Aislamiento e identificación de microorganismos con presuntivo potencial probiótico a partir de heces de animales de producción industrial

Texto completo

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PONTIFICIA UNIVERISAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS CON PRESUNTIVO POTENCIAL PROBIOTICO A PARTIR DE HECES DE ANIMALES DE PRODUCCION

INDUSTRIAL

JORGE ENRIQUE RODRÍGUEZ OGLIASTRI

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial para optar al título de Microbiólogo Industrial

Directora

ANDREA CAROLINA AGUIRRE Codirectora

SANDRA JANETH SANTOS

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ, D.C.

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AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS CON PRESUNTIVO POTENCIAL PROBIOTICO A PARTIR DE HECES DE ANIMALES DE PRODUCCION

INDUSTRIAL

JORGE ENRIQUE RODRÍGUEZ OGLIASTRI

APROBADO

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ, D.C.

2011 Dra. INGRID SCHULER GARCÍA Ph.D

Decana académica Dra. JANETH ARIAS PALACIOS M.Sc-M.Ed

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AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS CON PRESUNTIVO POTENCIAL PROBIOTICO A PARTIR DE HECES DE ANIMALES DE PRODUCCION

INDUSTRIAL

JORGE ENRIQUE RODRÍGUEZ OGLIASTRI

ANDREA CAROLINA AGUIRRE M.Sc Directora

SANDRA JANETH SANTOS Codirectora

LUIS DAVID GÓMEZ M.Sc Jurado

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ, D.C.

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“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en

sus trabajos de tesis. Sólo velará por qué no se publique nada contrario al dogma y a la

moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona

alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

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AGRADECIMIENTOS

A Andrea Aguirre, Carval de Colombia, Sandra Janeth Santos, al laboratorio de Biotecnología Aplicada de la Pontificia Universidad Javeriana y en su nombre, Balkys Quevedo, por su ayuda, sin la cual este proyecto no hubiera sido posible.

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TABLA DE CONTENIDO

Página

1. RESUMEN 7

2. INTRODUCCIÓN 8

3. MARCO TEÓRICO 9

4. JUSTIFICACIÓN Y PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN 11

5. OBJETIVOS 12

5.1 OBJETIVO GENERAL 12

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 12

6. METODOLOGÍA 12

6.1 RECOLECCIÓN DE MUESTRAS 12

6.2 MUESTREO INICIAL 12

6.3 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS 13

6.4 CONSERVACIÓN INICAL DE CEPAS 13

6.5 IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA 14

6.6 CONSERVACIÓN FINAL DE CEPAS 14

7. RESULTADOS 15

7.1 MUESTREO INICIAL 15

7.2 MUESTREOS 16

7.2.1 RECUENTO DE MUESTREOS 16

7.2.2 COLORACIONES DE GRAM 20

7.3 IDENTIFICACIONES BIOQUÍMICAS 22

8. DISCUSIÓN 26

9. CONCLUSIONES 33

10. RECOMENDACIONES 34

11. BIBLIOGRAFÍA 35

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1. RESUMEN

Los probióticos han entrado en auge en los últimos años por su aplicación como medicina preventiva y en el campo agrícola se ha buscado reducir el uso de antibióticos promotores de crecimiento (APCs), mejorar la alimentación de los animales y también, evitar las enfermedades causadas por patógenos entéricos. En este estudio se aplicaron metodologías para el aislamiento de microorganismos con presuntiva capacidad probiótica a partir de heces de vertebrados como aves (gallinas de engorde), ganado porcícola (cerdos de engorde), ganado vacuno (rumiantes de engorde) y caninos (como mascotas domésticas). Se identificaron un total de 60 microorganismos mediante pruebas bioquímicas usando baterías API (Biomerieux®) obteniendo bacterias Ácido Lácticas como Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactobacillus rhamnosus, L. pentosus, L. paracasei ssp.

paracasei y L. brevis. Bacilos esporulados como Bacillus subtilis/amyloliquefaciens, B. megaterium

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2. INDTRODUCCIÓN

Los probióticos son microorganismos vivos que, cuando son suministrados en cantidades adecuadas, confieren un beneficio sobre el huésped (1). Dentro de las aplicaciones que se les ha dado a estos productos están medicinales como antialérgicas (2), contra la diarrea, contra infecciones urinarias, contra el cáncer de colon, entre otras (3).

Quizá la aplicación más estudiada y comercial es la de colonización intestinal para la defensa contra patógenos entéricos como Shigella, Salmonella y Escherichia coli. Existen productos derivados de la leche, como el yogurt, que contienen Bacterias Ácido Lácticas como las Bifidobacterias y Lactobacilos que al colonizar el tracto digestivo humano, previenen enfermedades causadas por ciertos patógenos (4).

Se ha sugerido que le eficiencia en la nutrición animal se debe principalmente a los microorganismos nativos del tracto digestivo (5). Se han descrito dos mecanismos de acción principales que emplean los probióticos responsables del beneficio para el huésped animal y humano: 1) El efecto nutricional caracterizado por la reducción de reacciones metabólicas que producen sustancias tóxicas, estimulación de enzimas propias del huésped, producción de vitaminas y minerales y secreción de antimicrobianos. 2) El efecto de salud distinguido por el incremento en la resistencia de colonización contra patógenos mediante la competencia de adhesión a la superficie intestinal, competencia por sustrato, secreción de bacteriocinas y estimulación de la respuesta inmune (5, 6).

Los probióticos son común denominador en dietas recomendadas por nutricionistas y ahora se conoce que consumir productos a base de microorganismos estudiados con fines probióticos optimizan las funciones que ejerce el aparato digestivo, bien sea de humanos o de animales. El futuro de los probióticos está direccionado hacia el mercado del cuidado personal y de la salud animal. Se busca que éstos puedan ser usados en la prevención o alivio de síntomas o enfermedades específicas, especialmente para la población de recién nacidos, la tercera edad o personas inmunosuprimidas (2).

