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Marcadores moleculares de secuencias simples repetidas en la caracterización de Lolium perenne, Lolium multiflorum, Lolium hybridum, y Dactylis glomerata

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Academic year: 2017

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(1)

COLEGIO DE POSTGRADUADOS

INSTITUCION DE ENSEÑANZA E INVESTIGACIÓN EN CIENCIAS AGRÍCOLAS

CAMPUS MONTECILLO

POSTGRADO DE RECURSOS GENÉTICOS Y PRODUCTIVIDAD GANADERÍA

MARCADORES MOLECULARES DE SECUENCIAS SIMPLES

REPETIDAS EN LA CARACTERIZACIÓN DE Lolium perenne, Lolium

multiflorum, Lolium hybridum y Dactylis glomerata.

CINTHIA JIMENA AGUIRRE ROBERT

T E S I S

PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL

PARA OBTENER EL GRADO DE:

(2)
(3)

MARCADORES MOLECULARES DE SECUENCIAS SIMPLES REPETIDAS EN LA CARACTERIZACIÓN DE Lolium perenne, Lolium multiflorum, Lolium hybridum y

Dactylis glomerata

Cinthia Jimena Aguirre Robert, M. en C. Colegio de Postgraduados, 2009

(4)

SIMPLE SEQUENCE REPEATS MARKERS ON THE CARACTERIZATION OF Lolium perenne, Lolium multiflorum, Lolium hybridum and Dactylis glomerata

Cinthia Jimena Aguirre Robert, M. en C. Colegio de Postgraduados, 2009

In Central Highland Valleys of México there has been an increase in Lolium, Festuca, Dactylis and Vicia cropping, which are the grass genera better adapted to the region, but their disadvantage is their limited genetic resources to continue genetic improvement of the species. Therefore, the objective of this study was to carry out an agronomic and molecular evaluation of eight Lolium accesions : Ansyl France (AF), New Zealand (NZ), Uruguay (U), Netherland Barenza (NB), USA Manhattan II (UMII), Canada Uri (4n) (CU4n), Australia Wimmera 62 (AW62) and France Itaque (FI); and

three Dactylis: Canada Hércules (CH), USA Potomac (UP) and USA Napier (UN).

Population structure and genetic similarity among accesions were determined by 13 SSR-loci, and the association between loci and morphological traits was estimated. It was found that Ansyl France (AF) surpassed for plant height, dry weight, leaf dry weight, and stem weight per plant; CU4n for percentage of leaf and stem; UP for percentage of dead material and dry weight of dead material per plant; and UMII for number of stems. Of the 13 SSR-loci, 59 alleles were identified (4.5 alleles per locus). Based on Nei’s genetic distances, the group analysis UPGMA showed an integration of three groups: per species (D. glomerata), per ploidy level (L. hybridum and L. perenne) and per genus (Lolium), which indicates that SSRs discriminate the genotypes per species, ploidy level and genus. The relationship between genetic distances of the 13 SSR-loci and the morphological characters, estimated by biplots of partial mean squares (PMS), indicated that SSR-loci expressed up to 14.3% of phenotypic variation of morphological traits among accessions (r2<0.143). It may be concluded that morphological traits and genetic distances from SSR-loci may be used for discriminating forage grasses, selecting genotypes with the best characteristics in order to establish a breeding program, based on genetic and phenotypic characters.

(5)

AGRADECIMIENTOS

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por la beca otorgada.

Al Consejo Mexiquense de Ciencia y Tecnología (COMECyT) por la beca otorgada.

Al Colegio de Postgraduados por brindarme la oportunidad de realizar la Maestría.

Al Grupo Produce Estado de México S.A. de C.V. Proyecto folio 13-2006-0963. "Producción de forraje verde para ganado bovino en invierno"

Al Programa universitario de investigación en Biotecnología Agrícola, proyecto folio 09220268. Determinación de genes asociados a polímeros fenólicos de maíz (Zea Mays L.) para el mejoramiento genético de gramíneas forrajeras.

Al Dr. Omar Hernández Mendo por sus valiosas aportaciones en la realización de la tesis, por su tiempo, comprensión y paciencia.

Al Dr. Baldomero Alarcón Zúñiga por dirigir el trabajo de investigación y por sus valiosas e importantes contribuciones en el mismo.

Al Dr. Sergio S. González Muñoz por el apoyo brindado en la elaboración y mejora de la tesis, por sus consejos, paciencia y comprensión.

