Evaluación de las características operativas de tres protocolos de Elisa indirecta para la detección de anticuerpos antibrucella abortus en bovinos de Colombia

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(1)EVALUACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS OPERATIVAS DE TRES PROTOCOLOS DE ELISA INDIRECTA PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTIBRUCELLA ABORTUS EN BOVINOS DE COLOMBIA.

(2) EVALUACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS OPERATIVAS DE TRES PROTOCOLOS DE ELISA INDIRECTA PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTIBRUCELLA ABORTUS EN BOVINOS DE COLOMBIA. Fabiola del Pilar Rodríguez Arévalo MV, Sp. Tesis presentada a la Facultad de Medicina como requisito parcial para optar al Grado de Maestría en Epidemiologia Clínica Pontificia Universidad Javeriana Mayo , 2014.

(3) COMITÉ DE TRABAJO DE GRADO. Dr. Carlos Gómez Restrepo. MSc. Director de Departamento, Profesor Asociado.. Dr. Álvaro Ruiz. MSc. Profesor titular de Medicina Interna y Epidemiología Clínica.. Dr. Martín Alonso Rondón Sepúlveda. MSc. Profesor Asociado..

(4) TABLA DE CONTENIDO 1.. Introducción ....................................................................................................................... 1. 2.. Marco Teórico .................................................................................................................... 5 2.1.. Generalidades ...................................................................................................................... 5. 2.2.. Etiología .............................................................................................................................. 6. 2.3.. Brucelosis en humanos:....................................................................................................... 6. 2.4.. Medidas de precisión en pruebas diagnósticas .................................................................. 18. 2.4.1.. Sensibilidad y Especificidad ......................................................................................... 18. 2.4.2.. Curva ROC .................................................................................................................... 20. 2.4.3.. Área Bajo la Curva ROC (AUC)................................................................................... 22. 3.. Objetivos e Hipótesis ....................................................................................................... 24 3.1.. Objetivo principal ............................................................................................................. 24. 3.2.. Objetivos específicos ........................................................................................................ 24. 3.3.. Hipótesis de trabajo ........................................................................................................... 25. 4.. Métodos............................................................................................................................ 26 4.1.. Tipo de Estudio ................................................................................................................. 26. 4.2.. Diseño del estudio ......................................................................................................... 26. 4.3.. Diseño de lectura ........................................................................................................... 27.

(5) 4.4.. Justificación ...................................................................................................................... 27. 4.5.. Población fuente de las muestras ...................................................................................... 28. 4.6.. Criterios de selección ........................................................................................................ 28. 4.6.1.. Criterios de Inclusión .................................................................................................... 28. 4.6.2.. Criterios de Exclusión ................................................................................................... 29. 4.7.. Definición de puntos de corte para el estudio ............................................................... 29. 4.8.. Cálculo del tamaño de la muestra ..................................................................................... 29. 4.9.. Diseño del muestreo ...................................................................................................... 31. 4.10.. Instrumentos, observadores y métodos empleados para medir las variables ................ 33. 4.11.. Control de sesgos .......................................................................................................... 33. 4.12.. Análisis estadístico ........................................................................................................ 34. 4.12.1.. Identificación, caracterización y tratamiento de resultados dudosos o no interpretables. 34. 4.12.2.. Determinar la precisión del test con cada uno de los protocolos ................................. 35. 4.12.3.. Contraste de las áreas bajo la curva ROC. .................................................................. 35. 5.. Resultados ........................................................................................................................ 36 5.1.. Sensibilidad, especificidad y valores predictivos .............................................................. 37. 5.2.. Determinación de la capacidad discriminativa del test para cada uno de los protocolos de. trabajo............................................................................................................................................ 38 5.3.. Contraste de las áreas bajo la curva ROC (AUC). .......................................................... 40.

(6) 5.4.. Cálculo de la probabilidad pos prueba ante un resultado positivo para dos diferentes. puntos de corte .............................................................................................................................. 45 6.. Discusión de resultados .................................................................................................... 47. Referencias Bibliográficas ........................................................................................................... 54.

(7) LISTA DE TABLAS Tabla 1. Población bovina y prevalencia de brucelosis según circuitos pecuarios, 2012................ 13 Tabla 2 Cálculo del tamaño de muestra para área bajo la curva ROC .............................................. 30. Tabla 3 Cálculo del tamaño de muestra para comparación de curvas ROC ..................................... 30 Tabla 4 Enumeración y definición de las variables del estudio ........................................................ 32 Tabla 5. Sensibilidad, especificidad y valores predictivos de la prueba con el protocolo de Bionote, Svanova 1:25, In house Svanova 1:200 y dos diferentes puntos de corte. ........................................ 37. Tabla 6. Áreas bajo la curva ROC .................................................................................................... 41 Tabla 7. Comparación de AUC de la prueba con el protocolo de Bionote y con el protocolo In house Svanova 1:200 ........................................................................................................................ 43 Tabla 8. Comparación de AUC del test calculadas con el protocolo de Svanova 1:25 y con el protocolo In house Svanova 1:200 .................................................................................................... 44 Tabla 9. Probabilidad de enfermar si la prueba es positiva frente a diferentes prevalencias de hato o probabilidad preprueba ..................................................................................................................... 45.

(8) LISTA DE FIGURAS. Ilustración 1. Curva ROC de un test diagnóstico y línea de no discriminación. ......................... 21 Ilustración 2. Curva ROC del test con el protocolo de Bionote. . ............................................. 39 Ilustración 3. Curva ROC del test con el protocolo de Svanova 1:25. . ...................................... 39 Ilustración 4. Curva ROC del test con el protocolo In house Svanova 1:200. ........................... 40 Ilustración 5. Curvas ROC del test con los diferentes protocolos de trabajo. ............................. 41 Ilustración 6. Curvas ROC del test con el protocolo de Bionote y con el protocolo In house Svanova 1:200 .............................................................................................................................. 42 Ilustración 7. Curvas ROC del test con el protocolo de trabajo In house Svanova 1:200 y con el protocolo de Svanova 1:25 ........................................................................................................... 43.

(9) RESUMEN. El objetivo del estudio fue estimar las características operativas de la prueba ELISA indirecta para la detección de anticuerpos anti Brucella abortus en bovinos de Colombia con tres protocolos: Svanova (en dilución del suero de trabajo 1:25, incubar * 10 minutos a temperatura ambiente 18-25º C), protocolo In house Svanova (dilución del suero de trabajo 1:200 incubar a 37º C * una hora según condiciones de estandarización y validación Mariño y colaboradores 1992, 1998) y Bionote (dilución 1:50, incubar * 15minutos a temperatura ambiente). Los kits comerciales de ELISA indirecta de Svanova y de Bionote se encuentran registrados y traen su propio protocolo de trabajo; sin embargo, el Laboratorio Nacional de Diagnóstico Veterinario trabaja el kit de Svanova de acuerdo al protocolo desarrollado en el laboratorio (In house).. La muestra fue seleccionada en forma retrospectiva del banco de sueros de diagnóstico serológico de brucelosis de 2013 de propiedad del Laboratorio Nacional de diagnóstico veterinario del Instituto Colombiano Agropecuario (ICA). Se seleccionaron sueros de bovinos > 24 meses de edad no hemolizados y con cantidad suficiente para correr las pruebas.. Los protocolos de ELISA indirecta se corrieron por un analista de laboratorio en forma independiente del investigador y de cada uno de los otros protocolos, y los resultados se.

(10) sometieron a los procedimientos del sistema de gestión de la calidad del ICA bajo la norma ISO 17025 “Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración” 2005-10-26 “lo que evita intereses particulares”.. Las características operativas de la prueba para cada uno de los protocolos se estimaron en Stata 12 a partir de los valores de densidad óptica de las pruebas. Como Patrón de Oro se utilizó la prueba de ELISA competitiva.. Se realizaron los cálculos de sensibilidad, especificidad, valores predictivos y probabilidad pos prueba de enfermedad ante un resultado positivo de la prueba, para los puntos de corte que se utilizan en forma rutinaria para el diagnóstico.. Para mejorar la información obtenida y controlar la influencia de la prevalencia en la distribución de los sueros originales, se realizaron cálculos con diferentes probabilidades pre prueba para los valores predictivos.. Se revisaron los puntos de corte establecidos y se hicieron evaluaciones en busca de las mejores características operativas al modificar los puntos de corte..

