 1988) citan la producción in vitro de un

antibiótico que explica el antagonismo de G. roseum, frente a varios hongos,

relacionándolo como uno de los posibles mecanismos responsables, además del

hiperparasitimo. Otra correlación, pero entre la actividad in vitro y en invernadero,

fue realizada para la quetomina producida por Chaetomium globosum, viéndose una

inhibición del patógeno Venturia inequalis, en ambos modelos de estudio (Cullen y

Andrews, 1984 citado por Fravel, 1988).

Fravel (1988), considera algunas investigaciones realizadas durante la década de

los 80´s, donde se mencionan varios estudios que relacionan el empleo de

diferentes extractos de fermentación fúngica con la inhibición de algunos

fitopatógenos. En 1982 (Papavizas et al.), el extracto del medio de cultivo de

Trichoderma harzianum resultó en una inhibición de la pudrición blanca ocasionada

por S. cepivorum. En 1986, Ricard y Bollen, encontraron una sustancia producida

por Scytalidium sp. que inhibía a Poria carbonica. El año siguiente, Fravel et al.,

aislaron un metabolito del medio de cultivo de Talaromyces flavus, que destruía los

esclerocios de V. dahliae.

Figura 3. Estructura de la Gliotoxina

Wilson y Wisniewski (1994), también exponen una revisión de diversas

(30)

líquidos, principalmente de especies de Trichoderma sp., varios compuestos de

estructura 6-pentil-α-pirona, siendo de este grupo, el 6-amil- α-pirona el más común y potente in vitro e in vivo. Otras especies como T. lignorum y T. viride producen

trichodermina, que inhibe no solo a hongos filamentosos sino también a Candida

albicans.

Otros metabolitos fúngicos derivados de este género, son las koninginas, aisladas

de T. Koningi que produce Koningina A, y de T. harizianum que sintetiza tanto la

Koninginas A y B, así como dos nuevas estructuras butenolidas, estas últimas con

actividad frente a Gaeumannomyces graminis, un patógeno de cereales (Wilson y

Wisniewski, 1994).

Para favorecer el ingreso a la planta, después de la germinación del conidio,

muchos fitopatógenos desarrollan una estructura conocida como apresorio, la cual

también se ha visto afectada por numerosos metabolitos orgánicos, con diferentes

estructuras químicas y modos de acción, dentro de las que se cuentan 4

glisopreninas de carácter lipofílico (Figura 4A) de cultivos de Clonostachys rosea, 6

dímeros derivados de la antraquinona, las Neobulgaronas A-F, con mayor actividad

de la Neobulgarona D (Figura 4B), purificadas del micelio de Neobulgaria pura

(asomycete) (Eilbert et al., 2000). Así como, varios ácidos grasos de longitud de

cadena de 16,18 ó 20 átomos de C, hallados en extractos de micelio de hongos,

viéndose según Eilbert y colaboradores (1999; citado por Thines et al., 2004) una

mejor actividad inhibitoria frente a M. grisea, para aquellos que presentaban

configuración –cis en su instauración, como el ácido palmitoléico, el octadecenico y

el petroselínico (C18, cis-6) principalmente.

Otros compuestos con la misma afinidad por el sitio de acción son Scytalol D (Figura

4C), producido por el hongo anamórfico Scytalidium sp. (Thines et al. 1998) y una

cerulenina obtenida de un aislamiento originalmente llamado Cephalosporium

(31)

Figura 4. (A) Glisoprenina C, la más activa de las 4 glisopreninas de C. rosea,

(B) Neobulgarona D, (C) Scytalol D (Thines et al., 2004).

Algunos metabolitos también han sido aislados de hongos basidiomycetes, puesto

que según el IBWF (2005) la mitad de ellos producen antibióticos, como los

encontrados en el extracto de Resupinatos leightonii, dos sesquiterpenos, el

4-germacradieno-2,6,12-triol y 1,6-farnesadieno-3,10,11-triol, asimismo inhibidores de

M. grisea (Eilbert et al., 2000; Thines et al., 2004).

Strobilurina A, ha sido un ejemplo destacado de metabolitos empleados como

moléculas modelo para el desarrollo de nuevos productos originalmente aislados de

fuentes fúngicas, en este caso de basidiomycetes. Porque según el IBWF (instituto

de investigación en Biotecnología y Drogas) junto con la Universidad de

Kaiserslautern (2005), de Alemania, esta es la clase más importante de fungicidas

utilizados en agricultura, descubiertas por Anke y colaboradores en 1977 de cultivos

líquidos de Strobilurus tenacellus un basidiomycete que crece en los conos de los

pinos.

