EFECTO DE DOS PROTECTORES UV EN EL COMPLEJO ESPORA CRISTAL DE Bacillus thuringiensis subsp israelensis MICROENCAPSULADO, SOBRE LA ACTIVIDAD LARVICIDA EN Aedes aegypti

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(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICA UNIDAD DE INVESTIGACIÓN. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. DE. CI EN. CI. EFECTO DE DOS PROTECTORES UV EN EL COMPLEJO ESPORA-CRISTAL DE Bacillus thuringiensis subsp. israelensis MICROENCAPSULADO, SOBRE LA ACTIVIDAD LARVICIDA EN Aedes aegypti.. TESIS. PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL DE:. TE. CA. BIÓLOGO - MICROBIÓLOGO. BI. BL. IO. AUTORA: Br. Keyla Mirely Torres Chiclayo. ASESORA: Dra. Eva Elizabeth Villanueva Tarazona. TRUJILLO – PERÚ 2017. 2014. i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE. LO. Dr. Orlando Gonzáles Nieves. G. IC. AS. TRUJILLO. CI EN. CI. AS. BI. O. RECTOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. Dr. Rubén Vera Véliz. TRUJILLO. BL. IO. TE. CA. DE. VICE-RECTOR ACADÉMICO DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE. Dr. Steban Ilich Zerpa. BI. SECRETARIO GENERAL DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS. LO. G. IC. AS. BIOLÓGICAS. Dr. Freddy Mejía Coico. CI EN. CI. AS. BI. O. DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. Dr. Wilmer Zelada Estraver. BIOLÓGICAS. BL. IO. TE. CA. DE. PROFESOR SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS. Dra. Bertha Soriano Bernilla. BI. DIRECTORA DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DE LA ASESORA. La que suscribe, Dra. Eva Elizabeth Villanueva Tarazona, Asesora de la. AS. presente Tesis: “Efecto de dos protectores UV en el complejo espora-cristal de. IC. Bacillus thuringiensis subsp. israelensis microencapsulado, sobre la actividad. O. LO. G. larvicida en Aedes aegypti”. BI. CERTIFICA:. AS. Que la investigación ha sido desarrollada de conformidad con su. CI EN. CI. correspondiente proyecto y con las orientaciones pertinentes brindadas a la tesista.. Que el presente informe ha sido redactado bajo mi asesoramiento, y acoge las sugerencias y observaciones pertinentes. Por ello, autorizo a la Br. Keyla Mirely Torres. BL. IO. TE. CA. DE. Chiclayo para continuar con los procedimientos según sus fines.. BI. Dra. Eva Elizabeth Villanueva Tarazona ASESORA. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. PRESENTACIÓN. G. IC. AS. SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:. LO. En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de Grados. O. y Títulos de la Universidad Nacional de Trujillo, ponemos a vuestra consideración y. BI. criterio el trabajo de investigación titulado: “Efecto de dos protectores UV en el. AS. complejo espora-cristal de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis microencapsulado,. CI EN. Profesional de Biólogo-Microbiólogo.. CI. sobre la actividad larvicida en Aedes aegypti” con el propósito de obtener el Título. DE. Esperando que vuestro criterio sea de comprensión por errores u omisiones. TE. CA. cometidos en la elaboración del presente trabajo, me someto a vuestro dictamen.. BI. BL. IO. Trujillo, Octubre del 2017. Br. Keyla Mirely Torres Chiclayo. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CI EN. CI. AS. BI. O. Ms.C. Aníbal Quintana Díaz PRESIDENTE. LO. G. IC. AS. MIEMBROS DEL JURADO. BI. BL. IO. TE. CA. DE. Dra. Judith Roldán Rodríguez SECRETARIA. Dra. Eva Villanueva Tarazona VOCAL. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN Los profesores que suscriben, miembros del jurado, declaran que el presente. AS. informe de tesis ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales, siendo. BI. O. LO. G. IC. aprobado por unanimidad.. DE. CI EN. CI. AS. Ms.C. Anibal Quintana Díaz PRESIDENTE. BI. BL. IO. TE. CA. Dra. Judith Roldán Rodríguez SECRETARIA. Dra. Eva Villanueva Tarazona VOCAL. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEDICATORIA. AS. A Dios, por haberme permitido alcanzar mis objetivos y afrontar retos durante mi vida académica y personal, en los que ha reflejado su paternidad, inagotable amor y. LO. G. IC. sabiduría.. A mis padres, Nury y David, por su apoyo durante mis estudios en la universidad y en. BI. AS. ustedes.. O. cada etapa de mi vida, quedan cortas las palabras para expresar mi gratitud hacia. A mi hijo Leonardo, por el amor que nos une y que han hecho de mí una mejor mujer,. CI EN. CI. madre y profesional.. A mi abuela Hilda, porque su recuerdo y anhelos hacía mi persona se mantuvieron. BI. BL. IO. TE. CA. DE. presentes y el sueño de verme realizada como profesional se ha cumplido.. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. AGRADECIMIENTOS. IC. A la Dra. Eva Villanueva Tarazona, por brindarme la oportunidad de trabajar este. G. tiempo a su lado, gracias por sus enseñanzas como maestra y amiga, en lo académico y. BI. O. LO. personal, que han sido parte vital de mi formación en estos últimos años.. AS. A mis maestros y maestras, por los conocimientos impartidos durante mis estudios. CI EN. CI. universitarios, el tiempo y la dedicación entregados para mi formación profesional.. Al Br. Claudio Quiñones Cerna, por su amistad y apoyo durante el desarrollo del. BI. BL. IO. TE. CA. DE. presente trabajo de investigación.. ix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN. La presente investigación tuvo como objetivo evaluar el efecto fotoprotector de. AS. Zea mays L. “maíz morado” y Theobroma cacao L. “cacao” en el complejo esporacristal de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis microencapsulado en alginato de. tres formulaciones de Bacillus. IC. calcio. Para realizar esta evaluación se prepararon. LO. G. thuringiensis subsp. israelensis, dos con Zea mays L. “maíz morado” y Theobroma cacao L. “cacao” al 0.1% y una sin fotoprotector UV adicionado y se las dispuso en. BI. O. recipientes de plástico de 1 litro de capacidad, que fueron llenados con 500 mL de agua destilada, todos los tratamientos se realizaron por triplicado y fueron sometidos a. AS. radiación UV proveniente de la radiación solar directa durante los días 12 a 17 del mes. CI. de julio del 2017. A las 0, 24, 48, 72, 96 y 120 horas de exposición, se adicionaron 25. CI EN. larvas de Ae. aegypti en III estadio a cada uno de los tratamientos y se registró la mortalidad a las 24 horas. Los resultados muestran efectos significativos en las. DE. comparaciones de par en par de todas las formulaciones excepto en la comparación de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis microencapsulado en alginato de calcio más. CA. Theobroma cacao “cacao” y Bacillus thuringiensis subsp. israelensis microencapsulado. TE. en alginato de calcio sin fotoprotector UV adicionado; así mismo se evidencia un mayor porcentaje de mortalidad de Aedes aegypti en la formulación Zea mays L. “maíz. BL. IO. morado” como fotoprotector UV, lo que demuestra que Zea mays L. “maíz morado” presenta una mejor acción fotoprotectora en el complejo espora-cristal de B.. BI. thuringiensis subsp. israelensis. PALABRAS CLAVE: Bacillus thuringiensis subsp. isralelensis, microencapsulación, Theobroma cacao L., Zea mays L., Aedes aegypti, actividad larvicida. x. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ABSTRACT. The present research aimed to evaluate the photoprotective effect of Zea mays L.. AS. "purple maize" and Theobroma cacao L. "cacao" in the spore-crystal complex of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis microencapsulated in calcium alginate. Three. G. IC. formulations of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, two with Zea mays L. "purple. LO. maize" and Theobroma cacao L. 0.1% "cocoa" and one without UV photoprotector added and they were put in plastic containers of 1 liter capacity, which were filled with. BI. O. 500 mL of distilled water, all treatments were performed in triplicate and exposed to. AS. UV radiation from direct solar radiation during days 12 to 17 of July 2017. At 0, 24, 48, 72, 96 and 120 hours of 25 larvae of Ae. aegypti in stage III to each of the. CI. treatments and mortality was recorded at 24 hours. The results show significant effects. CI EN. on the wide comparisons of all formulations except for the comparison of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis microencapsulated in calcium alginate plus Theobroma. DE. cacao L. "cacao" and Bacillus thuringiensis subsp. israelensis microencapsulated in calcium alginate without UV photoprotector added; and a higher percentage of mortality. CA. of Aedes aegypti in the formulation Zea mays L. "purple maize" as UV photoprotector,. TE. which shows that Zea mays L. "purple maize" presents a better photoprotective action in. IO. the spore-crystal complex of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis.. BI. BL. KEY WORDS: Bacillus thuringiensis subsp. isralelensis, microencapsulation, Theobroma cacao L., Zea mays L., Aedes aegypti, larvicidal activity.. xi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ÍNDICE. Página Autoridades de la Universidad Nacional de Trujillo……………………………………ii. AS. Autoridades de la Escuela de Ciencias Biológicas…….………………………………..iii. IC. Asesora………………………………………………………………………………….iv. G. Presentación………………………......………………………………………………….v. LO. Miembros del Jurado……………………………………………………………………vi Aprobación…………………….……………………………………………………….vii. O. Dedicatoria……………………….……………………………………………………viii. BI. Agradecimientos……………………………………………………………………..….ix. AS. Resumen…………………………………………………………………………………x Abstract………………………………………………………………………………….xi. CI. Índice……………………………………...……………………………………………xii. CI EN. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………….1 OBJETIVOS……………………………………………………………………………..5 MATERIAL Y MÉTODOS……………………………………………………………..6. DE. Material Biológico……………………………………………………………………...6 Diseño de experimentación…………………………………………………………….6. CA. 1. Reactivación y verificación de la pureza del cultivo de. TE. B. thuringiensis subsp. israelensis……………………………………………......6 2. Preparación y estandarización del inóculo de. IO. B. thuringiensis subsp. israelensis……………………………………………….7. BL. 3. Producción del complejo espora-cristal de B. thuringiensis subsp. israelensis……………………………………………….7. BI. 4. Adición de los protectores UV e inmovilización en alginato de calcio…………..8 5. Obtención de larvas de Ae. Aegypti en III estadio en condiciones de laboratorio………………………………………………………………………..8 6. Exposición de las formulaciones de B. thuringiensis subsp. israelensis a radiación UV y determinación de la actividad larvicida………………………..10. xii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 7. Análisis de datos………………………………………………………………...10 RESULTADOS………..……………………………………………………………….11 DISCUSIÓN…………………...……………………………………………………….16. AS. CONCLUSIÓN.………………………………………………………………………..19 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………………………20. IC. ANEXOS……………………………………………………………………………….25. LO. G. Anexo 01. Tinción de Gram de B. thuringiensis subsp. israelensis, incubado durante 48 horas a 30°C.…………………………………………..……...26. BI. O. Anexo 02. Colonias de B. thuringiensis subsp. israelensis de aspecto cremoso, blanquecinas, opacas y con bordes irregulares; característicos de la especie……………………………………………………………………27. AS. Anexo 03. Tinción de Wirtz de B. thuringiensis subsp. israelensis para la observación de esporas; incubado durante 48 horas a 30 °C……………..28. CI EN. CI. Anexo 04. Tinción de azul de Comassie de B. thuringiensis subsp. israelensis para la observación de cristales proteicos; incubado durante 48 horas a 30°C……………………………………………………………………..29. DE. Anexo 05. Incubación del inóculo de B. thuringiensis subsp. israelensis durante 16 horas, a 30°C y 200 rpm de agitación………………………………….30 Anexo 06. Cultivo de B. thuringiensis subsp. israelensis en biorreactor BioFio®/Celligen® 11 de 5L de capacidad con sistema de control…….31. TE. CA. Anexo 07. Pulverizado de (A) Teobroma cacao L. “cacao” y (B) Zea mays L. “maíz morado”…………………………………………………………...32. BI. BL. IO. Anexo 08. Mezcla del complejo espora-cristal de B. thuringiensis subsp. israelensis con una solución estéril de alginato de sodio al 1% con el respectivo agente protector adicionado a 0.01% , es decir (C) Zea mays L. “maíz morado”, (B) Theobroma cacao L. “cacao” y (A) sin agente protector…..................................................................................................33 Anexo 09. Mezcla de la solución estéril de alginato de sodio al 1% con Theobroma cacao L. “cacao” como fotoprotector UV. La mezcla fue extruida