Al Dr. Juan A. Burgueño Ferreira por brindarme su tiempo y por sus atinadas sugerencias en el escrito.

A la Dra. Ma. Rosario Venegas Ordoñez, gracias por el apoyo, enseñanzas y experiencias transmitidas durante mi estancia en el laboratorio.

Al Dr. Carlos Antonio Apodaca Sarabia por el apoyo incondicional y desinteresado que siempre me brindó para despejar mis dudas.

A todos los profesores que han contribuido en mi formación no sólo profesional, sino humana.

A los compañeros del Laboratorio de Genética Molecular y Microbiología de la UACH, por sus atenciones, apoyo y compañía.

Al personal administrativo del Colegio de Postgraduados, en especial a Celsa, Lupita, Anita, Lucy, Griselda y Jacinto, por el apoyo en la realización de los trámites, por tener siempre una sonrisa y una palabra de aliento.

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DEDICATORIA

A Dios porque siempre ha estado a mi lado paciente y compasivo, observando y guiando cada uno de mis pasos. Creo en Dios y en la Ciencia y estoy convencida que juntos hacen un gran equipo.

A mi hijo Leonardo por ser un guerrero, por estar conmigo a pesar de mis ausencias. Te amo, eres lo mejor de mi vida, nunca te rindas, mantente siempre fuerte porque eres un ser humano, inteligente, maravilloso y muy valiente.

A mis padres, Sr. Guillermo y Sra. Petronila porque son mi gran ejemplo de vida, no tengo palabras para agradecer todo el apoyo y amor que siempre me han brindado; gracias por estar a mi lado. Los amo, respeto y admiro.

A mis hermanos: Yari, Dayi, Kati, Cori y Lan, porque no han sabido hacer otra cosa más que apoyarme, gracias por su palabras de aliento cuando el cielo se tornaba gris, por creer en mi. Sé que no soy muy expresiva pero quiero que sepan que los amo, que sin ustedes no lo hubiera logrado; me siento muy orgullosa de ustedes. Beto, espero que la vida nos dé una oportunidad para conciliar nuestras diferencias; a pesar de todo te quiero hermano.

A mis sobrinos: Chucho, Vicko, Arturito, Astricha, Ale, Vicka, Fati, Audri y Yaretzi (patito-patito-patito) porque con su inocencia me estimulan a ser mejor cada día.

Para ti, que eres parte importante de mi vida porque siempre me has apoyado, me has dejado ser libre, sin olvidar mis valores e ideales, te agradezco sinceramente la paciencia, comprensión y el cariño que me has manifestado. Te admiro por la entrega y amor que tienes por tu trabajo. Ojalá la vida nos diera la oportunidad que hemos buscado. Te quiero Arturo, gracias por todo. Somos uno, jamás lo olvides.

A mis compañeros y amigos del Colegio, ya que compartimos un objetivo en común: la superación. Gracias Juan Manuel, Lorena, Dulce, Kike y Paulino.

A mis amigos de vida: Octavio, Rosa, Yanet (la negra), Ocaña (el gordo), Gil, Marisol, Lili, Lulú, Linda, Maciel, Ramón, Santillan, porque nuevamente compartieron conmigo penas y alegrías y me hicieron más grata la espera en este proceso.

A la familia González Mendoza: Sr. Sergio González Muñoz y Sra. Alba Mendoza Ahumada, por permitirnos entrar en su vida, en su hogar. Les agradezco sinceramente las muestras de cariño que han tenido para Leo y para mí. Gracias por su invaluable amistad; quiero que sepan que aprendimos mucho de ustedes; son un gran ejemplo de amor y lucha. Son seres humanos extraordinarios. Jamás los olvidaremos, siempre están en nuestra mente y corazón. Dios los bendiga; los queremos mucho.

A la familia Santiago Fabián por hacernos sentir parte de su familia, gracias por solidarizarse conmigo y no permitir que el sueño me venciera en esos momentos de trabajo intenso. Gracias Tere y Raúl.

A la familia Domínguez Salcedo (Don Pepe, Doña Carmen, Carmen y Pepe Luis) por el apoyo, consejos, amistad y por el cariño a Leo.