En 1986 se produjeron los primeros derivados sintéticos que tenían estabilidad

frente a la radiación UV, porque aplicaciones del compuesto natural en campo

demostraron una relativa volatilidad e inestabilidad fotoquímica (Gullino et al. 2000),

además que existían dificultades para producir el compuesto a gran escala. De la

optimización química han resultado varios análogos, especialmente kresoxin-metil,

desarrollada por BASF y comercializada como Stroby®, Brio®, Discus® y Juwel®.

A

C

(32)

Las strobilurinas en el presente, están dentro de los fungicidas más vendidos

alrededor del mundo, siendo usados como protectantes de plantas frente a los más

importantes hongos fitopatógenos. Porque análogos químicos como kresoxin-metil,

azoxystrobina, metominostrobina y trifloxystrobina, tienen un amplio espectro de

actividad ya que, son inhibidores de la respiración fúngica controlando ascomycetes

y basidiomycetes, mildeos (polvoso y velloso) y royas (Gullino et al., 2000),

presentes en hojas, tallos, frutos y espigas principalmente de cebada, trigo, arroz.

Además de su uso para cultivos de cereales, estos fungicidas se emplean para en

otros cultivos para el control de Alternaria, Rhizoctonia solani, Pythium spp.,

Venturia, Botrytis cinerea y Sclerotinia, entre otras enfermedades (Gullino et al.,

2000).

Estos fungicidas del tipo strobilurina son un ejemplo del éxito en la aplicación

comercial de un producto a base de hongos ó de sus metabolitos, evidenciando que

las sustancias naturales pueden ser una importante fuente de agentes antifúngos,

que luego pueden ser desarrollados como productos o bien como moléculas modelo

para la síntesis de nuevos fungicidas selectivos (Gullino et al., 2000; Thines et al.,

2004). Este último autor, además menciona su importancia para el ambiente, porque

se asume que los compuestos naturales, siendo parte del ecosistema, pueden ser

biodegradables, compatibles y menos tóxicos.

Enzimas

Las enzimas son otro tipo de metabolitos fúngicos que median el antagonismo

ejercido por agentes de biocontrol, lo que significa su uso potencial sobre

poblaciones de fitopatógenos y de insectos plaga. Debido a que, las enzimas

pueden degradar las paredes celulares y otros compuestos estructurales, o bien

actuar frente a algunos eventos relacionados con la patogénesis de organismo.

Fravel (1988) menciona dos investigaciones realizadas en 1982 y 1987, por Marois

y colaboradores y Lewis y Papavizas respectivamente, donde encontraron

compuestos que tenían una acción enzimática en fitopatógenos como Sclerotinia y

R. solani, derivados de Talaromyces flavus, Gliocladium virens y especies de

(33)

agroecológica, son las que producen varias especies de este género, como las

chitinasas y B-1,3-glucanasas reportadas por Elad y Kapat (1999) para Trichoderma

harzianum cepa T39.

Además de estas enzimas, De la Cruz y Llobell (1999) y Ait-Lahsen y colaboradores

(2001) indican la producción de B-1,6-glucanasas y proteasas corroborando la

producción de una gran variedad de estos metabolitos que lisan la pared celular, de

micelios y conidios en hongos fitopatógenos, por diferentes aislamientos de

Trichoderma.

Volátiles

Como se mencionó anteriormente, T. harzianum es una fuente de antifúngicos con

diferentes modos de acción, como los metabolitos volátiles reportados por Claydon

et al. (1987, citado por Fravel, 1988) identificados como alquilpironas con acción

fungicida y mayoritariamente fungistática sobre patógenos como R. solani.

Otro microorganismo que produce sustancias volátiles protectoras, es Boletus

varigatus (Krupa y Nyland; 1972 por Fravel, 1988) dentro de las que se incluyen

alcoholes como etanol e isobutanol y ácido isobutírico.

Por lo general los principales compuestos volátiles, pertenecen al grupo de los

alcoholes y de los ácidos, como los compuestos reportados para el hongo endofítico

Muscodor albus, denominado “biofumigante” según Mercier y Jiménez en el 2004,

porque este micelio estéril aislado de una árbol de canela (Cinnnamomum

zeylanicum) en Centro América (Strobel et al., 2001) produce 28 compuestos que

inhiben y destruyen varias especies de hongos, oomycetes y bacterias (Mercier y

Jiménez, 2004).