(11) Para cada uno de los protocolos de ELISA indirecta se elaboraron curvas ROC, se calcularon las áreas bajo la curva y se hicieron comparaciones de curvas para establecer los mejores parámetros en capacidad discriminativa.. Se encontraron diferencias en la capacidad discriminativa del test (Áreas bajo la curva ROC) de la prueba cuando se trabaja con el protocolo In house Svanova 1:200 comparado con el protocolo de Svanova 1:25.. No se pudo establecer diferencias en la capacidad discriminativa del test (Áreas bajo la curva ROC) cuando se trabajó con el protocolo de Bionote y comparado con el protocolo In house Svanova 1:200 aunque se encontraron diferencias en sensibilidad, especificidad y valores predictivos.. La revisión de los puntos de corte establecidos por el programa para cada uno de los kits evidenció la necesidad de modificar el punto de corte en el protocolo In house Svanova 1:200 con el objetivo de incrementar la sensibilidad y la especificidad.. El protocolo del trabajo fue estudiado y aprobado por el Comité de Ética e Investigación del. Hospital Universitario San Ignacio; se ciñó a las recomendaciones éticas para. investigación, no requirió consentimiento informado y respetó la confidencialidad del origen de las muestras..

(12) Palabras claves: Accuracy, Receiver Operating Characteristic analysis, Brucella abortus Enzyme linked inmunosorbent Assay..

(13) ABSTRACT. The aim of the study was to estimate the operative characteristics of indirect ELISA for detecting antibodies anti brucella abortus in bovine Colombia with three protocols: Svanova (working serum dilution 1:25, * 10 minute incubation temperature 25 - 18° C or room temperature), in house protocol Svanova (working serum dilution 1:200 incubate at 37 ° C * for one hour following standardization and validation conditions established by Mariño et al 1992, 1998) and Bionote (1:50 working serum dilution, incubated 15min at room temperature). Kits for indirect ELISA developed by Svanova and Bionote are registered and have their own working protocols; however the National Veterinary Diagnostic Laboratory works with the Svanova kit using a self-developed protocol (In house protocol).. The sample was selected retrospectively from the 2013 diagnosis serological bank of brucellosis owned by the National Veterinary Diagnostic Laboratory. Serum bovine from > 24 months of age and without hemolysis in enough quantity to run the selected tests.. Indirect ELISA protocols were run independently from each other and from the researcher by a laboratory analyst. The results were submitted to the ICA quality management system.

(14) procedures under ISO 17025 "General requirements for the competence of laboratories of testing and calibration" 2005-10-26 "to avoid particular interests".. The operating characteristics of the test for each of the protocols were estimated in Stata 12 from optical density values of the tests. As Gold standard competitive ELISA test was use.. Sensitivity, specificity, predictive values and posttest probabilities of disease were calculated against a positive test result for cutoff points that are routinely used for the diagnosis.. To improve the obtained information and to control de influence of the prevalence in the original serum distribution, calculations with different pretest probabilities for the predictive values were performed.. Established cut points were reviewed, and evaluations were made in order to find the best possible operative characteristics by modifying the cut points.. For each of the indirect ELISA protocols ROC curves were made, the areas under the ROC curves were calculated and the ROC curves were compared to establish their discriminative ability..

(15) Differences in discriminative ability of the test (areas under the ROC curve) in house protocol Svanova 1:200 dilutions to the Svanova 1:25 dilutions were found.. When working with the protocol Bionote and when working with in house protocol Svanova 1:200 dilution, differences in the discriminative ability of the test (areas under the ROC curve) failed to be established, although differences were found in sensitivity, specificity and predictive values.. The review of the cutoff points set by the program for each of the kits evidenced the need to modify the cutoff in the in house protocol Svanova 1:200 dilutions in order to increase its sensitivity and specificity.. The working protocol was studied and approved by the Ethics and research committee from the University Hospital San Ignacio. The protocol used followed the Ethics recommendations for research, it didn’t need informed consent, and it respected the origin confidentiality of the samples..

(16) AGRADECIMIENTOS. A mis maestros Al Lara, a la Catalindia, al Monaco y a la Princesa por ser el motor de mi existencia..

(17) 1. Introducción. La brucelosis bovina es una enfermedad bacteriana cuyo agente etiológico, Brucella abortus produce a nivel mundial pérdidas económicas significativas en las explotaciones pecuarias. Se transmite en forma vertical u horizontal. Provoca aborto e infertilidad en sus huéspedes naturales, las vacas. Además afecta a otras especies domésticas y animales salvajes que a su vez pueden ser reservorios de la enfermedad para otras especies animales y para el ser humano, por lo que la brucelosis se considera una importante zoonosis (2-5).. Al humano puede llegarle por contacto directo con los animales infectados, con sus secreciones o por el consumo de leche y subproductos lácteos no pasteurizados. Por su potencial zoonótico en Colombia es una enfermedad de interés nacional, su ocurrencia en bovinos es de declaración obligatoria y se encuentra sujeta a un programa oficial de control y erradicación a cargo del Instituto Colombiano Agropecuario (ICA), reglamentado mediante la resolución ICA 1332 del 2013.. En la mayoría de los países el programa de control sanitario en bovinos se basa en tres etapas: uso de diferentes protocolos de vacunación con cepa 19 de B. abortus para reducir la prevalencia de la enfermedad, identificación de reactores positivos y eliminación de esos reactores..

(18) Como la vacuna es antigénicamente muy similar a la cepa de campo, el diagnóstico serológico mediante ELISA indirecta no permite diferenciar los animales infectados naturalmente de los animales vacunados, por lo que se han desarrollado pruebas diagnósticas más específicas, como la ELISA competitiva, que sí permite discriminar los reactores positivos, que tienen anticuerpos residuales en respuesta a la vacunación de los reactores por infección de campo(6).. El programa dispone de la técnica de ELISA indirecta como prueba tamiz para la detección de anticuerpos anti B. abortus(7) en bovinos naturalmente infectados, y de la técnica de ELISA competitiva como prueba confirmatoria. El esquema de diagnóstico serológico de la enfermedad en bovinos incluye las dos pruebas corridas en serie. Como regla de decisión los resultados positivos en ELISA indirecta determinan que se corra ELISA competitiva, para diferenciar los anticuerpos de origen vacunal de aquellos por infección. La ELISA competitiva es una prueba de uso oficial y se realiza solo en laboratorios de la red de diagnóstico veterinario del ICA.. Los resultados de la prueba tamiz o ELISA indirecta se obtienen en forma sistematizada. A partir de las lecturas en unidades de densidad óptica (DO) se calcula el porcentaje de positividad (PP) del promedio de cada muestra con respecto al promedio del control positivo de referencia y se define el estatus de la muestra en función del punto de corte previamente establecido sobre la base de la población negativa (2).. 2.

(19) Los resultados de la prueba confirmatoria o ELISA competitiva se obtienen de la misma forma a partir del software de los lectores de ELISA y a partir de las lecturas de DO se calcula el porcentaje de inhibición (PI).. El uso de este tipo de pruebas para el diagnóstico en brucelosis se remonta a la década del 90, cuando el Centro de investigación en salud animal (CEISA), hoy Laboratorio Nacional de Diagnóstico Veterinario (LNDV), participó internacionalmente en la estandarización y validación primaria de la ELISA indirecta In house (desarrollado por los investigadores del laboratorio) y de la ELISA competitiva para la detección de anticuerpos anti B. abortus en bovinos naturalmente infectados. La ELISA indirecta In house fue validada para la dilución en sueros de trabajo 1:200 con sensibilidad diagnóstica de 94.8% y especificidad de 96.0%.. Cuando la casa comercial Svanova de Suecia adquirió las patentes de los kits de ELISA en brucelosis, validó el uso comercial de la ELISA indirecta con un conjugado monoclonal en presentación liofilizado y sueros de trabajo en dilución 1:25. A finales de la década del 90, la casa comercial Bionote registró ante el ICA un kit de ELISA indirecta con un conjugado monoclonal de similar especificidad con dilución lista para su uso y con validación en dilución 1:50 para el suero de trabajo. Estas diluciones trajeron consigo un aparente aumento de la sensibilidad diagnóstica para la detección de sueros débilmente positivos y. 3.