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3. MARCO TEÓRICO

3.1Probióticos

Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), los probióticos son microorganismos vivos que cuando son suministrados en cantidades adecuadas, confieren un efecto benéfico sobre el huésped (1). El concepto de probiosis también abarca la exclusión competitiva para mejorar una ecología microbiana específica. Existen diferentes tipos de microorganismos que son considerados probióticos; entre ellos están las bacterias Ácido Lácticas, los bacilos formadores de espora (Bacilos Esporulados) y las levaduras (7, 8).

Estos microorganismos se le han atribuido también efectos de estimulación en la digestión y mantenimiento en la flora intestinal tanto de humanos como animales. De esta manera ayudan a contrarrestar el estrés causado por cambios en la dieta y proveen una línea de defensa contra patógenos.

Ciertos microorganismos probióticos secretan enzimas, vitaminas y otras sustancias consideradas como factores de crecimiento que llevan a aumentas la eficiencia en la producción animal (9). Se ha estudiado la capacidad de estos microorganismos de producir sustancias antimicrobianas conocidas como bacteriocinas, que inhiben el crecimiento y reproducción de patógenos entéricos (10).

3.2Bacterias Ácido Lácticas

Son denominadas de ésta manera por su capacidad de producir ácido láctico a partir de carbohidratos como la glucosa, fructosa, manosa, etc. Tienen morfología microscópica cocoíde o bacilar y reaccionan positivamente ante los colorantes de Gram (8). Entre las bacterias de este tipo, las más reportadas y comúnmente empleadas están: Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. crispatus, L. gasseri, L. paracasei, L. reuteri y L. rhamnosus (3).

3.3 Bacilos esporulados

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existen especies consideradas patógenas, también existen otros con reportes y usos por sus capacidades probióticas. El más ampliamente conocido en este campo es Bacillus subtilis (5).

3.4 Levaduras

Ciertos hongos presentan una morfología llamada levaduriforme. Esta se caracteriza por ser de mayor tamaño que las bacterias y presenta una reacción positiva ante los colorantes de Gram, aunque a diferencia de las bacterias, esta se debe por la afinidad al colorante Cristal Violeta y no por la presencia de peptidoglicano en la pared como ocurre en las bacterias Gram positivas (8).

Saccharomyces cerevisiae y S. boulardii se han usado durante muchos años como suplemento alimenticio por su alto contenido proteico, además ser utilizado como agente anti diarreico en humanos.

Las características atribuidas a estos microorganismos para ser utilizados en animales son: su producción de minerales, vitaminas hidrosolubles y enzimas; mejora en la eficiencia alimentaria dada por la mejora en la absorción de nutrientes en el huésped (por el control de la diferenciación y proliferación de células epiteliales en el intestino), control la flora intestinal y reducción de olores en las excretas (9).

3.5Mecanismos de acción implicados en la probiosis

Principalmente, los probióticos son conocidos como una línea de defensa contra patógenos causantes de enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) (10) por varias razones: su adhesión a las células del intestino causa una competencia por espacio y nutrientes contra los patógenos, producción de bacteriocinas que afectan el crecimiento de éstos, modulación de la respuesta inmune causada como respuesta a la pared de las bacterias Ácido Lácticas (ácido lipoteícoico) que ayuda a los antígenos de membranas celulares de las células epiteliales causando una interacción que desencadena una producción de citoquinas, proliferación de células mononucleares, macrófagos y células NK (natural killers) (3).

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4. JUSTIFICACIÓN Y PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

4.1 JUSTIFICACIÓN

Los probióticos han entrado en auge en los últimos años con ventas de preparados a base de leche con adición de una carga de Bifidobacterias, Lactobacilos y Lactococos con los cuales se busca la colonización del tracto digestivo, eviten la enfermedad de patógenos entéricos y ayuden a regular el metabolismo (7-10). Esto ha sido aplicado, en gran parte para humanos, sin embargo, en Colombia no ha habido grandes estudios respecto a la producción de biopreparados para la industria agropecuaria.

Se ha encontrado que en la producción industrial de animales, como la avicultura y la porcicultura, ocurren condiciones en donde los mayores costos y pérdidas económicas son causados por infecciones con virus, bacterias, hongos y protozoos y por la inversión de antibióticos profilácticos y como factor de crecimiento empleados (7). Los antibióticos promotores del crecimiento (APC) se usan para aumentar la eficiencia en la absorción de nutrientes en las aves y para el aumento en peso corporal. Bajo reglamentación, se establece que los APC no deben causar daño al consumidor y no deben dejar residuos de compuestos relacionados bien sea en la carne o en los huevos. Sin embargo, no se conoce un estudio fiable que cuantifique con exactitud dichos compuestos (8, 9). El uso de los APC ha llevado a una pérdida del balance de la flora intestinal y desarrollo de resistencias a antibióticos por parte de los microorganismos que pueden ser patógenos para animales o humanos (5). Con la tendencia global a evitar consumir lo que se ha inundado con químicos, en este caso siendo los APC, los productos a base de probióticos como Bactocell® (7, 11) son una alternativa que puede proveer nuevas tendencias en la agricultura.

En la industria de ganado vacuno, se ha encontrado que los antibióticos suministrados a estos animales reducen de manera drástica la población microbiana en el intestino inferior lo que causa dificultades en asimilación de nutrientes para el animal y establecimiento de patógenos (12). Se conoce que para la digestión de nutrientes en estos animales se necesitan de microorganismos, en especial para la degradación de celulosa (13)

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4.2 Pregunta de investigación

¿Es posible aislar géneros de microorganismos de presuntiva capacidad probiótica a partir de heces de ganado bovino, porcícola, avícola y de caninos?

5. OBJETIVOS

5.1 Objetivo general:

Aislar e identificar microorganismos con capacidad probiótica presuntiva a partir de muestras fecales de animales de producción industrial y de comercio agrícola.

5.2 Objetivos específicos:

- Aislar microorganismos a partir de heces bovinas, avícolas, porcícolas y caninas. - Identificar bioquímicamente los microorganismos previamente aislados

6. METODOLOGÍA

6.1 Recolección de muestras

Se recolectaron muestras de:

- Heces caninas - Heces bovinas - Heces porcícolas - Heces avícolas

Las muestras provinieron de granjas ubicadas en el Valle del Cauca, Colombia. Se enviaron para su procesamiento en refrigeración bajo correo certificado.