Este tipo de metabolitos principalmente 2-metil-1-butanol y el ácido isobutírico,

pueden ser empleados para controlar algunas de la enfermedades que se presentan

en postcosecha durante el almacenamiento de los frutos, ocasionadas por Botrytis,

Colletotrichum, Geotrichum, Monilinia, Penicillium y Rhizopus, ya que no se requiere

el contacto del hongo con el fruto o el fitopatógenos para ver un efecto inhibitorio,

(34)

1.1.2 Metodologías empleadas para la bioprospección de metabolitos con

interés en fitoprotección.

Para definir el perfil de un metabolito fúngico, es decir su modo de acción y

aplicabilidad, se hace necesario evaluar su actividad biológica en protocolos que

permitan cuantificar la sensibilidad del fitopatógeno respecto de los compuestos

antifúngicos, lo cual se puede lograr mediante ensayos in vitro e in vivo, en los que

se enfrenta el compuesto con el patógeno.

Bioprospección in vitro.

Bauer y colaboradores (1966, citado por Hadacek y Greger, 2000) implementaron la

metodología in vitro, para la evaluación de la actividad antagónica de los metabolitos

frente a los hongos filamentosos, mediante protocolos de difusión del producto en

cajas de petri que contienen un medio de cultivo (p.ej. Agar Papa Dextrosa –PDA-,

Extracto de Malta), que queda mezclado con el compuesto en una proporción

definida. Para luego, colocar un disco (5-10 mm de diámetro) con desarrollo del

hongo fitopatógeno en el centro de la caja sobre la superficie del medio y evaluar la

inhibición del crecimiento radial respecto del control (Daoubi et al., 2004; Folman et

al., 2004). Una variación de esta metodología, es disponer una suspensión de

esporas (10-20µl) en el centro de la caja (Hadacek y Greger, 2000), o bien, colocar la suspensión (0.5-1ml) distribuida sobre la superficie del medio de cultivo, donde se

colocan discos de papel filtro (3-5 mm de diámetro) impregnados con el metabolito,

para medir el halo de inhibición producido (zonas libres de micelio), después del

tiempo de incubación, tomando como parámetros de aceptación los valores dentro

del rango de 10-20 mm (Dardari et al., 2004; Hadacek y Greger, 2000; Santamarina

et al., 2002; Zhang et al., 2001).

Para evaluar estos compuestos difusibles, también se pueden colocar discos con

crecimiento del hongo (7mm) enfrentados con discos (5mm) inoculados con el

metabolito, conservando una distancia entre ellos de 2,0-2,5 cm, dentro de cajas de

petri con medio de cultivo (Chaurasia et al., 2005), para estimar igualmente el

(35)

Además de estos ensayos de difusión en medio sólido, desde mediados de los 90´s

se desarrollaron protocolos de dilución (microdilución) en medio líquido, en placas

tipo ELISA de 96-pozos, protocolo ampliamente adoptado por autores como

Alemany, 2001; Dardari et al., 2004; Hadacek y Greger, 2000; Hjeljord et al., 2001;

López-García et al., 2002; Meepagala et al., 2003; Pohanka et al., 2004; Salah et al.,

2003; Slawecki et al., 2002; Thines et al., 2004; Wilson et al., 1997; Wedge et al.,

2000 y Zhang et al., 2001, entre otros, para evaluar la susceptibilidad de los

fitopatógenos, a este tipo de compuestos antifúngicos. El formato de placas de

microtitulación es un bioensayo cuantitavo (Roberts y Boyce, 1972 citado por

Hadacek y Greger, 2000) que permite evaluar el modo de acción, al valorar la

inhibición de la adhesión y germinación del conidio, mediante observación directa

por microscopia (Alemany, 2001; Hadacek y Greger, 2000; Hjeljord et al., 2001;

Slawecki et al., 2002), así como la interferencia en el crecimiento del hongo, por

determinación de la absorbancia (Wilson et al., 1997).

Junto con las metodologías mencionadas, existen otros protocolos que buscan

evaluar únicamente una variable, como la inhibición de la germinación, al disponer

en láminas de vidrio un volumen (µl) del compuesto y de la suspensión de esporas del hongo, como lo realizado por Silva y colaboradores (2002) y por Walker y

colaboradores (2001), para evaluar extractos vegetales de Caryocar brasiliense

Camb. y metabolitos de Pseudomonas antimicrobica frente a Botrytis cinerea,

respectivamente.

