Hongos Micorrizicos Arbusculares nativos presentes en la rizósfera de Opuntia ficus indica en suelos áridos de Tumbes, Perú

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(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE. CI A. S. BI O. LO G. IC. AS. CIENCIAS BIOLÓGICAS. EN. “Hongos Micorrizicos Arbusculares nativos. CI. presentes en la rizósfera de Opuntia ficus-indica en. CA. DE. suelos áridos de Tumbes, Perú.” TESIS. BIÓLOGO. BL. IO TE. PARA OBTENER EL TÍTULO PRPFESIONAL DE. BI. AUTORA: Br. Quezada Salirrosas, Marilyn Rosa Alexandra. ASESORA: Dra. Chaman Medina, Mercedes Elizabeth. TRUJILLO – PERU 2016. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. LO G. IC. Dr. Orlando Gonzáles Nieves. AS. RECTOR. VICERRECTOR ACADEMICO. S. BI O. Dr. Rubén Vera Veliz. CI A. VICERRECTOR DE INVESTIGACION. CI. EN. Dr. Weyder Portocarrero Cárdenas. DE. DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS. CA. Dr. Marco Leoncio Salazar Castillo. IO TE. DIRECTOR DE LA ESCUELA ACADEMICA PROFESIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS. BI. BL. Dr. Manuel Roberto Rodríguez Lacherre. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. PRESENTACIÓN Señores miembros del jurado: En cumplimiento a lo dispuesto en el reglamento de grados y títulos de la. AS. Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, me es. IC. honroso presentar, someter a vuestra consideración y elevado criterio el. LO G. presente informe de tesis titulado: " Hongos Micorrizicos Arbusculares nativos presentes en la rizósfera de Opuntia ficus-indica en suelos áridos de Tumbes,. BI O. Perú.” de este modo se está cumpliendo con uno de los requisitos. DE. CI. EN. CI A. S. indispensables para optar el título profesional de Biólogo.. _______________________________________ Br. Marilyn Rosa Alexandra Quezada Salirrosas. BI. BL. IO TE. CA. Trujillo, Marzo del 2016. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. LO G. _________________________________________ Dr. Julio Chico Ruíz.. IC. AS. MIEMBROS DEL JURADO. EN. CI A. S. BI O. PRESIDENTE. CI. ________________________________________ Dr. Roger Veneros Terrones.. BI. BL. IO TE. CA. DE. SECRETARIO. ________________________________________ Dra. Mercedes Elizabeth Chaman Medina. VOCAL. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEL ASESOR Quien suscribe, profesora asesora de tesis titulada “Hongos Micorrizicos Arbusculares nativos. presentes en la rizósfera de Opuntia ficus-indica en. AS. suelos áridos de Tumbes, Perú” deja constancia que esta ha sido desarrollada. IC. de conformidad con los objetivos propuestos en su perfil académico y que el. LO G. informe ha sido revisado y acoge las observaciones y sugerencias alcanzadas.. __________________________________________. BL. IO TE. CA. DE. CI. EN. CI A. S. continuar con los trámites correspondientes.. BI O. Por tanto, autorizo al Br. Marilyn Rosa Alexandra Quezada Salirrosas a. BI. Dra. Mercedes Elizabeth Chaman Medina Asesora. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN DE TESIS Los profesores que suscriben, miembros del jurado dictaminador, declaran que la presente tesis titulada “Hongos Micorrizicos Arbusculares nativos presentes. AS. en la rizósfera de Opuntia ficus-indica en suelos áridos de Tumbes, Perú”. LO G. requisitos exigidos, por lo que fue aprobada por unanimidad.. IC. presentada por la Br. Marilyn Rosa Alexandra Quezada Salirrosas reúne los. CI A. S. BI O. Trujillo, 23 de Marzo del 2016.. CA. DE. CI. EN. _________________________________________ Dr. Julio Chico Ruíz PRESIDENTE. BI. BL. IO TE. _________________________________________ Dr. Roger Veneros Terrones. SECRETARIO. ________________________________________ Dra. Mercedes Elizabeth Chaman Medina. VOCAL. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEDICATORIA A mis amados padres Isabel y Augusto que me dieron la vida y han estado conmigo en todo mostrándome. su. amor,. apoyo. AS. momento,. IC. incondicional, comprensión y paciencia. Ya que. BI O. LO G. sin ellos todo esto no sería posible.. A mis hermanos Vladimir y José María, que aunque ya. S. no estén a mi lado siempre están presentes en mi. CI A. corazón y son el motor importante, mi fortaleza y las. A mi novio Alfredo que ha sabido ganarse mi confianza y mi amor; por ser una gran persona y el gran apoyo en mi. vida. profesional. ayudándome. en. los. momentos de necesidad sin mostrar ningún interés.. BI. BL. IO TE. CA. DE. CI. EN. ganas para salir adelante.. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AGRADECIMIENTOS A Dios por mostrarme el camino adecuado, protegiéndome con su divina misericordia cada día, llenándome de esperanza y paciencia en los momentos. AS. tristes y de necesidad.. IC. A mis mejores padres, por educarme, enseñarme, amarme y tratar de darme lo. LO G. mejor cada día a pesar de las circunstancias, ya que son el motivo para recorrer el camino del triunfo y hacer que se sientan orgullosos de mi cada día.. BI O. A mi hermano Vladimir Alexei Paoli que desde el cielo me cuida y por ser mi. S. motor y motivo para salir adelante y luchar por lo que quiero.. CI A. A mi hermano José Carlos, por ser ejemplo como profesional y por mostrarme. EN. su cariño y apoyo, por confiar plenamente en mi dándome consejos que he. CI. sabido valorar y poner en práctica.. A Bernabé por darme la oportunidad de realizar mi tesis en la empresa y ser. DE. una persona responsable, apoyándome y enseñándome cada día.. CA. A la señora Roxana por su amistad y gran apoyo en el tiempo que estuve. IO TE. realizando mi tesis en la ciudad de Tumbes. A Cesar Chanta por su apoyo en el laboratorio de Incabiotec SAC.. BL. A mi profesora Mercedes Elizabeth Chaman Medina, por aceptar ser mi. BI. asesora, por enseñarme, brindarme sus conocimientos, y apoyo constante en la elaboración de este proyecto de investigación.. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INDICEi ii. PRESENTACIÓN. iii. MIEMBROS DEL JURADO. iv. AS. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. v. IC. DEL ASESOR. LO G. APROBACIÓN DE TESIS DEDICATORIA. BI O. AGRADECIMIENTOS INDICE. S. LISTA DE TABLAS. CI A. LISTA DE FIGURAS. EN. RESUMEN. CI. ABSTRACT INTRODUCCIÓN. vi vii viii ix x xi xiii xiv 1 7. RESULTADOS. 14. CA. 20. IO TE. DISCUSIÓN. DE. MATERIAL Y MÉTODOS. 26. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 27. ANEXOS. 35. BI. BL. CONCLUSIONES. ix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. LISTA DE TABLAS Tabla 1. Parámetros físico – químicos considerados en el análisis de las muestras de suelo de las diferentes zonas de muestreo.. AS. Tabla 2. Temperaturas y tiempos optimizados en cada etapa de PCR en las 3. LO G. e ITS4+GLOM1310) y Gigaspora (NS5+GIGA5.8).. IC. semi-nested PCR de HMA para identificar los géneros Glomus (NS5+GLOM5.8. Tabla 3. Intensidad de bandas representadas por positivos leves (+L) y fuertes. BI O. (+F) para la identificación de HMA mediante pruebas de Semi-nested PCR,. S. utilizando primers específicos para los géneros Glomus (NS5+GLOM5.8 e. CI A. ITS4+GLOM1310) y Gigaspora (NS5+GIGA5.8) en las diferentes zonas de. BI. BL. IO TE. CA. DE. CI. EN. muestreo.. x Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. LISTA DE FIGURAS Figura. 1. Zonas de muestreo de la rizósfera de Opuntia ficus-indica en Tumbes-Perú.. IC. propagación de HMA en las diferentes zonas de muestreo.. AS. Figura. 2. Medicago sativa “alfalfa” usados como cultivos trampa para la. LO G. Figura. 3. Representación esquemática de genes de ARN ribosómico con sitios de hibridación de primers (Redecker, 2000).. BI O. Figura. 4. Esporas de HMA teñidas luego de realizar la tinción de raíces de. S. Medicago sativa (cultivo trampa) con azul de tripano (Phillips y Hayman, 1970). CI A. procedentes de las zonas conocidas como: A) Casitas. B) Cabuyal. C). EN. Corrales. D) Puerto Pizarro. E) Uña de Gato.. Figura. 5. Pellet obtenido luego de realizar la extracción de ADN de HMA en. CI. las diferentes zonas de muestreo.. DE. Figura. 6. Visualización de las bandas luego de la migración en gel de agarosa. CA. al 1% del ADN extraído de HMA de las diferentes zonas de muestreo. CE: Control de extracción. CO: Corrales. C+: Control positivo. UG: Uña de Gato.. IO TE. PP: Puerto Pizarro. CB: Cabuyal. CA: Casitas. Figura. 7. Toma de muestra de la rizosfera de O. ficus-indica en Puerto. BI. BL. Pizarro.. Figura. 8. Metodología usada en el aislamiento de HMA. (A) Muestras de suelo. en shaker. (B) Recojo de material que quedó atrapado en los diferentes tamices. (C) Embudo Buchner conectado a una bomba de vacío. (D) placas de Petri conteniendo papel filtro con esporas de HMA. xi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Figura. 9. Esporas de HMA luego de realizar el aislamiento mediante el método del tamizado de la rizósfera de O. ficus-indica procedentes de las zonas conocidas como: (A) Casitas. (B) Cabuyal. (C) Corrales. (D) Puerto Pizarro. (E). AS. Uña de Gato.. IC. Figura. 