6.2 Muestreo inicial

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térmico para así limitar el crecimiento a microorganismos esporulados (80°C durante 10 minutos y choque en frío a 20°C durante 10 minutos) (14).

Se procesaron muestras de cada animal al momento de la recepción de cada una. Se realizaron diluciones seriadas en base 10, hasta obtener una dilución correspondiente a 10-15. Se sembraron todas las diluciones por superficie (0.1mL) y se incubó a 37°C para bacterias (medios MRS y Plate Count) y 30°C para levaduras (medio YGC), durante 48 horas.

También se realizó un estudio para evaluar si las condiciones aeróbicas afectaban el crecimiento de los microorganismos crecidos en el medio de cultivo MRS.

A partir de los resultados del muestreo inicial, se tomaron las muestras que arrojaron el recuento mayor contable y se sembraron las diluciones 10-5 y 10-6 por duplicado, incubando un duplicado en

condiciones de microaerofilia, generado por el sistema GENEBOX de Biomerieux® y el otro en condiciones aeróbicas.

6.3 Procesamiento de muestras

De cada muestra se pesaron 10 gramos que fueron diluidos en 90mL de agua peptonada. Se realizaron diluciones seriadas en base 10 hasta 10-8 tomando como referencia los resultados del muestreo inicial realizado previamente. Se sembró 0,1 mL por en agar MRS, YGC y Plate Count. En este último se le dio un tratamiento térmico para así limitar el crecimiento a microorganismos esporulados (80°C durante 10 minutos y choque en frío a 20°C durante 10 minutos) (13). Se incubó a 37°C para bacterias (medios MRS y Plate Count) y 30°C para levaduras (medio YGC), durante 48 horas.

A cada morfotipo de colonia crecida se le realizó coloración de Gram y se purificaron según los siguientes criterios (anexo 2, tabla VII):

Colonias crecidas en MRS: cocos o bacilos Gram positivos

Colonias crecidas en YGC: levaduras ligeramente ovoides de gemación única

Colonias crecidas en Plate Count: bacilos Gram positivos esporulados

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Las colonias aisladas se conservaron realizando repiques cada 30 días en los medios originales para posteriores trabajos y conservación de las mismas (8).

Se realizó un banco de transporte correspondiente a 3 viales por microorganismo purificado, creciendo las colonias en tubos de 13x100 con 5mL del medio de cultivo correspondiente, 100rpm, 37°C para bacterias y 30°C para levaduras por 16 horas. Posterior al crecimiento se agregaron con un volumen final de 1mL a un tubo eppendorf con glicerol para obtener una concentración final de glicerol al 10% (v/v). Los viales se conservaron a -70°C y se reactivaron una semana después de preparado el banco, en el mismo medio en donde originalmente ser aisló cada microorganismo.

6.5 Identificación bioquímica

Los microorganismos se identificaron mediante las pruebas de API 50 CHL (para colonias crecidas en agar MRS), API 20C AUX (para colonias crecidas en agar YGC) y API 50 CHB (para colonias crecidas en Plate Count), siguiendo las instrucciones y protocolos de la casa comercial Biomerieux® y se ingresaron al software APIWEB de la misma casa comercial para su identificación.

6.6 Conservación final de las cepas

Aquellos microorganismos cuyo perfil bioquímico resultado de API arrojó la identificación de género referenciado en literatura como posible microorganismo probiótico fue conservado en glicerol al 10% (v/v) siguiendo la siguiente metodología:

A partir de una colonia pura, se sembró en caldos MRS, YPG o Plate Count (para bacterias aisladas de MRS, YGC o Plate Count respectivamente). Se incubó a 37 o 30°C para bacterias y levaduras respectivamente, por 16 horas a 100 rpm (15).

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7. RESULTADOS

7.1 Muestreo inicial

A partir de las muestras recibidas, se obtuvieron diferentes recuentos que principalmente variaron por el medio de cultivo utilizado para la siembra. A excepción de la muestra de heces porcícolas, en MRS se obtuvieron recuentos del mismo orden logarítmico de 107 (Tabla 1). La

mayoría de otros crecimientos se encontraron en concentraciones suficientes para continuar con el estudio.

Tabla I: Recuento en placa de muestreo inicial de heces de diferentes animales.

Procedencia de la Muestra

Medio de cultivo

Recuento (UFC/g)

Heces bovinas

MRS 6,50E+07

Plate Count 1,50E+05

YGC 2,30E+04

Heces porcícolas

MRS 3,10E+09

Plate Count 3,60E+05

YGC 4,00E+07

Heces avícolas

MRS 3,60E+07

Plate Count 4,60E+05

YGC 3,40E+06

Heces caninas

MRS 1,80E+08

Plate Count 3,60E+05

YGC 1,10E+04

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Figura I: Gráfico de barras del logaritmo natural de los recuentos iniciales en LN UFC/g. Fuente: elaboración propia

Los resultados de los crecimientos de microaerofilia y aerobiosis fueron en ambos casos, mayor a 2,60E+8 lo que indicó que no había interferencias en cuanto a densidad microbiana en los resultados por condiciones de oxígeno en la incubación.

7.2 Muestreos

7.2.1 Recuento de muestreos

Los resultados obtenidos para recuento en placa de las muestras analizadas fueron coherentes con el muestreo inicial en tanto que dieron cerca del mismo valor logarítmico (Anexo 2, Tabla XI) (Figuras II, III, IV, V, VI, VII y VIII). Sugiero mostrar la grafica y poner en anexos las tablas.

Se procesaron 10 muestras de cada vertebrado seleccionado separado en dos grupos de 5 exceptuando canes, para lo que se procesaron solamente 5 en total.