gota a gota a través de una jeringa estéril de 5 mL, en una solución estéril de cloruro de calcio (CaCl2) 0.2 M.................................................................34. xiii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Anexo 10. Incubación de los microencapsulados de B. thuringiensis subsp. israelensis en una solución de estéril de cloruro de calcio (CaCl2) 0.2 M…………...35 Anexo 11. Microencapsulados de B. thuringiensis subsp. israelensis en alginato de calcio, con Zea mays L., Theobroma cacao como fotoprotectores UV…36. AS. Anexo 12. Cubetas plástica con 2.5 L de agua declorada, donde se añadieron los huevos de Ae. aegypti…………………………………………………….37. G. IC. Anexo 13. Jaula de metal de 30x30x30 cm (ancho, largo y altura) para la crianza de adultos, hembras y machos, de Ae. aegypti………………………………38. LO. Anexo 14. Hematofagia de las hembras adultas de Ae. aegypti………………………39. BI. O. Anexo 15. Cubetas plásticas con 1.5 L de agua declorada conteniendo huevos de Ae. aegypti dispuestos en tiras de papel Whatman de 3-5 cm de ancho……...40. AS. Anexo 16. Recipientes de 1L de capacidad con 500 mL de agua destilada, para la ejecución del bioensayo…………………………………………………..41. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. Anexo 17. Exposición a radiación UV de las formulaciones de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis en la Estación Experimental de Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo……………………………………...…42. xiv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INTRODUCCIÓN El control de Aedes aegypti se ha convertido en una prioridad de salud. AS. pública, por ser esta especie el vector transmisor del virus del dengue (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4), chikunguya (CHIKV), zika (ZIKV) y fiebre amarilla. G. IC. (YFV) 1. Este mosquito está distribuido en 20 regiones del país, comprometiendo 392. LO. distritos, donde habitan más de 12 millones de personas que están en permanente riesgo. O. de ser infectadas 2.. BI. La amplia dispersión del mosquito y los altos índices de infestación existentes. AS. en varios distritos del país determinan un alto riesgo de transmisión de los virus. CI. mencionados en nuestro territorio, favoreciendo la aparición de situaciones epidémicas.. CI EN. Si bien no es posible controlar los múltiples determinantes para la introducción y diseminación viral, un control efectivo del vector permitirá mantener índices aédicos de. DE. bajo riesgo 2.. Muchas intervenciones para el control del vector se dirigen a las etapas. CA. inmaduras del mosquito, siendo el método más utilizado para dicho control el. TE. tratamiento periódico de los criaderos reales y potenciales con larvicidas químicos.. IO. Entre los insecticidas más utilizados se encuentra el organofosforado “temefos”, debido 3,4. . Sin embargo,. BL. a su relación costo-eficacia y la aceptación que tiene en la comunidad. como consecuencia del uso generalizado, se ha reportado resistencia de Ae. aegypti a. BI. “temefos” en muchos países de América Latina, incluyendo al Perú 5,6,7. Una alternativa a la aplicación de insecticidas químicos en el control de mosquitos vectores de enfermedades, es el control biológico, que además de reducir la toxicidad para especies no objetivo y la contaminación ambiental, también ofrece una 1. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. reducción potencial en el desarrollo de la resistencia 8. Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ha sido estudiada en gran detalle en los últimos 40 años a razón de sus propiedades insecticidas. La actividad insecticida de esta bacteria es derivada de. AS. inclusiones cristalinas proteicas producidas durante su fase de esporulación, las cuales. IC. son tóxicas para larvas de dípteros 9, entre los cuales se encuentra Aedes aegypti 7,10.. G. Bacillus thuringiensis subsp. israelensis se utiliza actualmente en programas. LO. de control de mosquitos en todo el mundo. Algunas ventajas de usar insecticidas a base. O. de endotoxinas incluyen que son seguros para los enemigos naturales de mosquitos y. BI. vertebrados, biodegradables, receptivas a la ingeniería genética y la producción a gran. AS. escala, altamente efectiva, y no produce resistencia en las poblaciones de insectos 11. Sin. CI. embargo, la exposición a factores bióticos y abióticos como la radiación solar, las. CI EN. partículas de polvo y arena, temperaturas elevadas, y la profundidad del agua, entre otros, disminuyen la eficacia y la actividad insecticida de las formulaciones de Bacillus. DE. thuringiensis subsp. israelensis 12,13.. La inactivación por la luz solar es uno de los mayores problemas de las. CA. formulaciones de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis en condiciones de campo. El. TE. rango de radiación UV-A/B (280-380 nm) de la luz solar incidente sobre la superficie de la Tierra es considerada responsable de la foto-degradación y consecuente pérdida de la. IO. 14,15. . Para superar estas dificultades, se están realizando esfuerzos para. BL. toxicidad. mejorar la efectividad de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis prolongando su. BI. actividad larvicida. Una de las principales formas de mejorar la resistencia de Bti a la. radiación UV es mejorar la formulación añadiendo agentes protectores que absorben los rayos UV. Los diferentes compuestos orgánicos sintéticos tales como rojo congo, ácido 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. úrico, ácido p-aminobenzoico, benzaldehído, melanina y verde de malaquita han sido evaluados como protectores de UV adecuados para diversos entomopatógenos 19. 