Efecto antifúngico in vitro del extracto etanólico de la cáscara de Punica granatum linn “granada” sobre cepas de Candida albicans

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE MEDICINA. IC. IN. A. -U. NT. ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA. ED. Tesis:. Efecto antifúngico in vitro del extracto etanólico. M. de la cáscara de Punica granatum linn “granada”. AD. DE. sobre cepas de Candida albicans. FA. CU. LT. PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE:. MÉDICO CIRUJANO AUTOR:. Bermúdez Azaña, Luis Gustavo ASESOR: Dr. Zárate Arce, Marco Antonio. TRUJILLO-PERÚ 2018. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. DEDICATORIA. A mi Dios eterno, a quien le debo la vida, mi familia, mi carrera y mucho más; quien nunca se apartó de mí en ningún momento y me demuestra cada día su amor infinito.. NT. A mis padres, Leopoldo y Rosa, por su amor, paciencia, motivación y apoyo; por ser mis más grandes mentores, mis soportes, las dos personas más importantes en la vida y por. -U. quienes daría todo. Los amo.. A. A mi hermano, Victor, por ser mi guía y ejemplo a seguir. A mi hermana, Kathy, por ser mi. IN. confidente y compañera de aventuras. Los amo.. ED. llegar a formar parte de mi familia.. IC. A la familia Blas Aranda, a mi cuñada Mónica y a mis sobrinos Dámaris y Mathías, por. M. A mi querida Facultad de Medicina y a mi Promoción LII, quienes aportaron en mi. DE. formación profesional y como persona. A mi madrina Gaby Sotomayor por el apoyo brindado durante estos años de carrera.. AD. A mis hermanos de Visión Médica, y a mi familia de la Junta Directiva CEM 2017, con. LT. quienes compartí gratos momentos y aprendí muchas cosas con ellos.. CU. A mi equipo querido, ScarpaFC, y a todos los integrantes que pudieron compartir los. FA. momentos en cada partido jugado.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. AGRADECIMIENTOS. A mi asesor, el Dr. Marco Antonio Zárate Arce, por la paciencia, la entrega y el apoyo. NT. brindado en la elaboración del presente trabajo.. A. tiempo en la elaboración de la presente investigación.. -U. A la Dra. Elva Mejia Delgado, por el apoyo desinteresado y dedicar parte de su. IN. A la Dra. Milagros Trujillo, por darme el aliento para seguir adelante, por estar pendiente. ED. IC. del avance del presente trabajo y día a día mostrar su preocupación.. M. Al personal técnico del Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina de la UNT,. DE. la Sra. Tania y al Sr. Javier por el apoyo brindado en la ejecución de la presente. AD. investigación.. LT. A la Dra. Marilú Soto Vásquez de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la UNT,. CU. por su apoyo en la elaboración del presente trabajo en la parte de Farmacognosia-. FA. Farmacobotánica.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. ÍNDICE. INTRODUCCIÓN .....................................................................................7. 1.2. Justificación ..................................................................................10. 1.3. Problema .......................................................................................12. 1.4. Hipótesis ........................................................................................12. 1.5. Objetivos........................................................................................12. A. -U. NT. Antecedentes ...................................................................................7. IN. MATERIAL Y MÉTODOS....................................................................13 Material de estudio .......................................................................13. 2.2.. Métodos y técnicas ........................................................................15. 2.3.. Instrumentos de recolección de datos .........................................19. 2.4.. Operacionalización de variables .................................................20. 2.5.. Definición conceptual de variables .............................................21. 2.6.. Análisis estadístico e interpretación de la información ............22. 2.7.. Aspectos éticos ..............................................................................22. DE. M. ED. IC. 2.1.. AD. II.. 1.1. LT. I.. 2.8.. Diseño experimental .....................................................................23. RESULTADOS ........................................................................................24. IV.. DISCUSIÓN .............................................................................................31. FA. CU. III.. V.. CONCLUSIONES ...................................................................................34. VI.. RECOMENDACIONES .........................................................................35. VII.. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ..................................................36. VIII. ANEXOS ..................................................................................................37. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. RESUMEN OBJETIVO: Evaluar la acción antifúngica in vitro del extracto etanólico de la cáscara de Punica granatum linn (EEPGL) “granada” sobre Candida albicans. MATERIAL. Y. METODOS:. Estudio. prospectivo,. transversal,. cuasi-. NT. experimental. La población estuvo conformada por placas inoculadas con cepas de. -U. Candida albicans, y se aplicó el EEPGL a concentraciones de 25%, 50%, 75% y 100%; se utilizó como control positivo Fluconazol y como control negativo cepas. A. puras sin tratamiento.. IN. RESULTADOS: El EEPGL tuvo efecto inhibitorio frente a Candida albicans al. IC. utilizar las diferentes concentraciones, teniendo como CIM 25%. Con respecto a los. ED. halos de inhibición, al medirlos según la escala de Duraffourd, se logró obtener una. M. “sensibilidad límite” en el grupo de fluconazol y los grupos de extracto etanólico de. DE. Punica granatum linn al 100% y 75% en un 100% de las muestras, y a la concentración de 50% en un 20%; y “sensibilidad nula” a los grupos de EEPGL con. AD. concentraciones de 50% en un 80% y de concentración del 25% en un 100%.. LT. CONCLUSION: La presente investigación demuestra que el EEPGL tiene efecto. CU. antifúngico in vitro sobre Candida albicans. PALABRAS CLAVE: Efecto antifúngico, Punica granatum linn, Candida. FA. albicans, Concentración mínima inhibitoria, unidades formadoras de colonia, halos de inhibición.