10. Cultivos trampa de alfalfa. (A) Macetas utilizadas para los cultivos. LO G. trampa. (B) Sustrato estéril inoculada con una capa homogénea de HMA. (C) Siembra de las semillas de alfalfa. (D) Diferencias de crecimiento del control. BI O. positivo y control negativo.. Figura. 11. Tinción de raíces de HMA. (A) Preparando reactivos para la tinción.. S. (B) Raíces extraídas de los cultivos trampa de alfalfa. (C) Raíces cortadas y. CI A. lavadas con agua estéril. D) Tubos conteniendo las raíces teñidas.. EN. Figura. 12. Extracción de ADN de HMA. (A) Agregándole nitrógeno líquido a la. CI. muestra de raíz. (B) Trituración de las raíces en un mortero con nitrógeno. DE. líquido. (C) Recojo de lo triturado a un microtubo de 1.5ml. (D) Agregándole. triturada.. CA. 600µl del Buffer de Extracción CTAB 2X (pre-calentado a 60°C) a la muestra. IO TE. Figura. 13. Visualización de las bandas del producto de las 3 semi-neted PCR migrados en gel de agarosa al 1.5%, Todas las bandas migraron a una misma. BL. distancia aproximada de 250 pb. CA1, CB1, CO1, PP1, UG1: Casitas 1,. BI. Cabuyal 1, Corrales 1, Puerto Pizarro 1, Uña de Gato 1. C+: Control positivo. M: Marcador de peso molecular. CA2, CB2, CO2, PP2, UG2: Casitas 2, Cabuyal 2, Corrales 2, Puerto Pizarro 2, Uña de Gato 2. CA3, CB3, CO3, PP3, UG3: Casitas 3, Cabuyal 3, Corrales 3, Puerto Pizarro 3, Uña de Gato 3.. xii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN El 40% de la superficie del Perú corresponde a zonas áridas. Actualmente algunas estrategias están orientadas a convertirlas en tierras cultivables.. AS. Especies propias de estos ecosistemas, como la cactácea O. ficus-indica, son. IC. muy eficientes en el aprovechamiento del agua. La asociación con Hongos. LO G. Micorrizicos Arbusculares (HMA) de su rizósfera les brinda resistencia a factores adversos como estas zonas áridas. Esta experiencia tuvo como. BI O. objetivo aislar e identificar HMA nativos presentes en la rizósfera de O. ficusindica en suelos áridos de Tumbes, Perú. Se obtuvieron muestras de rizósfera. S. en 5 zonas áridas de Tumbes, de donde se aisló esporas de HMA por el. CI A. método de tamizado y luego se multiplicó en cultivos trampas de alfalfa. El. EN. análisis molecular de HMA empezó con la extracción de su ADN, luego se procedió con las pruebas de semi-nested PCR usando primers externos específicos. (NS5+GLOM5.8R;. ITS4+GLOM1310;. NS5+GIGA5.8R), estas pruebas se evaluaron por. electroforesis. Los. CI. y. DE. (NS5+ITS4). CA. resultados mostraron bandas positivas en las muestras problemas, esto sugiere que mediante semi-nested PCR es posible la identificación de HMA en la. IO TE. rizósfera asociada a O. ficus-indica. Palabras Clave: Hongos Micorrizicos Arbusculares, rizósfera, O. ficus-indica,. BI. BL. suelos áridos.. xiii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ABSTRACT 40% of the surface of Peru corresponds to arid areas. Currently some strategies are oriented to turn them into arable land. typical of these ecosystems species,. AS. such as O. ficus-indica cactus, they are very efficient in water use. The. IC. association with mycorrhizal fungi Arbusculares (HMA) from its rhizosphere. LO G. gives resistance to adverse factors how are you arid areas. This experience aimed to isolate and identify native HMA present in the rhizosphere of O. ficus-. BI O. indica in arid soils of Tumbes, Peru. rhizosphere samples were obtained at 5 arid Tumbes, where spores of HMA was isolated by sieving method and then. S. multiplied in alfalfa crop traps. The molecular analysis of HMA began with the. CI A. extraction of DNA, then proceeded with testing semi-nested PCR using external. EN. primers (NS5 + ITS4) and specific (NS5 + GLOM5.8R; ITS4 + GLOM1310; NS5 + GIGA5.8R ), these tests were evaluated by electrophoresis. The results. CI. showed positive bands in the samples problems, this suggests that using semi-. DE. nested PCR is possible to identify HMA in the rhizosphere associated with O.. CA. ficus-indica.. BI. BL. IO TE. Keywords: Arbuscular mycorrhizal fungi, rhizosphere, O.ficus-indica, arid soil.. xiv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INTRODUCCION Las situaciones ambientales negativas que se viene observando a nivel nacional e internacional es la desertificación y la sequía; debido a los impactos. AS. económicos, sociales y ambientales que genera (Gómez, 2008). La. IC. desertificación es la degradación de las tierras de zonas áridas, semiáridas y. LO G. subhúmedas secas; es en estas en donde, a causa del mal manejo de los recursos naturales, se observa una mayor susceptibilidad al deterioro. BI O. desencadenando una serie de procesos negativos (MINAM, 