16, 17, 18,. . Aunque estos aditivos protegen contra los rayos UV, tienen algunas deficiencias: A. AS. menudo inhiben el crecimiento microbiano y la germinación de esporas; el protector UV es inestable, se evapora fácilmente o puede ser lavado por la lluvia, ocasionando pérdida. G. IC. en su capacidad de protección, además, se sospecha que muchos de los productos. LO. químicos utilizados como absorbentes de ultravioleta tales como tintes y agentes. O. fluorescentes son carcinógenos20.. BI. Existe la necesidad de desarrollar una formulación de Bacillus thuringiensis. AS. subsp. israelensis más efectiva y segura. Por lo que se considera necesario evaluar el. CI. uso de protectores naturales y la microencapsulación como un método prometedor para. CI EN. utilizar Bacillus thuringiensis subsp. israelensis en campo. Entre los productos naturales que han sido ampliamente estudiados por los compuestos que tienen y su actividad como protectores de radiación ultravioleta se mencionan Theobroma cacao L. “cacao” y. DE. Zea mays L. “maíz morado”. En el caso de Zea mays L. “maíz morado”, los. CA. flavonoides, son compuestos que absorben los rayos UV-B21 y Theobroma cacao L. “cacao” cuenta con polifenoles y teobromina que le confiere su actividad fotoprotectora. IO. TE. frente a la radiación UV22.. BL. Por otro lado, la microencapsulación permite mejorar la liberación lenta del. producto y prolonga el período del efecto residual. La microencapsulación con alginato. BI. de sodio es el método más estudiado y efectivo. Además presenta la ventaja de ser un método simple, de fácil operación, de bajo costo y alto índice de incrustación; en base a estas ventajas se ha convertido en el método de elección para la obtención de las comúnmente llamadas “perlas de alginato”23.. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Considerando que mediante el control de las etapas inmaduras de Aedes aegypti es factible combatir la transmisión de enfermedades virales como son, el dengue, zika y chikunguya y que el uso de insecticidas químicos genera resistencia en la población. AS. blanco, es necesario desarrollar formulaciones biológicas, tales como las de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis microencapsuladas con compuestos que permitan la. IC. protección de su principio activo de los efectos adversos de la radiación UV,. LO. G. prolongando la persistencia de sus formulaciones en condiciones de campo24. En base al análisis anterior, en la presente investigación, se evalúa el efecto de los fotoprotectores. BI. O. naturales, Zea mays L. “maíz morado” y Theobroma cacao L. “cacao”, en el complejo. AS. espora-cristal de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis inmovilizado en alginato de. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. calcio, sobre la mortalidad de larvas en estadio III de Aedes aegypti.. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. OBJETIVO Determinar la formulación de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis microencapsulado en alginato de calcio, con Zea mays L. “maíz morado” o. AS. Theobroma cacao L. “cacao”, como fotoprotectores UV, que obtenga un mayor. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. porcentaje de muerte de larvas en III estadio de Aedes aegypti.. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MATERIAL Y MÉTODOS MATERIAL BIOLÓGICO Cultivo de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (Bti) proporcionado por el. Huevos de Aedes aegypti proporcionados por el Laboratorio Referencial. G. -. IC. Laboratorio de Biología de la Universidad Nacional de Trujillo.. LO. Regional de La Libertad.. O. Pulverizado de Zea mays L. “maíz morado” y Theobroma cacao L. “cacao”. BI. -. AS. -. AS. producido y distribuido por NutryBody S.A.C.. CI. DISEÑO DE EXPERIMENTACIÓN. CI EN. 1. Reactivación y verificación de la pureza del cultivo de B. thuringiensis subsp. israelensis. DE. El cultivo de B. thuringiensis subsp. israelensis (Bti) conservado en refrigeración a -4°C, fue sembrado en tubos estériles conteniendo 9 mL de. CA. caldo nutritivo suplementado con melaza (5 g de peptona, 3 g de extracto de. TE. carne y 5 g de NaCl, 3 g melaza, 1000 mL de agua destilada), y fue incubado a 30°C por 48 horas24.. Culminado el tiempo de incubación se realizó la. IO. coloración de Gram para verificar la pureza (Anexo 01). Luego se sembró por. BI. BL. agotamiento en placas de Petri conteniendo Agar nutritivo y se incubó por 30°C por 48 horas. Después de la incubación se observó la uniformidad de colonias y sus características macromorfológicas, tales como, aspecto, borde y color (Anexo 02). Así mismo, se evaluó las características micromorfológicas, mediante la coloración de azul de Coomassie para la observación de. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. inclusiones cristalinas proteicas (cristales) y coloración de Wirtz para la observación de esporas (Anexo 03 y 04).. AS. 2. Preparación y estandarización del inóculo de B. thuringiensis subsp. israelensis Confirmada la pureza del cultivo, se sembró por estría en placas de Petri. IC. conteniendo Agar Luria-Bertani (5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl, 10 g. LO. G. de peptona de caseína y 15 g de agar, 1000 mL de agua destilada), se incubó a 30 °C por 24 horas. Cumplido el tiempo de incubación se retiró una colonia. BI. O. aislada y se suspendió en 9 mL de agua destilada estéril (ADE), la concentración inicial del pre-inóculo se ajustó hasta alcanzar una concentración aproximada de. AS. 3x108 células/mL usando el Nefelómetro de MacFarland. Finalmente, se agregó. CI. 1mL del pre-inóculo en 50 mL de Caldo Luria- Bertani. Se incubó en un shaker. CI EN. a 200 rpm, a una temperatura de 30°C, durante 16 h24 (Anexo 05).. DE. 3. Producción del complejo espora-cristal de B. thuringiensis subsp. israelensis El cultivo del microbio se realizó en un biorreactor BioFio®/Celligen® 115. CA. (marca New Brunswick), como se muestra en el anexo 06. Se adicionó 1L de. TE. caldo Luria-Bertani dentro del sistema y se esterilizó en autoclave a 1 atm a 121 °C durante 15 min. Posteriormente, el sistema autorregulo el pH del medio a un. BL. IO. valor de 7.0 utilizando NaOH y HCl al 2N.. BI. Finalmente, se adicionó el inóculo especificado en el punto 2, se incubó durante 96 horas, para luego realizar la cosecha. El caldo fue centrifugado a 5000 rpm durante 10 min a 4°C; el sobrenadante fue esterilizado antes de ser descartado y el pellet se lavó tres veces con NaCl 0.1 M y luego con ADE, por centrifugación,. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. según las condiciones anteriores. El complejo espora-cristal (CEC) obtenido fue secado a 60°C por 48 horas24.. AS. 4. Adición de los protectores UV e inmovilización en alginato de calcio. El CEC (0.02g/mL) se mezcló con una solución estéril de alginato de sodio al. IC. 1% con el respectivo agente protector adicionado al 0.1% (Anexo 07) (es decir,. LO. G. Zea mays L. “maíz morado” o Theobroma cacao L. “cacao”, cuyas. O. especificaciones se muestran en el Anexo 08). La mezcla fue extruida gota a. BI. gota a través de una jeringa de 5 mL estéril, en una solución estéril de cloruro de. AS. calcio (CaCl2) 0.2 M (Anexo 09). Una vez formadas las microcápsulas en contacto con la solución de CaCl2, se incubó durante una hora para permitir la. CI. solidificación23 (Anexo 10), el tamaño de las microcápsulas fue de 3 mm y con. CI EN. una masa promedio de 0.025 g por microcápsula. Luego, las microcápsulas fueron recuperadas, lavadas con ADE y transferidas a una placa de Petri estéril. DE. para ser secadas a 37 ° C en una incubadora durante un período de 48 h. Finalmente, se almacenaron en placas de Petri estériles selladas con parafilm, a. TE. CA. una temperatura de 4 °C hasta su uso29 (Anexo 11).. 5. Obtención de larvas de Ae. Aegypti en III estadio en condiciones de laboratorio.. IO. El mantenimiento de la cepa de Ae. aegypti se realizó siguiendo la metodología. BL. del Manual de Indicaciones Técnicas del Insectario28. Para la cría de las larvas se. BI. utilizaran cubetas plásticas con 2.5 L de agua declorada, donde se añadieron los huevos de Ae. aegypti (Anexo 12), una vez eclosionados los huevos, se añadió. como alimento purina previamente cernida y esterilizada al autoclave, aproximadamente 0.25 g por día. Al pasar al estadio de pupa se colocaran las. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. mismas en un vaso de precipitación dentro de una jaula (30x30x30cm) hasta que logren emerger los adultos (Anexo 13). Los machos adultos fueron alimentados con solución azucarada al 15% y para. AS. las hembras hematófagas, con sangre, siendo condiciones necesarias para el. IC. mantenimiento de la colonia y la posterior puesta de huevos. Para esto se. G. dispuso de un sistema de alimentación en donde se colocó un plato de aluminio. LO. con sangre dos veces por semana. Una cantidad de sangre fue introducida dentro. O. del plato de aluminio (10 cm x 10 cm x 3 mm) sellado con parafilm (Anexo 14).. BI. Para favorecer la alimentación, la sangre fue temperada colocando una bolsa de. AS. granos que fueron dispuestos encima del plato de aluminio, la bolsa contuvo 250. CI. g de legumbres que fueron calentadas en un horno microondas dentro de la bolsa. CI EN. de algodón por un lapso de 10 segundos28.. Dos días posteriores a la alimentación de las hembras adultas, se realizó la. DE. recogida de huevos. Para esto se dispuso en el borde interior del vaso de precipitación dentro de la jaula, una tira de papel Whatman de 4–5 cm de ancho.. CA. Una vez puestos los huevos, las tiras de papel se retiraron y se guardaron. TE. debidamente rotuladas. Se repitió el procedimiento hasta recolectar cerca de 2. IO. mil huevos de Ae. aegypti. Los huevos fueron eclosionados hasta obtener 1800. BL. larvas en estadio III (Anexo 15), distribuidas de acuerdo a los tiempos en los que. BI. se ejecutó el bioensayo.. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 6. Exposición de las formulaciones de B. thuringiensis subsp. israelensis a radiación UV y determinación de la actividad larvicida. El bioensayo fue llevado a cabo en un área sin sombra, en la estación de. AS. Bioquímica Experimental de la Universidad Nacional de Trujillo, Trujillo, Perú,. IC. durante los días 12 a 17 del mes de julio del 2017. Se usó 12 recipientes de. G. plástico de 1 litro de capacidad, que fueron llenados con 500 mL de agua. LO. destilada, y se los dispuso a una distancia de 7.5 cm el uno del otro (Anexo 16).. O. Las tratamientos que se evaluaron fueron: 1) cBti + Theobroma cacao,. BI. microencapsulado de B. thuringiensis subsp. israelensis más Theobroma cacao, 2). AS. cBti + Zea mays L., microencapsulado de B. thuringiensis subsp. israelensis más. CI. Zea mays L., 3) cBti, microencapsulado de B. thuringiensis subsp. israelensis y. CI EN. sólo agua como control; todos los tratamientos se realizaron por triplicado y fueron sometidos a radiación UV proveniente de la luz solar directa. Se adicionó 25 larvas de Ae. aegypti en III estadio para cada recipiente. Los análisis de la. DE. mortalidad larvaria fueron hechos después de 24 horas de exposición de los. TE. CA. tratamientos a las 0, 24, 48, 72, 96 y 120 horas.. IO. 7. Análisis de datos. BL. Los porcentajes de mortalidad obtenidos de cada uno de los tratamientos fueron analizados por la prueba de ANOVA para la comparación de promedios de par. BI. en par, utilizando el software estadístico IBM SPSS (29).. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESULTADOS Para determinar la actividad larvicida del complejo espora-cristal de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis microencapsulado en alginato de calcio, con Zea mays. G. IC. cristales paraesporales, antes indicados, como se muestran en la Figura 1.. AS. L. y Theobroma cacao L., como fotoprotectores UV, se produjeron en primer lugar, los. LO. La actividad larvicida de las formulaciones de Bacillus thuringiensis subsp.. O. israelensis con Zea mays L. y Theobroma cacao L., como fotoprotectores UV; sobre el. BI. porcentaje de muerte de larvas en estadio III de Aedes aegypti son presentadas en la. AS. Figura 2.. CI. Comparaciones de par en par de los tratamientos analizados en el bioensayo. CI EN. frente a larvas en estadio III de Aedes aegypti, por la prueba estadística ANOVA, mostraron efectos significantes (P < 0.05) (Tabla 1) y mejor mortalidad de Aedes aegypti en la formulación de B. thuringiensis subsp. israelensis microencapsulado en. BI. BL. IO. TE. CA. DE. alginato de calcio con Zea mays, como fotoprotector UV (Tabla 2).. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CA. Figura 1. Tinción de azul de Comassie de Bacillus thuringiensis subsp.. de incubación en Agar Luria-Bertani.. BI. BL. IO. TE. israelensis para la observación de cristales proteicos; a las 48 h. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. complejo espora-cristal de. TE. Figura 2. Porcentaje de mortalidad larvaria por efecto del. IO. Bacillus thuringiensis subsp. israelensis microencapsulado en alginato de calcio,. BL. con Zea mays L. “maíz morado” y Theobroma cacao L. “cacao”, expuestos a. BI. radiación UV durante 120 horas.. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. Tabla 1. Análisis de varianza (ANOVA) por comparaciones de par en par del efecto. IC. larvicida de las formulaciones de B. thuringiensis subsp. israelensis. G. microencapsuladas en alginato de calcio, con Zea mays L. “maíz morado” y. BI. Significancia ± EEA. cBti + Zea mays L. vs. cBti + Theobroma cacao. P < 0.05. 0.000 ± 0.024. P < 0.05. 0.000 ± 0.032. P < 0.05. 1.000 ± 0.021. P > 0.05. cBti + Theobroma cacao vs. control. 0.000 ± 0.047. P < 0.05. 0.000 ± 0.052. P < 0.05. cBti + Zea mays L. vs. cBti. DE. cBti + Zea mays L. vs. control. CI EN. 0.000 ± 0.021. TE. CI. AS. Formulaciones de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis microencapsulado en alginato de calcio (cBti) con dos protectores UV. O. LO. Theobroma cacao L. “cacao”, como fotoprotectores UV.. CA. cBti + Theobroma cacao vs. cBti. A. IO. cBti + control. BI. BL. EE: Error Estándar. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. Tabla 2. Porcentaje de mortalidad de larvas de Ae. aegypti en III estadio por efecto de las formulaciones de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis microencapsuladas en. IC. alginato de calcio, con Zea mays L. “maíz morado” y Theobroma cacao L. “cacao”,. LO. G. expuestas a radiación UV durante 120 horas.. A. cBti + Zea mays. cBti + Theobroma. L.. cacao L.. 94.7. 100. 0. 98.7. 90.7. 90.5. 1.33. 48. 81.3. 56.0. 69.3. 0. 78.7. 57.3. 58.7. 0. 73.3. 53.3. 57.3. 1.33. 120. 69.3. 53.3. 42.7. 0. CA TE. 72. DE. 24. Control. IO. 100. CI EN. (horas) 0. cBti. CI. Tiempo de irradiación UV de las formulaciones. AS. BI. O. Porcentaje de mortalidad larvaria de las formulaciones de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis microencapsuladas en alginato de calcio (cBti) con dos protectores UV. BI. BL. 96. A. Promedio de tres replicados.. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DISCUSIÓN. AS. El factor limitante para la sobrevivencia del principio activo de Bacillus. IC. thuringiensis subsp. israelensis son los componentes de la radiación solar,. G. principalmente la radiación UV-A (320-400 nm) y UV-B (280-320 nm). Estas. LO. longitudes de onda son responsables de la fotodegradación e inactivación de diferentes. O. biopesticidas bajo condiciones de campo15. Es así que se han venido desarrollando. BI. numerosas formulaciones de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis para la protección. AS. del complejo espora-cristal9, 24 , responsable de su toxicidad frente a Aedes aegypti7, 10.. CI. El uso de fotoprotectores como el rojo de congo, verde de malaquita, ácido para-. CI EN. aminobenzoico, benzaldehído, entre otros compuesto sintéticos, han sido ampliamente estudiados en Bacillus thuringiensis y Bacillus sphaericus9,. 18, 20, 22. . Aunque estos. DE. aditivos tienen protección contra los rayos UV, a menudo inhiben el crecimiento microbiano y la germinación de esporas, son inestables y tienen componentes. CA. carcinogénicos. Alternativamente, la evaluación de fotoprotectores naturales está siendo. TE. investigada en la actualidad, con la finalidad desarrollar formulaciones biológicas. IO. seguras y eficientes20.. BL. En esta investigación se determina los porcentajes de muerte de larvas en III. BI. estadio de Aedes aegypti por efecto de tres formulaciones de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis microencapsuladas en alginato de calcio, dos de las formulaciones con Zea mays L. “maíz morado” y Theobroma cacao “cacao”, como fotoprotectores naturales UV respectivamente y una formulación sin fotoprotector UV adicionado. Los. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. resultados muestran efectos significativos (P < 0.05) en las comparaciones de par en par mediante el estadístico de Análisis de Varianza (ANOVA) de todas las formulaciones evaluadas excepto en la comparación de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis. AS. microencapsulado en alginato de calcio más Theobroma cacao “cacao” y Bacillus thuringiensis subsp. israelensis microencapsulado en alginato de calcio sin. G. IC. fotoprotector UV adicionado (Tabla 1); así mismo se evidencia un mayor porcentaje de. LO. mortalidad de Aedes aegypti en la formulación de B. thuringiensis subsp. israelensis. O. microencapsulado en alginato de calcio con Zea mays L. “maíz morado” como. BI. fotoprotector UV (Figura 1).. AS. La actividad fotoprotectora de Zea mays L. “maíz morado” radica. en los. CI. flavonoides, compuestos que absorben los rayos UV-B21; por su parte Theobroma cacao. CI EN. L. “cacao” cuenta con polifenoles y teobromina que le confiere su actividad fotoprotectora frente a la radiación UV22. La actividad antioxidante de los compuestos de Zea mays L. “maíz morado” y Theobroma cacao L. “cacao”, como son las. DE. antocianinas y polifenoles respectivamente, captan las especies reactivas del oxígeno. CA. generadas por la radiación UV-A en las esporas, está interacción puede afectar el ADN,. TE. además de causar la inactivación de proteínas33.. IO. Griego y Spence (1978) determinaron la inactivación del complejo espora-cristal. BL. de Bacillus thuringiensis a la radiación ultravioleta artificial (290 nm a 700 nm) y. BI. natural, determinando que la vida media de Bacillus thuringiensis expuesta a la luz solar es menor a 72 horas32. En esta investigación, los resultados demostraron que después de. 72 horas de irradiación, existe una disminución del 16% en la actividad larvicida de la formulación de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis sin fotoprotector UV adicionado, mientras que la formulación con Zea mays L., como agente protector UV, 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. mostró una disminución del 9.4%. Se puede comprobar que la formulación sin fotoprotector UV adicionado, tiene una mayor pérdida de actividad insecticida en comparación con la formulación con Zea mays L. “maíz morado”, lo que demuestra la. AS. acción fotoprotectora de Zea mays L. “maíz morado” en el complejo espora-cristal de B.. IC. thuringiensis subsp. israelensis.. G. En trabajos similares se ha evaluado el efecto de la radiación UV utilizando todo. (2009). evaluaron el efecto de la radiación. O. UV. Por ejemplo, Hadapad