Otro efecto in vitro que también puede ser cuantificado, es el carácter volátil de los

metabolitos, una variable que ha sido estimada para extractos vegetales y aceites

esenciales en microplacas, al sellar cada pozo con láminas de cera dental para

prevenir la contaminación cruzada (Wilson et al., 1997). Esta variable también

puede ser evaluada en cajas de petri, creando dos áreas con medio de cultivo al

retirar una tira de agar, del centro de la caja, con el fin de inocular a un lado del plato

un microorganismo productor de volátiles (p. Ej. M. albus) y en el otro lado, 7-10

días después, un disco de agar con el hongo fitopatógeno, para ver el efecto sobre

(36)

De todos los ensayos de antagonismo, se puede inferir que la metodología en

microplacas ofrece por una parte, un potencial para una alta eficiencia en el análisis

de 10,000 o más compuestos por semana ya que, se reduce la cantidad de

metabolito y de inóculo necesarias y por otro lado, permite una observación directa

para detectar anomalías morfológicas (Hadacek y Greger, 2000), como inhibición en

la germinación y daño de las hifas, entre otros.

Bioprospección in vivo (in planta).

En los ensayos in vivo principalmente se busca ver el desarrollo de los signos y

síntomas del fitopatógeno estimado como incidencia y severidad de la enfermedad,

evaluando también la inhibición de la germinación o del crecimiento del patógeno,

expresado como la supresión de la enfermedad en la planta.

Conduciendo en muchas ocasiones, a que los parámetros evaluados in vitro puedan

ser o no correlacionados con el biocontrol in vivo, en condiciones similares a la

naturales (Fravel, 1988). Por ejemplo, este autor cita un ensayo realizado por

Richard y Bollen (1986), donde se vio la inhibición de un fitopatógeno frente a una

sustancia microbiana, tanto en ensayos in vitro en agar como in planta, sobre trozos

de madera.

Elad y Kapat, 1999; Fravel, 1988; O´Neill et al., 1997 y Mercier y Jiménez, 2004,

entre otros autores, reportan la aplicación de los extractos fúngicos, sobre hojas o

segmentos de éstas, en tallos, en frutos, o en suelo estéril y en combinación o no

del fitopatógeno para observar la supresión del microorganismo o de estructuras de

resistencia como esclerocios (Fravel, 1988), lo que resulta en la disminución de la

enfermedad. De Meyer y colaboradores (1998) indican que al emplear la totalidad

de la planta, también se puede observar la inhibición de los fitopatógenos, porque

dependiendo del sitio de inoculación se pueden inducir respuestas de defensa en el

(37)

1.1.2.1 Metabolismo secundario: Biosíntesis de productos naturales con

interés en fitoprotección.

Brakhage y colaboradores (2004), estudiaron algunos mecanismos que regulan la

biosíntesis de penicilina en hongos filamentosos, encontrando que la producción de

este metabolito secundario, no es esencial para la directa supervivencia del

organismo productor, indicando que los genes para la biosíntesis son controlados

por una red compleja de regulación; por el pH del ambiente, la fuente de carbono,

nitrógeno, aminoácidos, entre otros elementos, coincidiendo con Calvo y

colaboradores (2002), en que varios aspectos internos y externos, como factores

ambientales y genéticos pueden influenciar la producción de metabolitos

secundarios. Incluyendo en algunos casos, reacciones muy alejadas del

metabolismo energético (Doran, 1998), ya que muchos de estos compuestos no son

esenciales ni para el crecimiento ni como intermediarios del metabolismo básico del

microorganismo, entendiéndose que probablemente juegan algún otro rol en la vida

de los hongos (Turner 1971; Demain, 1981; Guarro et al., 1999).

Cabe resaltar que toda la producción de metabolitos, está enmarcada dentro del

comportamiento cinético del microorganismo, en este caso de los hongos

filamentosos, los cuales experimentan una tendencia diferente que se caracteriza

por tener una primera fase llamada trofofase o de crecimiento, en la cual se

sintetizan los metabolitos primarios y la idiofase donde se producen los metabolitos

secundarios (Demain, 1981; Poutou, 2002). En la trofofase o fase de crecimiento, se

le proporcionan condiciones apropiadas al hongo filamentoso para que crezca de

manera eficaz y es donde el microorganismo produce metabolitos relacionados con

su crecimiento. Para la fase siguiente, la Idiofase, se producen metabolitos

secundarios, esta producción puede no derivarse del sustrato primario de

crecimiento, sino a partir de un producto que él mismo formó, a partir de esa fuente

primaria (Demain, 1981; Poutou, 2002). Sirviendo el metabolismo primario, en las

vías biosintéticas de antibióticos, como un proveedor de precursores y cofactores

para el metabolismo secundario (Gunnarsson et al., 2004) con la consecuente

(38)

En estudios con biorreactores realizados por Saha y colaboradores, 2004, se ha

demostrado que la producción de este tipo de metabolitos, también depende

fuertemente de la escala de operación, donde existe una relación definitiva entre la

concentración de oxígeno disuelto, pH del medio, empleo de glucosa, diferenciación

celular y producción. Ratificando que todas las condiciones del cultivo y de la

fermentación, soportan e influencian la síntesis de metabolitos secundarios (Higgs et

al., 2001).