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. ABSTRACT OBJECTIVE: To evaluate the in vitro antifungal effect of the ethanolic extract of Punica granatum linn (EEPGL) on Candida albicans. MATERIAL AND METHODS: Prospective, cross-sectional, quasi-experimental study. The population. NT. consisted of plates inoculated with strains of Candida albicans, and the EEPGL was applied in 25%, 50%, 75% and 100%; Fluconazole was used as positive control and. -U. pure strains without treatment was used as negative control. RESULTS: The. A. EEPGL had an inhibitory effect against Candida albicans when using the different. IN. concentrations, having a MIC of 25%. Regarding the inhibition halos, when. IC. measured according to the Duraffourd scale, a "limit sensitivity" was obtained in. ED. the fluconazole group and the groups of ethanolic extract of Punica granatum linn. M. 100% and 75% in 100% the samples, and at a concentration of 50% by 20%; and. DE. "zero sensitivity" to the EEPGL groups with concentrations of 50% in 80% and concentration of 25% in 100%. CONCLUSION: The present investigation. AD. demonstrates that the ethanolic extract of Punica granatum linn has an antifungal. LT. effect in vitro on Candida albicans. KEY WORDS: Antifungal effect, Punica granatum linn, Candida albicans,. FA. CU. minimum inhibitory concentration, colony forming units, halo of inhibition.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. I. INTRODUCCIÓN 1.1 ANTECEDENTES Candida albicans es considerado el principal hongo patógeno del ser humano, mostrando un incremento en las tasas de morbilidad y mortalidad en los últimos. NT. años. Este microorganismo es un hongo dimórfico que puede presentar una. -U. morfología levaduriforme o como un hongo filamentoso formando hifas verdaderas. Es un microorganismo comensal oportunista que coloniza las membranas mucosas. A. de las regiones mucocutánea, gastrointestinal y genitourinaria en un 30 a 60% de. IN. personas sanas; sin embargo, bajo ciertas condiciones puede generar lesiones en la. IC. mucosa yugal, la lengua, el paladar y los labios. Por otro lado, en aquellos. ED. hospederos susceptibles (pacientes inmunosuprimidos), puede causar infecciones. M. superficiales sistémicas. Cuando la cepa se comporta como patógena generalmente. DE. forman pseudomicelios o micelios verdaderos, mientras que si está como comensal se presenta generalmente como levadura1,2,3.. AD. La candidosis o candidiasis, es una micosis causada por diversas especies de. LT. levaduras de este género de hongos; y son el primer signo de disfunción. CU. inmunológica (candidiasis de la mucosa oral, gastrointestinal y vaginal)3,4,5. El hallazgo de estos organismos como agentes infecciosos involucrados en. FA. enfermedades sistémicas intrahospitalarias, ha aumentado en los últimos años5. Chincha y col (2013), realizaron un estudio observacional retrospectivo con. datos de los años 2010 – 2012 donde describieron la incidencia de infecciones intrahospitalarias asociadas a dispositivos invasivos en unidades de cuidados intensivos del Hospital Nacional Cayetano Heredia, encontrando un total de 222 infecciones intrahospitalarias, donde Candida sp (69%) fue el principal agente infeccioso6. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. La distribución geográfica de la candidosis es universal y más de 70% de los casos reportados son causados por C. albicans serotipo B. Cualquier tejido puede ser afectado, por lo que existe una gran diversidad de cuadros clínicos, asociados directamente al estado inmunológico del paciente. Las candidosis superficiales (mucosas y piel) son frecuentes, de fácil tratamiento y no atentan contra la vida del. NT. paciente, en tanto que las sistémicas de evolución aguda o crónica son generalmente. -U. graves5.. A. Existen varios agentes antifúngicos de uso tópico y sistémico para el. IN. tratamiento de las infecciones por Candida albicans. El fármaco antifúngico de uso. IC. común contra Candida albicans y considerado de primera elección es el Fluconazol;. ED. sin embargo, como consecuencia de su uso tan generalizado, levaduras como Candida sp. han desarrollado resistencia7. Además, sus efectos colaterales como. M. molestias gastrointestinales: náuseas, vómitos, dolor y distensión abdominal y. DE. diarrea; cefalea y exantema cutáneo, limitan su uso. También puede producir un. AD. relativo aumento de transaminasas y bilirrubina, así como hepatitis grave tóxica y síndrome de Stevens Johnson principalmente en población de alto riesgo como. LT. pacientes con SIDA y en pacientes oncológicos8.. CU. El desarrollo de la resistencia de los agentes infecciosos a los medicamentos,. FA. además de los efectos colaterales y adversos relacionados con las drogas existentes, ha animado a investigadores a buscar nuevas opciones de tratamiento, siendo la fitoterapia una de ellas. Esta se constituye de preparados tradicionales, estandarizados, eficaces, con inocuidad y calidad controladas, elaborados de plantas medicinales aisladas, purificadas y de estructura molecular determinada, sin la preconización del uso de sustancias químicamente definidas. Un gran porcentaje de los principios activos están presentes en extractos y en aceites esenciales que pueden obtenerse a partir de hojas, bulbos, rizomas y frutos que contienen: 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. alcaloides, esteroides, terpenoides, flavonoides, gomas, resinas y taninos, etc., que pueden ser letales para las células microbianas (bacterias, levaduras y mohos) o simplemente servir como inhibidores de sus actividades metabólicas2,9. Estos productos de origen vegetal han sido muy estudiados debido a la baja toxicidad relacionada con su uso en la medicina tradicional. Por ello, cada día se. NT. presta más atención al estudio de las plantas medicinales de forma tal que la. -U. etnobotánica y la fitoterapia están tomando un gran auge en el mundo actual, tanto. A. en la medicina aplicada como en la investigación experimental, a tal punto que el. IN. 80 % de la población mundial, aproximadamente unos cuatro mil millones de. IC. personas utiliza a las plantas como principal remedio medicinal en muchas. ED. enfermedades2,9.. La especie de Punica granatum, popularmente conocido como granada, es una. M. planta medicinal cuyo fruto posee propiedades terapéuticas y cuyo origen radica en. DE. el medio oriente y la región mediterránea. Es cultivada en las regiones tropicales y. AD. subtropicales de todo el mundo; en Perú se cultiva en Ica, Lima, La Libertad, Tacna, Moquegua y Lambayeque9. El uso popular extendido de esta planta le ha otorgado. LT. propiedades útiles para la medicina3,9. El pericarpio (cáscara, corteza) de Punica. CU. granatum contiene sustancias como punicalaginas, flavonas, flavanonas, y otros. FA. flavonoides que poseen actividad antiinflamatoria, antimutagénica y antifúngica; útiles como remedio medicinal en muchas enfermedades10. Un estudio realizado por Milthun y col. (2010) determinaron la eficacia. antimicrobiana de Punica granatum, Acacia nilotica, Cuminum cymimum y Foeniculum vulgare sobre Candida albicans; donde Punica granatum mostró la mayor actividad antifúngica contra Candida albicans (p < 0,01 que era altamente significativo) con una zona media de inhibición de 22 mm11.. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. Un estudio realizado por Anibal y col. (2013) demostraron que los extractos etanólicos de Punica granatum, obtenidos de la fruta entera, de arilos y semillas, del pericarpio y de la cáscara tuvieron efecto antifúngico sobre diferentes especies de Candida. A las 24 horas de crecimiento se pudo observar que el extracto obtenido de la cáscara de Punica granatum tuvo un CMI 125 μg / ml para Candida albicans.. NT. Mientras que, después de 48 h de crecimiento, el extracto presentó una actividad. -U. inhibidora con una CMI de 250 μg / ml12.. A. Singla y col. (2013) utilizaron extractos etanólicos y acuosos de cáscaras y. IN. semillas de Punica granatum Linn. Obtuvieron como resultado zonas de inhibición. IC. mínima de 11, 13, 10 y 10 mm, con el extracto etanólico de las cáscaras de Punica. 1637 respectivamente13.. ED. granatum Linn en cepas de Candida albicans MTCC 3958, MTCC 3018, MTCC. M. En otro estudio, realizado por Annasaheb y col. (2014) demostraron que. DE. concentraciones de 30, 60 y 100 mg/ml de extracto etanólico de la cáscara de Punica. AD. granatum Linn daban zonas de inhibición de Candida albicans de 7, 15 y 18 mm de diámetro respectivamente; estos resultados mostraban más potencia que la del. CU. LT. fluconazol estándar (10 μg/ml) con una zona de inhibición de 11 mm de diámetro14.. FA. 1.2 JUSTIFICACIÓN La candidosis o candidiasis, es una infección micótica oportunista causada por. diversas especies de levaduras del género Candida, siendo Candida albicans la especie más importante en un 80% de las infecciones. El hallazgo de estos organismos como agentes infecciosos involucrados en enfermedades sistémicas intrahospitalarias, ha aumentado en los últimos años. La distribución geográfica de la candidosis es universal y más de 70% de los casos reportados son causados por 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. C. albicans serotipo B. Cualquier tejido puede ser afectado, por lo que existe una gran diversidad de cuadros clínicos (localizados y sistémicos), asociados directamente al estado inmunológico del paciente. Las candidosis superficiales (mucosas y piel) son frecuentes, de fácil tratamiento y no atentan contra la vida del paciente, en tanto que las sistémicas de evolución aguda o crónica son generalmente. NT. graves.. -U. El uso excesivo de fármacos, sus efectos adversos (hepatotoxicidad,. A. nefrotoxicidad), el alto costo de los mismos, la resistencia antifúngica, así como el. IN. difícil acceso a las farmacos convencionales son los principales problemas. IC. reconocidos por los pacientes para el tratamiento de esta patología, por lo que es. ED. necesario buscar nuevas alternativas que permitan disminuir el daño causado por los microorganismos con amplio impacto epidemiológico.. M. Además, en el Perú, principalmente en el área rural, existe preferencia por la. DE. medicina natural, por lo que los pacientes guiados por el conocimiento tradicional. AD. recurren al uso de plantas a las que se les atribuyen propiedades curativas, que sin embargo, adolecen de suficientes estudios que validen su uso.. LT. Ante tal problemática, la presente investigación pretende aportar nuevos. CU. conocimientos materializado en una alternativa terapéutica que amplié las. FA. posibilidades de combatirlo y que sea de fácil acceso a la población, disminuyendo también los efectos adversos de los medicamentos empleados comúnmente en las infecciones. por. Candida. albicans;. además,. analizar. las. propiedades. antimicrobianas in vitro del extracto etanólico de Punica granatum Linn sobre las cepas de Candida albicans.. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. 1.3 PROBLEMA ¿El extracto etanólico de la cáscara de Punica granatum Linn “granada” tiene efecto antifúngico in vitro sobre cepas de Candidad albicans?. -. NT. 1.4 HIPÓTESIS Hipótesis nula (Ho):. -U. El extracto etanólico de la cáscara de Punica granatum linn “granada” no tiene. Hipótesis alterna (Ha):. IN. -. A. efecto antifúngico in vitro sobre cepas de Candida albicans.. IC. El extracto etanólico de la cáscara de Punica granatum Linn “granada” sí tiene. ED. efecto antifúngico in vitro sobre cepas de Candida albicans. DE. M. 1.5 OBJETIVOS 1.5.1. Objetivo General. AD. Evaluar la acción antifúngica in vitro del extracto etanólico de la cascara de Punica. LT. granatum linn “granada” sobre cepas de Candida albicans.. CU. 1.5.2. Objetivos específicos. FA.  Determinar la susceptibilidad in vitro del extracto etanólico de la cáscara de Punica granatum Linn “granada” sobre cepas de Candida albicans..  Determinar la concentración inhibitoria mínima del extracto etanólico de la cáscara de Punica granatum Linn sobre las cepas de Candida albicans.  Determinar la susceptibilidad in vitro del Fluconazol sobre cepas de Candida albicans.  Comparar in vitro el efecto antifúngico del extracto etanólico de la cáscara de Punica granatum linn y el Fluconazol sobre cepas de Candida albicans 12. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. II. MATERIAL Y MÉTODOS 2.1. MATERIAL DE ESTUDIO 2.1.1. TIPO DE ESTUDIO Investigación de tipo aplicada y régimen libre.. -. Según el periodo que capta la información: Prospectivo. -. Según la evolución del fenómeno estudiado: Transversal. -. Según la interferencia del investigador en el fenómeno que se analiza:. -U. NT. -. IC. 2.1.2. POBLACIÓN Y MUESTRA. IN. A. Cuasi-Experimental. ED. 2.1.2.1. CARACTERÍSTICAS GENERALES. M. Se realizó con cepas de Candida albicans expuestas a extracto etanólico de. DE. Punica granatum linn “Granada” en concentraciones de 25%, 50%, 75% y 100%.. AD. 2.1.2.2. CRITERIOS DE SELECCIÓN DE MUESTRA. LT. CRITERIOS DE INCLUSIÓN. FA. CU. . Placas con agar Sabouraud con macro dilución de Candida albicans y la concentración de extracto etanólico de Punica granatum Linn correspondiente.. CRITERIOS DE EXCLUSIÓN . Placas con la macrodilución cuyo resultado en el proceso de incubación sea dudoso.. . Placas con la macrodilución donde se presente crecimiento de otras especies diferente a Candida albicans. 13. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. CRITERIOS DE ELIMINACIÓN . Placas Petri con la macrodilución que sufra deterioro o daño durante la conservación y los procedimientos, que no permitan su. 2.1.3. DISEÑO ESTADÍSTICO DE MUESTREO. NT. evaluación posterior.. -U. Se calculó el número de ensayos con el programa estadístico Minitab 17,. A. obteniendo como tamaño de muestra 10 repeticiones como mínimo para cada. IN. nivel. La muestra total estará constituida por 40 unidades de muestreo para los. -. ED. IC. 4 grupos experimentales y 20 para los 2 grupos controles: GRUPO 1: 10 repeticiones utilizando extracto etanólico de Punica. GRUPO 2: 10 repeticiones utilizando extracto etanólico de Punica. DE. -. M. granatum linn (Granada) a una concentración de 25%. granatum linn (Granada) a una concentración de 50% GRUPO 3: 10 repeticiones utilizando extracto etanólico de Punica. AD. -. GRUPO 4: 10 repeticiones utilizando extracto etanólico de Punica. CU. -. LT. granatum linn (Granada) a una concentración de 75%. FA. granatum linn (Granada) a una concentración de 100%. -. GRUPO 5: 10 repeticiones utilizando Fluconazol. -. GRUPO 6: 10 repeticiones sin ningún tratamiento.. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. 2.2. MÉTODOS Y TÉCNICAS 2.2.1. DE LA APROBACIÓN DEL PROYECTO Se obtuvo el permiso para la ejecución, mediante la aprobación del proyecto por el Comité Permanente de Investigación Científica de la Facultad de Medicina. NT. de la Universidad Nacional de Trujillo y la correspondiente Resolución de. -U. Decanato.. 2.2.2. DE LA AUTORIZACIÓN PARA LA EJECUCIÓN. A. Después de haber sido aprobado el proyecto, se solicitó el permiso para hacer. IC. ED. Universidad Nacional de Trujillo.. IN. uso del Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina de la. 2.2.3. DE LA CERTIFICACIÓN DEL EXAMINADOR. DE. supervisión de su asesor.. M. La presente investigación se desarrolló por el investigador principal, bajo la. AD. El investigador se certificó por su asesor, experto en el tema, para lo cual realizó la lectura de 10 placas Petri para el conteo de las UFC mediante la inspección. LT. visual de cada placa y también repitió la medición con un vernier los halos de. CU. inhibición en milímetros entre el investigador y asesor.. FA. 2.2.4. EXTRACTO ETANÓLICO DE Punica granatum linn (granada) PARA EL ESTUDIO. 2.2.4.1. Recolección e identificación taxonómica de Punica granatum (granada) El fruto completo de la granada (5kg) se recolectó del distrito La Esperanza, provincia de Trujillo, departamento de la Libertad, ubicada a 50 msnm. Un ejemplar, se llevó al Herbarium Truxillense de la Universidad Nacional de Trujillo para su identificación y posterior verificación taxonómica según el sistema filogenético de la especie. 15. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. 2.2.4.2. Preparación de la muestra vegetal Obtenida la muestra necesaria de Punica granatum linn, fue trasnportada al laboratorio de Farmacognosia de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional. de Trujillo.. Los. frutos. recolectados. fueron. seleccionados, teniendo en cuenta que estén en buenas condiciones, sin ataques. NT. de hongos. Luego, fueron lavados con agua destilada, seguido de una. -U. desinfección, utilizando hipoclorito de sodio al 0.5%. Posteriormente, se. A. realizó un enjuague con suficiente agua destilada estéril, para retirar los. IN. residuos de hipoclorito.. ED. llevadas a secar a una estufa a 40°C.. IC. Se pelaron las cáscaras de los frutos, y fueron colocadas en papel Kraft y. Una vez secadas las cáscaras de los frutos, se pulverizaron con ayuda de un. M. molino y se tamizaron utilizando el tamiz N° 0.75 hasta obtener polvo semifino.. DE. Luego estos fueron guardados en un frasco de vidrio color ámbar15.. AD. 2.2.4.3. Preparación del extracto etanólico de las cáscaras de Punica. LT. granatum linn. CU. Se pesó con exactitud 200g de polvo de Punica granatum linn. Luego, se. FA. colocó en un frasco de vidrio color ámbar de boca ancha, de capacidad de 4 litros y, se añadió 1 litro de etanol 70% hasta cubrir la muestra por sobre 2 cm de altura. Se mezcló bien, teniendo en cuenta que la mezcla debe ocupar como máximo las ¾ partes del recipiente. Se tapó el recipiente y se maceró por 7 días, agitándose por 15 minutos, dos veces al día. Transcurrido el tiempo de maceración, se filtró el macerado, al vacío con papel de filtro Whatman N° 1. El extracto etanólico filtrado se llevó a sequedad en una cámara de secado vacío a una presión reducida y a una temperatura de 40°C; luego se pesó el residuo 16. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. seco. A partir del residuo seco, se prepararon las concentraciones de 25% (250 mg/ml), 50% (500 mg/ml), 75% (750 mg/ml), 100% (100 mg/ml) disueltas en etanol de 70%. Finalmente, los extractos etanólicos se guardaron en frascos de vidrio ámbar previamente esterilizados y en refrigeración (4 – 8°C) hasta su. NT. posterior utilización15,16.. -U. 2.2.5. PREPARACIÓN DE LAS CEPAS MICÓTICAS. Se trabajó con cepas de Candida albicans, obtenidas del cepario de la sección. IN. A. de microbiología de la facultad de medicina de la universidad nacional de. IC. Trujillo, para su posterior aislamiento e identificación, y conservación en medio. ED. Agar Sabouraud.. M. 2.2.6. CRECIMIENTO DE LAS CEPAS MICÓTICAS. DE. Las cepas de Candida albicans fueron activadas y cultivadas en tubos de ensayo a 37°C por 24 horas en medio Agar, para su posterior crecimiento.. AD. 2.2.7. ESTANDARIZACIÓN DE Candida albicans. LT. La cepa de Candida albicans, se cultivó en tubos de ensayo cerrados. CU. herméticamente conteniendo el medio agar Sabouraud para el crecimiento de este hongo.. FA. Se incubó a 37°C con el fin de obtener colonias jóvenes. Luego de 24 horas se suspendieron en un tubo con 5ml solución salina estéril (ClNa 0,85%). Se agitó bien y se ajustó a la turbidez al equivalente al tubo 0.5 de la escala de Mc Farland hasta alcanzar el inóculo 108 hongos/mL. Los tubos fueron girados entre las manos entre 30-40 segundos antes de proceder al sembrado para distribuir los microorganismos.. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. 