(20) por lo tanto un aumento de reactores falsos positivos que deben ser confirmados por ELISA Competitiva.. Por lo anterior, los responsables del diagnóstico oficial, teniendo en cuenta tanto los criterios originales aplicados en la estandarización y validación primaria internacional como el efecto de la campaña y los programas de control y vacunación sobre la prevalencia de la enfermedad en el país, verifican en cada lote de producción de los kits de la casa comercial Svanova el comportamiento de los sueros controles del kit y de sueros de referencia primaria internacional en la dilución 1:200 validada, contra la concentración de conjugado correspondiente al mismo lote.. Como aún no se ha estimado como se afectó la precisión diagnóstica con la modificación realizada al protocolo de estandarización de la prueba en la que participó el país, ni se ha realizado un estudio de las características operativas de la ELISA indirecta con los diferentes protocolos y bajo las condiciones actuales de la enfermedad en el país, este trabajo pretende dar respuesta a la siguiente incógnita:. ¿Hay diferencia en la capacidad discriminativa del test de ELISA indirecta trabajado con los protocolos de Svanova dilución 1:25, In house Svanova dilución 1:200 y Bionote dilución 1:50?. 4.

(21) 2. Marco Teórico. 2.1. Generalidades. La brucelosis es una enfermedad zoonótica de origen bacteriano transmitida a las personas a partir de animales infectados o de animales que actúan como reservorios. También es conocida como fiebre de Malta, fiebre Rock, fiebre Gibraltar, fiebre Cyprus, fiebre mediterránea, enfermedad de Bang’s, fiebre tifo intermitente o fiebre tifo malaria.. Aproximadamente 500.000 casos de brucelosis en humanos son reportados anualmente en el mundo (8). Ha sido reportada en el Mediterráneo, en la India, en México, en algunas áreas de África, en países de Centro y de Sur América (8) y está asociada con exposición doméstica u ocupacional con animales infectados o con sus productos. La infección es causada por contacto directo, consumo de productos o inhalación en forma de aerosol; por lo tanto, veterinarios granjeros, trabajadores de plantas de proceso de productos lácteos y cárnicos tienen mayor riesgo de exposición a la bacteria, aunque la transmisión de persona a persona es muy rara (9).. 5.

(22) 2.2. Etiología. El agente etiológico de la Brucella es un cocobacilo Gram negativo, intracelular facultativo que puede infectar muchas especies de mamíferos. Se han reconocido diez especies separadas en dos grupos con énfasis en el huésped preferencial, fenotipo y genotipo. El primer grupo incluye a B. abortus (biovars 1,2,3,4,5,6,7,9) responsables de la brucelosis bovina y del mal de la cruz en equinos, B. melitensis (biovars 1,2,3) aislada de ovejas y cabras que afecta pequeños rumiantes y a humanos, B. suis (biovars 1,2,3) afecta porcinos, biovar 4 afecta renos, biovar 5 afecta pequeños roedores, B. ovis afecta las ovejas produciendo la epididimitis contagiosa de los carneros, B. canis afecta a los caninos y B. neotomate específica de los roedores del desierto (10). El segundo grupo incluye a las especies de brucelas descritas recientemente como B. ceti que afecta los mamíferos marinos, B. inopinata aislada de un implante mamario (11) pero se desconoce que especies puede afectar (10), B. pinnipedialis aislada de focas y B. microti aislada de topos y de zorros.. 2.3. Brucelosis en humanos:. En humanos se han identificado cuatro especies de brucella que causan enfermedad localizada o sistémica: B. melitensis, B. abortus, B. suis y B. canis. La mayoría de las personas afectadas reportan signos clínicos inespecíficos como mialgias en 47% de los pacientes (12), fiebre en 78% de los casos, por lo que es un signo clínico importante en el diagnóstico diferencial de malaria en áreas endémicas, dolor de espalda en 45% de los 6.

(23) pacientes (12), artralgias; 65% reportan debilitamiento (12) o sudoración nocturna y la enfermedad puede evolucionar hacia la cronicidad, pero raramente es fatal (5).. Ron-Román en 2013 reportó un caso de epidídimoorquitis causada por B. abortus biovar 1 en un inseminador expuesto a fluidos corporales de abortos de vacas infectadas (5). Como casos fatales y complicaciones en áreas endémicas a B. melitensis se reporta meningitis como una manifestación potencial de neurobrucelosis (13) en 4% de los pacientes afectados (12); también hay reportes de endocarditis (14), hallazgos postmorten de abscesos multifocales y la presencia de nódulos en hígado, pulmón y pleura como complicaciones de hepatitis crónica por B. abortus biotipo 1(8) son algunas de las manifestaciones clínicas reportadas en la literatura por brucelosis.. El riesgo zoonótico de transmisión de B. canis es alto para las personas que laboran en las perreras o están expuestos a animales infectados en clínicas veterinarias. Según los reportes argentinos, debe incluirse en la población de riesgo a las personas inmunodeficientes, niños o mujeres embarazadas (15).. En Colombia, el grupo de zoonosis de la Subdirección de Vigilancia y Control Público en el informe final del 2009 sobre brucelosis humana, concluye que los estudios realizados para determinar la prevalencia de la enfermedad son esporádicos y se han limitado a personal de alto riesgo, como trabajadores de las plantas de beneficio. No se conoce el comportamiento del evento en Colombia, no se cuenta con datos como línea de base que permitan conocer prevalencias e incidencias, existe un subdiagnóstico y escasa notificación 7.

(24) de casos por desconocimiento de la enfermedad en los médicos, desconocimiento de factores asociados a factores de riesgo y desconocimiento de costumbres de la población en general (16).. En humanos, el examen clínico se caracteriza por el hallazgo de hepatomegalia y una elevación inespecífica de la aminotransferasa en suero. Histológicamente es común identificar una granulomatosis hepática no especifica que retorna a la normalidad sin dejar secuelas significativas cuando el paciente es tratado (8).. En la actualidad, el diagnóstico de la enfermedad en humanos se basa en el aislamiento de la bacteria a partir de muestras clínicas seguido de pruebas microbiológicas en tubo, pruebas serológicas para detección de anticuerpos anti brucella y en pruebas moleculares para detección del DNA de la bacteria.. La seroaglutinación (rosa de bengala) es considerada el método de tamizaje ideal, y los positivos son confirmados por test serológicos más específicos. Cuando los resultados por seroaglutinación no son concluyentes debe utilizarse el test de Coombs (10). En casos crónicos y en convalecientes se usa el test de ELISA, ya que esta técnica es más sensible para detectar anticuerpos IgG.. Independientemente del estadio de la enfermedad, la técnica de PCR es más sensible que el cultivo y más especifica que los test serológicos, aunque un resultado positivo también debe ser confirmado por otra PCR diferencial para confirmar identificación y diferenciación de especies de Brucella (10). 8.

(25) La detección molecular de ADN de la bacteria puede ser un signo de brucelosis aguda o crónica pero también puede ser detectado en sujetos asintomáticos con historia de brucelosis. Lo anterior es un fenómeno que se podría explicar por la supervivencia y la persistencia de la bacteria en los macrófagos y la sensibilidad del método capaz de detectar microorganismos fagocitados no viables. Posteriormente una PCR cuantitativa en tiempo real podría diferenciar una infección pasada de una activa y dilucidar el misterio de la persistencia de ADN de la bacteria en pacientes.. Los aislamientos se realizan a partir de muestras de sangre, médula ósea, tejidos y fluidos corporales como la orina. El asilamiento depende del estadio de la enfermedad (aguda o crónica), del tratamiento previo con antibióticos, de una adecuada muestra clínica y de los métodos de cultivo utilizados. La bacteremia generalmente se produce en estadíos tempranos de la enfermedad y en fase febril, y la prueba puede alcanzar sensibilidades de 80 a 90%, en contraste con los casos crónicos en los que sólo alcanza sensibilidades de 30 a 70%.. Las muestras de médula ósea proveen mejor sensibilidad que las muestras de sangre en cualquier estadio de la enfermedad, en pacientes tratados o en pacientes con fuerte sospecha de brucelosis clínica. En contraste con el cultivo, las pruebas serológicas son rápidas, seguras y más sensibles pero solo pueden demostrar en forma indirecta la infección por Brucella.. 9.