La morfología fúngica, en algunas ocasiones, es otro parámetro clave dentro de la

producción industrial, porque puede variar durante el proceso de fermentación, ya

que también está influenciada por aspectos como la velocidad de agitación, la tasa

de crecimiento, el oxígeno disuelto, el número de esporas o conidias por litro de

medio de fermentación, aspectos de importancia que deben ser considerados

cuando se quieren altos rendimientos en el proceso (Pazouki et al., 2000).

Además de los diferentes parámetros y condiciones de fermentación, mencionados

anteriormente, cabe resaltar que al interior de las células es donde se evidencia el

impacto de este tipo de factores, lo que desemboca en la consecución del producto

de interés y en el desarrollo de vías metabólicas para tal fin. Una de las rutas

metabólicas de donde se derivan los metabolitos secundarios, es la vía del

shikimato o ácido shikímico (Demain, 1981), porque según Adachi y colaboradores

(2003), la producción y vía salvaje de shikimato, es favorable para la biosíntesis de

muchos antibióticos, herbicidas y aminoácidos aromáticos, porque en esta vía se

sintetiza el corismato, un precursor común de muchos metabolitos aromáticos, tanto

(39)

1.2 IMPORTANCIA DEL TOMATE (Lycopersicon esculentum Mill.).

El Tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) es la principal hortaliza a nivel mundial,

se cultiva en cerca de casi 4,0 millones de hectáreas, con más de 100 millones de

toneladas promedio de producción (FAO 2005). Siendo países como China y

Estados Unidos de América, los principales productores con 30 y 12 millones de

toneladas, respectivamente.

En Colombia, según datos emitidos por la FAO (2005), el cultivo de tomate ocupa un

lugar representativo dentro de los productos básicos del país, en cuanto a

producción e importancia alimenticia. La producción promedio es de 382,438

toneladas, durante los últimos seis años (1999-2004), con una superficie cultivada

promedio para el mismo período de 16.200 hectáreas, siendo para él último año

(2004) de 15.000 Ha. En cuanto a rendimiento, los datos suministrados entre

1999-2003 arrojan un valor medio de 23.502 kg/Ha (2,3 Ton/Ha). Variables que presentan

crecimientos para los últimos dos años. Pero, cuyos resultados son sustancialmente

inferiores, comparados con países como Brasil y Chile, primer y segundo productor

suramericano, que presentan datos de producción de 3,4 y 1,3 millones de

toneladas, frente a las 370,000 toneladas nacionales, lo que significa una diferencia

de 3 millones (Ton), respecto de Brasil y de 930,000 toneladas menos frente a Chile.

Estos datos son un reflejo de la brecha tecnológica existente, que traduce en una

menor productividad. Porque, aunque existe una baja diferencia de área cultivada p.

Ej., entre Colombia y Chile, con 15,000 y 20,000 Ha, este último país, triplica la

producción deduciéndose que realiza un mejor aprovechamiento de los recursos

junto con la introducción de programas de cultivo sostenible.

Cabe resaltar que el cultivo de esta hortaliza presenta una gran variedad de

enfermedades, que minan su producción, de las cuales Colombia no es una

excepción.

1.2.1 Principales Patologías del Tomate.

(40)

nemátodos; virus, como el mosaico del tomate; bacteriosis, Pseudomonas syringae,

y hongos filamentosos, dentro de los que se consideran, al moho gris (Botrytis

cinerea), mildeo polvoso y velloso, moho blanco (S. sclerotiorum), Alternaria sp.,

Fusarium oxysporum f sp.lycopersici y Verticillium dahliae (Infoagro, 2004), como los

más representativos, por su incidencia sobre todas las partes de la planta lo cual,

conduce a la reducción en el rendimiento porque se limita el desarrollo de la planta,

entre otros efectos. Estas enfermedades, concuerdan con lo reportado Bareño

(citado por Moreno, 2003) quien relaciona la presencia en el país, de algunos de

estos problemas fitosanitarios del ambiente foliar, tanto en época seca como

húmeda. Para el primer período algunos son causados por la mosca blanca, el

pasador de fruto, el gusano cogollero y Oidium sp., y en tiempo húmedo son

Phytophthora infestans, Alternaria solani, Fulvia fulva, bacteriosis, mildeo velloso y

Botrytis cinerea los factores restrictivos.

