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Evaluación de la capacidad biocida de bacillus thuringiensis h 14 var israelensis cultivado en sanguaza sobre larvas de aedes aegypti en el distrito de laredo la libertad – peru, 2008 2009

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(1)

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

ESCUELA DE POST GRADO

PROGRAMA DOCTORAL EN CIENCIAS BIOLOGICAS

EVALUACION DE LA CAPACIDAD BIOCIDA de Bacillus

thuringiensis H-14 var. Israelensis CULTIVADO EN

SANGUAZA SOBRE LARVAS DE Aedes aegypti EN EL

DISTRITO DE LAREDO LA LIBERTAD – PERU, 2008 - 2009.

TESIS

PARA OPTAR EL GRADO DE DOCTOR

EN CIENCIAS BIOLOGICAS

AUTOR: Ms. C. GINA GENARA ZAVALETA ESPEJO

ASESOR: Dr. HEBER MAX ROBLES CASTILLO

TRUJILLO – PERU 2010

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JURADO CALIFICADOR

Dra. Edita Araujo Castillo Presidente

Dra. Nélida Milly Otiniano García Dr. Heber Robles Castillo Secretario Miembro

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DEDICATORIA

A DIOS

Gracias por guiarme, protegerme y darme tu inmenso amor.

A mis Padres:

Mercedes y Martha

A mi compañero Charlye

A mis queridos hijos:

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AGRADECIMIENTO

Al Instituto Nacional de Salud por el apoyo económico brindado para el desarrollo de la presente investigación.

A mis colegas Roxana Untol Paredes y Cristina Zavaleta Castro, por su colaboración y apoyo incondicional en la presente investigación.

Al Dr. Heber Max Robles Castillo, en su condición de asesor de la presente investigación.

A la Blga. Rosa Alfaro Arteaga responsable del control vectorial en el Centro de Salud Materno Infantil “Laredo” por la valiosa orientación en las encuestas en el distrito de Laredo.

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PRESENTACION

Señores miembros del jurado:

Dando cumplimiento con lo dispuesto en el Reglamento de la Escuela de Postgrado de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo en consideración el presente informe de tesis titulada:

“Evaluación de la capacidad biocida de Bacillus thuringiensis H-14 var. Israelensis cultivado en sanguaza sobre larvas de Aedes aegypti en el distrito de Laredo La Libertad – Perú, 2008 – 2009”, para obtener el grado académico de doctor en Ciencias Biológicas.

El mismo que dejo a su criterio para su dictamen esperando reunir los requisitos para vuestra aprobación.

(6)

INDICE

Jurado Calificador………...………….………ii

Dedicatoria………..………..………iii

Agradecimiento………..………..iv

Presentación………...………..v

Índice………..………..………...vi

Indice de Tablas……..………...………..…..vii

Indice de Figuras………...………...xi

Resumen...………....xiii

Abstract………...…...xiv

I. INTRODUCCION………...……....1

II. MATERIAL Y METODOS………...………...………....8

III. RESULTADOS ………...……….17

IV. DISCUSION………...37

V. CONCLUSIONES………...……..46

VI. PROPUESTAS ………...…………..47

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS………...…………...48

VIII. ANEXOS………...……….57

Anexo 1. Medio de cultivo suplementado con sanguaza…...58

(7)

INDICE DE TABLAS

Tabla 1 Promedio de los Porcentajes de Mortalidad de larvas del III estadio de Aedes aegypti expuestas a diferentes concentraciones y tiempos de exposición de Bacillus thuringiensis H-14 var. Israelensis cultivado en sanguaza en condiciones de laboratorio……...22 Tabla 2 Concentraciones letales (LC50 y LC90) de B. thuringiensis H-14 var.

Israelensis cultivado en sanguaza a diferentes tiempos de exposición sobre larvas del III estadio de A. aegypti en condiciones de laboratorio………...………..25 Tabla 3 Tiempos Letales (LT50 y LT90) de B. thuringiensis H-14 var. Israelensis

cultivado en sanguaza a diferentes concentraciones sobre larvas del III estadio de A. aegypti en condiciones de laboratorio………...….26 Tabla 4 Promedio de los porcentaje de mortalidad de larvas de A. aegypti por tiempo de exposición a diferentes concentraciones de B. thuringiensis H - 14 var. Israelensis en condiciones de campo simulado………….……27 Tabla 5 Concentraciones letales (LC50 y LC90) de B. thuringiensis H-14 var.

Israelensis cultivado en sanguaza a diferentes tiempos de exposición sobre larvas del III estadio de A. aegypti en condiciones de campo simulado………...…..30 Tabla 6 Tiempos Letales (LT50 y LT90) de B. thuringiensis H-14 var. Israelensis

(8)

Tabla 7 Promedio del Porcentaje de reducción del índice aédico al aplicar el bioisecticida contra larvas de A. aegypti en tres sectores de la localidad de Laredo, al día siguiente de aplicación…………...…32 Tabla 8 Promedio del Porcentaje de reducción del índice aédico al aplicar el

bioisecticida contra larvas de A. aegypti en tres sectores de la localidad de Laredo, a las semana de aplicación………...33 Tabla 9 Promedio del porcentaje de reducción del índice aédico al aplicar el

bioinsecticida contra larvas de A. aegypti en la localidad de Laredo, a los quince días de aplicación………...………34 Tabla 10 Promedio del porcentaje de reducción del índice aédico al aplicar el

bioinsecticida contra larvas de A. aegypti en la localidad de Laredo, a los 30 días de aplicación………...…….35 Tabla Anexo 2 Análisis químico de la “sanguaza” fresca obtenida de Puerto

Malabrigo-Perú………...…...…….58 Tabla Anexo 15 Base de datos de los recuentos en UFC/mL de Bacillus

thuringiensis H- 14 var. Israelensis cultivado en sanguaza………...66 Tabla Anexo 16 Base de datos del porcentaje de mortalidad a diferentes

concentraciones de B. thuringiensis H- 14 var. Israelensis cultivado en sanguaza sobre larvas de A. aegypti en condiciones de laboratorio………...……67 Tabla Anexo 17. Base de datos del porcentaje de mortalidad a diferentes

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Tabla Anexo 18 Análisis de Varianza de los Porcentajes de Mortalidad de larvas del III estadio de A. aegypti expuestas a diferentes concentraciones de B. thuringiensis H-14 var. Israelensis cultivado en sanguaza en condiciones de laboratorio (4 Horas)………...………...……69 Tabla Anexo 19 Análisis estadístico de comparación múltiple del porcentaje

de mortalidad de larvas del III estadio de A. aegypti expuestas a diferentes concentraciones B. thuringiensis H-14 var. Israelensis cultivado en sanguaza en condiciones de laboratorio, utilizando la prueba de significación de Tukey………...…….70