(26) Los títulos de aglutinación ≥ 1:160 o un aumento de cuatro veces los títulos en suero al seguimiento, son indicadores de infección activa, sin embargo, pueden ser detectados aún meses o años después de la infección aguda, a pesar de éxito terapéutico y de hemocultivos negativos.. En regiones endémicas puede haber títulos de anticuerpos persistentes debido a la exposición permanente a la bacteria, por lo que es esencial determinar en individuos sanos los puntos de corte antes de hacer un estudio de prevalencia, ya que la detección de anticuerpos sin signos y síntomas clínicos o antecedentes de exposición es muy cuestionada.. La serología puede ser negativa en estados tempranos de la enfermedad, por lo que se debe repetir el examen una o dos semanas después de la sospecha clínica. En la primera semana se eleva la IgM, en la segunda semana predomina la IgG y después los títulos de ambos subtipos se elevan continuamente llegando a un pico hacia la cuarta semana. Si el paciente es tratado con antibióticos hay un rápido descenso en el título de anticuerpos pero si el tratamiento fracasa persisten los títulos de IgG. En las recaídas se elevan los IgG y los IgA pero no los IgM (10). En los países no endémicos el diagnóstico de brucelosis debe basarse en cuatro criterios: la presentación clínica, la estadía en una región endémica, el consumo de leche cruda o productos cárnicos y los hallazgos de laboratorio. En regiones endémicas el diagnóstico se debe basar en dos criterios: la presentación clínica y los hallazgos de laboratorio (10).. 10.

(27) Para los test serológicos en humanos no existe un antígeno de referencia estandarizado. Generalmente el diagnóstico serológico clásico se realiza a partir de extractos de células enteras que contienen grandes cantidades de lipopolisacáridos lisos S-LPS y como la respuesta inmune humoral durante la infección es mediada principalmente por anticuerpos dirigidos contra estos polisacáridos, los test detectan de forma fiable anticuerpos aglutinantes, pero con el inconveniente de la existencia de reactividad cruzada con otras bacterias, lo que hace que la especificidad de estas pruebas pueda ser baja, debido a que el epítope inmunodominante del polisacárido O de la Brucella es semejante a los epítopes de Yersinia enterocolitica O:9, Salmonella urbana grupo N, Vibrio cholerae, Francisella tularensis, Escherichia coli O57, subtipo kaufman y Stenotrophomonas maltophilia.. En general se produce una reacción cruzada con todas las bacterias Gram negativas que tengan polisacáridos tipo O en el LPS. Por el contrario el antígeno S-LPS no es compartido por todas las brucellas, lo que explica que la brucelosis canina no puede ser diagnosticada mediante métodos serológicos estándar (10).. La prueba confirmatoria de ELISA Competitiva para el diagnóstico de brucelosis humana en Bogotá está autorizada para ser llevada a cabo, entre otros, por el LNDV. Entre 1996 y 2004 reportó haber procesado 5.363 muestras de suero humano de las cuales 12% fueron positivas a B. abortus. En 2006 y 2007 el Instituto de Medicina Tropical de Medellín analizó 18 sueros de pacientes para B. abortus, de las cuales cinco fueron positivos y tratados. Durante el año 2008 el LNDV reportó el análisis de 1.206 sueros (66% en hombres y 34% en mujeres) y fueron identificados como reactores positivos 60,4% de las muestras de los hombres y 40% de las muestras de las mujeres mediante Rosa de bengala, 11.

(28) ELISA indirecta y ELISA Competitiva. El Laboratorio de Salud Pública del departamento de Magdalena desde 2005 hasta 2008 diagnosticó 52 casos de brucelosis humana, mediante la prueba de ELISA Competitiva. En 2009 Colombia no reporta la presencia de B. mellitensis (16), enfermedad catalogada como exótica en el país.. La brucelosis bovina se manifiesta con aborto tardío después del tercer trimestre de gestación ocasionado por una placentitis necrótica y con mastitis intersticial en hembras preñadas; los fetos abortados presentan pleuritis fibrinosa con neumonía intersticial. El Programa nacional de prevención y control de la brucelosis bovina, con perspectivas a su erradicación de Colombia informó que en 2009 se certificó la primera zona libre de brucelosis bovina en Colombia integrada por la provincia de García Rovira y el municipio de Santa Bárbara en Santander. En 2010 se logró la certificación de la segunda zona libre de brucelosis en el país, correspondiente al cañón de Anaime en el municipio de Cajamarca, Tolima y se avanzó en los muestreos de San Andrés y Providencia y la Zona Norte de Boyacá.. En 2011, se certificaron como libres de brucelosis la zona Norte de Boyacá y el Municipio de Coveñas en el Departamento de Sucre. En total, fueron certificadas 9.666 fincas como libres de la enfermedad, con mayor participación de los departamentos de Antioquia, Nariño y Cundinamarca, zonas donde se concentran las cuencas lecheras del país. Así mismo se resalta la certificación en departamentos que nunca se habían certificado, como Choco y Guaviare.. 12.

(29) En 2012, la Dirección Técnica de Sanidad Animal del ICA reportó la prevalencia de brucelosis en bovinos por circuito de ferias ganaderas así: Tabla 1. Población bovina y prevalencia de brucelosis según circuitos pecuarios, 2012. Circuitos pecuarios. Población 2013. Prevalencia. Antioquia Eje Cafetero. 2.531.371. 3,65. Costa Atlántica. 9.964.294. 4,82. Cundiboyacense. 1.912.284. 4,95. Llanos Orientales. 5.629.859. 6,40. Sur occidente. 3.274.044. 4,31. Amazonia. 20.916. 0,00. San Andrés y Providencia. 1.000. 0,00. TOTAL. 23.333.768. 4,74. Para este año, la certificación de fincas libres de brucelosis alcanzó las 6.047, 55% de ellas del departamento de Antioquia (3.339), seguido por Cundinamarca con 20% (1.231) y Nariño con 6,5% (391).. Otros estudios de seroprevalencia en bovinos se han realizado en el país pero son publicaciones no indexadas. Jaime y colaboradores, en su estudio sobre prevalencia de brucelosis bovina, equina y humana en el departamento de Caldas en 2008, encontró una prevalencia en humanos de 0,14% y en bovinos de 0,6% (0,3-0,9%) con una prevalencia 13.

(30) en hatos de 4,2%. Tique et al en 2009, establecieron la prevalencia de brucelosis en bovinos en 3,71% y en hatos de 12,7%.. En 2012, Agudelo et al en Antioquia establecieron que la seroprevalencia de brucelosis canina en once comunas de Medellín fue de 2,8%, y aumentaba a 7,5% cuando la vivienda era compartida con otros animales.. El diagnóstico clínico de la brucelosis en animales se dificulta por la escasez de signos clínicos característicos; por lo tanto, la información epidemiológica que lo soporta frecuentemente no está disponible. El cultivo bacteriológico confirma la presencia de la enfermedad pero la probabilidad de obtener un cultivo positivo de muestras que proceden de un animal infectado es baja, es un procedimiento costoso y el riesgo de infección está presente para el analista, lo que lo hace inapropiado como técnica de cribaje (17).. La serología es el pilar que soporta el diagnóstico de la brucelosis porque la muestra es muy accesible, los test son relativamente baratos, son sensibles y han demostrado ser eficientes en los programas de erradicación; sin embargo, el costo del compromiso de sangrar los animales continuamente y la necesidad de apoyo sostenido de los Servicios Oficiales de Sanidad Animal (SOSA), hace que en muchas ocasiones se fracase en los programas de erradicación de la enfermedad (17).. 14.

(31) En bovinos la capacidad operativa de la ELISA indirecta para detección de anticuerpos ha sido evaluada en múltiples ocasiones. Esta técnica ofrece ventajas sobre otras debido a que no necesita que el suero problema sea inactivado o sea sometido a tratamiento previo con 2mercaptoetanol (18), lo que facilita su uso en campañas sanitarias de erradicación de la enfermedad en bovinos.. Colombia tiene registrados y disponibles para diagnostico oficial dos kits comerciales de ELISA indirecta de dos diferentes casas comerciales. El kit aniGen B. Brucella Ab ELISA 2.0 Bionote es un análisis inmunoabsorbente indirecto ligado a enzima para la detección cualitativa de anticuerpos contra B. abortus en plasma, suero o leche. Contiene una micro placa precubierta con antígeno de Brucella, de tal forma que si hay presencia de anticuerpos en el suero problema, se ligan a los antígenos en el pozo y el conjugado que se agrega posteriormente forma un complejo con los anticuerpos de la bacteria. El material no ligado se extrae por aspiración y lavado y luego se adiciona una solución de sustrato. La actividad enzimática residual que queda en el pozo es directamente proporcional a la concentración de anticuerpos antibrucella en las muestras. La lectura colorimétrica se efectúa usando un espectrofotómetro a 450 nm con una longitud de onda de referencia a 620 nm. Los resultados del test se dan en Porcentaje de Positividad (PP) así:. 15.