Por estas y otras patologías microbianas que afectan al tomate, se ha creado la

necesidad de buscar e implementar nuevas alternativas de control que aumenten la

productividad del cultivo, además de minimizar el uso indiscriminado de productos

químicos (Infoagro, 2004) a los que se expone esta hortaliza, surgiendo nuevas

estrategias que pueden ser implementadas dentro de un Manejo Integrado de las

Plagas (MIP) que afectan al tomate. Diseñadas también, en respuesta a la

resistencia que adquieren algunos de los patógenos. El Laboratorio de Control

Biológico, de Corpoica C.I, Tibaitatá, ha encaminado algunos de sus proyectos de

investigación, en la búsqueda de alternativas de manejo, en pre y postcosecha del

tomate, derivadas de fuentes microbianas que disminuyan algunos problemas de

importancia hortícola, como los ocasionados por Botrytis cinerea un fitopatógeno

frecuente del ambiente de invernadero.

1.3. MOHO GRIS: Botrytis cinerea.

1.3.1 Generalidades del Agente Etiológico del Moho Gris.

Botrytis cinerea es un hongo polífago que causa serios daños y pérdidas en un

(41)

atacando prácticamente plantas de todas las especies hortícolas, frutícolas y

florícolas (Kerssies, 1993; De la Isla, 1994; Malolepsza, 2004), durante la

producción y el almacenamiento (Malolepsza, 2004) en la pre- y poscosecha

(Morandi et al., 2000, 2001).

El moho gris causado por Botrytis cinerea es probablemente una de las

enfermedades de vegetales, ornamentales, frutales y cultivos de campo, más

comunes y ampliamente distribuidas a lo largo del mundo (Ben-Shalom et al., 2003;

Barka et al. 2002; Elad, 1996), generando un impacto negativo con repercusiones

económicas, tanto por su distribución como por la capacidad de infectar las hojas,

los tallos, las flores y los frutos (O´Neill et al., 1997). Ocasionando la enfermedad

conocida como Moho o podredumbre gris, que durante epidemias severas puede

destruir la totalidad del follaje (Elad et al., 1999), porque el patógeno ocasiona una

propagación de lesiones necróticas en hojas (Morandi et al., 2001).

B. cinerea se disemina por el aire, se comporta como saprófito mientras encuentra

las condiciones favorables para infectar el hospedero y convertirse en patógeno

(Avila, 1993). Esta habilidad de desarrollarse como saprófito es esencial pues le

permite incrementar su inóculo sin recursos de sostenimiento derivados de la

patogénesis de las células del huésped (Blakeman, 1993 citado por Moreno, 2003).

1.3.2 Características Microscópicas y Macroscópicas de Botrytis cinerea. Botrytis cinerea Pers ex Fr, es el hongo más importante de las especies de Botrytis

(Daoubi et al., 2004), siendo un hongo Deuteromycete (Hyphomycete) (Tabla1), es

el estado imperfecto de Botryotinia fuckeliana (su teleomorfo) (De Meyer et al.,

1998) (Ellis y Waller, 1974 citado por Kerssies, 1993).

Microscópicamente B. cinerea, presenta los extremos de las hifas ramificados, al

comienzo de su formación se ven hialinas, con el tiempo se tornan pardas o negras

(Piñeros et al., 1998). La célula terminal de cada ramificación tiene forma de ampolla

a partir de la cual se forma en un dentículo una conidia hialina, esférica o elipsoide y

Figure

Figura 1. Paclitaxel (Strobel y Daisy, 2003)

Figura 1.

Paclitaxel Strobel y Daisy 2003 . View in document p.26
Figura 3. Estructura de la Gliotoxina

Figura 3.

Estructura de la Gliotoxina . View in document p.29
Tabla 2. Morfoespecies recuperadas de los tubos de agar.

Tabla 2.

Morfoespecies recuperadas de los tubos de agar . View in document p.62
Figura 5. Fotografías macroscópicas de las morfoespecies 226(a), 1(b), 134(c), 80(d),  149(e), 167(f), 62(g), 96(h), 113(i), 31(j), 152(k), 143(l) provenientes de los suelos 1, 2 y 3

Figura 5.