(7)

CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN GENERAL ..1

2. OBJETIVOS...2

3. HIPÓTESIS 3

4. REVISIÓN DE LITERATURA .3

4.1 Descripción de géneros .4

4.1.1 El género Lolium ..4

4.1.2 El género Dactylis 5

4.2 Mejoramiento genético en gramíneas forrajeras ...7

4.3 Marcadores moleculares 9

4.3.1 Marcadores moleculares bioquímicos 10

4.3.2 Marcadores moleculares de ADN ...10

4.3.2.1 Técnicas basadas en la hibridación de ADN .11

4.3.2.2 Técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) .11

4.4 Características de los marcadores moleculares de secuencias simples repetidas (SSRs) o microsatélites ...14

4.5 Aplicación de los marcadores moleculares en gramíneas 14

4.5.1 Desarrollo y construcción de mapas genéticos 15

(8)

Estudio 1. Evaluación de componentes morfológicos de Lolium perenne, Lolium multiflorum, Lolium hybridum y Dactylis glomerata.

1. Introducción .17

2. Materiales y métodos .19

2.1 Material genético experimental ..19

2.2 Variables de respuesta 21

2.2.1 Componentes de hoja, tallo y material muerto .21

2.2.2 Altura y número de tallos .22

2.3. Análisis estadístico ..22

3. Resultados y discusión ..23

3.1 Porcentaje de hoja (PH) y tallo (PT) ..24

3.2 Porcentaje de material muerto (PMM) ..27

3.3. Relación hoja:tallo (RHT) ...28

3.4 Peso seco total (PST), peso seco de tallo (PST), peso seco de hoja por planta (PSHP) y tallo(PSTP) .30

3.5. Peso seco de material muerto por planta (PSMMP) .33

3.6 Altura de la planta (Alt) y número de tallos por planta (NTa) 34

3.7 Interpretación del análisis de varianza ..36

(9)

Estudio 2. Caracterización molecular de Lolium perenne, Lolium multiflorum, Lolium hybridum y Dactylis glomerata.

1. Introducción .39

2. Materiales y métodos .40

2.1 Material experimental ...40

2.2 Extracción de ADN, selección de iniciadores y condiciones de PCR ..42

2.3 Organización de datos y análisis estadísticos .44

3. Resultados y discusión ..45

4. Conclusiones ...51

Estudio 3. Relación entre marcadores moleculares y caracteres fenotípicos. 1. Introducción .52

2. Materiales y métodos .54

2.1 Caracterización de componentes morfológicos ..54

2.2 Caracterización molecular de los genotipos .55

2.3 Análisis estadístico ...55

3. Resultados y discusión ..56

4. Conclusiones ...62

(10)

ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Lista de 42 cultivares, origen, pedigree, número de réplicas y año de liberación incluidos en la prueba de madurez temprana, media y tardía de pasto ovillo ..6

Cuadro 2. Comparación de los marcadores moleculares de ADN más comúnmente utilizados ...13

Cuadro 3. Descripción de las accesiones incluidas en el experimento. El número de accesión correspondiente al registro asignado por el banco de germoplasma del GRIN- USDA-ARS, Washington, EE.UU. ...20

Cuadro 4. Fecha de corte y días transcurridos entre corte .21 Cuadro 5. Análisis de varianza .37 Cuadro 6. Descripción de accesiones empleados de L. perenne, L. multiflorum, L.

hybridum y D. glomerata 41

Cuadro 7. Características de los iniciadores seleccionados para la caracterización del material genético experimental .43

(11)

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Porcentaje de hoja (PH) ...26

Figura 2. Porcentaje de tallo (PT) 27

Figura 3. Porcentaje de material muerto (PMM) ...28

Figura 4. Relación hoja:tallo (RHT) .30

Figura 5. Peso seco de la planta (PSP) ..31

Figura 6. Peso seco de tallo (PST) ..32

Figura 7. Peso seco de hoja por planta (PSHP) 32

Figura 8. Peso seco de tallo por planta (PSTP) 33

Figura 9. Peso seco de material muerto por planta (PSMMP) 34

Figura 10. Altura de las plantas (Alt) ...35

Figura 11 Número de tallos (NTa) ...36

Figura 12. Dendograma de 11 genotipos correspondientes a D. glomerata, L. hybridum L. perenne, L. multiflorum ..49

Figura 13. Biplot de MCP enriquecido con 59 alelos y 11 variables fenotípicas en la estación de otoño 57

Figura 14. Biplot de MCP es enriquecido con 59 a lelos y 11 variables fenotípicas en la estación de invierno ....58

Figura 15. Biplot de MCP es enriquecido con 59 alelos y 11 variables fenotípicas en la estación de primavera 59

(12)

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Figura 1. Temperatura máxima, media y mínima (°C) mensual, de octubre de 2007 a septiembre de 2008 en Chapingo, México

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