(32) Los resultados se interpretan según el punto de corte establecido para Colombia así:. Suero Positivo: PP ≥30 Suero Negativo: PP < 30 (19). El kit ELISA indirecta de marca Svanova es un análisis inmunoenzimático indirecto en fase sólida. Las muestras son expuestas a un antígeno tipo polisacárido (s LPS) de Brucella no infeccioso que recubre la microplaca. Si los anticuerpos están presentes en el suero se unen al antígeno. Al adicionar el conjugado antiinmunoglobulina G1 (IgG1) forma un complejo con los anticuerpos específicos anti-SLPS de la bacteria. Los materiales que no se unen durante las reacciones son removidos por medio de ciclos de lavado antes de la adición de la solución al sustrato. La conversión del sustrato por el conjugado se evidencia por una reacción de color que puede ser medida en longitud de onda de 450nm e interpretada como positiva o negativa de acuerdo con puntos de corte epidemiológicamente establecidos (20). Todos los valores de DO de las muestras y controles negativos se relacionan con el valor de DO del control positivo y se expresan en porcentaje de positividad PP que se calcula de la siguiente forma:. Y se interpreta de la siguiente manera: PP < 40 Suero Negativo PP ≥40 Suero Positivo 16.

(33) En Colombia se trabaja en dilución 1:200 y los resultados se interpretan según el punto de corte establecido así: PP< 30 Suero Negativo PP≥30 Suero Positivo. El kit Brucella (Brucella-Ab C-ELISA) Svanova es un análisis inmunoabsorbente competitivo para la detección de anticuerpos séricos contra B. abortus y B. melitensis tanto en especies domésticas como en especies salvajes. En bovinos y bufalinos es capaz de diferenciar entre animales infectados y animales vacunados con cepa 19 a la edad reglamentaria. Se basa en un análisis inmunoenzimático competitivo en fase sólida en el que los sueros problema son expuestos al lipopolisacárido liso (S-LPS) de la B. abortus que se encuentra recubriendo las microplacas en forma simultánea con un anticuerpo monoclonal de ratón (mAb) o competidor, el cual es altamente especifico por la cadena O del S-LPS presente en una combinación distinta en las bacterias patógenas. Si el suero proviene de un animal infectado tiene anticuerpos que compiten por los epítopes con el anticuerpo monoclonal por al antígeno presente en la placa, inhibiendo la unión del competidor al polisacárido O del S-LPS y por lo tanto no se desarrolla color. En ausencia de anticuerpos por infección en el suero problema el anticuerpo monoclonal se une a la cadena O (epítope antigénico) del S-LPS, reacción que se evidencia por el desarrollo de color al final del procedimiento. Los anticuerpos séricos de animales vacunados con cepa 19 no compiten con el anticuerpo monoclonal debido a las diferencias en el reconocimiento del epítope vacunal, a su conformación, a la baja especificidad y baja afinidad lo que. 17.

(34) conduce a una reacción negativa. En caso de muestras tomadas antes de seis meses post vacunación o vacunación no reglamentaria con cepa 19 pueden dar falsos positivos.. Los resultados del test de ELISA Competitiva se expresan en porcentaje de Inhibición PI que se calcula de la siguiente manera:. El estatus de la muestra se determina según el punto de corte establecido para Colombia así: PI <45% Suero Negativo PI ≥ 45% Suero Positivo (21).. 2.4. Medidas de precisión en pruebas diagnósticas. 2.4.1. Sensibilidad y Especificidad. Como medidas de precisión en test diagnósticos se tienen la sensibilidad (Se) y la especificidad (Sp). La Se es la habilidad del test para detectar la condición cuando está presente, la Sp es la habilidad del test para excluir la condición cuando está ausente.. 18.

(35) Las características operativas de un test de diagnóstico de ELISA indirecta para brucelosis se estudian a partir de un valor de DO y posterior cálculo de los PP. Se establece un punto de corte, en el que los "positivos" son valores mayores o iguales al punto de corte, y "negativos", valores menores que el punto de corte. Al contrastar los resultados de DO y su posterior PP por ELISA indirecta con los resultados de un estándar de oro que para el diagnóstico de brucelosis es la ELISA Competitiva, surgen entonces cuatro posibles alternativas diagnósticas:. 1. Animales que tienen brucelosis según el estándar de oro, y cuya medición de DO y posterior cálculo de PP los diagnostica como "positivos". Estos animales son verdaderos positivos (VP).. 2. Animales que tienen brucelosis según el estándar de oro, sin embargo, su medición de DO y posterior cálculo de PP los diagnostica como "negativos". Estos animales son falsos negativos (FN).. 3. Animales que no tiene brucelosis según el estándar de oro, y cuya medición de DO y posterior cálculo de los PP se diagnostica como "negativos". Estos animales reciben el nombre de verdaderos negativos (VN).. 4. Animales que no tienen brucelosis según el estándar de oro, sin embargo, su medición de DO y posterior cálculo de PP los diagnostica como "positivos". Estos animales reciben el nombre de falsos positivos (FP).. 19.

(36) Conociendo el número de animales en cada una de las anteriores alternativas diagnósticas se procede al cálculo de la Se y de la especificidad Sp para el punto de corte que les origina aplicando las siguientes fórmulas:. La Se y la Sp son estimadores de parámetros poblacionales por lo que cada uno tiene asociado un error de estimación, entonces se deben reportar sus respectivos intervalos de confianza. Existen tantos puntos de corte posibles como valores posee su escala de medición, y cada punto de corte posee su respectiva sensibilidad y especificidad para el diagnóstico de la enfermedad bajo estudio (22).. 2.4.2. Curva ROC. La curva ROC es una ilustración de la sensibilidad del test en el eje Y contra la razón de FP (1- especificidad) en el eje de las X de cada uno de los posibles puntos de corte de un test diagnóstico, cuya escala de medición es continua. Se construye con los resultados de distintos puntos de corte y a medida que aumenta la Se, los FP disminuyen y la curva ROC muestra la magnitud de estos cambios.. 20.

(37) ROC es la representación visual de la precisión, es independiente de la prevalencia dado que la Se y la Sp son independientes y se construye a partir de ellas, puede ser afectada por el espectro de la enfermedad, no varía con las trasformaciones que se le hagan a la escala de los resultados porque depende solo del rango de las observaciones y no de la magnitud de los resultados y se utiliza para comparar dos o más test diagnósticos (23). Ambos ejes incluyen valores entre 0 y 1 (0% a 100%).. El eje Y del gráfico de curva ROC corresponde a la proporción de VP sobre el total de pacientes enfermos (i.e. sensibilidad), y el eje X corresponde a la proporción de FP sobre el total de sujetos sanos (i.e. 1-especificidad).. Conocida la condición de "enfermo" y "no-enfermo" a partir del estándar de oro, se clasifican los animales en VP, VN, FP y FN, y se procede a calcular la Se y Sp para cada posible punto de corte de la escala continua. Con dichos cálculos se construye una curva ROC, para identificar el punto de corte que determina la Se y Sp más alta.. Cuando se desea estimar el punto de corte óptimo en una prueba diagnóstica, el método de Liu maximiza el producto entre la Se y la Sp y el método de Youden maximiza la suma entre los dos. Entonces, a partir de la estimación del Índice de Youden se obtiene la correspondiente estimación del punto de corte óptimo asociado.. 21.

(38) 0.00. 0.25. 0.50. 0.75. 1.00. Ilustración 1. Curva ROC de un test diagnóstico y línea de no discriminación.. 0.00. 0.25. 0.50. 0.75. 1.00. 1 - Especificidad Área bajo la Curva ROC = 0.8517. Cuando se necesita disponer de un test diagnóstico altamente sensible (ejemplo en tamizaje de enfermedades) o altamente específico (ejemplo en confirmación de enfermedades) no se aconseja utilizar el punto de corte identificado por el índice de Youden. Es más útil conocer los valores de Se y Sp en los diferentes puntos de corte y seleccionar aquel que determine la mayor Se, o la mayor Sp, según sea el objetivo.. 2.4.3. Área Bajo la Curva ROC (AUC). La capacidad discriminativa de un test diagnóstico se refiere a su habilidad para discriminar entre pacientes sanos y enfermos. Para esto se estima el AUC, única medida independiente de la prevalencia de la enfermedad qué se utiliza para saber qué tan bueno es el test para discriminar pacientes con y sin la enfermedad a lo largo de todo el rango de puntos de corte posibles. Generalmente toma valores entre 0,5 y 1,0(24). 22.