Fotograf as macrosc picas de las morfoespecies 226 a 1 b 134 c 80 d 149 e 167 f 62 g 96 h 113 i 31 j 152 k 143 l provenientes de los suelos 1 2 y 3. View in document p.63
Figura 6. Fotografías macroscópicas de las morfoespecies 112(a), 197(b), 212(c), 27(d),  150(e), 228(f), 217(g), 153(h), provenientes de los suelos 1, 2 y 3

Figura 6.

Fotograf as macrosc picas de las morfoespecies 112 a 197 b 212 c 27 d 150 e 228 f 217 g 153 h provenientes de los suelos 1 2 y 3. View in document p.64
Tabla 3. Morfoespecies recuperadas de los viales en aceite.

Tabla 3.

Morfoespecies recuperadas de los viales en aceite . View in document p.65
Figura 7. Fotografías microscópicas 40X de las morfoespecies 17(a), 18(b), 2(c), 213(d), 205(e), 28(f), 36(g),  151(h), 112(i), 23(j), 62(k)

Figura 7.

Fotograf as microsc picas 40X de las morfoespecies 17 a 18 b 2 c 213 d 205 e 28 f 36 g 151 h 112 i 23 j 62 k . View in document p.66
Figura 8. Algunos extractos producidos en Czapeck-Dox y YMG, pertenecientes a las morfoespecies 1(a), 83(b), 213(c), 150(d), 139(e), 115(f)

Figura 8.

Algunos extractos producidos en Czapeck Dox y YMG pertenecientes a las morfoespecies 1 a 83 b 213 c 150 d 139 e 115 f . View in document p.67
Tabla 5. Características de los extractos fúngicos extracelulares (EFE) producidos en el medio Czapeck-Dox y YMG, durante 8 días, provenientes de las morfoespecies del Suelo 2

Tabla 5.

Caracter sticas de los extractos f ngicos extracelulares EFE producidos en el medio Czapeck Dox y YMG durante 8 d as provenientes de las morfoespecies del Suelo 2. View in document p.71
Figura 9.  Agrupamiento del efecto inhibitorio de la germinación de B. cinerea producida por

Figura 9.

Agrupamiento del efecto inhibitorio de la germinaci n de B cinerea producida por . View in document p.73
Figura 10.  Agrupamiento del efecto inhibitorio de la germinación de B. cinerea producida por

Figura 10.

Agrupamiento del efecto inhibitorio de la germinaci n de B cinerea producida por . View in document p.74
Figura 11. Tubos germinales cortos de los tratamientos con los extractos 88(a), 176(b) producidas en Czapeck-Dox y 136(c) producida en YMG, correspondientes a las morfoespecies 100, 48 y 169, en relación con el control (d)

Figura 11.

Tubos germinales cortos de los tratamientos con los extractos 88 a 176 b producidas en Czapeck Dox y 136 c producida en YMG correspondientes a las morfoespecies 100 48 y 169 en relaci n con el control d . View in document p.77
Figura 13. Tubos germinales secundarios y terciarios de B. cinereaextractos 167 (a) producido en el medio YMG,  84 (b) y 40 (c) producidos en Czapeck-Dox, , producidos por los en relación con el control (d)

Figura 13.

Tubos germinales secundarios y terciarios de B cinereaextractos 167 a producido en el medio YMG 84 b y 40 c producidos en Czapeck Dox producidos por los en relaci n con el control d . View in document p.78
Figura 14. Análisis de agrupamiento del efecto inhibitorio (>60% I) de los extractos EFE producidos en el medio Czapeck-Dox (CD) de acuerdo con el análisis de Grupos Homogéneos (Programa STATGRAPHICS versión 4,2)

Figura 14.

An lisis de agrupamiento del efecto inhibitorio 60 I de los extractos EFE producidos en el medio Czapeck Dox CD de acuerdo con el an lisis de Grupos Homog neos Programa STATGRAPHICS versi n 4 2 . View in document p.80
Figura 15. Análisis de agrupamiento del efecto inhibitorio (>59% I) de los extractos EFE producidos en el medio YMG de acuerdo con el análisis de Grupos homogéneos (Programa STATGRAPHICS versión 4,2)

Figura 15.