0 5 10 15 20 25

Heces bovinas

Heces porcícolas

Heces avícolas

Heces caninas

LN

U

FC

/g

Muestra

Recuento de muestreo inicial

(17)

Figura II: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales avícolas (M1, M2, M3, M4 y M5). Fuente: elaboración propia

Figura III: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales avícolas (M1, M2, M3, M4 y M5). Fuente: elaboración propia

0 5 10 15 20

M1 M2 M3 M4 M5

LN

U

FC

/g

Número de muestra

Población microbiana crecida en

Heces Avícolas 1

MRS Plate Count YGC

0 5 10 15 20 25

M1 M2 M3 M4 M5

LN

U

FC

/g

Número de muestra

Población microbiana crecida en

Heces Avícolas 2

(18)

Figura IV: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales porcícolas (M1, M2, M3, M4 y M5). Fuente: elaboración propia

Figura V: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales porcícolas (M1, M2, M3, M4 y M5). Fuente: elaboración propia

0 5 10 15 20 25

M1 M2 M3 M4 M5

LN

U

FC

/g

Número de muestra

Población microbiana crecida en

Heces Porcícolas 1

MRS Plate Count YGC

0 5 10 15 20 25

M1 M2 M3 M4 M5

LN

U

FC

/g

Número de muestra

Población microbiana crecida en

Heces Porcícolas 2

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Figura VI: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales caninas (M1, M2, M3, M4 y M5). Fuente: elaboración propia

Figura VII: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales bovinas (M1, M2, M3, M4 y M5). Fuente: elaboración propia

0 2 4 6 8 10 12 14 16

M1 M2 M3 M4 M5

LN

U

FC

/g

Número de muestra

Población microbiana crecida en

Heces Caninas

MRS Plate Count YGC

0 5 10 15 20 25

M1 M2 M3 M4 M5

LN

U

FC

/g

Número de muestra

Población microbiana crecida en

Heces Bovinas 1

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Figura VIII: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales porcícolas (M1, M2, M3, M4 y M5). Fuente: elaboración propia

7.2.2 Coloraciones de Gram

Las morfologías y reacciones ante los colorantes de Gram se observan en la tabla II. Aunque el medio YGC contiene un antimicrobiano de amplio espectro, se observaron morfologías de bacterias como bacilos y cocos Gram negativos

Tabla II: Coloraciones de Gram de la diferentes morfologías macroscópicas observadas en las siembras en placa. M(#): Muestra, BGP: Bacilo Gram Positivo, BGPE: Bacilo Gram Positivo Esporulado, BGN: Bacilo Gram Negativo, CGP: Coco Gram Positivo, CGN: Coco Gram Negativo, LS: Levadura Silvestre, LGM: Levadura ovoide con Gemación Múltiple, LGU: Levadura ovoide con Gemación Única, C(#): Colonia *Repicada.

Muestra MRS Plate Count YGC

M1 M2 M3 M4 M5 M1 M2 M3 M4 M5 M1 M2 M3 M4 M5

Heces avícolas 1 C1: BGP * C2: CGP C3: BGP * C1: BGP* C2: BGP* * C1: CGN C2: BGN C1: BGN C2: BGN C1: CGN C2: CGN C1: BGN C2: BGP C1: BGPE * C2: BGN C3: BGN C1: BGPE * C2: BGP C1: BGPE * C2: BGN C3: CGP C1: BGPE* C2: CGP C3: CGP C1: LS C2: LS C1: LS C2: BGN C3: LS C1: LS C2: LGU * C1: LS C2: LS C3: LS C4: C1: BGN C2: LS C3: LS 0 5 10 15 20

M1 M2 M3 M4 M5

LN

U

FC

/g

Número de muestra

Población microbiana crecida en

Heces Bovinas 2

(21)
(22)

CGP

* C3:

BGP

*

BGN BGN BGN

Heces bovinas 1 C1: BGN C2: BGN C3: CGP * C4: BGN C5: BGN C1: BGM C2: BGN C3: BGN C4: BGN C1: BGN C2: CGN C3: CGN C4: BGN C5: BGN C1: BGN C2: BGN C3: BGN C1: CGP * C2: CGP * C1: BGP C2: CGP C3: BGN C4: BGN C1: BGP C2: BGN C3: BGP C1: BGPE * C2: BGP C3: BGP C4: BGN C1: BGP C2: BGN C3: BGPE * C1: BGP C2: BGP C3: BGP

- - - C1:

LGU * C2: LGM C3: LGU * C4: LGM C1: LGM Heces bovinas 2 C1: BGP * C2: BGN C3: BGN C4: BGN C1: BGP* C2: BGN C3: CGN C4: BGN C1: BGN C2: CGN C3: BGN C1: BGP * C2: BGN C1: BGP * C2: CGN C3: BGN C1: BGP C2: BGP C3: BGN C1: BGPE * C2: BGP C3: BGP C1: BGP C2: BGP C3: BGP C4: BGP C1: BGPE * C2: BGP C3: BGN C4: BGN C1: BGP C2: BGP C3: BGP C4: BGP C5: CGP C1: LS C2: LS C1: 1

- C1: LS C2: LS

-

Fuente: elaboración propia

7.3 Identificación bioquímica

(23)

Tabla III: Resultados de las identificaciones bioquímicas mediante el uso de la técnica API 50CHL (para microorganismos obtenidos en MRS).

Bacterias Ácido Lácticas

Microorganismo Procedencia

Lactococcus lactis ssp. lactis Heces bovinas

Lactobacillus pentosus Heces bovinas

Lactobacillus paracasei ssp. paracasei Heces avícolas

Lactobacillus paracasei ssp. paracasei Heces bovinas

Lactobacillus brevis Heces bovinas

Lactobacillus pentosus Heces avícolas

Lactobacillus pentosus Heces avícolas

Lactococcus lactis ssp. lactis Heces caninas

Lactococcus lactis ssp. lactis Heces bovinas

Lactococcus lactis ssp. lactis Heces bovinas

Lactobacillus paracasei ssp. paracasei Heces porcícolas

Lactobacillus rhamnosus Heces porcícolas

Lactobacillus rhamnosus Heces bovinas

Lactobacillus rhamnosus Heces bovinas

Lactobacillus pentosus Heces bovinas

Lactobacillus rhamnosus Heces avícolas

Lactobacillus rhamnosus Heces caninas

Lactobacillus paracasei ssp. paracasei Heces porcícolas

Lactococcus lactis ssp. lactis Heces porcícolas

Lactobacillus rhamnosus Heces bovinas

Lactobacillus pentosus Heces bovinas

Lactobacillus pentosus Heces avícolas

Lactobacillus rhamnosus Heces avícolas

Lactobacillus rhamnosus Heces caninas

Lactobacillus pentosus Heces porcícolas

Lactobacillus paracasei ssp. paracasei Heces avícolas

Bacilos esporulados

Microorganismo Procedencia

Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces bovinas

Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces avícolas

Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces avícolas

Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces avícolas

Bacillus pumilus Heces porcícolas

Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces porcícolas

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Tabla V: Resultados de las identificaciones bioquímicas mediante el uso de la técnica API 20C AUX® (para levaduras obtenidas en YGC). Fuente: Elaboración propia