Tabla Anexo 20 Análisis de Varianza de los Porcentajes de Mortalidad de larvas del III estadio de A. aegypti expuestas a diferentes concentraciones de B. thuringiensis H-14 var. Israelensis cultivado en sanguaza en condiciones de campo simulado (4 Horas)………...71 Tabla Anexo 21 Análisis estadístico de comparación múltiple del porcentaje de

mortalidad de larvas del III estadio de A. aegypti expuestas a diferentes concentraciones B. thuringiensis H-14 var. Israelensis cultivado en sanguaza en condiciones de laboratorio, utilizando la prueba de significación de Tukey…………...……….72 Tabla Anexo 22 Recipientes preferidos por el A. aegypti, en la encuesta pre

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(1eraEncuesta)………...………73 Tabla Anexo 23 Recipientes preferidos por el A. aegypti, en la encuesta pre

tratamiento en los diferentes sectores de la localidad de Laredo (2da Encuesta)………..…...……74 Tabla Anexo 26 Temperaturas y Humedad Relativa tomadas por tiempo de

(11)

INDICE DE FIGURAS

Fig. 1 Curva de crecimiento de Bacillus thuringiensis H-14 var. Israelensis (Bti) cultivado en sanguaza en un biorreactor de tanque agitado. pH: 7.0; 30ºC; 0.5 vvm; 200 rpm, durante 48 horas………...………..20 Fig. 2 Linearización de la curva de crecimiento de B. thuringiensis H-14 var.

Israelensis cultivado en sanguaza en un biorreactor de tanque agitado. pH: 7.0; 30ºC; 0.5 vvm; 200 rpm, durante 48 horas…...………21 Fig. 3 Porcentaje comparativo de mortalidad de larvas del III estadio de Aedes

aegypti expuestas a diferentes tiempos y concentraciones de B. thuringiensis H-14 var. Israelensis cultivado en sanguaza en condiciones de laboratorio………...….23 Fig. 4 Porcentaje comparativo de mortalidad de larvas del III estadio de A. aegypti

expuestas a diferentes tiempos y concentraciones de B. thuringiensis H-14 var. Israelensis cultivado en sanguaza en condiciones de laboratorio……...………24 Fig 5 Porcentaje comparativo de Mortalidad de larvas del III estadio de A. aegypti

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Fig. 7 Reducción y Aumento de los Índices Aédicos en tres sectores de la localidad de Laredo, durante el 1, 7,15 y 30 días de aplicación del

bioinsecticida...36

Fig. Anexo 3 Crianza de larvas de A. aegypti……...………..………….60

Fig. Anexo 4 Jaulas para la crianza de A. aegypti………...….….…60

Fig. Anexo 5 Biorreactor Tanque Agitado y Aireado...61

Fig. Anexo 6 Cepa de B. thuringiensis H-14 var. Israelensis ...61

Fig. Anexo 7 Preparación de Medios Fermentativos...62

Fig. Anexo 8 Colonia Típica de Bti...62

Fig. Anexo 9 Campo Real con esporas de color verde y cristales de color rojo mediante la coloración Verde de malaquita modificado...63

Fig. Anexo 10 Bioensayos en condiciones de laboratorio………...……… 63

Fig. Anexo 11 Larvas muertas de A. aegypti por acción de Bti...64

Fig. Anexo 12 Aplicación de Bti en la localidad La Merced – Laredo…...….64

Fig. Anexo 13 Bioensayos en la localidad La Merced – Laredo………...….65

Fig. Anexo 14 Alumnos de la UNT que participaron en la aplicación y evaluación de la capacidad biocida de Bti en condiciones de campo………...……65

(13)

RESUMEN

Se elaboró un bioinsecticida a base de Bacillus thuringiensis H-14 var. Israelensis (Bti), cultivado en un medio utilizando a la sanguaza como fuente proteica y se evaluó la capacidad biocida del Bti sobre larvas de Aedes aegypti en condiciones de laboratorio, campo simulado y campo en el distrito de Laredo durante los años 2008 y 2009. La producción se llevó a cabo en biorreactores de tanque agitado y se obtuvo un bioinsecticida a una concentración de 10 11 UFC/mL después de 48

horas.

Para los bioensayos en condiciones de laboratorio y campo simulado se utilizaron larvas de A. aegypti criadas en laboratorio, se formaron siete grupos experimentales, cada grupo en un vaso con 25 larvas del III estadio y 100 mL de agua destilada (G1:0 mL, G2: 670 esp/mL. G3: 1683 esp/mL, G4: 4227 esp/mL. G5: 10619 esp/mL. G6: 26673 esp/mL y G7: 67000 esp/mL.); para los bioensayos en condiciones de campo simulado se realizaron en el centro poblado La Merced con cinco grupos experimentales (G1: 0 mL/50L, G2: 0.2 mL/50L; G3: 0.5 mL/50 L; G4:1 mL/50L; G5: 5 mL/50L), y con 200 larvas del III estadio por cada recipiente, evaluándose a diferentes tiempos y finalmente para la evaluación en campo se realizaron encuestas entomológicas pre y post tratamiento, con el fin de determinar el índice aédico.

(14)

ABSTRACT

It was elaborated a bioinsecticide with Bacillus thuringiensis H-14 var. Israelensis (Bti) cultivated in a medium using “flesh water fish” like a proteic source and it was evaluated the biocide capacity of the Bti over larvae of Aedes aegypti in laboratory conditions, simulated field and field in the district of Laredo during the years 2008 and 2009. The production was carried out in biorreactors of upset tank and a bioinsecticide was obtained to a concentration of 1011 UFC/mL after 48 hours. For

(15)

INTRODUCCION

En la actualidad, el Dengue es una de las arbovirosis más frecuentes que afecta al hombre; constituyéndose en un severo problema de Salud Pública en el Mundo, especialmente en la mayoría de países tropicales, donde las condiciones medio ambientales favorecen el desarrollo y proliferación del zancudo Aedes aegypti, principal vector, se estima que anualmente se presentan 50 millones de casos de Dengue en el mundo 1, 2,3.

El Perú, en el siglo XIX gran parte de su territorio estuvo infestado con A. aegypti; reportándose epidemias de Dengue en los años 1817 y 1877, En el año 1990 en la ciudad de Iquitos, se reporto una epidemia con un total de 150,000 personas infectadas; así como también en la ciudad de Tarapoto. Para el año 2000 en la ciudad de Trujillo, mayoritariamente en los distritos de Florencia de Mora, El Porvenir, La Esperanza y Laredo donde se reportaron aproximadamente 7000 casos de Dengue clásico 4,5.

(16)

alimenta primordialmente durante el día y pica principalmente en la mañana o en las últimas horas de la tarde dentro de la vivienda o en el peridomicilio 6, 7, 8.

En el distrito de Laredo los índices aédicos (IA) para el año 2005 fueron de 5.5%, con un total de 75 casos probables, 36 casos de dengue clásico confirmados y 3 casos de dengue hemorrágico; para el año 2006 el IA reportado fue de 4.0 %, con un total de 6 casos probables de dengue clásico y para el 2007 hasta la fecha es de 3.5 %, reportándose 18 casos probables y 2 confirmados de dengue clásico. Siendo los sectores de más alto riesgo La Merced, A.A. H.H. 30 de Noviembre y Laredo Centro, reportándose un índice de 3 %, 4% y 3.5% respectivamente 9.