2.2.8. DETERMINACIÓN. DE. EFECTO. ANTIFÚNGICO. (PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD) Es un método cuantitativo, que se realizó para determinar el efecto antifúngico del extracto etanólico de Punica granatum linn. Previamente, se preparon discos de papel filtro estériles y se sumergieron. NT. 10 discos en cada una de las concentraciones del extracto etanólico de Punica. -U. granatum linn. Luego, con un hisopo estéril, el cual fue embebido en el tubo. A. del cultivo preparado, se sembraron las cepas de Candida albicans en placas. IN. Petri con agar Sabouraud. El hisopado se sembró uniformemente sobre toda la. IC. superficie del agar y girando cada placa 30º por 10 veces aproximadamente.. ED. Posteriormente, con una aguja estéril se colocaron los discos, previamente sumergidos, sobre los cultivos de Candida albicans en las placas. M. preparadas. Además, un grupo control con cepas de Candida albicans permitió. DE. evaluar el efecto frente al Fluconazol.. AD. Todas las placas se incubaron a 37ºC durante 24 horas. Pasadas las 24 horas se realizó la lectura de los resultados.. LT. Se midieron los halos de inhibición incluyendo el diámetro del disco. CU. haciendo uso de una regla milimetrada. La concentración de extracto que ejerce. FA. el halo fue usada para evaluar el efecto antifúngico del antimicrobiano. La lectura de los halos de inhibición producidos se midió en milímetros tomando en cuenta la escala de Duraffourd17. o Nula (-) para un diámetro inferior a 8 mm. o Sensibilidad límite (sensible = +) para un diámetro comprendido entre 8 a 14 mm. o Medio (muy sensible = ++) para un diámetro entre 14 y 20 mm. o Sumamente sensible (+++) para un diámetro superior a 20 mm 18. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. 2.2.9. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN INHIBITORIA MÍNIMA (CIM) Se prepararon 6 tubos de ensayo; de los cuales a 4 tubos se le añadió 0,8 ml de cada concentraciones del extracto etanólico de 25, 50%, 75%, y 100% de Punica granatum linn en cada tubo. Un quinto tubo, correspondió al control. NT. positivo con 0.8 ml de Fluconazol y un sexto tubo correspondió al control. -U. negativo, sin ningún tratamiento; además a los seis tubos se le añadió 0,2 mL. A. de la cepa de Candida albicans18,19.. IN. Posteriormente, los tubos se mezclaron hasta que se uniformizaron y luego. IC. se incubaron a 37° C durante 24 horas. Luego, se determinaron las cuentas. ED. viables sembrando 0,1 mL de solución de cada uno de los tubos en 10 placas para agar Sabouraud (Candida albicans), por cada concentración y grupos. M. controles utilizados. Dichas placas se colocaron en la estufa por 24 h a 37°C y. DE. luego se observó el crecimiento del microorganismo mediante el conteo de. AD. Unidades Formadoras de Colonias, considerándose como CIM a la menor. CU. LT. concentración en la cual no se observan UFC 18, 19. UFC= N/4 x A x D. N= número de colonias; A= Área; D= Dilución. FA. Todo el procedimiento se llevó a cabo dentro del diámetro de 10 cm alrededor de la llama de un mechero bunsen y fueron 10 placas Petri por concentración.. 2.3. INSTRUMENTOS DE RECOLECCIÓN DE DATOS Se llenaron los datos obtenidos en las fichas elaboradas (ANEXO Nº1 Y N°2) El instrumento contiene: 1. El conteo de las Unidades Formadoras de Colonias (UFC) 2. Medida de halos de inhibición expresada en milímetros (mm). 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. 2.4. OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES VARIAB. DEFINICION. DIMENSION. TIPO DE. DEFINICIÓN. ESCALA. LE. CONCEPTUAL. ES. VARIABLE. OPERACIONAL E. DE. INDICADORES. MEDICIO. Cantidad de. Cualitativa. característico,. extracto. extracto etanólico de. obtenido a partir de. etanólico en. Punica granatum Linn. la cáscara de. ml.. en concentraciones de. -U. A IN. linn desecada, por. IC. maceración o percolación en. ED. contacto con etanol, seguida de. M. la eliminación de. DE. dicho solvente por un procedimiento. AD. físico20.. Cuantitativa. Unidades Formadoras. DE RAZON. Inhibitoria. de Colonias (UFC) por. extracto etanólico. Mínima. ml. CU. LT. Interacción entre el. de Punica. Susceptibilidad. granatum Linn. antifúngica. Cuantitativa. Escala de Duraffourd:. DE. Diámetro en mm. RAZON. FA. (Variable dependiente). NOMINAL. 25, 50,75 y 100%.. Concentración. Efecto antifúngico. Administración de. NT. Mezcla con olor. Punica granatum independiente). Extracto etanólico de Punica granatum L. (Variable. N. sobre Candida albicans. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. 2.5. DEFINICIÓN CONCEPTUAL DE VARIABLES Extracto etanólico de Punica granatum linn: Mezcla con olor característico, obtenido a partir de la cáscara de Punica granatum linn desecada, por maceración o percolación en contacto con etanol, seguida de la. -U. Efecto antifúngico “in vitro” frente a Candida albicans:. NT. eliminación de dicho solvente por un procedimiento físico20.. A. Interacción entre el extracto etanólico de Punica granatum linn sobre Candida. IN. albicans. Se tomó como concentración efectiva, al tener como resultados 0 UFC.. IC. Y para determinar la sensibilidad fúngica, se utilizó la Escala de Duraffourd,. M. diámetro de inhibición.. ED. escala utilizada para determinar cualitativamente el efecto inhibitorio in vitro, según. Nula (-) para un diámetro inferior a 8 mm.. -. Sensibilidad límite (sensible = +) para un diámetro comprendido entre 8 a. AD. 14 mm.. DE. -. Medio (muy sensible = ++) para un diámetro entre 14 y 20 mm.. -. Sumamente sensible (+++) para un diámetro superior a 20 mm.. CU. LT. -. FA. Sensibilidad de Candida albicans a Fluconazol: Se consideró según el diámetro de inhibición21: -. Susceptible: Halo de inhibición igual o superior a 19 mm. -. Dosis susceptible: Halo de inhibición entre 15 y 18 mm. -. Resistente: Halo de inhibición menor o igual a 14 mm.. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. 2.6. ANÁLISIS. ESTADÍSTICO. E. INTERPRETACIÓN. DE. LA. INFORMACIÓN Se usó la prueba no paramétrica Kruskal-Wallis, debido a que al realizar la prueba de análisis de varianza (ANOVA) hubo un incumplimiento de normalidad en las. NT. muestras analizadas (a excepción del control positivo con Fluconazol) y un incumplimiento de la homogeneidad de varianza, lo que hacía de esta prueba una. -U. herramienta no útil en este caso.. A. Los datos fueron organizados en el programa Microsoft Excel 2013, e ingresados. IN. en los programas IBM SPSS Stadistics 22 y STATA 14 para aplicar las pruebas. 