y col.. LO. el rango de radiación y evaluando alternativas de protección, como son los protectores. BI. ultravioleta cubriendo el rango entre 285 nm y 320 nm, es decir radiación UV de tipo B,. AS. sobre el complejo espora-cristal de Bacillus sphaericus con fotoprotectores naturales y. CI. sintéticos. Después de seis horas de exposición a la radiación UV del complejo espora-. CI EN. cristal de Bacillus sphaericus con melaza, extracto de soya y extracto de levadura al 0.1%, se presentó una viabilidad en el conteo de esporas de Bacillus sphaericus del 83.5, 63.9 y 59 % respectivamente, sugiriendo una pérdida de la toxidad27. Sin embargo,. DE. cuando en la presente investigación el complejo espora-cristal de Bacillus thuringiensis. CA. subsp. israelensis fue mezclado con Zea mays L. “maíz morado” y Theobroma cacao L.. TE. “cacao” al 0.1% como agentes protectores UV, ambas formulaciones mantuvieron el 98.7% y el 90.7% de su actividad larvicida después de veinticuatro horas de exposición. IO. a radiación UV proveniente de la radiación solar directa respectivamente (Tabla 2),. BL. indicando que dichas sustancias brindaron una efectiva protección frente a la radiación. BI. UV.. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CONCLUSIÓN En la presente investigación se logró producir el complejo espora-cristal (CEC) de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (Bti), para ser microencapsulado en alginato. AS. de calcio con los fotoprotectores UV, Zea mays L. y Theobroma cacao L., ambas. IC. formulaciones fueron sometidas a radiación UV durante 120 horas, siendo la. G. formulación con Zea mays L. la que presento un mayor porcentaje de muerte de larvas. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. en III estadio de Aedes aegypti, demostrando una mejor acción fotoprotectora.. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 1. CDC. Surveillance and Control of Aedes aegypti and Aedes albopictus in the United States. 2016. Disponible en:. AS. http://www.cdc.gov/chikungunya/pdfs/surveillance-and-control-of-aedes-. G. IC. aegypti-and-aedes-albopictus-us.pdf. LO. 2. Boletín epidemiológico del Perú del 12 de Junio al 18 de Junio del 2016.. Disponible. en:. BI. 0762.. O. Volumen 25 – Semana epidemiológica N° 24. ISSN versión electrónica: 2415-. AS. http://www.dge.gob.pe/portal/docs/vigilancia/boletines/2016/24.pdf.. CI. 3. World Health Organization. Dengue guidelines for diagnosis, treatment,. CI EN. prevention and control: new edition. Geneva: World Health Organization. 2009. 147 p. p.. DE. 4. Chavasse DC, Yap HH, World Health Organization. Division of Control of Tropical Diseases. Chemical methods for the control of vectors and pests of. CA. public health importance. Geneva: World Health Organization. 1997. 129 p. p.. TE. 5. Rodríguez MM, Bisset JA, Fernández D. Levels of insecticide resistance and. IO. resistance mechanisms in Aedes aegypti from some Latin American countries. J. BL. Am Mosq Control Assoc. 2007; 23(4): 420-9.. BI. 6. Grisales N, Poupardin R, Gomez S, Fonseca-Gonzalez I, Ranson H, Lenhart A. Temephos resistance in Aedes aegypti in Colombia compromises dengue vector control. PLoS Negl Trop Dis. 2013; 7(9):e2438.. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 7. Melo-Santos MA, Varjal-Melo JJ, Araújo AP, Gomes TC, Paiva MH, Regis LN, Furtado AF, Magalhaes T, Macoris ML, Andrighetti MT, Ayres CF. Resistance to the organophosphate temephos: mechanisms, evolution and reversion in an. AS. Aedes aegypti laboratory strain from Brazil.. IC. 8. Boyce R, Lenhart A, Kroeger A, Velayudhan R, Roberts B, Horstick O. Bacillus. LO. literature review. Trop Med Int Health. 2013; 18(5):564-77.. G. thuringiensis israelensis (Bti) for the control of dengue vectors: systematic. BI. O. 9. Aguilar-Meza O, Ramírez-Suero M, Bernal JS, Ramírez-Lepe M. Field evaluation against Aedes aegypti larvae of aluminum - carboxymethylcellulose-. AS. encapsulated spore-toxin complex formulation of Bacillus thuringiensis serovar. CI EN. CI. israelensis. J Econ Entomol. 2010; 103(3):570-6.. 10. Elleuch J, Jaoua S, Darriet F, Chandre F, Tounsi S, Zghal RZ. Cry4Ba and Cyt1Aa proteins from Bacillus thuringiensis israelensis: Interactions and. DE. toxicity mechanism against Aedes aegypti. Toxicon. 2015; 104:83-90.. CA. 11. Satinder KB, Verma M, Tyagi RD, Valéro JR. Recent advances in downstream. TE. processing and formulations of Bacillus thuringiensis based biopesticides. 2006;. IO. 41(2): 323-342.. BL. 12. Vilarinhos PT, Monnerat R. Larvicidal persistence of formulations of Bacillus. BI. thuringiensis var. israelensis to control larval Aedes aegypti. J Am Mosq Control Assoc. 2004; 20(3):311-4.. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 13. Elcin YM, Cokmus C, and Sacilik CS. Aluminum carboxymethylcellulose encapsulation of Bacillus sphaericus for control of Culex sp. (Diptera: Culicidae) larvae. J. Econ. Entomol. 1995; 88:830-834.. AS. 14. Pusztai M, Fast P, Gringorten L, Kaplan H, Lessard T, Carey PR. The. IC. mechanism of sunlight-mediated inactivation of Bacillus thuringiensis crystals.. LO. G. Biochem J. 1991; 273:43-7.. 15. Pozsgay M, Fast P, Kaplan H, Carey PR. The effect of sunlight on the protein. BI. O. crystals from Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD1 and NRD12: A Raman. AS. spectroscopic study. Journal of Invertebrate Pathology. 1987; 50(3):246-253.. CI. 16. Kuppusamy M, Hoti SL, Balaraman K. Residual activity of briquette and. CI EN. alginate formulations of Bacillus sphaericus against mosquito larvae. Indian J Med Res. 1987; 86:591-6.. DE. 17. Elcin YM. Bacillus sphaericus 2362-calcium alginate microcapsules for mosquito control. Enzyme Microbial. Techol. 1995: 17, 587–591.. CA. 18. Dunkle RL, Shasha BS. Response of starch encapsulated Bacillus thuringiensis. TE. containing ultraviolet screens to sunlight. Environ. Entomol. 1989; 18: 1035–41.. IO. 19. Cökmüs C, Hakki Sayar A, Saçilik SC, Osmanağaoğlu O, Berber I. Effects of. BL. UV-light on Bacillus sphaericus and its protection by chemicals. J Basic. BI. Microbiol. 2000; 40(4):215-21.. 20. Zhang L, Zhang X, Zhang Y, Wu S, Gelbič I, Xu L et al. A new formulation of Bacillus thuringiensis: UV protection and sustained release mosquito larvae studies. Sci Rep. 2016; 22 (6): 39425.. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 21. Korać RR, Khambholja KM. Potential of herbs in skin protection from ultraviolet radiation. Pharmacogn Rev. 2011; 5(10):164-73.. AS. 22. Scapagnini G, Davinelli S, Di Renzo L, De Lorenzo A, Olarte HH, Micali G et al. Cocoa bioactive compounds: significance and potential for the maintenance. LO. G. IC. of skin health. Nutrients. 2014; 6(8):3202-13.. O. 23. Corbo MR, Bevilacqua A, Speranza B, Di Maggio B, Gallo M, Sinigaglia M.. BI. Use of alginate beads as carriers for lactic acid bacteria in a structured system. AS. and preliminary validation in a meat product. Meat Sci. 2016; 111:198-203.. CI. 24. Ramírez-Lepe M, Aguilar O, Ramírez-Suero M y Escudero B. Protection of the. CI EN. spore-toxin complex of Bacillus thuringiensis serovar israelensis from ultraviolet irradiation with aluminum- cmc encapsulation and photoprotectors.. DE. Southwest. Entomol. 2003; 28(2): 137-143.. CA. 25. Maldonado Blanco MG, Galán Wong LJ, Rodríguez Padilla C, Quiroz Martínez H. Evaluation of polymer-based granular formulations of Bacillus thuringiensis. TE. israelensis against larval Aedes aegypti in the laboratory. J Am Mosq Control. BL. IO. Assoc. 2002; 18(4):352-8.. 26. Arthurs SP, Lacey LA, Behle RW. Evaluation of spray-dried lignin-based. BI. formulations and adjuvants as solar protectants for the granulovirus of the codling moth, Cydia pomonella (L). J Invertebr Pathol. 2006; 93(2):88-95.. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 27. Hadapad AB, Hire RS, Vijayalakshmi N, Dongre TK. UV protectants for the biopesticide based on Bacillus sphaericus Neide and their role in protecting the binary toxins from UV radiation. J Invertebr Pathol. 2009; 100(3):147-52.. AS. 28. Peréz O, Rodriguez J, Bisset J, Leyva M, Díaz M, Fuentes O y otros. Manual. IC. de Indicaciones Técnicas para Insectarios. Ciencias Médicas. 2004; 16-28.. LO. G. 29. Prabakaran G, Hoti SL. Immobilization in alginate as a technique for the preservation of Bacillus thuringiensis var. israelensis for long-term preservation.. BI. O. J Microbiol Methods. 2008; 72(1):91-4.. AS. 30. Carvalho DO, Nimmo D, Naish N, McKemey AR, Gray P, Wilke AB et al.. CI. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in. CI EN. Brazil. J Vis Exp. 2014; 4(83):e3579.. 31. SPSS Inc. SPSS for Windows. 2015. Version 12.0. SPSS Inc., Chicago, IL.. DE. 32. Griego VM, Spence KD. Inactivation of Bacillus thuringiensis spores by. CA. ultraviolet and visible light. Appl Environ Microbiol. 1978; 35(5):906-10. 33. Moeller R, Horneck G, Facius R, Stackebrandt E. Role of pigmentation. TE. inprotecting Bacillus sp. endospores against environmental UV radiation. FEMS. BI. BL. IO. Microbiol Ecol. 2005; 51(2):231-6. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. ANEXOS. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(40) DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CA. Anexo 1. Tinción de Gram de B. thuringiensis subsp. israelensis, incubado durante 48. BI. BL. IO. TE. horas a 30 °C.. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(41) DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CA. Anexo 2. Colonias de B. thuringiensis subsp. israelensis de aspecto cremoso,. BI. BL. IO. TE. blanquecinas, opacas y con bordes irregulares; característicos de la especie.. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(42) DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CA. Anexo 3. Tinción de Wirtz de B. thuringiensis subsp. israelensis para la observación de. BI. BL. IO. TE. esporas; incubado durante 48 horas a 30 °C.. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(43) DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CA. Anexo 4. Tinción de azul de Comassie de B. thuringiensis subsp. israelensis para la. BI. BL. IO. TE. observación de cristales proteicos; incubado durante 48 horas a 30°C.. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(44) CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. TE. Anexo 5. Incubación del inóculo de B. thuringiensis subsp. israelensis durante 16. BI. BL. IO. horas, a 30°C y 200 rpm de agitación.. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(45) CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. TE. Anexo 6. Cultivo de B. thuringiensis subsp. israelensis en biorreactor. BI. BL. IO. BioFio®/Celligen® 11 de 5L de capacidad.. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(46) DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. B. CA. A. TE. Anexo 7. Pulverizado de (A) Theobroma cacao L. “cacao”, obtenido del grano y. presentaciones son producidas y distribuidas por NutryBody S.A.C.. BI. BL. IO. (B) Zea mays L. “maíz morado”, obtenido de la coronta y grano; ambas. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(47) B. C. CA. DE. A. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. TE. Anexo 8. Mezcla del complejo espora-cristal de B. thuringiensis subsp. israelensis con una solución estéril de alginato de sodio al 1% con el respectivo agente protector. IO. adicionado a 0.01% , es decir (C) Zea mays L. “maíz morado”, (B) Theobroma. BI. BL. cacao L. “cacao” y (A) sin agente protector.. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(48) CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Anexo 9. Mezcla de la solución estéril de alginato de sodio al 1% con Theobroma. TE. cacao L. “cacao” como fotoprotector UV. La mezcla fue extruida gota a gota. IO. a través de una jeringa estéril de 5 mL, en una solución estéril de cloruro de. BI. BL. calcio (CaCl2) 0.2 M.. 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(49) CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. TE. Anexo 10. Incubación de los microencapsulados de B. thuringiensis subsp. israelensis. BI. BL. IO. en una solución de estéril de cloruro de calcio (CaCl2) 0.2 M.. 35 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(50) DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CA. Anexo 11. Microencapsulados de B. thuringiensis subsp. israelensis en alginato de. BI. BL. IO. TE. calcio, con Zea mays L., Theobroma cacao como fotoprotectores UV.. 36 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

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