Por tal motivo en este distrito, se realiza el control de este vector para disminuir el riesgo de infección y el número de casos. Esto se ha mejorado mucho por el uso de plaguicidas químicos10, 11, para tales fines se están utilizando

carbamatos y cipermetrinas, los cuales también afectan al ecosistema debido a su falta de selectividad, causando daño a otras formas de vida 12,13.

(17)

Actualmente para controlar poblaciones de insectos perjudiciales se está utilizando bacterias entomopatógenas, como las que forman una endotoxina con una alta capacidad de invadir la pared intestinal de los insectos; igualmente existen bacterias que se caracterizan por su alta patogenicidad, alta capacidad invasora y una rápida producción de toxina, que causa la muerte en los insectos. Los insecticidas biológicos solucionan algunos problemas, sus características más relevantes son: alta especificidad, lo que significa inocuidad para el hombre, animales y plantas; el no dejar residuos tóxicos, en el ambiente, y el tener mínimo impacto ambiental 18,19.

Bacillus thuringiensis es una bacteria que se encuentra en la flora natural del suelo, de forma bacilar, Gram positiva, anaeróbica facultativa y formadora de esporas; produce toxinas altamente específicas contra insectos 20. Se produce

comercialmente por fermentación en grandes tanques, primero se propaga en una fase vegetativa y luego exponencialmente.

Cuando un compuesto nutritivo del medio se agota, la bacteria entra en fase de esporulación siendo las proteínas toxigénicas sintetizadas durante esta fase. Después de terminada la esporulación, las células se lisan por completo, liberándose la espora y los cristales proteicos 21,22.

(18)

que tenga efecto. El cristal proteínico es altamente insoluble en condiciones normales, así ésta es enteramente segura para humanos, animales y muchos insectos 23,24, 25.

La δ -endotoxina de 130- 140 Kda es efectiva solamente cuando es ingerida por insectos que tienen en las membranas de sus células epiteliales del intestino medio receptores específicos para ligar dicha toxina. Una vez que esta ha sido ingerida, se solubiliza en el ambiente alcalino y reductor de este y bajo la acción de las proteasas, se transforma en su forma activa de 60 Kda; la cual actúa sobre dichos receptores, creando poros en las membranas celulares y conduciendo al desequilibrio de iones. Las células se lisan; la larva deja de alimentarse, el pH intestinal disminuye para equilibrarlo con el pH sanguíneo. Esta disminución en el pH permite a las esporas bacterianas germinar, invadiendo posteriormente al huésped y causando una letal septicemia 26, 27,28.

La esporulación es una respuesta a determinadas condiciones nutricionales y ambientales; las fuentes de carbono nitrógeno y oxígeno muy importantes en la producción de biomasa de Bti; así como de la toxina; pues la falta o disminución de las concentraciones de estas fuentes son las causas principales del inicio de la esporulación, así, se puede producir bioinsecticida a partir de fuentes carbonadas y nitrogenadas de desecho 29, 30,31.

(19)

bombeo" y "sanguaza". Este último desecho es eliminado sin ninguna clase de tratamiento a la red pública; estas fábricas se encuentran en el radio urbano; y si se encuentran cerca al mar, vacían estos desechos a las orillas sin ningún tratamiento preliminar, constituyendo realmente una evidencia preocupante de la alteración del ambiente; solamente en la ciudad de Chimbote se produce, alrededor del 65% de este desecho, generándose un grave problema de contaminación 32, 33.

Las fábricas de harina de pescado ubicadas en Puerto Malabrigo, distrito de Rázuri, provincia de Ascope, Región La Libertad están contaminando el ambiente costero de su jurisdicción al arrojar sus desechos sin tratamiento o parcialmente tratados directamente al mar ó en su defecto a las arenas de las playas 34,35.

Esta contaminación de las aguas conduce a un mayor consumo de oxígeno y a un mayor gasto del oxígeno por degradación de la materia orgánica; entonces el oxígeno disuelto se consume casi totalmente, y comienzan a desaparecer la mayoría de los pequeños animales y muchas algas verdes y, por consiguiente, los peces y finalmente la capacidad autodepuradora del cauce se agota 36,37.

(20)

El desecho pesquero "sanguaza" contiene cantidades apreciables de proteínas (6,3%), grasas (3,2%), sólidos solubles e insolubles (3,5%), sales minerales (1,8%) y otros, las cuales podrían ser aprovechadas para la producción de biomasa de la bacteria. La sanguaza ha sido utilizada en biorreactores Airlift así como también en biorreactores de Tanque Agitado, como fuente orgánica de nitrógeno, satisfaciendo las necesidades nutricionales de la bacteria, logrando la producción del bioinsecticida y alcanzando la mayor concentración del bacilo a las primeras seis horas de fermentación; así mismo trabajaron la producción de Bti produciendo su toxina en un medio fermentativo diseñado solo a base de sanguaza diluida, pero no se encontraron valores elevados de producción , tal vez por la falta de aireación usada o la falta de algún nutriente específico 40,41 .

(21)

cambios o las variaciones bruscas son el primer signo de un problema en la fermentación 29,40.

(22)

MATERIAL Y METODOS

1. Material biológico:

En el presente trabajo de investigación se empleó la cepa de Bacillus thuringiensis H-14 var. Israelensis (BTI) proviene del Instituto Pasteur de Paris – Francia, lote Nº 91509 donada por el instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboltd de la Universidad Peruana Cayetano Heredia.

Larvas de Aedes aegypti, del distrito de Laredo.

Sanguaza proveniente de las industrias harineras del Puerto de Malabrigo (Provincia de Ascope – Dpto. La Libertad).

2 METODOS

2.1 Ubicación del distrito de Laredo

El distrito de Laredo se encuentra ubicado en el valle de Santa Catalina al Nor-Este de Trujillo, departamento de La Libertad, comprende 25 localidades dentro de su jurisdicción. Tiene una superficie territorial de 335 Km2 a una altitud de 39 m.s.n.m.

2.2 Diseño Experimental

(23)

sectores de la localidad de Laredo y así determinar el Índice Aédico Pre tratamiento e Índice Aédico Post tratamiento

Los sectores se escogieron por presentar el mayor índice aédico.

2.3 Diseño de los biorreactores “Tanque Cilindro Agitado y Aireado” (TCAA) Se construyeron 3 biorreactores de Tanque Cilindro Agitado con aireación interna, cada uno de 1.7 litros de volumen de trabajo, los cuales presentaron circulación interna de aire, para este fin se usaron asas internas, los flujos de aire utilizados fueron de 0.5 vvm y 220 rpm (Anexo 5).

El aire se proporcionó por una bomba, el cual fue previamente purificado al pasar a través de dos frascos en serie que contuvieron solución salina estéril al 30%.

Terminada la construcción y ensamblaje de cada biorreactor se desinfectó con alcohol de 70º y luego se sometió a la luz UV por tres horas 40.