Fuente: Elaboración propia

En las figuras IX, X y XI se resume las identificaciones obtenidas por las diferentes pruebas API®, diferenciando entre tipo de microorganismo obtenido (según el medio de cultivo utilizado para su aislamiento).

Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces avícolas

Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces porcícolas

Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces avícolas

Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces avícolas

Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces bovinas

Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces bovinas

Bacillus pumilus Heces porcícolas

Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces porcícolas

Bacillus pumilus Heces porcícolas

Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces porcícolas

Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces porcícolas

Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces bovinas

Bacillus megaterium Heces porcícolas

Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces porcícolas

Bacillus pumilus Heces porcícolas

Bacillus licheniformis Heces porcícolas

Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces porcícolas

Bacillus licheniformis Heces porcícolas

Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces porcícolas

Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces porcícolas

Bacillus pumilus Heces porcícolas

Levaduras

Microorganismo Procedencia

Candida zeylanoides Heces porcícolas

Candida dubliniensis Heces porcícolas

Kloeckera sp. Heces bovinas

Candida rugosa Heces bovinas

Cryptococcus terreus Heces porcícolas

Candida parapsilosis Heces Avícola

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Figura IX: Nombre y cantidad de microorganismos identificados mediante el uso de la técnica API 50CHL® (para bacterias obtenidas en MRS). Fuente: Elaboración propia.

Figura X: Nombre y cantidad de microorganismos identificados mediante el uso de la técnica API 50CHB® (para bacterias esporuladas obtenidas en Plate Count). Fuente: Elaboración propia

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

m

er

o

d

e

cepa

s

Microorganismos

Bácterias Ácido Lácticas identificadas

Lactobacillus rhamnosus

Lactobacillus pentosus

Lactococcus lactis ssp. lactis

Lactobacillus paracasei ssp. paracasei

Lactobacillus brevis

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

m

er

o

d

e

cepa

s

Microorganismos

Bacterias esporuladas identificadas

Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Bacillus pumilus

Bacillus licheniformis

(26)

Figura XI: Nombre y cantidad de microorganismos identificados mediante el uso de la técnica API 20C AUX® (para levaduras obtenidas en YGC). Fuente: Elaboración propia.

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

m

er

o

d

e

cepa

s

Microorganismos

Levaduras identificadas

Candida parapsilosis C. rugosa

(27)

8. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

En cuanto a la prueba de crecimiento de microorganismos obtenidos en el medio de cultivo MRS bajo las diferentes condiciones de oxígeno (aerobiosis y microaerofilia), se encontró que los recuentos fueron muy parejos y las características microscópicas y macroscópicas fueron muy similares (resultados no escritos). Las bacterias Ácido Lácticas son generalmente anaeróbicas facultativas o microaerofílicas, lo que les permite crecer tanto en condiciones de anoxia o en la presencia de oxígeno (8, 14, 15). Por esta razón se decidió continuar el estudio en condiciones aeróbicas para todos los muestreos. Diversos autores han trabajado en condiciones de anaerobiosis estrictas para el aislamiento de este tipo de microorganismos; esto puede ser una de las razones que expliquen que la diversidad microbiana encontrada fue diferente de la que se halló en este estudio, además de la diversidad microbiana atribuida a geografía y/o alimentación del animal huésped (4, 5, 12, 16).

Los recuentos encontrados para las muestras sembradas en MRS de este estudio (7 – 9 unidades logarítmicas) son similares a las reportadas en bibliografía (12, 14, 16, 17), lo cual indica una metodología de siembras apropiadas (Tabla 1 y 2).

(28)

microorganismos fue su morfología microscópica y la reacción en su pared celular ante los colorantes de Gram.

Bajo el contexto explicado de los medios de cultivo utilizados para el procesamiento de las muestras, se entiende la razón por la cual las morfologías microscópicas que presentaron los microorganismos crecidos en los nuestros fueron tan diversas. Con lo anterior mencionado, cabe resaltar de nuevo que los microorganismos de interés para este estudio tenían características específicas microscópicas (colonias crecidas en MRS: cocos o bacilos Gram positivos; Plate Count: bacilos Gram Positivos esporulados y YGC: levaduras ligeramente ovoides de gemación única). Estas características fueron el criterio de selección para la purificación de los mismos.

Las identificaciones de los microorganismos aislados mediante las pruebas bioquímicas se muestran en la tabla 4. Se identificaron un total de 60 microorganismos: 26 a partir de bacterias aisladas del medio de cultivo MRS, 27 a partir de bacterias aisladas del medio de cultivo Plate Count (muestras con tratamiento térmico) y 7 levaduras a partir del medio de cultivo YGC.

A partir de las colonias obtenidas en el procesamiento de todas las muestras en el medio de cultivo MRS, se obtuvieron un total de 26 microorganismos: 5 cepas de Lactococcus lactis ssp.

Lactis: 3 de heces bovinas, 1 de heces porcícolas y 1 una de heces caninas; 8 cepas de Lactobacillus rhamnosus: 3 de heces bovinas, 1 de heces porcícolas, 2 de heces caninas y 2 de heces avícolas; 5 cepas de L. paracasei ssp. paracasei: 1 de heces bovinas, 3 de heces porcícolas y 1 de heces avícolas; 7 cepas de L. pentosus: 3 de heces bovinas, 1 de heces porcícolas y 3 de heces avícolas; y 1 cepa de L. brevis a partir de heces bovinas. En su mayoría, los perfiles bioquímicos de las aquellas cepas encontradas, fueron diferentes, incluyendo aquellas que arrojaron la misma identificación (resultados no mostrados).