An lisis de agrupamiento del efecto inhibitorio 59 I de los extractos EFE producidos en el medio YMG de acuerdo con el an lisis de Grupos homog neos Programa STATGRAPHICS versi n 4 2 . View in document p.81
Figura 17. Efecto de los extractos fúngicos 49 (a), 56 (b), 66 (c) y 158 (d) sobre la inhibición de la germinación de conidios de horas de incubación (26 +/- 2 °C)

Figura 17.

Efecto de los extractos f ngicos 49 a 56 b 66 c y 158 d sobre la inhibici n de la germinaci n de conidios de horas de incubaci n 26 2 C . View in document p.85
Figura 18. Morfoespecies de (a) Penicillium sp., (b)Beauveria sp., (c)Aspergillus sp. y (d)Phialophora sp., cepas productoras de los extractos 49, 56, 66 y 158, respectivamente, del grupo de inhibición alta

Figura 18.

Morfoespecies de a Penicillium sp b Beauveria sp c Aspergillus sp y d Phialophora sp cepas productoras de los extractos 49 56 66 y 158 respectivamente del grupo de inhibici n alta. View in document p.86
Figura 19. Curva de calibración para Botrytis cinerea, Concentración vs. Delta de densidad

Figura 19.

Curva de calibraci n para Botrytis cinerea Concentraci n vs Delta de densidad . View in document p.89
Tabla 11. Extractos fúngicos extracelulares producidos en el medio             Czapeck-Dox, empleados para la correlación entre el porcentaje de germinación para B

Tabla 11.

Extractos f ngicos extracelulares producidos en el medio Czapeck Dox empleados para la correlaci n entre el porcentaje de germinaci n para B. View in document p.92
Figura 21. Modelo de calibración lineal entre las variables delta de densidad óptica (405 nm)

Figura 21.

Modelo de calibraci n lineal entre las variables delta de densidad ptica 405 nm . View in document p.93
Figura 21. Modelo de calibración lineal entre las variables delta de densidad óptica (405 nm)  y % de germinación de los extractos fúngicos producidos en el medio Czapeck-Dox, p<0.01

Figura 21.

Modelo de calibraci n lineal entre las variables delta de densidad ptica 405 nm y de germinaci n de los extractos f ngicos producidos en el medio Czapeck Dox p 0 01. View in document p.93
Tabla 12. Extractos fúngicos extracelulares producidos en el medio YMG, empleados para la correlación entre el porcentaje de germinación para               B

Tabla 12.

Extractos f ngicos extracelulares producidos en el medio YMG empleados para la correlaci n entre el porcentaje de germinaci n para B. View in document p.94
Figura 26. Fitotoxicidad sobre los foliolos de tomate en presencia del extracto 49 (a y b)

Figura 26.

Fitotoxicidad sobre los foliolos de tomate en presencia del extracto 49 a y b . View in document p.101
Figura 25. Fitotoxicidad sobre los foliolos de tomate en presencia del extracto 49 (a y b) después de los primeros 8 días de inoculación en relación con el control no tratado (c)

Figura 25.

Fitotoxicidad sobre los foliolos de tomate en presencia del extracto 49 a y b despu s de los primeros 8 d as de inoculaci n en relaci n con el control no tratado c . View in document p.101
Figura 27. Progreso del moho gris sobre los foliolos 8(a), 11(b), 13(c) y 19(d) días después

Figura 27.

Progreso del moho gris sobre los foliolos 8 a 11 b 13 c y 19 d d as despu s . View in document p.102
Figura 27. Progreso del moho gris sobre los foliolos 8(a), 11(b), 13(c) y 19(d) días después de la inoculación

Figura 27.

Progreso del moho gris sobre los foliolos 8 a 11 b 13 c y 19 d d as despu s de la inoculaci n. View in document p.102
Figura 29. Porcentaje de incidencia del moho gris, a los 19 d después de la inoculación          B

Figura 29.

Porcentaje de incidencia del moho gris a los 19 d despu s de la inoculaci n B. View in document p.103
Figura 31. Progreso de la severidad de la enfermedad moho gris en los foliolos de Tomate,

Figura 31.

Progreso de la severidad de la enfermedad moho gris en los foliolos de Tomate . View in document p.104
Figura 32. Porcentaje de severidad de la enfermedad moho gris, a los 19 d después de la inoculación de B

Figura 32.

Porcentaje de severidad de la enfermedad moho gris a los 19 d despu s de la inoculaci n de B. View in document p.105
Figura 33. Beauveria sp. cepa 223, productora del extracto 56. Fuente: El Autor.

Figura 33.

Beauveria sp cepa 223 productora del extracto 56 Fuente El Autor . View in document p.107

Referencias

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