2.4 Recolección y conservación del desecho pesquero sanguaza

La sanguaza fue recolectada de las fábricas de harina de pescado del puerto “Malabrigo”, está se transportó al Laboratorio de Microbiología Industrial

Sectores

(24)

y Biotecnología, determinándose su composición química (Anexo 2) y conservándola por congelación (-20 ºC) por un tiempo no mayor de 5 días 40 .

2.5 Preparación del Medio fermentativo

Se acondicionó en base a un medio de producción a gran escala (Anexo 1) en el que se adicionó sanguaza en reemplazo de la fuente nitrogenada. La sanguaza previamente colectada, fue diluida a 10% v/v (Anexo 7), el pH fue ajustado a 7.0 con NaOH 1 N, y el medio esterilizado en autoclave (121ºC/15 min/1 atm.) 41.

2.5.1 Aislamiento de la cepa

Se tomó una asada del cultivo (Anexo 8), obtenido en el medio líquido (TPH) Triptosa fosfato (Anexo 6) y se sembró por el método de agotamiento en medio agar NYSMA para la esporulación 25. Luego se incubó a 30 ºC por

24 horas, posteriormente se realizó el control microbiológico mediante la coloración de GRAM y verde de malaquita modificado 42.

2.5.2 Estandarización del inóculo

Se cosechó el cultivo de B. thuringiensis H-14 var. Israelensis (24 horas / 30ºC) con solución salina fisiológica estéril a partir de las placas con el agar NYSMA para la esporulación, y se estandarizó hasta el tubo Nº 2 (9 x 106 cél/ mL.) del Nefelómetro de Mac Farland 40.

(25)

Se inoculó una alícuota de 170 mL. de la suspensión estándar, en cada biorreactor, seguidamente se los incubó en agitación y aireación constante durante 48 horas a temperatura de (30º C. ± 2 º C) 29 .

2.6 Control de la Producción del bioinsecticida

Los muestreos se realizaron cada 5 horas, se extrajeron 5 mL. del medio fermentativo para las evaluaciones de pH, temperatura, tiempo de fermentación, recuento de células vegetativas y células esporulantes mediante la coloración verde de malaquita modificado (Anexo 9) y el recuento de UFC/mL se realizará por el método de recuento en placa 71.

2.7 Obtención del bioinsecticida.

Una vez terminado el tiempo de fermentación, se centrifugó el medio fermentativo de los diferentes biorreactores a 3500 rpm. por 15 minutos, eliminándose el sobrenadante. El precipitado se guardó en la refrigeradora 5 ºC hasta su aplicación. Se consideró como formulación bioinsecticida el contenido total de esporas, cristales proteicos y residuos celulares.

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de agua destilada, con un número aproximado de 300 larvas por recipiente. (Anexo 3)

Posteriormente, se alimentaron las larvas desde el primer estadio con alimento para peces bien triturado. El alimento se esterilizó en una estufa a 80 ºC durante 30 minutos y se empaco en papel aluminio, el agua se recicló interdiariamente para evitar el desarrollo de patógenos 16.

Las pupas, fueron colocadas en una jaula de metal con tul, de los adultos que emergieron: las hembras (hematófagas) fueron alimentadas con sangre de ratón y los adultos machos (fitófagos) fueron alimentados con glucosa al 10 %. Posteriormente las hembras alimentadas se colocaron en vasos descartables con agua, dentro del cual se colocó papel bond adherido a las paredes, sobre el cual las hembras realizaron la ovoposición, posteriormente los huevos fueron sumergidos en depósitos con agua declorada, para que eclosionen y así obtener unas 3000 larvas del tercer estadio de A. aegypti que fueron utilizadas en los bioensayos 45. (Anexo 4)

2.9 Evaluación del bioinsecticida en condiciones de laboratorio

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4227 esp/mL, G5: 10619 esp/mL, G6: 26673 esp/mL y G7: 67000 esp/mL). A todos los grupos experimentales se mantuvieron en las mismas condiciones ambientales, las lecturas fueron realizadas después de las 2, 4,8, 12 y 24 horas de exposición, las larvas muertas por acción del Bti no presentan movimiento y toman un color negruzco (Anexo 11).

2.9.1 Análisis estadístico

Se empleó el programa Statgraphic Plus for Windows version 5.1, para determinar si existen diferencias significativas entre los tratamientos con respecto al control , mediante el análisis de varianza y comparación de medias (Tukey), se consideró estadísticamente significativo un p < 0.05 47.

2.10 Determinación de la infectividad y la virulencia mediante la concentración letal LC50 y el tiempo letal LT50 de A. aegypti para la

evaluación en condiciones de laboratorio

Se determinó la infectividad mediante la concentración letal (LC50) y la

virulencia mediante el tiempo letal (LT50) de A. aegypti, los datos obtenidos

en los bioensayos se procesaron mediante el programa Probit versión 1.5 46,

el cual tiene un nivel de significancia del 95%.

2.11 Evaluación del Bioinsecticida en campo simulado

(28)

bandeja de plástico de 50 litros con agua previamente declorada (Anexo 12). La elección de los tratamientos por cada unidad experimental y control se realizó completamente al azar. Se aplicaron cuatro tratamientos (0.2mL/50L; 0.5mL/50L; 1mL/50L; 5mL/50L) y un grupo control al que no se le agregó Bti, cada tratamiento se realizó por triplicado. Las unidades experimentales fueron evaluadas a las 2, 4, 8, 12, 16, 24, 36 y 48 horas (Anexo 13), en cada tiempo de evaluación se tomaron también datos de temperatura y humedad relativa. (Anexo 26).

2.11.1 Análisis estádistico

Se empleó el programa Statgraphic Plus for Windows version 5.1, para determinar si existen diferencias significativas entre los tratamientos con respecto al control , mediante el análisis de varianza y comparación de medias (Tukey), se consideró estadísticamente significativo un p < 0.05 47.

2.12 Determinación de la infectividad y la virulencia mediante la concentración letal LC50 y el tiempo letal LT50 de A. aegypti para la

evaluación en condiciones de campo simulado

Se determinó la infectividad mediante la concentración letal (LC50) y

la virulencia mediante el tiempo (LT50) de A. aegypti, los datos obtenidos en

los bioensayos se procesaron mediante el programa Probit versión 1.5 46, el

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2.13 Evaluaciones de los índices aédicos antes de la aplicación del bioinsecticida en el distrito de Laredo.

Las evaluaciones pre aplicación, aplicación y post aplicación se llevaron a cabo durante los años 2008 y 2009. Para las evaluaciones se tomo en cuenta los factores ambientales como temperatura ambiental y humedad relativa del distrito de Laredo. Se realizó las encuestas entomológicas en los sectores de La Merced, AA.HH. 30 de Noviembre y Laredo Centro, obteniéndose un índice aédico pre tratamiento de cada sector; con el fin de conocer el nivel de infestación inicial y el tipo de depósitos domiciliarios positivos de A. aegypti . Posteriormente se realizaron las encuestas entomológicas post tratamiento para determinar el índice aédico. Para la realización de esta encuesta se utilizó un formato proporcionado por la Dirección General de Salud Ambiental (Anexo 23)43.