(39) 2.4.4. Diagonal de referencia o línea de no-discriminación.. Es la línea que se traza desde el punto 0,0 al punto 1,1 en el espacio ROC. Este línea describe lo que sería la curva ROC de un test diagnóstico incapaz de discriminar pacientes sanos versus enfermos, debido a que cada punto de corte que la compone determina la misma proporción de VP y de FP. Un test diagnóstico tendrá mayor capacidad discriminativa en la medida que sus puntos de corte tracen una curva ROC lo más lejana posible a la línea de no-discriminación; dicho de otra manera, lo más cercana posible a los lados izquierdo y superior del gráfico. Los ejes del gráfico de curva ROC adoptan valores entre 0 y 1,0 (0% y 100%), delimitando un cuadrado de área=1,0. Un test diagnóstico se considera no-discriminativo si su curva ROC coincide con la línea de no discriminación, la cual posee AUC=0,50. A medida que el AUC de un test diagnóstico se acerca al valor 1,0 (test diagnóstico perfecto), mayor será su capacidad discriminativa. A manera de ejemplo un AUC=0,75 se encuentra a medio camino entre la no discriminación (AUC=0,50) y la discriminación perfecta (AUC=1,0). El AUC es un estimador muestral de un parámetro poblacional, por lo que se debe reportar su IC 95%. Si el intervalo incluye el valor 0,50 (por ejemplo, IC 95% 0,45-0,96), no es posible afirmar que el AUC del test bajo estudio es diferente a la no discriminación.. Para comparar la capacidad discriminativa de dos test diagnósticos se comparan sus respectivas AUC, y se considera más discriminativo el test con la mayor AUC. Pero para afirmar que hay una diferencia estadísticamente significativa entre el AUC de una prueba A con respecto a una prueba B se requiere comparar estadísticamente ambas AUC, según los métodos descritos por Hanley & McNeil o DeLong. (23). 23.

(40) 3. Objetivos e Hipótesis 3.1. Objetivo principal. Estimar las características operativas de tres protocolos de ELISA Indirecta: con la dilución del suero de trabajo recomendada por Svanova (1:25), con la dilución con la que fue estandarizada la prueba (In house) (1:200) y con la dilución del suero de trabajo recomendada por Bionote (1:50) para la detección de anticuerpos antibrucella abortus en bovinos de Colombia.. 3.2. Objetivos específicos. . Calcular la Se, la Sp, la razón de FP y la razón de FN del test con cada uno de los protocolos bajo estudio.. . Elaborar las curvas ROC del test con cada uno de los protocolos (Svanova 1:25, In house Svanova 1:200 y Bionote 1:50).. . Calcular las AUC.. . Comparar la capacidad discriminativa del test con cada uno de los protocolos bajo estudio a través del contraste de sus correspondientes AUC.. 24.

(41) 3.3. Hipótesis de trabajo. . Ho: Las AUC del test de ELISA indirecta con cada uno de los protocolos bajo estudio son iguales estadísticamente.. . Ha: Las AUC del test de ELISA indirecta con cada uno de los protocolos bajo estudio son diferentes estadísticamente.. 25.

(42) 4. Métodos 4.1. Tipo de Estudio. Estudio de Pruebas Diagnósticas, de características operativas y de comparación de la capacidad discriminativa mediante el contraste de Áreas bajo la curva ROC.. El estudio se realizó a partir de sueros con resultados de ELISA Competitiva pertenecientes al banco de sueros del 2013 (retrospectivo) del LNDV del ICA, a los cuales se les corrió tres protocolos diferentes para ELISA indirecta como prueba de tamizaje.. Como es retrospectivo, los sueros fueron seleccionados conociendo su estatus con respecto a la enfermedad mediante el test de ELISA Competitiva como prueba confirmatoria.. 4.2. Diseño del estudio. Pareado. Los mismos sueros problema fueron evaluados con los protocolos bajo estudio. No fue necesaria la selección aleatoria del orden de corrida de los protocolos para prevenir la aparición del sesgo de lectura cuando se corrió el último protocolo (23) porque los resultados de los mismas fueron sistematizados. Cada uno de los protocolos fue corrido en forma independiente de los resultados de los otros protocolos.. 26.

(43) 4.3. Diseño de lectura. Diseño tradicional en el que todos los lectores de las pruebas interpretaron los resultados de las mismas. La totalidad de los resultados fueron sometidos a los procedimientos establecidos por el sistema de gestión de la calidad del ICA bajo la norma ISO 17025 “Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración” 2005-10-26.. 4.4. Justificación. La prueba de ELISA indirecta se utiliza de rutina en diagnóstico como prueba de tamizaje a nivel mundial. Colombia participó en la estandarización y validación de la ELISA indirecta con una dilución de 1:200 para los sueros de trabajo, las casas comerciales validaron la prueba para trabajar en diluciones 1:25 y 1:50.. Aún no se ha realizado un estudio en el que se establezca y compare la precisión diagnóstica de cada uno de los protocolos a pesar de que fueron modificadas las condiciones iniciales de estandarización y validación de la prueba. Por lo anterior, se desconoce cómo los cambios realizados en la dilución de los sueros de trabajo modificaron su precisión diagnóstica y cuál sería el mejor protocolo para detectar anticuerpos de animales infectados en el estado actual de la campaña de control y erradicación de la enfermedad.. 27.

(44) Por otro lado, como consecuencia del avance en el programa de control de la enfermedad en el país, la prevalencia ha disminuido y por lo tanto, las condiciones de la población objetivo cambiaron. Entonces, dado que el valor predictivo del test diagnóstico depende de la prevalencia de la enfermedad en la población estudiada y que los puntos de corte no se han revisado, consideramos que esto ha afectado la precisión del diagnóstico.. Con los resultados del estudio se pretende estimar la precisión de la prueba con cada uno de los protocolos bajo estudio así como revisar los puntos de corte establecidos.. 4.5. Población fuente de las muestras Bovinos nativos > 24 meses de edad que fueron analizados para brucelosis en el LNDV durante el 2013 y que cumplieron con los criterios de inclusión.. 4.6. Criterios de selección 4.6.1. Criterios de Inclusión. Sueros de bovinos > de 24 meses de edad a quienes se les realizó examen de ELISA Competitiva.. 28.

(45) 4.6.2. Criterios de Exclusión. Se excluyen sueros de bovinos > de 24 meses de edad a quienes se les realizó examen de ELISA Competitiva que se encontraban hemolizados o sin volumen suficiente para las pruebas.. 4.7. Definición de puntos de corte para el estudio. Como punto de corte se utilizó para la prueba confirmatoria ELISA Competitiva el siguiente: Sueros positivos: PI ≥ 45% Sueros negativos: PI < 45%. 4.8. Cálculo del tamaño de la muestra. El cálculo del tamaño de muestra se realizó en MedCal versión 12.7.5. Se calculó el tamaño de muestra por separado para el AUC y para el contraste de curvas ROC.. 29.

(46) Tabla 2 Cálculo del tamaño de muestra para área bajo la curva ROC Parámetros del muestreo. Resultado. Error Tipo I. 0,05. Error Tipo II. 0,2. Área bajo la curva ROC. 0,7. Hipótesis nula. 0,5. Razón de (+)/(-) en el tamaño de muestra. 1. Número de casos requeridos (+). 31. Número de casos requeridos (-). 31. Total. 62. Tabla 3 Cálculo del tamaño de muestra para contraste de curvas ROC Parámetros del muestreo. Resultado. Error Tipo I. 0.05. Error Tipo II. 0.2. Área bajo curva ROC I. 0.90. Área bajo curva ROC II. 0.85. Correlación en grupo (+). 0.8. Correlación en grupo (-). 0.8. Razón positivos/negativos en tamaño de muestra. 1. Número de casos requeridos (+). 117. Número de casos requeridos (-). 117. Total. 234. 30.