2.7. ASPECTOS ETICOS. ED. IC. estadísticas.. M. - Para la ejecución de esta investigación, el personal investigador tomó todas las. DE. medidas estándares de bioseguridad establecida por el Ministerio Nacional de Salud. AD. (MINSA) antes, durante y después de cada procedimiento microbiológico. - Se tomó en cuenta el principio de precaución en conformidad con el Principio 15. LT. de la Declaración de Río sobre el Medio Ambiente y el Desarrollo22 y el Protocolo. CU. de Cartagena sobre Seguridad de la Biotecnología del Convenio sobre la Diversidad. FA. Biológica23, considerando los riesgos para la salud humana.. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. FA. CU. LT. AD. DE. M. ED. IC. IN. A. -U. NT. 2.8. DISEÑO EXPERIMENTAL: Extracto etanólico de Punica granatum linn (EEPGL). 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. III. RESULTADOS. A) DETERMINACIÓN DE LOS HALOS DE INHIBICIÓN. NT. En la TABLA N°01 se describe los análisis de desviación estándar de cada grupo: La desviación estándar en la concentración del EEPGL al 25% fue 3.46,. -U. al 50% fue 0.42, al 75% fue 1.10 y al 100% fue 0.92. En el grupo de Fluconazol. A. la desviación estándar fue 1.10.. IN. En la TABLA N°02 se muestra el efecto inhibitorio in vitro según diámetro de. IC. inhibición por grupos de investigación teniendo en cuenta la escala cualitativa. ED. de Duraffourd: Se clasifica como “sensibilidad límite” al grupo de fluconazol. M. en un 100% y a los grupos de extracto etanólico de granada con concentraciones de 100% y 75% en un 100% y al de concentración de 50% en un 20%; mientras. DE. que se clasificó como “sensibilidad nula” a los grupos de EEPGL con. AD. concentraciones de 50% en un 80% y de concentración del 25% en un 100%.. LT. En el GRÁFICO N°01 se utilizó la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis, obteniéndose como resultado que sí existe diferencia significativa entre las. CU. medias de los diámetros de halos de inhibición de los grupos de investigación. FA. dado que el valor de P de la tabla es menor que 0.05. (p = 0.000). La TABLA N°03 muestra las comparaciones entre cada concentración del extracto etanólico de Punica granatum linn (25%, 50%, 75%, 100%) con el Fluconazol. El extracto etanólico a la concentración de 100% no tiene diferencia significativa con el Fluconazol; y las concentraciones de 25%, 50% y 75% sí tienen diferencia significativa con el Fluconazol.. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. B) DETERMINACIÓN. DE. LA. CONCENTRACIÓN. MÍNIMA. INHIBITORIA (CIM). En la TABLA N°04 mostramos que la efectividad antifúngica en los cuatro grupos de concentración de EEPGL así como en el grupo de fluconazol fue de. NT. 100% debido a que no se observó crecimiento de UFC en ninguna de las 10. FA. CU. LT. AD. DE. M. ED. IC. IN. A. -U. repeticiones de los 5 grupos mencionados.. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. TABLA N°01: EFECTO INHIBITORIO in vitro PROMEDIO SEGÚN DIÁMETROS DE INHIBICIÓN POR GRUPOS DE INVESTIGACIÓN SOBRE Candida albicans. N°. PROMEDIO. ESTÁNDAR. 10. Extracto etanólico de granada 50%. 10. Extracto etanólico de granada 75%. M. 3.46 0.42. 10. 8.9. 1.10. 10. 10.8. 0.92. 10. 23.9. 1.10. IC. IN. 7.2. ED. Extracto etanólico de granada 100%. 4. A. Extracto etanólico de granada 25%. -U. INVESTIGACIÓN. Fluconazol. DESV.. NT. GRUPOS DE. DE. FUENTE: Datos obtenidos por el investigador. Laboratorio de. FA. CU. LT. AD. Microbiología de la Facultad de Medicina – UNT. Setiembre 2018.. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. TABLA N°02: EFECTO INHIBITORIO in vitro SEGÚN DIÁMETROS DE LOS. HALOS. DE. INHIBICIÓN. (EN. mm). POR. GRUPOS. DE. INVESTIGACION SOBRE Candida albicans GRUPO DE INVESTIGACION. Sensibilidad. ni. %. ni. 10. 100%. 0. 0%. 0. 0%. %. ni. 8 80%. 0. 100%. Fluconazol. NT. 75%. -U. 50%. %. ni. %. ni. %. 0. 0%. 0. 0%. 10. 100%. 0%. media Sumamente. 0. AD. sensible. ED. Sensibilidad. 10. 0%. 100%. 0. 0. 0%. 0%. 0. 0%. 0. 0%. 0. 0%. 0. 0%. 0. 0%. 0. 0%. 10 100%. 10. 100%. 10 100% 10 100%. LT. TOTAL. 2 20% 10 100% 10 100%. M. límite. DE. Sensibilidad. IC. IN. nula. 25%. A. SENSIBILIDAD. FUENTE: Datos obtenidos por el investigador. Laboratorio de. FA. CU. Microbiología de la Facultad de Medicina – UNT. Setiembre 2018.. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. GRÁFICO. Nº01:. DETERMINAR. PRUEBA. DE. DIFERENCIAS. –. KRUSKAL. WALLIS. SIGNIFICATIVAS. PARA. EN. LOS. DIAMETROS DE LOS HALOS DE INHIBICIÓN (EXPRESADAS EN mm). FA. CU. LT. AD. DE. M. ED. IC. IN. A. -U. NT. ENTRE LOS GRUPOS DE INVESTIGACION SOBRE Candida albicans. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. TABLA N° 03: COMPARACIÓN DEL EFECTO INHIBITORIO in vitro SEGÚN. DIÁMETROS. DE. INHIBICIÓN. POR. GRUPOS. DE. INVESTIGACIÓN SOBRE Candida albicans.. de. Error. 6,450. 25% - 75%. -18,950. 6,450. 25% - 100%. -27,350. 6,450. (Fluconazol). Ajust.. 0,258. 1,000. -2,938. 0,003. 0,033. -4,240. 0,000. 0,000. 6,450. -5,953. 0,000. 0,000. -38,400. IC. 25% - Control positivo. Sig.. -1,132. -U. -7,300. Sig.. contraste. IN. 25% - 50%. Estadístico de. ED. contraste. Desv.. A. Muestra 1 - Muestra 2. Error. NT. Estadístico. -11,650. 6,450. -1,806. 0,071. 0,709. 50% - 100%. -20,050. 6,450. -3,108. 0,002. 0,019. -31,100. 6,450. -4,822. 0,000. 0,000. -8,400. 6,450. -1,302. 0,193. 1,000. -19,450. 6,450. -3,015. 0,003. 0,026. -11,050. 6,450. -1,713. 0,087. 0,867. DE. M. 50% - 75%. (Fluconazol). LT. 75% - 100%. AD. 50% - Control positivo. CU. 75% - Control positivo. FA. (Fluconazol). 100% - Control positivo (Fluconazol). 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. TABLA Nº04: CONCENTRACIÓN INHIBITORIA MÍNIMA DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE Punica granatum linn SOBRE Candida albicans.. UFC. TRATAMIENTO. Concentración del. 0. -U. 25% 50%. extracto etanólico de. IN. 100%. 100%. 0. 100%. 0. 100%. 0. 100%. A. 75%. Punica granatum linn. % Efectividad. NT. GRUPOS DE. Fluconazol. 0. 100%. Control negativo. Sin tratamiento. 108. 0. M. ED. IC. Control positivo. FUENTE: Datos obtenidos por el investigador. Laboratorio de. FA. CU. LT. AD. DE. Microbiología de la Facultad de Medicina – UNT. Setiembre 2018.. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. IV.. DISCUSION. La resistencia a los medicamentos y los efectos indeseables causados por los agentes antifúngicos existentes han sido de gran preocupación para muchos investigadores, por ello se ha venido desarrollando numerosos estudios con la. NT. finalidad de encontrar nuevos principios activos antimicrobianos presentes en. -U. productos naturales. Este interés va aumentando a lo largo de los años, y las plantas. A. medicinales se han identificado como fuentes de compuestos bioactivos, siendo. IC. modo de acción y sitios objetivo12,25.. IN. aislados y sometidos a análisis estructurales detallados para comprender mejor su. ED. El presente estudio evaluó el efecto antifúngico in vitro del extracto etanólico de Punica granatum linn sobre cepas de Candida albicans. Usando la prueba de. M. crecimiento de UFC, se observó que con las 4 concentraciones del extracto. DE. etanólico no hubo crecimiento de Candida albicans, siendo la concentración. mg/ml).. AD. minima inhibitoria (CIM) correspondiente al grupo de concentración al 25% (250. LT. Este efecto inhibitorio es debido a que Punica granatum (granada) contiene. CU. en su cáscara compuestos como granatinas A y B, taninos hidrolizables como. FA. punicalagina, punicalina, pedunculagina y punigluconina que le proporcionan la propiedad antimicrobiana. El extracto de granada inhibe el crecimiento de las levaduras del género Candida mediante diferentes mecanismos: Inhibición de enzimas extracelulares, privación de sustratos e iones metálicos necesarios para el crecimiento microbiano, acción directa sobre el metabolismo microbiano a través de la inhibición de la fosforilación oxidativa, acción en la célula especificamente en la membrana celular precipitando proteínas12,26.. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. Anibal y col. investigaron a partir de extractos etanólicos de la fruta entera, arilos, semillas, pericarpio y cáscara de granada y el efecto sobre Candida spp. Los extractos del pericarpio y de la cáscara de la fruta mostraron actividad contra Candida albicans con una CIM de 125 µg/ml cada uno, a las 24 horas de crecimiento. Después de 48 horas de crecimiento, los extractos obtenidos del. NT. pericarpio y de la cáscara tuvieron una CIM de 250 µg/ml. Resultados comparables. -U. al presente estudio, con CIM a la concentración del 25% (250 mg/ml)12.. A. Un resultado similar fue el de Annasaheb y col., quienes con concentraciones. IN. de extracto etanólico de granada de 30% (30 mg/ml), 60% (60 mg/ml) y 100% (100. IC. mg/ml) encontraron que las zonas de inhibición media fueron de 7 mm, 15 mm y. ED. 18 mm respectivamente; comparando con el Fluconazol como control positivo que presentó un diámetro de inhibición media de 11 mm. Resultados comparables a la. M. presente investigación, donde a las concentraciones de 25%, 50%, 75% y 100%. DE. obtuvimos como zonas de inhibición media de 4, 7.2, 8.9 y 10.8 mm. AD. respectivamente en comparación al obtenido con el Fluconazol de 23.9 mm14. De igual manera, Singhal y col. determinaron los halos de inhibición del. LT. extracto etanólico de Punica granatum frente a Candida albicans, obteniendo como. CU. resultado que a las 24 horas de crecimiento el extracto etanólico (100 mg/ml) tuvo. FA. como zona de inhibición un diámetro de 14,33 mm. Resultados comparables a la presente investigación que obtuvimos 10,8 mm en la concentración al 100% (100 mg/ml) del extracto26. Gowhar y col. (2015), determinaron los halos de inhibición de los extractos de Punica granatum frente a Candida albicans. Obtuvieron a las concentraciones de 25% (250 mg/ml), 50% (500 mg/ml) y 75% (750 mg/ml) halos de inhibición media de 13 ± 1.23mm, 14.8 ± 1.30mm y 16 ± 2.55 mm respectivamente. Resultados comparables con la presente investigación, donde obtuvimos que a las 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. concentraciones de 25%, 50% y 75% presentaron halos de inhibición media de 4 ± 3.46mm, 7.2 ± 0.42 mm y 8.9 ± 1.1mm respectivamente27. Saeed y col (2015), de 30 conejos (con edades entre 6 y 7 meses, y con un peso de 1.37 a 1.4 kg) obtuvieron muestras de Candida albicans de heridas infectadas. Determinaron el efecto antifúngico de 2 concentraciones de 300 mg/ml. NT. y 500 mg/ml de extracto etanólico de Punica granatum obteniendo como zonas de. -U. inhibición de 8.6 mm ± 0.71 y 10.7 mm ± 0.31 respectivamente. Resultados comparables al del presente trabajo que obtuvo a la concentración máxima de. IN. A. 100mg/ml (100%) una zona de inhibición de 10.8 mm ± 0.9230.. IC. Rizwan R. y col. (2018), aislaron especies de Candida de muestras de vagina,. ED. aspirado traqueal, pus, herida, fluidos de cavidad corporal, esputo, orina y sangre de 130 pacientes infectados. Obtuvieron zonas de inhibición medias del extracto de. M. Punica granatum y Berberis aristata de 17.48mm ± 4.03 y 22.27mm ± 4.93. DE. respectivamente; en comparación al de Fluconazol y Voriconazol donde obtuvieron. AD. 14.29 mm ± 12.86 y 16.90 mm ± 13.92 respectivamente. Resultados comparables al de la presente investigación, que se obtuvo como zona de inhibición media. LT. máxima de 10.8 mm ± 0.92 en comparación a nuestro control positivo (Fluconazol). CU. que tuvo una zona de inhibición media de 23.9 mm ± 1.10 29.. FA. El presente estudio permitió evaluar y comparar los efectos antifúngicos del. extracto etanólico de la cáscara de Punica granatum linn (granada) frente a cepas de Candida albicans. En cuanto a la toxicidad de Punica granatum (granada), esta resulta ser eficiente, sin tener efectos nocivos a dosis terapéuticas <2000 mg al día, junto con efectos hepatoprotectores y nefroprotectores. Es conocido como "superalimento" por los mitólogos debido a su aparente valor nutritivo no tóxico y curativo29. 30.. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. V. CONCLUSIONES.  El diámetro in vitro del halo inhibitorio generado por el extracto etanólico de. NT. Punica granatum linn sobre Candida albicans al 25% fue de 4 ± 3.46 mm, al. -U. 50% de 7.2 ± 0.42mm, al 75% de 8.9 ± 1.1 mm y al 100% de 10.8 ± 0.92 mm.  La concentración mínima inhibitoria del extracto etanólico de Punica granatum. IN. A. linn (granada) fue 25% (250 mg/ml) frente a Candida albicans.. IC.  El diámetro in vitro del halo inhibitorio generado por el Fluconazol sobre. ED. Candida albicans fue de 23.9 ± 1.10 mm.. M.  El efecto antifúngico del extracto etanólico de Punica granatum linn a las concentraciones de 25%, 50% y 75% tuvieron una diferencia significativa con. DE. Fluconazol con un “p” de 0.000, 0.000, 0.026 respectivamente; sin embargo, a. AD. la concentración de 100% no tuvo diferencia significativa con Fluconazol con. FA. CU. LT. un “p” de 0.867 (p > 0.05).. 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. VI. RECOMENDACIONES.  