Diversos autores han realizado trabajos con estas cepas, tanto en el campo de probióticos, como en alimentos como quesos madurados, procesos de extracción, purificación, identificación y evaluación de bacteriocinas y extracción de proteinasas (15 - 17, 19 - 23).

(29)

persistencia intestinal (16). Deben ser capaces de tolerar pHs bajos y concentraciones de jugos gástricos para también asegurar su transición del estomago al intestino y una vez se encuentre en el intestino, tenga la capacidad de adherirse a las células epiteliales (14, 15).

De los microorganismos identificados, quizá el más estudiado para aplicaciones probióticas es L. rhamnosus (19), además de ser uno de los cuatro Lactobacilos autorizados en la legislación europea (Directive 70/524/EEC, JLO 297:15/11/2001) (25). Guo y colaboradores en su estudio del

2010 mostraron que de las cepas aisladas a partir de heces porcícolas, aquellas que obtuvieron mejores resultados en cuanto a características probióticas in vitro fueron las identificadas como L. rhamnosus (identificada mediante API 50CHL y corroboradas secuenciando la subunidad 16s ribosomal) obteniendo tolerancias a concentraciones de sales biliares de 0.3 y 1.0 % (m/v), supervivencia a pH de 2 durante 3 horas (sin disminución de unidad logarítmica poblacional) (16).

Bernardeau y colaboradores en su estudio del 2002 también concluyeron que esta bacteria (L. rhamnosus) tenía un gran potencial probiótico, sin embargo, abordado desde otro ángulo: “Las cepas L. MA27/6B y MA27/6R (dos cepas de L. rhamnosus) son no patógenas y seguras para el consumo animal y tienen un efecto benéfico sobre el crecimiento en ratones (17, 26).

Los autores mencionados concluyen que estos microorganismos tienen diversas aplicaciones como su uso en la industria porcícola como aditivos en la alimentación del animal, por sus tolerancias a factores adversos encontrados en el tracto gastrointestinal y actividad antimicrobiana (16). Otros sugieren profundización en estudios, en cuanto a consorcios y pruebas in vivo por los resultados in vitro obenidos (17) y no sólo se demostró la bioseguridad en cuanto al consumo de éstos microorganismos usando ratones, sino también la mejora en el crecimiento (26).

(30)

Organism Despositary Accession Number, FERM BP-4693) lo cual incrementa el interés por implementar este microorganismo en dietas (29).

Lactobacillus paracasei ssp. paracasei ha sido estudiado por autores como Maragkoudakis y colaboradores en el 2006 encontrando que de 29 cepas de Lactobacilos aisladas en investigación, una sub especie de este microorganismo se destacó frente a los demás en cuanto a las pruebas probióticas in vitro, como tolerancia a pHs de 1 y 2 , teniendo una ligera disminución poblacional, no obstante dicha disminución fue menor con respecto a los demás microorganismos evaluados (entre los cuales estaban varias cepas de L. acidophilus y L. plantarum), tolerancia a pepsina (componente de sales biliares) a pH 2, inmunomodulación (estimulación de producción de interluquinas 10 y 12, TNFα e interferón γ) e inhi i ión destacada contra patógenos entéricos como E. coli y Salmonella sp. (17).

Por otro lado, Lactococcus lactis ssp. lactis ha tenido un enfoque de estudio diferente al campo probiótico. Este microorganismo ha tenido aplicaciones en la industria de alimentos para la maduración de quesos y extracción de proteinasas específicas de cisteína para el mejoramiento de textura y sabor de quesos duros y semi-duros (22, 30). Sin embargo, una aplicación interesante en el campo de antimicrobianos, más específicamente, las bacteriocinas. Estos compuestos han sido definidos como proteínas o complejos proteicos antagónicos a bacterias estrechamente relacionadas genéticamente al organismo productor. Investigadores han reconocido a L. lactis ssp.

lactis como productor de nisina Z (bacteriocina). Rilla y colaboradores (2003) evaluaron la capacidad de éste microorganismo para inhibir al patógeno Clostridium tyrobutyricum. Los autores señalan que la inhibición se debe gracias a la bacteriocina producida puesto que evaluaron tanto el extracto crudo de la bacteria sembrada en pozos en agar con C. tyrobutyricum como la bacterias enfrentadas en queso evaluando la viabilidad de cada microorganismo (23).

Además de L. lactis ssp. lactis, la bacteria Lactobacillus pentosus también se le ha atribuido la producción de bacteriocinas. Liv en su estudio sobre bacteriocinas (2008) y Delgado en su estudio del aislamiento de L. pentosus a partir de aceitunas (2007) concluyeron que este microorganismo es el responsable de la producción de la bacteriocina capaz de inhibir un amplio espectro de bacterias como Listeria monocytogenes, L. ivanovii, L. inocua, E. coli, Staphylococcus aureus y

(31)

En el caso de las bacterias aisladas en el medio de cultivo Plate Count, se obtuvieron un total de 27 bacterias: 19 cepas de Bacillus subtilis/amyloliquefaciens (las pruebas bioquímicas no diferencian estas dos especies) provenientes de: 4 de heces bovinas, 9 de heces porcícolas y 4 de heces avícolas; 5 cepas de B. pumilus todas aisladas a partir de muestras de heces porcícolas; 2 cepas de

B. licheniformis a partir de heces porcícolas y 1 de B. megaterium de heces porcícolas (tabla 4).

Para diferenciar entre la identificación de B. subtilis/amyloliquefaciens con precisión, se sugieren pruebas moleculares como secuenciación de la subunidad 16S del mRNA.