(47) 4.9. Diseño del muestreo. La estrategia utilizada fue un muestreo aleatorio estratificado con afijación óptima. Estratificada porque se tomó como estrato la clasificación obtenida mediante la prueba de ELISA Competitiva y aleatorio, porque la selección de sueros dentro de cada estrato fue a partir de un muestreo aleatorio simple. La afijación fue óptima ya que se tomó un mayor tamaño de muestra en el estrato con mayor incertidumbre.. Partiendo de la base de datos que contenía los resultados de los sueros trabajados por ELISA Competitiva en la especie bovina en el 2013, y teniendo como referencia el punto de corte establecido para la prueba (Porcentaje de Inhibición ≥45), se procedió a dividirla en tres subgrupos:. •. Sueros con PI ≤40 (11.254 sueros). •. Sueros con PI entre ≥ 41 y ≤50 (206 sueros). •. Sueros con PI ≥51 (1.548 sueros). 31.

(48) Para efectos de concentrar la muestra alrededor del punto de corte y con la intención de retar la prueba, fueron seleccionados mediante M.A.S. (Función Excel “aleatorio entre”) 184 sueros del grupo con PI ≥ 41 y ≤50; 100 sueros del grupo con PI<40 y 100 sueros del grupo con PI≥51 para un total de 384 sueros, muestra inicialmente calculada.. Como se descartaron 27 sueros la distribución final. de los sueros trabajados fue la. siguiente: •. 87 sueros con PI < de 45; 184 sueros con PI entre ≥ 41 y ≤50 y 86 sueros con PI ≥51para un total de 357 sueros trabajados.. Tabla 4 Enumeración y definición de las variables del estudio Variable. Naturaleza. Nivel de medición. Definición. Cuantitativa. Razón. Numérica. Cuantitativa. Razón. Numérica. Cuantitativa. Razón. Numérica. Cualitativa. Dicotómica. positivo/negativo. Resultados (DO) Protocolo de Bionote 1:50 Resultados (DO) Protocolo de Svanova 1:25 Resultados (DO) Protocolo In house Svanova 1:200 Elisa Competitiva. 32.

(49) 4.10.. Instrumentos, observadores y métodos empleados para medir las. variables Los resultados fueron procesados en Stata versión 12 y como Estándar de Oro se utilizó ELISA Competitiva, cuya Se y Sp estimada por Paré y Colaboradores es de 100% y 99.8% respectivamente (1).. 4.11.. 1.. Control de sesgos. Sesgo de selección: La selección de la muestra no fue influenciada por factores externos, por lo tanto se considera representativa de la población objetivo. Todas las muestras tenían la misma probabilidad de ser incluidas en el estudio. Se revisó la base de datos de las muestras de los bovinos que ingresaron para diagnóstico en el 2013.. 2.. Sesgo de espectro: La selección de la muestra incluyó el total del espectro de la enfermedad. Animales negativos, animales sospechosos y animales positivos factores relacionados con la precisión del test.. 33.

(50) 3.. Sesgo de orden de lectura: En forma lo más cercana en el tiempo, para cada muestra de suero se corrieron los diferentes protocolos de ELISA indirecta. No existió influencia de los resultados previos en el resultado final de la prueba confirmatoria porque se partió de los resultados conocidos de ELISA competitiva.. 4.. Sesgo de revisión de diagnóstico: En todo caso, los resultados de la prueba son sistematizados, luego no dependen del analista que corre la prueba. El investigador principal fue la persona encargada de consolidar la información referente a los resultados de las pruebas de tamizaje y los resultados de la prueba confirmatoria.. 4.12. Análisis estadístico. 4.12.1. Identificación, caracterización y tratamiento de resultados dudosos o no interpretables.. 1. Revisar estándares de calidad de los sueros. 2. Revisar coeficiente de dispersión de los valores de DO para cada uno de los sueros. 3. Repetir el montaje de los sueros que cambiaron de estatus en el duplicado del montaje.. 34.

(51) 4.12.2. Determinar la precisión del test con cada uno de los protocolos. 1. Cálculo de frecuencias en términos de positivos/negativos según el protocolo empleado.. 2. Elaboración de tablas 2*2 con los resultados obtenidos con cada uno de los protocolos vs resultados de ELISA Competitiva como prueba confirmatoria.. 3. Cálculo de la Se, Sp, razón de FP y FN.. 4. Cálculo de curvas ROC para determinar la capacidad discriminativa del test para cada uno de los protocolos. Según el método empírico, el cual es un método no paramétrico, que no necesita ningún supuesto acerca de la distribución de los resultados de la prueba.. 4.12.3. Contraste de las áreas bajo la curva ROC.. Según el método descrito por DeLong (22) se utilizó la prueba de homogeneidad de áreas mediante el estadístico Ji- cuadrado, que es apropiada para cuando las curvas se derivan del mismo grupo de pacientes.. 35.

(52) 5.. Resultados. En total se analizaron 357 sueros distribuidos así: 87 sueros con PI < de 45; 184 sueros con PI entre ≥ 41 y ≤50 y 86 sueros con PI ≥51para un total de 357 sueros trabajados.. Se descartaron 27 sueros que no cumplían con los estándares de calidad para ser procesados, por falta de volumen suficiente para procesar las muestras o por contaminación bacteriana.. Inicialmente se utilizó para el cálculo del tamaño muestra para comparación de curvas ROC 0,70 y 0,75 como valores estimados en la diferencia de la curva ROC I y de la curva ROC II, con lo que se obtuvo un tamaño de muestra de 384 sueros. Como existió la necesidad de descartar 27 sueros y dados los costos asociados para completar el tamaño de muestra inicial, se consideró realizar un análisis preliminar con los datos que se tenían con el objetivo de conocer el valor estimado de las AUC y posteriormente calcular el poder ó calcular de nuevo el tamaño de la muestra para comparación de curvas ROC.. Conociendo los resultados del análisis preliminar de las curvas ROC y observando que las áreas de las curvas estimadas eran mayores que las utilizadas inicialmente para el cálculo del tamaño de muestra para contraste de curvas ROC, se recalculó el tamaño de muestra. 36.

(53) obteniéndose un tamaño de muestra corregido de 234 sueros, menor que al inicialmente calculado, lo que hizo innecesario reemplazar los sueros descartados.. 5.1.. Sensibilidad, especificidad y valores predictivos. Se procedió a la elaboración de las tablas de 2*2 utilizando como punto de corte para ELISA indirecta ≥30 establecido por el programa de control y erradicación de la Brucelosis bovina. Con el propósito de observar cómo se afectaba la Se, la Sp y los valores predictivos de la prueba bajo los diferentes protocolos, se disminuyó el punto de corte (PC) a ≥ 25 y se procedió a su evaluación. Tabla 5. Sensibilidad, especificidad y valores predictivos de la prueba con el protocolo de Bionote, Svanova 1:25, In house Svanova 1:200 y dos diferentes puntos de corte.. Punto de corte≥30. Protocolo de Diagnóstico Bionote. Svanova 1:25. In house Svanova 1:200. Se. Sp. Punto de corte ≥25. VP+. VP-. Se. Sp. VP+. VP-. 98,14. 26,02. 52,15. 94,44. 98,14. 24,49. 51,63. 94,12. (96,73-. (21,47-. (46,96-. (92,04-. (96,73-. (20,30-. (46,45-. (91,68-. 99,54). 30,57). 57,33). 96,82). 99,54). 28,95). 56,82). 96,56). 98,14. 24,49. 51,63. 94,12. 98,14. 23,98. 51,47. 94,0. (96,73-. (20,03-. (46,45-. (91,68-. (96,73-. (19,55-. (46,28-. (91,54-. 99,54. 28,95). 56,82). 96,56). 99,54). 28,41). 56,65). 96,46). 91,93. 58,67. 64,63. 89,84. 95,65. 49,49. 60,87. 93,27. (89,10-. (53,57-. (59,67-. (86,71-. (93,54-. (44,30-. (55,81-. (90,67-. 94,75). 63,78). 69,59). 92,98). 97,77. 54,68). 65,93). 95,87). * Se: Sensibilidad, Sp: Especificidad, VP+: Valor predictivo positivo, VP-: Valor predictivo negativo.. 37.

(54) Cuando se trabajó con el protocolo de Bionote y con el protocolo de Svanova 1:25 la Se del test fue igual y se mantuvo constante al disminuir el punto de corte (Tabla 5). Cuando se trabajó con el protocolo In house Svanova 1:200 la Se se incrementó al disminuir el punto de corte. En general el incremento de la Se disminuye la Sp.. La Sp es mayor cuando se trabajó con el protocolo In house Svanova 1:200 (58,67 para punto de corte ≥30 y 49,49 para punto de corte ≥25) comparada con la Sp cuando se trabajó con los otros protocolos. En general al disminuir del punto de corte disminuye la Sp (Tabla 5).. El VP+ o porcentaje de enfermos entre los animales positivos, se disminuyó al disminuir el punto de corte. El VP+ del test fue mayor cuando se trabajó con el protocolo In house Svanova 1:200 para el punto de corte ≥25 y ≥30 comparado con los otros protocolos (Tabla 5).. 5.2.. Determinación de la capacidad discriminativa del test para cada uno de los protocolos de trabajo.. Se elaboraron las correspondientes curvas ROC como una representación visual de la precisión diagnóstica en términos de Se y de FP.. 38.