Realizar estudios para ampliar el espectro de actividad antifúngica, con extractos etanólicos de Punica granatum linn a concentraciones menores al 25%.. NT.  Aislar los principios activos de Punica granatum linn responsables de su. -U. actividad antimicrobiana..  Realizar estudios in vitro con extractos etanólicos de Punica granatum linn en. A. otras cepas microbianas.. IC. IN.  Realizar estudios in vivo de los extractos etanólicos de Punica granatum linn en. ED. modelos animales mediante diferentes vías de administración, para evaluar el efecto antifúngico, así como la dosis terapéutica y la concentración óptima para. FA. CU. LT. AD. DE. M. ser utilizado como medicamento.. 35 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. 1. Campelo M, Vieira J, De Medeiros D.Potencial antifúngico da Punica granatum Linn na odontologia. Rev Bras Pesq Saúde. 2014; 16 (1): 112 – 117. Disponible. NT. en: http://periodicos.ufes.br/RBPS/article/view/8498 2. Bustillos L. Elaboración de un gel de Punica granatum para el tratamiento de. -U. pacientes con estomatitis protésica. Acta Bioclínica. 2012; 2 (4): 44 – 52. en:. A. Disponible. IN. http://erevistas.saber.ula.ve/index.php/actabioclinica/article/view/4183. IC. 3. Tobar E, Silva F, Olivares R, Gaete P, Luppi M. Candidiasis invasoras en el. ED. paciente crítico adulto. Rev Chil Infect. 2011; 28(1): 41-49. M. 4. Panizo M, Reviákina V. Candida albicans y su efecto patógeno sobre las. DE. mucosas. Rev. Soc. Ven. Microbiol. 2001; 21(2): 38-45. 5. Pineda J, Cortés A, Uribarren T, Castañón L. Candidosis vagingal. Revisión de. Risaralda.. AD. la literatura y situación de México y otros países latinoamericanos. Rev Med 2017;. 23. (1):. 38-44.. Disponible. en:. LT. http://www.scielo.org.co/scielo.php?pid=S0122-. CU. 06672017000100009&script=sci_abstract&tlng=es. FA. 6. Chincha O, Cornelio E, Valverde V, Acevedo M. Infecciones intrahospitalarias asociadas a dispositivos invasivos en unidades de cuidados intensivos de un hospital nacional de Lima, Perú. Rev. Perú med. 2013; 30(4): 616-620. 7. Gómez C. Resistencia de levaduras del género Candida al fluconazol. Rev Infect.. 2010;. 14(2):. 172-180.. Disponible. en:. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S012393921070134X 8. Catalán M y Montejo J. Antifúngicos sistémicos. Farmacodinamia y farmacocinética. Rev Iberoam Micol. 2006; 23(1): 39-49. 36 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

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(41) ED. IC. IN. A. -U. NT. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. FA. CU. LT. AD. DE. M. VIII. ANEXOS. 41 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(42) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. ANEXO Nº01: Diámetros de halos de inhibición en mm en función a cuatro concentraciones de extracto etanólico de la cáscara de Punica granatum linn “granada” sobre cepas de Candida albicans. Control: Fluconazol (Control positivo) y Sin tratamiento (control negativo). MEDICIÓN DE LOS HALOS DE INHIBICIÓN Control Control (-). NT. Punica granatum linn. 25%. 50%. 75%. 100%. mm. mm. mm. A. 7. 7. 10. 13. 7. 7. 10. 10. 0. 7. 11. 11. 9. 10. 7. 8. 11. 7. 8. 10. 0. 7. 8. 11. LT. -U. (+). 0. 7. 8. 10. 6. 8. 9. 11. 7. 7. 8. 11. 4. 7.2. 8.9. 10.8. Numero de. 3 4. 7. 6. AD. 6. 7 8. CU. 9. 10. FA. PROMEDIO. IC. 8. DE. 0. 5. ED. 2. M. 1. mm. IN. Repeticiones. Fluconazol. mm. Sin tratamient o mm. 25 23 23 22 25 24 25 24 23 25 23.9. FUENTE: Datos obtenidos por el investigador, año 2018. 42 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(43) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. ANEXO N° 02: Número de UFC en cuatro concentraciones del extracto etanólico de la cáscara de Punica granatum linn “granada”sobre cepas de Candida albicans. Control: Fluconazol (Control positivo) y Sin tratamiento (control negativo). CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA (CIM) Control. NT. Punica granatum linn. Control (-). Fluconazol. Sin tratamiento. 25%. 50%. 75%. UFC/ml. UFC/ml. UFC/ml. UFC/ml. UFC/ml. UFC/ml. 1. 0. 0. 0. 0. 0. 108. 2. 0. 0. 0. 0. 108. 3. 0. ED. 0. 0. 0. 0. 0. 108. 4. 0. 0. 0. 0. 0. 108. 5. 0. 0. DE. 0. 0. 0. 108. 0. 0. 0. 0. 0. 108. 0. 0. 0. 0. 0. 108. 0. 0. 0. 0. 0. 108. 9. 0. 0. 0. 0. 0. 108. FA. -U. (+). 10. 0. 0. 0. 0. 0. 108. PROMEDIO. 0. 0. 0. 0. 0. 108. Numero de. AD. 7. CU. 8. LT. 6. M. IC. IN. A. Repeticiones. 100%. FUENTE: Datos obtenidos por el investigador, año 2018. 43 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(44) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. ANEXO N° 03: Constancia de Asesoría UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE MEDICINA. -U. CONSTANCIA DE ASESORÍA. NT. ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MEDICINA. Yo, Marco Antonio Zárate Arce, profesor principal a tiempo completo del. IN. A. Departamento Académico de Ciencias Básicas de la Facultad de Medicina de la. ED. IC. Universidad Nacional de Trujillo.. M. CERTIFICO. DE. Ser asesor de la tesis titulada: “EFECTO ANTIFÚNGICO in vitro DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE LA CÁSCARA DE Punica granatum linn. AD. “granada” SOBRE CEPAS DE Candida albicans”, perteneciente al estudiante de. LT. Pregrado: Luis Gustavo Bermúdez Azaña, identificado con DNI: 47308287,. CU. código de matrícula: 1011801913; de la facultad de Medicina de la Universidad. FA. Nacional de Trujillo. Se expide la presente para los fines correspondientes. Trujillo, 17 de enero del 2018. Marco Antonio Zárate Arce Código Docente: 2880 ASESOR 44 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(45) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. FA. CU. LT. AD. DE. M. ED. IC. IN. A. -U. NT. ANEXO N° 04: Constancia de Aprobación para ejecución del proyecto. 45 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(46) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. ANEXO N° 05: Constancia de preparación del extracto etanólico de Punica. FA. CU. LT. AD. DE. M. ED. IC. IN. A. -U. NT. granatum linn.. 46 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(47) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. FA. CU. LT. AD. DE. M. ED. IC. IN. A. -U. NT. ANEXO N° 06: Constancia de adquisición de la cepa de Candida albicans. 47 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(48) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNT. ANEXO N° 07: Constancia para la Determinación taxonómica de la fruta Punica. FA. CU. LT. AD. DE. M. ED. IC. IN. A. -U. NT. granatum linn “granada”. 48 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.