2.14 Aplicación del Bioinsecticida en el distrito de Laredo

Para la aplicación se utilizó el bioinsecticida cultivado en sanguaza, se aplicó a los tres sectores seleccionados del distrito de Laredo (Asentamiento Humano 30 de Noviembre, La Merced y Laredo Centro).

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La dosis del bioinsecticida fue de 5 mL por cada 50 litros de agua, esta se aplicó en el depósito establecido como positivo a larvas de A. aegypti 44.

Las aplicaciones fueron realizadas por estudiantes de biología de la Universidad Nacional de Trujillo y personal del establecimiento de Salud de “Laredo” (Anexo 14).

Las aplicaciones del bioinsecticida se realizarán por triplicado.

2.15 Evaluación post tratamiento

Luego de concluida la encuesta pre tratamiento y aplicación al siguiente día se realizó la primera encuesta post tratamiento, a la semana a los 15 días y al mes para obtener la información sobre su permanencia, las viviendas a evaluar fueron las mismas que en la encuesta pre tratamiento y aplicación.

2.16 Participación Comunitaria

Para este trabajo se reunió a la población de estos tres sectores con sus respectivas autoridades y se les informó sobre las medidas necesarias para la aplicación de este bioinsecticida y para obtener su aprobación, mediante un consentimiento informado (Anexo 24 y 25).

2.17 Análisis Estadístico

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RESULTADOS

Al evaluar la capacidad biocida de Bacillus thuringiensis H-14 var. Israelensis (Bti), cultivado en sanguaza sobre larvas de Aedes aegypti en el distrito de Laredo durante los años 2008-2009, se encontró los siguientes resultados que han sido organizados en tablas y gráficos como se muestran a continuación.

En la figura 1 se presenta la curva de crecimiento de B. thuringiensis H-14 var. Israelensis cultivado en sanguaza en un biorreactor de tanque agitado a 200 rpm; 30 ºC; pH 7.0; 0.5 vvm, durante 48 horas de agitación constante, donde se observa que al aumentar el tiempo de incubación, aumentan también las UFC/mL.

En la figura 2 se presenta la linearización de la curva de crecimiento de B. thuringiensis H-14 var. Israelensis cultivado en sanguaza Ln (UFC/mL) en función del tiempo de duración del bioproceso (48 horas), mostrándose una velocidad de crecimiento de 0.251 h-1 en un biorreactor de tanque agitado a 200 rpm; 30 ºC ; pH

7.0; 0.5 vvm.

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En las figuras 3 y 4, se muestran los porcentaje comparativos de mortalidad de larvas del III estadio de A. aegypti expuestas a diferentes concentraciones y tiempos de exposición de B. thuringiensis H-14 var. Israelensis cultivado en sanguaza en condiciones de laboratorio; por otro lado en las figuras 5 y 6 se presentan los porcentajes comparativos de mortalidad de larvas del III estadio en campo simulado.

Al realizar el análisis Probit, se determinó los valores de las dosis letales (LC50 y LC90) para las larvas del III estadio de A. aegypti a las 2, 4, 8, 12 y 24 horas

en condiciones de laboratorio y campo simulado como se observa en las tablas 2 y 5 respectivamente.

Los valores del tiempo letal (LT50 y LT90) para larvas del III estadio de A. aegypti a las diferentes concentraciones de B. thuringiensis H-14 var. Israelensis se muestran en las tablas 3 y 6, tanto en condiciones de laboratorio como de campo simulado respectivamente, observándose que a medida que aumenta la concentración, el tiempo necesario para matar el 50% y 90% de la población en estudio va disminuyendo.

(33)

al 96.78%, al siguiente día de aplicación, posteriormente el índice de reducción va disminuyendo a través del tiempo.

(34)

Fig. 1 Curva de crecimiento de Bacillus thuringiensis H-14 var. Israelensis cultivado en sanguaza en un biorreactor de tanque agitado. pH: 7.0; 30ºC; 0.5 vvm; 200 rpm, durante 48 horas.

Tiempo (horas)

(

UF

C

/m

L

)

1.00E+00 1.00E+01 1.00E+02 1.00E+03 1.00E+04 1.00E+05 1.00E+06 1.00E+07 1.00E+08 1.00E+09 1.00E+10 1.00E+11 1.00E+12

(35)

Ln

(

UF

C

/mL

)

Fig. 2 Lin Isr 7.0

nearización aelensis cu 0; 30ºC; 0.5

de la cur ultivado en 5 vvm; 200 r T

rva de cre sanguaza e rpm, duran Tiempo (ho

ecimiento d en un biorr te 48 horas oras)

de B. thuri reactor de t s.

ringiensis H tanque agit

(36)

Tabla 1 Promedio de los Porcentajes de Mortalidad de larvas del III estadio de Aedes aegypti expuestas a diferentes concentraciones y tiempos de exposición de B. thuringiensis H-14 var. Israelensis cultivado en sanguaza en condiciones de laboratorio.

Tratam. T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7

0.0 uL. 0.4 uL. 0.98 uL. 2.45 uL. 6.2 uL. 15.5 uL. 38.7 uL.

2 0 4 6.7 16 54.7 81.3 93.3

4 0 25.3 26.7 50.7 86.7 94.7 98.7

6 0 47.3 70.7 85.3 96 98.7 100

8 0 66.7 82.7 94.7 96 100 100

10 0 74.7 88 96 96 100 100

12 0 80 90.7 100 100 100 100

14 0 85.3 93.3 100 100 100 100

16 0 90.7 93.3 100 100 100 100

18 0 93.3 96 100 100 100 100

20 0 94.7 97.3 100 100 100 100

22 0 96 100 100 100 100 100

24 0 97.3 100 100 100 100 100

26 0 98.7 100 100 100 100 100

Concent. Tiempo

(37)

Porcen de

mortal

Fig. 3 P ae thu de ntaje e lidad

Porcentaje c

gypti exp uringiensis

laboratorio

comparativo puestas a H-14 var. Is o.

C

o de morta diferentes sraelensis Concentracione

alidad de la tiempos cultivado e es

arvas del I y concent n sanguaza

II estadio d raciones d a en condic

(38)

Por

mor

Fig. 4 P rcentaje

de rtalidad

Porcentaje c

aegypti e thuringiens condicione

comparativo expuestas

sis H-14 es de labora

o de morta a diferente var. Israe atorio.

Concentracion

alidad de la es tiempos elensis cu nes

arvas del I y concent ultivado en

II estadio d traciones d n sanguaz

(39)

Tabla 2 Concentraciones letales (LC50 y LC90) de B. thuringiensis H-14 var.

Israelensis cultivado en sanguaza a diferentes tiempos de exposición sobre larvas del III estadio de A. aegypti en condiciones de laboratorio.