(55) 0.00. 0.25. 0.50. 0.75. 1.00. Ilustración 2. Curva ROC del test con el protocolo de Bionote.. 0.00. 0.25. 0.50 1-especificidad. 0.75. 1.00. Área bajo la curva ROC = 0.8896. 0.00. 0.25. 0.50. 0.75. 1.00. Ilustración 3. Curva ROC del test con el protocolo de Svanova 1:25. 0.00. 0.25. 0.50 1-especificidad. Área bajo la Curva ROC = 0.8517. 39. 0.75. 1.00.

(56) 0.00. 0.25. 0.50. 0.75. 1.00. Ilustración 4. Curva ROC del test con el protocolo In house Svanova 1:200.. 0.00. 0.25. 0.50. 1-especificidad. 0.75. 1.00. Área bajo la Curva ROC = 0.8802. 5.3.. Contraste de las áreas bajo la curva ROC (AUC).. Para determinar si las AUC del test calculadas con los diferentes protocolos de trabajo, tenían o no diferencias estadísticamente significativas, se probaron las siguientes hipótesis e hicieron los respectivos cálculos según los métodos descritos por DeLong (22) recomendados cuando las curvas se derivan del mismo grupo de pacientes.. Hipótesis de trabajo.. Ho: El AUC del test de ELISA indirecta con el protocolo de Bionote = AUC del test de ELISA indirecta con el protocolo de Svanova 1:25= AUC del test trabajado con protocolo In house Svanova 1:200. Ha: Al menos una es diferente. 40. el.

(57) 0.00. 0.25. 0.50. 0.75. 1.00. Ilustración 5. Curvas ROC del test con los diferentes protocolos de trabajo.. 0.00. 0.25. 0.50. 0.75. 1.00. 1-Especificidad Área Curva ROC BIONOTE:0.8896 Área curva ROC In House: 0.8802. Área Curva ROC SVANOVA: 0.8517 Línea de Referencia. Visualmente, el test de ELISA indirecta trabajado con el protocolo de Bionote (Ilustración 5) tuvo la mayor AUC y ésta fue muy similar a la del test cuando se trabajó con el protocolo In house Svanova 1:200. Tabla 6. Áreas bajo la curva ROC. Protocolo del test Área ROC Bionote 0,8896 Svanova 1:25 0,8517 In house Svanova 1:200 0,8802 *Chi 2 (2)= 12,83 Prob. > Chi 2= 0,0016. Error Estándar 0,0168 0,0198 0,0177. IC 95% 0,85674-0,92251 0,81286-0,89059 0,84555-0,91478. Al menos una de las AUC del test trabajadas bajo con protocolo de Bionote, Svanova 1:25 e In house Svanova 1:200 es diferente (Nivel de Confianza 95%) (Tabla 6).. Para determinar en cuál o cuáles de las Áreas bajo la curva ROC se encontraban las diferencias se procedió a hacer una evaluación comparativa dos a dos. 41.

(58) Hipótesis de trabajo:. Ho: El AUC del test de ELISA indirecta con el protocolo de Bionote = AUC del test de ELISA indirecta con el protocolo In house Svanova 1:200.. Ha: El AUC del test de ELISA indirecta con el protocolo de Bionote ≠ AUC del test de ELISA indirecta con el protocolo In house Svanova 1:200.. Ilustración 6. Curvas ROC del test con el protocolo de Bionote y el con el protocolo. 0.00. 0.25. 0.50. 0.75. 1.00. In house Svanova 1:200. 0.00. 0.25. 0.50. 0.75. 1.00. 1-Especificidad Área bajo la Curva ROC In House: 0.8802 Línea de Referencia. 42. Área bajo la Cruva ROC SVANOVA: 0.8517.

(59) Tabla 7. Comparación de AUC de la prueba con el protocolo de Bionote y con el protocolo In house Svanova 1:200 Protocolo del test Área ROC Bionote 0,8896 In house Svanova 1:200 0,8802 2 * Chi (1)=0,66 Prob. > Chi 2= 0,4170. Error estándar 0,0168 0,0177. IC 95% 0,85674-0,92251 0,84555-0,91478. El AUC para el test de ELISA indirecta calculada a partir del protocolo de Bionote no difiere estadísticamente del AUC calculada a partir del protocolo In house Svanova 1:200 (Nivel de Confianza 95%).. Hipótesis de trabajo:. Ho. AUC del test de ELISA indirecta calculada a partir del protocolo de Svanova 1:25= AUC del test de ELSA indirecta calculada a partir del protocolo In house Svanova 1:200.. Ha: AUC del test de ELISA indirecta calculada a partir del protocolo de Svanova 1:25≠ AUC del test de ELISA indirecta calculada a partir del protocolo In house Svanova 1:200.. 43.

(60) Ilustración7. Curvas ROC del test calculadas con el protocolo In house Svanova. 0.00. 0.25. 0.50. 0.75. 1.00. 1:200 y con el protocolo Svanova 1:25. 0.00. 0.25. 0.50. 0.75. 1.00. 1-Especificidad Área bajo la Curva ROC In House: 0.8802. Área bajo la Cruva ROC SVANOVA: 0.8517. Línea de Referencia. Tabla 8. Comparación de AUC del test calculadas con el protocolo de Svanova 1:25 y con el protocolo In house Svanova 1:200. Protocolo de Prueba diagnóstica. Área ROC. Svanova 1:25 0,8517 In house Svanova 1:200 0,8802 2 *Chi (1)=12,15 Prob > Chi 2= 0,0005. Error Estándar. IC 95%. 0,0198 0,0177. 0,81286-0,89059 0,84555-0,91478. El AUC del test cuando se trabajó con el protocolo de Svanova 1:25 difiere estadísticamente del AUC del test cuando se trabajó con el protocolo In house Svanova 1:200 (IC 95%) (Tabla 8).. 44.

(61) 5.4.. Cálculo de la probabilidad pos prueba ante un resultado positivo para dos diferentes puntos de corte.. Para conocer la probabilidad de estar enfermo teniendo un resultado positivo del test de ELISA indirecta en presencia de diferentes prevalencias de hato se realizó el cálculo con diferentes prevalencias posibles de encontrar (Tabla 9).. Tabla 9. Probabilidad de enfermar si la prueba es positiva frente a diferentes prevalencias de hato o probabilidad preprueba. Punto de corte≥30 Prevalencia. Punto de corte ≥25 Protocolo. Protocolo. Protocolo Protocolo. Protocolo In house. Protocolo. Svanova Bionote. In house Svanova. Svanova. Bionote. 1:25. Svanova 1:25. 1:200 0,02 0,05 0,07 0,10 0,15 0,20 0,45. 1:200. 3,91%. 3,86%. 6,23%. 3,86%. 3,81%. 5,23%. 6,48%. 6,40%. 10,15%. 6,39%. 6,32%. 8,59%. 9,02%. 8,91%. 13,91%. 8,90%. 8,79%. 11,84%. 12,76%. 12,61%. 19,27%. 12,61%. 12,46%. 16,55%. 18,86%. 18,65%. 27,48%. 18,64%. 18,44%. 23,95%. 24,77%. 24,52%. 34,94%. 24,51%. 24,26%. 30,86%. 52,00%. 52,00%. 65,00%. 52,00%. 51,00%. 61,00%. 45.

(62) Dependiendo de la prevalencia de la enfermedad en el hato, la probabilidad posprueba de estar enfermo y tener un resultado positivo aumenta a medida que aumenta la probabilidad preprueba (Tabla 9).. La probabilidad de estar enfermo si el test es positivo para diferentes prevalencias en un hato, es mayor cuando se trabajó con el protocolo In house Svanova 1:200 comparada con la calculada cuando se trabajó con el protocolo de Bionote o con el protocolo de Svanova 1:25. La disminución del punto de corte de ≥30 a ≥25, disminuyó la probabilidad pos prueba ante un resultado positivo (Tabla 9).. 46.

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