Las especies de Bacillus han sido usados como suplementos alimentarios hace más de 50 años con el producto italiano Enterogermina® (31). Entre las especies más estudiadas están B. subtilis, B. clausii, B. coagulans y B. licheniformis (32 - 34). Las esporas de estos bacilos le otorgan una ventaja sobre las bacterias Ácido Lácticas por su estructura de resistencia, pues ayuda la supervivencia en el tracto gastrointestinal confiriéndole tolerancias a pH bajos y tensores como las sales biliares. Esta estructura también otorga un interés comercial, pues una vez el preparado haya sido desecado no hay pérdidas de viabilidad aun si se almacena en temperatura ambiente, ahorrando costos de refrigeración que pueden tener los demás biopreparados (31).

Algunos de los productos más comercializados que contienen esporas de B. subtilis son: Bio-Kult®, biopreparado comercializado en el Reino Unido, Biosporin® de Ucrania, Medilac-Vita® de China y Primal Defense de los Estados Unidos (31).

En Japón se comercializa un producto de la fermentación de soja conocida como Natto. Este alimentos se ha caracterizado por tener esporas viables de una cepa de B. subtilis con la que se han realizado estudios revelando que tiene la capacidad de reducir la coagulación de la sangre por fibrilosis causada por la secreción de la enzima Natoquinasa (enzima reconocida como GRAS en los Estados Unidos) (35).

Para la agricultura, este microorganismo está teniendo gran auge pues se ha demostrado que reduce la infección en cerdos y aves de Salmonella enterica, Clostridium perfringes y E. coli

078:K80 por competencia de espacio y nutrientes (36, 37), además de producir Amicoumacina, un antibiótico con actividad demostrada in vitro contra el patógeno tropical Helicobacter pylori (38).

(32)

especias de Clostridium. Especies de Bacillus como las aisladas en este estudio (B. licheniformis y B. pumilus) han tenido recientes estudios en cuanto a su toxicidad en la veterinaria. Nieminen y colaboradores (2007) encontraron 4 bacterias que pertenecían a las especias de B. pumilus y B. licheniformis produjeron toxinas termo estables no proteicas en la leche bovina. Mencionaron que las cepas de B. licheniformis eran similares genéticamente (en genes codificando para la producción de toxinas) a B. cereus productor de toxina entérica termo estable causante de diarreas y vómitos (39, 40).

Sin embargo, no todas las bacterias esporuladas aisladas en este estudio diferentes de B. subtilis

son reportados como patógenos; B. megaterium tiene aplicaciones agrícolas de gran interés diferentes de probiosis. Padgham y Sikora en el 2007, Kildea y colaboradores en el 2008 y Kong y colaboradores en el 2010 han demostrado que este microorganismo puede ser usado como biocontrolador en diferentes cultivos contra fitopatógenos. Padgam y Sikora encontraron que B. megaterium tiene actividad antagónica contra Meloidogyme gramicola, nematodo que afecta cultivos de arroz aerobios (no inundados), reduciendo la atracción del nematodo a penetrar las raíces del cultivo previniendo así la infección (41). Kildea y colaboradores revelaron que B. megaterium también puede ser usado para reducir la enfermedad del trigo conocida como Septoriosis que evidenciada por manchas en el área foliar. En el estudio mostraron como la mancha foliar se reducía inoculando al bacilo Esporulado en plantas infectadas con el fitopatógeno

Mycosphaerella graminícola (42). En China, Kong y colaboradores (2010) mostraron que otro fitopatógeno (Aspergillus flavus) se veía inhibido tanto in vitro como in vivo por B. megaterium

reduciendo la incidencia de la enfermedad causada por A. flavus en los granos de maní (43).

En cuanto a levaduras, el microorganismo objetivo eran especies de Saccharomyces, más específicamente S. boulardii o Saccharomyces cerevisiae. Por el contrario, sólo se identificaron levaduras de los géneros Candida, Geotrichum, Kloeckera y Cryptococcus. Esto se debe principalmente a que las levaduras no son microorganismos propios del intestino animal, sino que generalmente su presencia es transitoria dependiendo de la dieta suministrada.

(33)

Candida dubliniensis ha sido asociada a estomatitis protésica (proceso inflamatorio de la mucosa oral asociada a especies de Candida) junto con C. albicans (44). C. parapsilosis es la segunda levadura más comúnmente aislada en muestras de sangre en hospitales de Estados Unidos, Canadá y América Latina. A pesar de su baja patogenicidad, este microorganismo tiene capacidad de destrucción de tejidos epidérmicos y orales (45).

Otros géneros de levaduras también considerados patógenos aislados e identificados en este estudio son Geotrichum y Cryptococcus. El primero está asociado a infecciones sistémicas que resultan graves especialmente para la población inmunosuprimida con una tasa de mortalidad entre el 60 y el 80% de la población infectada en condiciones de baja inmunidad. Cryptococcus es una levadura encapsulada sin discriminación en huéspedes de infección (40).

Kloeckera es junto con Saccharomyces cerevisiae la levadura que se encuentra más frecuentemente en los mostos para la producción del vino. Está relacionada con fermentaciones no deseables en la bebida alcohólica puesto que produce muchos ácidos volátiles (46).

Por otro lado, ciertas levaduras aisladas en este estudio tienen aplicación industrial como es el caso de Candida rugosa. Domínguez de María y colaboradores (2006) publicaron un reporte en cuanto a las lipasas producidas por esta levadura. Estas lipasas han sido ampliamente usadas en tecnologías de fermentaciones, ensayos biocatalíticos, detergentes y solventes (47).

Levaduras ampliamente reportadas en el campo probiótico son Saccharomyces cerevisiae y S. boulardii. Ortiz y Reuto en su estudio del 2007 mostraron mediante la evaluación in vitro de S. cerevisiae su capacidad de tolerancia a sales biliares desde 0.5% hasta 3.0%, estabilidad ante enfrentamiento a jugos gástricos, reducción de 54% de colesterol en 12 horas y adherencia celular con la línea celular Caco-2 (48).

De manera similar, Le Bon y colaboradores en el 2010 investigaron la influencia de S. cerevisiae

(34)

9. CONCLUSIONES

 Las muestras procesadas presentaron una alta carga microbiana, especialmente la evidenciada en el medio de cultivo MRS (entre 104 y 108 UFC/mL) mostrando un amplio

potencial para el trabajo con estos microorganismos hacia el beneficio de la industria agropecuaria.