Tiempos

(Horas)

LC50 LC90

uL uL

2 5.22 23.82

4 1.62 9.28

8 0.175 1.58

(40)

Tabla 3 Tiempos Letales (LT50 y LT90) de B. thuringiensis H-14 var. Israelensis

cultivado en sanguaza a diferentes concentraciones sobre larvas del III estadio de A. aegypti en condiciones de laboratorio.

Concentración

(uL.)

LT50

(horas)

LT90

(horas)

0.4 6.43 15.41

0.98 4.91 11.09

2.45 3.54 6.74

6.2 1.74 4.73

(41)

Tabla 4 Promedio de los porcentaje de mortalidad de larvas de A. aegypti por tiempo de exposición a diferentes concentraciones de B. thuringiensis H - 14 var. Israelensis en condiciones de campo simulado.

Tratam. T1 T2 T3 T4 T5

0.0 mL. 0.2 mL. 0.5 mL. 1.00 mL. 5.00 mL.

2 0 3 15 55 96

4 0 37 43 76 97

8 0 69 72 81 98

12 0 70 72 84 99

16 0 75 77 96 99

20 0 87 93 98 100

24 0 88 99 100 100

48 0 100 100 100 100

Tiempo

Horas

(42)

Fig. 5 P a th c Porcentaje de mortalidad

Porcentaje c

aegypti ex huringiensis condiciones

comparativo xpuestas a

s H-14 de campo s

o de Morta diferentes var. Israel simulado.

Concentracio

alidad de la s tiempos

ensis cu ones

arvas del I y concen ultivado en

II estadio d traciones d n sanguaza

(43)

Porc

mor

Fig. 6 P a th c centaje de rtalidad Porcentaje c

aegypti exp huringiensis condiciones

comparativo puestas a

s H-14 v de campo s

Concentr

o de Mo diferente var. Israele simulado. raciones ortalidad de es tiempos

nsis culti

e larvas del y concent vado en

III estadio traciones de

(44)

Tabla 5 Concentraciones letales (LC50 y LC90) de B. thuringiensis H-14 var.

Israelensis cultivado en sanguaza a diferentes tiempos de exposición sobre larvas del III estadio de A. aegypti en condiciones de campo simulado.

Tiempos 

( Horas)     

LC 50 (mL)  LC 90 (mL) 

2 1.025 2.88

4 0.41 2.61

8 0.09 1.86

12 0.08 1.5

(45)

Tabla 6 Tiempos Letales (LT50 y LT90) de B. thuringiensis H-14 var. Israelensis

cultivado en sanguaza a diferentes concentraciones sobre larvas del III estadio de A. aegypti en condiciones de campo simulado.

 

Concentración 

(mL.)  LT50

(horas)

LT90 (horas)

0.2 5.73 25.02

0.5 5.32 18.55

(46)

Tabla 7 Promedio del Porcentaje de reducción del índice aédico al aplicar el bioisecticida contra larvas de A. aegypti en tres sectores de la localidad de Laredo, al día siguiente de aplicación.

Sector Total de

viviendas Viviendas Inspecc. Viviendas Cerradas Vivienda Positivas (pre-aplica) Índice Aédico Vivienda Positivas (post-aplica) Índice Aédico Reducción del Índice Aédico (%)

Laredo Centro 918 565 245 14 2.47 1 0.18

*

92.71

30 de Noviembre

436

278

141

9 3.23 0 0.00

*

100

La Merced 620 297 334 8 2.69 0 0.00

*

100

Total 1974 1140 720 31 2.71 1 0.087

*

96.78

(47)

Tabla 8 Promedio del Porcentaje de reducción del índice aédico al aplicar el bioisecticida contra larvas de Aedes aegypti en tres sectores de la localidad de Laredo, a las semana de aplicación.

Sector Vivienda

Inspec.

Vivienda Positivas (pre-aplica)

Índice Aédico

Vivienda Positivas (post-aplica)

Índice Aédico

Reducción del Índice Aédico (%)

Laredo Centro 565 14 2.47 2 0.35 * 85.83

30 de Noviembre 278 9 3.23 1 0.36 * 88.85

La Merced 297 8 2.69 1 0.34 * 87.36

Total 1140 31 2.71 4 0.35 * 87.05

(48)

Tabla 9 Promedio del porcentaje de reducción del índice aédico al aplicar el bioinsecticida contra larvas de Aedes aegypti en la localidad de Laredo, a los quince días de aplicación.

*Existen diferencias significativas

Sector Vivienda

Inspec.

Vivienda Positivas (pre-aplica)

Índice Aédico

Vivienda Positivas (post-aplica)

Índice Aédico

Reducción del Índice Aédico (%)

Laredo Centro 565 14 2.47 8 1.41 * 42.91

30 de Noviembre 278 9 3.23 5 1.79 * 44.58

La Merced 297 8 2.69 4 1.34 * 50.19

(49)

Sector Vivienda

Inspec.

Vivienda Positivas (pre-aplica)

Índice Aédico

Vivienda Positivas (post-aplica)

Índice Aédico

Reducción del Índice Aédico (%)

Laredo Centro 565 14 2.47 4 2.12 NS 14.17

30 de Noviembre 278 9 3.23 9 3.23 NS 0

La Merced 297 8 2.69 8 2.69 NS 0

Total 1140 31 2.71 31 2.71 NS 6.27

Tabla 10 Promedio del porcentaje de reducción del índice aédico al aplicar el bioinsecticida contra larvas de A. aegypti en la localidad de Laredo, a los 30 días de aplicación.

(50)

Fig Índice Aédico

g. 7 Red loc bio

ducción y calidad de oinsecticida

Aumento Laredo, du

.

de los Índ urante el Tiem

dices Aédic 1, 7,15 y mpo

os en tres 30 días de

sectores e aplicació

(51)

DISCUSION

Bacillus thuringiensis H-14 var. Israelensis (Bti) es un microorganismo que se puede cultivar en fermentadores o biorreactores de tanque aireado y agitado que son eficientes ya que permiten una producción con menos contaminación, mejor calidad y alta transferencia de oxigeno 25; el medio

fermentativo juega un papel importante, pues en el deben estar contenidos todos los nutrientes y sustancias químicas que lleven a la máxima producción de la toxina al menor costo posible 31, por lo que en la presente investigación se cultivo

Bti en un medio líquido utilizando a la sanguaza producto de desecho de la industria harinera al 10% v/v, como fuente proteica, en biorreactores de tanque aireado y agitado (Anexo 5), a pH 7.0, 30 ºC, 0.5 vvm y 220 rpm durante 48 horas; en las figuras 1 y 2 se observa que el bioinsecticida obtenido tuvo una buena producción de biomasa (Anexo 15) por lo tanto la sanguaza demostró ser una buena fuente orgánica nutricional para la reproducción del Bti, puesto que el inóculo inicial fue de 106 esporas/mL, obteniéndose al final del proceso

una concentración de 1011 esporas/mL, lo que coincide con De Barjac , quien

indica que un medio es apropiado para la producción de B. thuringiensis cuando su concentración al final del proceso se encuentra entre 106 UFC y 1010

esporas/mL 48.