 Se aislaron bacterias Ácido Lácticas reportadas con capacidad probiótica (8 Lactobacillus

rhamnosus, 7 Lactobacillus pentosus, 5 Lactococcus lactis ssp. lactis y 5 Lactobacillus paracasei ssp. paracasei)

 Se aislaron bacterias Esporuladas reportadas con capacidad probiótica (19 Bacillus subtilis

/ amyloliquefaciens)

 No se hallaron géneros de levaduras reportadas como probióticas.

10. RECOMENDACIONES

 Para dar continuación al proyecto se sugieren pruebas de capacidad probiótica in vitro

como adhesión celular, producción de bacteriocinas, tolerancia a pH, tolerancia a sales biliares, tolerancia a jugos gástricos, reducción de colesterol y antagonismo contra patógenos.

 Con el fin de tener una mayor precisión en cuanto a la identificación de los

microorganismos, se sugiere la secuenciación de la subunidad 16s del RNA.

(35)

10. BIBLIOGRAFÍA

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(40)

11. ANEXOS

Anexo 1:

Tabla VI: Resultados de recuento en placa de las muestras analizadas. M(#): Muestra. Fuente: Elaboración propia

Muestr a

MRS Plate Count YGC

M1 M2 M3 M4 M5 M1 M2 M3 M4 M5 M1 M2 M3 M4 M5

(41)

Anexo 2

Tabla VII: Ejemplos de criterios de selección según morfologías y coloraciones de Gram para la purificacion de microorganismos obtenidos en los muetreos.

Tipo de microorganismo Morfología

Bacteria Ácido Láctica

Bacilo Gram Positivo

Coco Gram Positivo Bacteria Esporulada

(42)

Levadura

Figure

Tabla I: Recuento en placa de muestreo inicial de heces de diferentes animales.

Tabla I:

Recuento en placa de muestreo inicial de heces de diferentes animales. p.15
Figura I: Gráfico de barras del logaritmo natural de los recuentos iniciales en LN UFC/g

Figura I:

Gráfico de barras del logaritmo natural de los recuentos iniciales en LN UFC/g p.16
Figura II: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales avícolas (M1, M2, M3, M4 y M5)

Figura II:

Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales avícolas (M1, M2, M3, M4 y M5) p.17
Figura III:  Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales avícolas (M1, M2, M3, M4 y M5)

Figura III:

Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales avícolas (M1, M2, M3, M4 y M5) p.17
Figura IV:  Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales porcícolas (M1, M2, M3, M4 y M5)

Figura IV:

Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales porcícolas (M1, M2, M3, M4 y M5) p.18
Figura V:  Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales porcícolas (M1, M2, M3, M4 y M5)

Figura V:

Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales porcícolas (M1, M2, M3, M4 y M5) p.18
Figura VI: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales caninas (M1, M2, M3, M4 y M5)

Figura VI:

Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales caninas (M1, M2, M3, M4 y M5) p.19
Figura VII:  Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales bovinas (M1, M2, M3, M4 y M5)

Figura VII:

Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales bovinas (M1, M2, M3, M4 y M5) p.19
Figura VIII:  Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales porcícolas (M1, M2, M3, M4 y M5)

Figura VIII:

Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales porcícolas (M1, M2, M3, M4 y M5) p.20
Tabla II: Coloraciones de Gram de la diferentes morfologías macroscópicas observadas en las Levadura Silvestre, siembras en placa

Tabla II:

Coloraciones de Gram de la diferentes morfologías macroscópicas observadas en las Levadura Silvestre, siembras en placa p.20
Tabla IV:  Resultados obtenidos de identificaciones mediante la técnica API 50CHB® (para microorganismos obtenidos en Plate Count)

Tabla IV:

Resultados obtenidos de identificaciones mediante la técnica API 50CHB® (para microorganismos obtenidos en Plate Count) p.23
Tabla III: Resultados de las identificaciones bioquímicas mediante el uso de la técnica API 50CHL (para microorganismos obtenidos en MRS)

Tabla III:

Resultados de las identificaciones bioquímicas mediante el uso de la técnica API 50CHL (para microorganismos obtenidos en MRS) p.23
Tabla V: Resultados de las identificaciones bioquímicas mediante el uso de la técnica API 20C AUX® (para levaduras obtenidas en YGC)

Tabla V:

Resultados de las identificaciones bioquímicas mediante el uso de la técnica API 20C AUX® (para levaduras obtenidas en YGC) p.24
Figura IX: Nombre y cantidad de microorganismos identificados mediante el uso de la técnica API 50CHL® (para bacterias obtenidas en MRS)

Figura IX:

Nombre y cantidad de microorganismos identificados mediante el uso de la técnica API 50CHL® (para bacterias obtenidas en MRS) p.25
Figura X: Nombre y cantidad de microorganismos identificados mediante el uso de la técnica API 50CHB® (para bacterias esporuladas obtenidas en Plate Count)

Figura X:

Nombre y cantidad de microorganismos identificados mediante el uso de la técnica API 50CHB® (para bacterias esporuladas obtenidas en Plate Count) p.25
Figura XI: Nombre y cantidad de microorganismos identificados mediante el uso de la técnica API 20C AUX® (para levaduras obtenidas en YGC)

Figura XI:

Nombre y cantidad de microorganismos identificados mediante el uso de la técnica API 20C AUX® (para levaduras obtenidas en YGC) p.26
Tabla VI: Resultados de recuento en placa de las muestras analizadas. M(#): Muestra. Fuente: Elaboración propia

Tabla VI:

Resultados de recuento en placa de las muestras analizadas. M(#): Muestra. Fuente: Elaboración propia p.40
Tabla VII: Ejemplos de criterios de selección según morfologías y coloraciones de Gram para la purificacion de microorganismos obtenidos en los muetreos

Tabla VII:

Ejemplos de criterios de selección según morfologías y coloraciones de Gram para la purificacion de microorganismos obtenidos en los muetreos p.41