(52)

Para evaluar la capacidad biocida de Bti cultivado en sanguaza, se realizaron bioensayos sobre larvas del III de Aedes aegypti en condiciones de laboratorio (Anexo 16), demostrando tener una alta actividad tóxica, como lo muestra la Tabla Nº 1; así mismo al comparar la mortalidad larval entre 4 y 8 horas (Fig.3) se puede observar para esta especie existe una mortalidad directamente proporcional a las concentraciones aplicadas, es decir a mayor concentración mayor mortalidad de larvas, esto debido que hay una alta cantidad de cristales presentes en el bioinsecida, y por ende una mayor probabilidad de que las larvas se alimenten de estos y desencadenen su acción tóxica provocando la muerte de las larvas; por otro lado al comparar los porcentajes de mortalidad entre las 12 y 24 horas (Fig. 4), podemos observar que a las 24 horas existe una mortalidad del 100% en todas las concentraciones, lo cual indica que estaríamos frente a un potente bacilo entomopatógeno, tales resultados concuerdan con los obtenidos por Montero quien demostro una alta susceptibilidad de las especies Culex quinquefasciatus y A. aegypti frente al B. thuringiensis variedad Israelensis H-14 11.

(53)

Los valores de la concentraciones letales medias (LC50) y las

concentraciones letales al 90% (LC90) se muestran en la Tabla 2, evidenciándose

diferencias de las LC50 y LC90 a diferentes tiempos de exposición, para 2 horas

se presenta una LC50 de 5.22 y para 12 horas una LC50 de 0.16, por consiguiente

a mayor tiempo menor concentración del bioinsecticida, es decir las larvas de A. aegypti son muy susceptibles a la acción tóxica de la deltaendoxina, lo cual ha sido mostrado por Rodrigues quien encontró diferencias en los valores de las LC50 para diferentes especies Anopheles braziliensis, A. darlingi y A. nuneztovari

utilizando B. sphaericus 2362 52; así mismo al analizar los valores LT50 y LT90

(Tiempos para matar el 50% y 90% de la población respectivamente), se aprecian en la Tabla 5, evidenciándose que a mayor concentración, el tiempo de muerte va disminuyendo, es decir se requiere una concentración mayor para un mayor efecto tóxico en el menor tiempo de exposición y visceversa.

Los bioensayos realizados en el laboratorio utilizando Bti cultivado en sanguaza demostraron la gran capacidad biocida de esta bacteria contra las larvas de A. aegypti; por lo tanto se realizaron los bioensayos en campo simulado, tomando los resultados en base al mayor porcentaje de mortalidad, en el menor tiempo y la menor concentración evaluada, condiciones básicas para determinar la eficiencia del bioinsecticida elaborado en base a Bti, tales consideraciones son propuestas por Castro 58 .

(54)

Anophelinos con Bti se producen entre las 24 horas de realizadas las aplicaciones.

Al realizar las comparaciones de la mortalidad larval entre 4 y 8 horas (Fig.5), 24 y 48 horas (Fig.6), se puede observar que existe una mortalidad directamente proporcional a las concentraciones aplicadas, así como también al tiempo, reportándose que la mayor mortalidad larval se evidencia a las 24 y 48 horas de aplicado el bioinsecticida en condiciones de campo simulado, resultados concordantes con los de Pereira 56, quien trabajo con bioinsecticida a

base de Bti, en Río de Janeiro Brazil, obteniendo una mortalidad del 100 % a las 24 y 48 horas en condiciones de campo simulado; esto debido a la gran capacidad biocida, así como también por su especificidad al insecto blanco.

A partir de los resultados en campo simulado, analizados estadísticamente, se observo que existen diferentes significativas entre los tratamientos (Anexo 20), encontrándose mediante la prueba de Tukey tres grupos homogéneos con respecto a la concentración (Anexo 21), teniendo el mismo efecto la concentración de 1mL/50L y 5mL/50L es decir, no presentan diferencias significativas, demostrando estadísticamente que cualquiera de estas dos concentraciones podrían ser utilizadas para posteriores aplicaciones en campo; de otro lado Wilmot, evaluó Vectobacâ y Bactimosâ en su formulación granulada para controlar larvas de mosquito del género Aedes en charcas del bosque en Michigan; no encontró diferencias significativas entre las dos formulaciones, ya que obtuvo un 90% de control con aplicaciones bajas 0.89 lb/acre y un 98 % de control con aplicaciones altas de 2.5 a 5 lb/acre 65 .

(55)

de evaluación corresponden diferentes valores de CL50 y CL90, así como a cada

concentración correspondieron también diferentes valores de TL50 y TL90,

obteniéndose que para las 12 horas de exposición un LC50 0.08 mL y un LC90

1.50 y para las 24 horas de exposición un LC50 0.07 mL y un LC90 0.22; en lo

concerniente a la concentración 1 mL se necesitó un LT50 de 1 hora con 33

minutos y un LT90 de 10 horas con 39 minutos, estos resultados comparados

con los obtenidos por Gato 67, quien no encontró diferencias significativas entre

los valores de LC50 y LC90 de Bti contra A. aegypti probablemente por factores

genéticos, así como también por los factores ambientales que juegan un papel importante en la expresión del genotipo.

Las concentraciones de 1mL/50L y 5mL/50L no presentaron diferencias significativas, por lo tanto fueron ideales para aplicarlas en condiciones de campo, en ese sentido la concentración elegida fue la de 5ml/50L, debido a que se enfrentó a muchos factores, especialmente los ambientales, las variables intervinientes del distrito de Laredo, por otro lado también se evaluó la residualidad del bioinsecticida.

Los resultados obtenidos en condiciones de campo corroboran la gran capacidad biocida de Bti cultivado en sanguaza contra larvas de A. aegypti (Tabla 7), con una elevado porcentaje de reducción del índice aédico a las 24 horas de aplicación en los tres sectores de la localidad de Laredo, resultados que difieren con los reportados por Gomes 44, quienes después de haber

aplicado Bti en formulaciones líquidas y sólidas obtuvo una reducción del índice aédico del 17 al 22% en algunos distritos de Río de Janeiro, no obstante Rodrígues 52, utilizo distintas concentraciones de

(56)

En la tabla 7 en la evaluación del bioinsecticida al siguiente día de la aplicación se observa que en el sector Laredo Centro existe un índice del 0.18 % es decir en una vivienda en donde se aplicó el bioinsecticida se encontrarón larvas vivas, probablemente a la gran cantidad de sedimento encontrado en el cilindro que consistió en tierra y otras partículas, ya que esto neutraliza la acción biocida 48.

A la capacidad biocida de Bti cultivado en sanguaza contra larvas de A. aegypti se aúnan los factores medioambientales en los que se da el contacto de las larvas con el producto; sin embargo juegan un papel importante las condiciones de temperatura y humedad relativa, ya que al aumentar la temperatura hay una mayor efectividad a causa de un mayor metabolismo y actividad alimentaria, el biolarvicida se enfrentó a estos factores encontrados en el distrito de Laredo, por consiguiente no alteraron los resultados ya que demuestran ser muy efectivo; sin embargo, esto no coincide con Montalván 60,

que vieron limitado el efecto del biolarvicida por el alto nivel de alcalinidad del agua en la zona. Estudios realizados por Masuh, demostró que bajo condiciones de presión de los factores climáticos se ve limitado el efecto de Bti sobre el patrón de comportamiento de los índices larvales 68.

(57)

los cilindros y baldes quienes constituyen los de mayor número, y en quienes se aplicó las dosis de 5mL por cada 50 litros de agua, previa consentimiento informado (Anexo 25).

La variación en porcentaje de reducción de los índices aédicos en los tres sectores de la localidad de Laredo (tablas 7, 8,9 y 10), nos muestran que el valor del índice aédico pre tratamiento en la localidad de Laredo es de 2.71 considerando en mediano riesgo, aplicando el bioinsecticida se observa que tiene una reducción del 96.78% a la evaluación realizada al siguiente día, debido al comportamiento alimenticio de las larvas, ya que ellas van al fondo del recipiente para tomar el alimento 48, el bioinsecticida usado fue en

formulación líquida, este sedimentó al fondo para estar a disposición de las larvas, el uso del bioinsecticida tiene una relevancia, porque permitió reducir sustancialmente el riesgo de transmisión del dengue en estos sectores, pues ya que índices aédicos superiores al 5% podrían ocasionar epidemias del Dengue.

La condiciones óptimas encontradas de temperatura entre 18 y 24ºC y humedades relativas de 54 a 66% son condiciones óptimas que para que el bioinsecticida actué en condiciones de campo, consideraciones que deben tomadas en cuenta para la aplicación de todo bioinsecticida como lo indica Ponce 57. Por otro lado la residualidad de Bti es hasta la fecha la característica

(58)

La evaluación de la permanencia o residualidad del bioinsecticida es de una semana, ya que a los quince días (Fig, 7) de aplicado el bioinsecticida nos muestran que en algunas casas ya este se agoto, presentando un repoblamiento de larvas y esto debido a diferentes factores como la temperatura hay una mayor actividad metabólica, presencia de radiación ultravioleta podrían tener un efecto perjudicial sobre la deltaendotoxina 61, esto concuerda con los resultados

de Giraldo 70, quienes obtienen un efecto residual de quince días utilizando Bacillus thuringiensis contra larvas de A. aegypti.; no obstante estos resultados difieren de los obtenidos por 44, quienes utilizan diversas formulaciones de B. thuringiensis H-14 var. Israelensis contra A. aegypti encontrando una residualidad de 62 días, y esto probablemente al tipo de características de las formulaciones empleadas.

Durante muchos años, el temephos (organofosforado) demostró ser un excelente larvicida, de acción rápida para controlar al A. aegypti, la aparición de resistencia en algunos países 53, la contaminación del ambiente, y la potencial

toxicidad en seres humanos, es que ha obligado a buscar nuevas alternativas de control seguras, efectivas y de bajo costo para el control del Dengue, que podría reemplazar el uso de productos químicos o combinar ambos métodos, en tal sentido es que el uso del bioinsecticida es una herramienta de bajo impacto ambiental para implementarlo en el programa de control del A. aegypti y la OMS lo establece como una muy buena alternativa para reemplazar al Temefos (Abate), sobre todo en aquellos casos en donde se detecte la resistencia al larvicida.

(59)

aplicado para el control de vectores en muchos países como Indonesia, India, Nigeria, Israel, China, Korea, Colombia, Brasil, Cuba, Argentina 63, algunos

(60)

CONCLUSIONES

Bacillus thuringiensis H-14 var. Israelensis cultivado en sanguaza, presenta una alta capacidad biocida sobre larvas de Aedes aegypti en el distrito de Laredo bajo condiciones de campo, durante los años 2008 y 2009..

Bacillus thuringiensis H-14 var. Israelensis cultivado en sanguaza, presenta una alta concentración de cristales y una alta efectividad sobre las larvas del III estadio de Aedes aegypti en condiciones de laboratorio.

Bacillus thuringiensis H-14 var. Israelensis cultivado en sanguaza, presenta una alta efectividad sobre las larvas del III estadio de Aedes aegypti en el distrito de Laredo bajo condiciones de campo simulado.

• A mayor concentración de esp/ml de B. thuringiensis H-14 var. Israelensis demuestra una mayor mortalidad contra larvas del III estadio de A. aegypti.

• Los valores de la LC50 y LC90 son variables a las diferentes horas de

exposición.

• La concentración efectiva para la aplicación contra las larvas de A.

(61)

PROPUESTA

La aplicación de insecticidas químicos son cada vez más criticados por la persistencia en el medio ambiente, toxicidad a otros organismos, y sobre todo porque los insectos han desarrollado resistencia en algunos países de Sudamérica. En la actualidad se utiliza el insecticida órganofosforado Abate (Temephos) larvicida muy eficaz de alto poder residual, para combatir larvas de Aedes aegypti vector establecido en la región y a nivel nacional, por ello los resultados de la presente investigación proponen:

1. Continuar con las investigaciones, utilizando otras alternativas locales, como productos alternativos para la producción de Bacillus thuringiensis (Bti), que se encuentre al alcance y que abarate los costos de producción, y que reduzcan el impacto ambiental en nuestra localidad.

2. Potenciar y masificar la aplicación de Bti cultivado en sanguaza, por constituir una buena alternativa para controlar específicamente larvas de Aedes aegypti transmisor del Dengue, por ser seguro y efectivo e inocuo para la naturaleza. 3. Implementar normas y políticas dentro del Programa de Control del Dengue en

nuestros gobiernos locales y regionales para el uso de este bioinsectida como una herramienta alternativa para reemplazar al Temephos (Abate) sobre todo en aquellos casos donde se presente la resistencia a este larvicida.

(62)

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(70)
(71)
(72)

ANEXO 1

COMPONENTES DEL MEDIO FERMENTATIVO SUPLEMENTADO CON

“SANGUAZA”

Glucosa... 5.0g

KH

2

PO

4

... 2.5g

Puré de Tomate... 40.0g

CaCO

3

... 1.0g

MgSO

4

.7H

2

O... 0.00011g

MnSO

4

. H

2

O... 0.040g

FeSO

4

.7H

2

O... 0.028g

CaCl

2

.4H

2

O... 0.030g

Sanguaza diluida al 1/10... 500mL

Agua destilada... 500mL

Figure

Fig. 1 Curva de  crecimiento de Bacillus thuringiensis H-14 var. Israelensis cultivado  en sanguaza en un biorreactor de tanque agitado
Tabla 1  Promedio de los  Porcentajes de Mortalidad de larvas del III estadio de Aedes aegypti  expuestas a diferentes concentraciones  y
Tabla 2  Concentraciones letales (LC 50  y LC 90 ) de B. thuringiensis  H-14 var.
Tabla 3  Tiempos Letales (LT 50  y LT 90 ) de B. thuringiensis  H-14 var. Israelensis
+6

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