2011). Algunos de éstos son: pérdida de suelos por erosión eólica e hídrica, empobrecimiento. S. químico del suelo, reducción del nivel de agua del subsuelo, alteración general. CI A. del ciclo hidrológico, regeneración natural menor de plantas herbáceas y. EN. leñosas, reducción severa de la productividad de los ecosistemas y pérdida de. CI. la diversidad biológica (Granados et al., 2013). En el. sector agrícola la desertificación cobra importancia por las. DE. consecuencias en mano de obra y donde la población de bajos ingresos es la. CA. más vulnerable a este problema ambiental, debido a que ellos son altamente. IO TE. dependientes de la agricultura y por ende de la productividad de la tierra para su sostenimiento (Hazell et al., 2002, tomado de Winslow et al., 2004). El grado de desertificación se puede medir por el impacto que tiene sobre la. BL. productividad. La desertificación ligera corresponde a la reducción en. BI. productividad por debajo de 10%, moderada entre 10% y 25%, severa entre 25% y 50% y muy severa mayor a 50%. En el caso de desertificación muy severa, no es posible revertir el proceso. (Gómez, 2008).. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Las tierras secas alcanzan un total de 61.5 millones de km2 (MINAM, 2011). Además cabe resaltar, que solamente Chile y Perú presentan zonas hiperáridas, las cuales ocupan cerca de 200 mil km2 (Reynolds et al., 2005).. AS. Alrededor de la mitad de las tierras cultivables es árida, semiárida o está bajo la. IC. amenaza de la sequía. El Perú ocupa el tercer lugar entre los países con mayor. LO G. extensión de desierto a nivel de América del Sur, de acuerdo a estas estimaciones, las tierras secas entre zonas áridas, semiáridas y subhúmedas. BI O. secas alcanzan más de 500 mil km2, lo que constituye el 40% de la superficie del Perú. (MINAM, 2011).. S. En años recientes se ha incrementado el interés en diversas especies de. CI A. cactus, debido al papel sobresaliente que juegan en el éxito de sistemas de. EN. agricultura sustentables en áreas marginales de zonas áridas y semiáridas, por. CI. lo que los cactus han desarrollado adaptaciones fenológicas, fisiológicas y. (Reynolds, 2003).. DE. estructurales con el fin de mantener su desarrollo en este ambiente adverso. CA. Los cactus son plantas suculentas (turgentes, carnosas y jugosas), por su. IO TE. característica de almacenar agua en sus tejidos y que luego se utilizarán, como una forma de adaptación para soportar prolongadas sequías y sobrevivir en. BL. lugares muy áridos (Ostolaza, 2010).. BI. En el Perú se encuentran 262 especies de cactus que forman parte de nuestra flora silvestre (Ostolaza, 2014). La única representante del orden Cactales es la familia Cactaceae, que incluye 130 géneros y 2000 especies (Shedbalkar et al., 2010); se divide en cuatro subfamilias:. Pereskioideae, Opuntioideae,. Maihuenioideae y Cactoideae (Anderson, 2001; Wallace,. 1995; Wallace y. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Gibson., 2002). La subfamilia Opuntioideae se caracteriza porque presenta gloquidios o espinas barbadas, que son unas espinas muy pequeñas y abundantes, como pinceles, que se quiebran fácilmente de la base y se. AS. adhieren a la ropa o la piel al manipularlas (Ostolaza, 2010). El género Opuntia tiene numerosas especies, cerca de 75, es el de mayor distribución y el más. LO G. IC. conocido. (Ostolaza, 2014).. O. ficus-indica “tuna”, es la especie más conocida y de mayor valor económico.. BI O. Oriunda de México, se cultiva en muchos países, sobre todo fuera del continente. Es entre las cactáceas, la de mayor importancia agronómica, tanto. S. por sus sabrosos frutos como por sus tallos que sirven de forraje (Ostolaza,. CI A. 2014); Complementario a su importancia como alimento, están también sus. EN. usos como medicina, bebida, fuente de pigmentos y como objeto de prácticas. CI. mágico-religiosas (Anaya, 2003).. El establecimiento de Opuntia en particular en zonas de escasos recursos de. DE. agua y nutrientes, como son los suelos áridos, requerimos de una visión global. CA. de todo el ecosistema e interacción planta-microorganismos. La diversidad microbiana como son los HMA del suelo, aun es poco conocida (Nobel, 2002;. IO TE. Kobert et al., 2011, Marasco et al., 2012). Conocer los integrantes de la comunidad microbiana asociada a los cactus es un aspecto de particular. BL. atención para desarrollar una agricultura de desierto ya que es posible. BI. favorecer la aplicación de inoculantes sin perjudicar el equilibrio biológico de los suelos (Soroa et al., 2009). La rizósfera es el hábitat ecológico en el cual los microorganismos están en contacto directo con la raíz de las plantas y es el sitio donde se dan diversas interacciones, como: competencia, mutualismo, comensalismo, amensalismo, 3. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. predación y parasitismo. Dependiendo del tipo de relación con la planta, los microorganismos pueden ser benéficos o nocivos (Gómez et al., 2012). Las bacterias, hongos (incluidos los HMA), oomycetes, virus y arqueas viven en la. AS. rizósfera, estos son atraídos y se alimentan de rhizodepositos, es decir, nutrientes, exudados, células de frontera y mucílago liberada por la raíz de la. LO G. IC. planta (Philippot et al., 2013).. Los HMA son microorganismos rizosféricos simbióticos. Como en otras. BI O. relaciones simbióticas, ambos participantes obtienen beneficios. En este caso la planta recibe de los hongos principalmente nutrientes, minerales y agua, y el. S. hongo obtiene de la planta hidratos de carbono y vitaminas que él por sí mismo. CI A. es incapaz de sintetizar mientras que ella lo puede hacer gracias a la. EN. fotosíntesis y otras reacciones internas (Redecker, 2000). Los resultados de la simbiosis son modificaciones en la organización de células vegetales y fúngicas. CI. causadas por cambios específicos en la expresión génica. Recientemente,. DE. muchos esfuerzos se centraron en el estudio de estos patrones de expresión génica para identificar un espectro más amplio de genes implicados. Se estima. CA. que entre el 90 y el 95% de las plantas terrestres presentan micorrizas de. IO TE. forma habitual. (Smith y Read, 1997). El uso de HMA en la agricultura tiene un gran potencial biotecnológico debido a. BL. que facilitan la disponibilidad de nutrientes para las plantas. Además de ser. BI. estos microsimbiontes, componentes inseparables de los agroecosistemas, realizan diversas funciones en su asociación con las plantas, pueden constituir sustitutos biológicos de los fertilizantes minerales (Thompson, 1991). Entonces el uso de estos hongos, permite que se incremente la adaptación y que la fertilización sea más eficiente, es por ello que en el caso de los cultivos se 4. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. podría ahorrar cantidades importantes de fertilizantes minerales e igualmente lograr una absorción de los nutrientes disponibles en el suelo (Prieto et al., 2012). Por lo tanto, las plantas micorrizadas poseen una ventaja importante con. AS. respecto a las no micorrizadas (Klironomos, 2003).. IC. El efecto benéfico de los HMA (definido como efectividad) en la promoción del. LO G. crecimiento y/o nutrición de las plantas parece estar definido por la riqueza de aspectos ecológicos de donde fueron recolectados los HMA. Aun cuando no. BI O. son específicos, los HMA pueden presentar mayor compatibilidad hacia algunas especies vegetales (Van der Heijden, 1998). Así, algunos HMA pueden. S. estimular el crecimiento, y otros pueden favorecer la absorción de nutrientes,. CI A. inducir resistencia a fitopatógenos, o ayudar en la adaptación y tolerancia de. EN. las plantas ante condiciones de estrés (Hodge et al., 2000).. CI. En sistemas agroforestales con cacao, en el trópico húmedo ecuatoriano, al aislar HMA, los géneros encontrados fueron los siguientes: Gigaspora,. DE. Acaulospora, Glomus y Scutellospora. En todos los sitios muestreados el. CA. género con mayor representatividad en cantidad de esporas encontradas por gramo de suelo fue Glomus, mientras que para Gigaspora hubo la menor. IO TE. cantidad de esporas (Prieto et al., 2012). La inoculación de HMA a plantas hospederas o cultivos trampa, es la única. BL. forma de asegurarse que se aislaron esporas de HMA que forman la. BI. endomicorriza vesículo – arbuscular. Para la propagación del inoculante se recomiendan plantas de crecimiento rápido o ciclo vegetativo corto (Ferrera et al., 1993).. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. La coloración de raíces y su observación al microscopio; es el único método para la determinación de la presencia de ciertas estructuras de HMA: vesículas, hifas, arbúsculos y su relación dentro de la raíz (Phillips y Hayman, 1970).. AS. PCR (Polymerase Chain Reaction) es una técnica de biología molecular, la cual. IC. consiste en la amplificación de un segmento determinado de la cadena de ADN. LO G. o ADNc y producir muchas copias, para diferentes fines, como visualización en gel, cuantificación, secuenciación, etc. La semi-nested PCR es una variante de. BI O. la PCR, en la cual consiste en dos PCR consecutivas utilizando 3 primers, 2 primers universales para la primera PCR y 1 primer interno y 1 primer universal. S. para la segunda PCR (Shafiqua y Stephan, 2013; Redecker, 2000).. CI A. La electroforesis horizontal es una técnica de biología molecular para observar. EN. la presencia o ausencia de ADN, así como también peso molecular de ácidos. CI. nucleicos, siempre y cuando se adicione un marcador de peso molecular (Khan. DE. et al., 2007).. Para la identificación de HMA a nivel molecular se realizaron pruebas de semi-. CA. nested PCR con primers universales el ITS4 y NS5 y primers internos el. IO TE. GLOM1310, GLOM5.8R, GIGA5.8R, LEC1670, ACAU1660 y ARCH1311 (Redecker, 2000). Nuestro objetivo en esta investigación fue aislar e identificar HMA nativos presentes en la rizósfera de O. ficus-indica en suelos áridos de. BI. BL. Tumbes, Perú.. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ATERIAL Y METODOS a. Área de estudio (Toma de muestra) Tumbes es un departamento. situado en el extremo noroeste de. AS. Perú, se caracteriza por poseer una alta temperatura y humedad. IC. relativa durante todo el año, siendo la temperatura promedio de 26. LO G. °C, así mismo el promedio de precipitación anual es de 464.1 mm y ocurren durante los meses de diciembre a abril (SENAMHI, 2015).. BI O. Las muestras fueron recolectadas de la rizósfera de O. ficus-indica de las zonas de Corrales, Cabuyal, Casitas, Uña de Gato y Puerto. S. Pizarro del departamento de Tumbes (Fig.1). O. ficus-indica fue. CI A. seleccionada por juicio no probabilístico o de conveniencia debido a. EN. que las plantas se encontraban en pequeñas cantidades y en estado silvestre, se consideró como juicio crítico la vigorosidad de la planta y. BI. BL. IO TE. CA. DE. CI. el tamaño. Figura 1. Zonas de muestreo de la rizósfera de Opuntia ficus-indica en Tumbes-Perú.. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. b. Material Biológico Se excavó un hoyo alrededor de las raíces, y se tomó el suelo que a. estas,. conjuntamente. con. fragmentos. de. raíz. AS. rodeaba. (aproximadamente 200 gr) de seis plantas de O. ficus-indica para. IC. cada zona de muestreo. Las muestras fueron colectadas en bolsas. LO G. ziploc cada una por separado, enseguida dichas muestras fueron llevadas a laboratorio y conservadas a 4 °C, para evitar el deterioro. S. BI O. de la muestra.. CI A. c. Determinación físico-químico del suelo. Del suelo de las 6 plantas de muestreo por cada zona, se hizo una. textura, pH, materia orgánica, nitrógeno, fosforo y. CI. determinar la. EN. mezcla y a partir de los 1200 gr se pesó 1000 gr de suelo para. DE. potasio, esta determinación fue realizada en el Laboratorio de Agua, Suelo, Medio Ambiente y Fertirriego de la Facultad de Ingeniería. CA. Agrícola de la Universidad Nacional Agraria La Molina, quienes nos. IO TE. proporcionaron los resultados del análisis correspondiente. Los 200 gr restantes de cada zona de muestreo se separaron para el. BI. BL. aislamiento de esporas de HMA.. d. Aislamiento de esporas de HMA en la rizósfera. Lo realizamos mediante el método de tamizado (Gerderman y Nicholson, 1963). La cual consistió en pesar 10 g de suelo y se mezcló con 100 ml de agua en un matraz, se agitó durante 15 8. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. minutos, seguidamente se dejó reposar por 30 segundos, para que las esporas queden suspendidas, luego se pasó a través de tamices de 500, 212, 106 y 38 µm. El material que quedó atrapado en los. AS. diferentes tamices, se recogió y se vertió en un tubo falcón cada uno con una pequeña cantidad de agua de manera que de una cantidad. IC. de 15 ml, se llevó a centrifugar durante 5 minutos a 2000 rpm, se. LO G. descartó el sobrenadante. Luego se le adicionaron 15 ml de la solución de sacarosa al 80%. Se equilibraron los tubos y se llevó a. BI O. centrifugar durante 2 minutos a 2000 rpm. Se sacó cuidadosamente los tubos de la centrifuga, cuidando de no romper la interface agua –. CI A. S. sacarosa. Se vertió toda la superficie de la interface y un poco de esta para recoger las esporas que no atravesaron la solución, en un. EN. embudo Buchner al cual se colocó un papel filtro y se complementó. CI. con una bomba de vacío, para que toda la materia que este flotando. DE. en la superficie del agua pase al papel filtro. Luego el papel filtro con los sedimentos después del filtrado se colocaron en placas de petri y. CA. se observaron al microscopio para visualizar las esporas aisladas y. IO TE. pasar a inocular a los cultivos trampa.. BI. BL. e. Cultivos Trampa Usamos cultivos trampa de alfalfa con la finalidad de propagar esporas de HMA y obtener mejor calidad de ADN de estos HMA (Ferrera et al., 1993). Se esterilizó el suelo, para ello lo llenamos el suelo en frascos de vidrio y lo colocamos en el autoclave a 15 atmosferas por 15 minutos; luego se desinfectó la maceta con 9. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. alcohol y se le llenó de suelo hasta las tres cuartas partes de su capacidad total, seguidamente se colocó una capa homogénea del inóculo del HMA (papel filtro conteniendo esporas) y se llenó hasta. AS. su capacidad total con suelo estéril. Se procedió a la siembra con semillas de alfalfa y se le mantuvo bajo condiciones de invernadero. CI A. S. BI O. LO G. IC. por un periodo de 3 meses (Fig. 2).. Figura 2. Medicago sativa “alfalfa” usados como cultivos trampa. EN. para la propagación de HMA en las diferentes zonas de muestreo.. CI. .. f. Tinción de raíces colonizadas con HMA.. DE. Realizamos la tinción de raíces de los cultivos trampa de Medicago. CA. sativa “alfalfa” mediante el método de Phillips y Hayman (1970), con la finalidad de observar la propagación y la presencia de las esporas. IO TE. e hifas de HMA.. BL. g. Extracción de ADN de HMA. BI. Trituramos las raíces en un mortero con nitrógeno líquido, se traspasó aproximadamente 0.1gr de lo triturado a un microtubo de 1.5ml y con la ayuda de los maceradores se siguió triturando, se le agregó 600µl del Buffer de Extracción CTAB 2X (pre-calentado a 60°C) para luego seguir macerando y luego se homogenizó en el 10. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. vortex. Se llevó a Incubar a 60°C por 60 minutos (homogenizó cada 15-20 minutos durante el tiempo de incubación). Se le adicionó 300µl de fenol buferiado y 300µl de cloroformo/alcohol isoamilico (24:1). AS. (homogenizó invirtiendo los microtubos), se llevó a centrifugar a 12 000 rpm por 10 minutos a 4°C y se recuperó el sobrenadante a un. IC. nuevo microtubo. Se le volvió agregar un volumen igual de. LO G. cloroformo/alcohol isoamilico (24:1) (homogenizó invirtiendo los microtubos), se centrifugó a 12 000 rpm por 10 minutos a 4°C y se. volumen. de. isopropanol. helado. BI O. recuperó el sobrenadante a un nuevo microtubo. Se le agregó 0.6 (homogenizó. invirtiendo. los. CI A. S. microtubos) y se llevó a incubar -20°C por 30-60 minutos. Se centrifugó a 10 000 rpm por 10 minutos a 4°C, se eliminó el. EN. sobrenadante y se agregó 500 µl de etanol al 75%, se homogenizó. CI. en el vortex. Por último se llevó a Centrifugar a 10 000 rpm por 5 se. DE. minutos a 4°C, se eliminó el sobrenadante completamente y. centrifugó a 12 000 rpm por 1 minuto, se sacó los restos de. CA. sobrenadante. Se dejó secar 15 minutos el pellet a temperatura. IO TE. ambiente para luego resuspenderlo en 30 µl de T.E (precalentado a 60 °C). Se le agregó 1 µl de ARNasa y se incubó a 65 °C por 15. BI. BL. minutos.. h. Semi-nested PCR Preparamos el buffer mix, el cual consistió en agregar en un tubo eppendorf los siguientes reactivos: 15.8 µl de AUP (Agua Ultra Pura), 2.5 µl de Buffer 10x, 0.5 µl de Dntps, 2 µl de MgCl2, 1 µl de Primers 11. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Forward y Reverse y 0.2 µl de Taq. Polimerasa recombinante, por cada reacción, luego se agregó 23 µl del buffer mix y 2 µl de la muestra de ADN en microtubos, seguidamente fueron puestos en un. AS. termociclador con el programa optimizado. Para HMA realizamos pruebas de semi-nested PCR, los cuales se usamos como primers (NS5+ITS4). y. específicos. (NS5+GLOM5.8R;. IC. externos. LO G. ITS4+GLOM1310; NS5+GIGA5.8R) (Fig. 3.) debido a que son. EN. CI A. S. BI O. específicos para identificar HMA.. DE. CI. Figura 3. Representación esquemática de genes de ARN ribosómico con sitios de hibridación de primers (Redecker, 2000).. i. Electroforesis en gel de agarosa. CA. Para la preparación del gel pesamos 1.8 gr de agarosa y se le. IO TE. mezcló con 120 ml de tampón TAE 1X en un matraz de Erlenmeyer, Se calentó la mezcla en la cocina hasta que se disolvió la agarosa, se dejó enfriar la mezcla y se agregó 6 µl de bromuro de etidio, se. BI. BL. mezcló bien y se vertió la solución en el molde, se dejó que se forme el gel. Una vez completamente formado el gel, se retiró cuidadosamente el peine y se colocó el gel en la cubeta de electroforesis. Previamente se mezcló 8 µl del producto de la seminested PCR con 2 µl del buffer de carga, para luego proceder a. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. cargar los 10 µl de cada muestra en pocillos consecutivos, se cerró la tapa de la cubeta del gel y se conectó los cables eléctricos a 90 voltios por 40 minutos, para que el ADN migre hacia el ánodo. Por. BI. BL. IO TE. CA. DE. CI. EN. CI A. S. BI O. LO G. IC. bandas que es la presencia del ADN de HMA.. AS. último se llevó el gel en un transiluminador UV y se observó las. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESULTADOS Los resultados obtenidos del análisis físico–químico como textura, pH, materia orgánica (M.O.), nitrógeno (N), fosforo (P) y potasio (K) del suelo de O. ficus-. IC. AS. indica de cada zona de muestreo se presentan en la Tabla 1.. Zona de. pH. M.O.. relación 1:1. (%). P. K. (%). ppm. ppm. Franco Arenoso. 7.74. 3.82. 0.16. 25.38. 228.00. Corrales. Arena franca. 8.18. 1.79. 0.08. 44.36. 268.00. Uña de Gato. Franco Arenoso. 8.13. 0.71. S. 0.04. 32.05. 137.60. Cabuyal. Arena franca. 8.37. 1.30. 0.06. 39.95. 190.80. Casitas. Franco Limoso. 6.73. 1.61. 0.08. 46.53. 1,628.00. CI. EN. Puerto Pizarro. CI A. muestreo. N. BI O. Textura. LO G. Tabla N° 1. Parámetros físico – químicos considerados en el análisis de las muestras de suelo de las diferentes zonas de muestreo.. La presencia de estos HMA en 5 suelos diferentes de Tumbes fue evaluada. DE. mediante el método del tamizado estándar como se describe por Gerderman y. CA. Nicholson (1963). Los HMA es esencial para la colonización y la formación de la relación simbiótica entre la planta y los hongos (Hijri et al., 2006; Smith y. IO TE. Read, 2008), además tienen un impacto considerable en el crecimiento vegetal y la administración de estos en la agricultura sostenible es esencial. BL. (Klironomos, 2003; Prieto et al., 2012).. BI. Para evaluar la propagación micorrízica en cultivos trampa (figura 4), se llevó a cabo mediante su tinción con azul de tripano (Phillips y Hayman, 1970) y observación al microscopio óptico de las estructuras características de esta asociación (esporas, hifas) (Suchitra et al., 2012). La propagación en cultivos. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. trampa de Medicago sativa “alfalfa” y la utilización de estas plantas con periodo vegetativo corto permite la obtención de una mayor cantidad de HMA (Coyne, 2000; Prieto et al., 2012). En nuestros resultados observamos que el cultivo los cuales estos. AS. trampa utilizado fue efectivo para la propagación de HMA,. HMA son un grupo de microorganismos del suelo, que no pueden cultivarse en. IC. medios sintéticos en ausencia de la planta hospedera, por ello es el único. LO G. medio que sirve para obtener mayor cantidad de esporas y mejor calidad de. BI. BL. IO TE. CA. DE. CI. EN. CI A. S. BI O. ADN (Shafiqua y Stephan, 2013).. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Figura 4. Esporas de HMA teñidas luego de realizar la tinción de raíces de Medicago sativa (cultivo trampa) con azul de tripano (Phillips y Hayman, 1970) procedentes de las zonas conocidas como: A) Casitas. B) Cabuyal. C) Corrales. D) Puerto Pizarro. E) Uña de Gato.. AS. Para el análisis molecular se realizó como primer paso la extracción de ADN de HMA (figura 12) a partir de raíces frescas de cultivos trampa de Medicago. LO G. IC. sativa “alfalfa”, para ello se optimizó el protocolo teniendo en cuenta que para la extracción de ADN debe contener las siguientes fases: lisis celular,. BI O. purificación, precipitación, lavado, secado y resuspension del ADN (Kang y. S. Yang, 2004).. CI A. En la figura 5, muestra la presencia del pellet luego de la extracción de ADN. EN. con el protocolo optimizado para cada zona de muestreo, El material genético se obtuvo a partir de 0,1 gr de tejido macerado, resuspendido en 30 µl de T.E. CI. (precalentado a 60 °C). En la figura 6 se muestra las bandas en el gel de. DE. Agarosa al 1 % en el cual se ha migrado ADN genómico y se pudo observar la. CA. presencia de ADN de HMA en los 5 cultivos trampa de Medicago sativa “alfalfa”. Pese a que la cantidad de ADN obtenida en cada extracción fue poca,. IO TE. se consideró suficiente para realizar las reacciones de amplificación por PCR,. BI. BL. utilizando 2 μl de ADN en cada reacción.. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) S. BI O. LO G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CI A. Figura 5. Pellet obtenido luego de realizar la extracción de ADN de HMA en las. IO TE. CA. DE. CI. EN. diferentes zonas de muestreo.. BI. BL. Figura 6. Visualización de las bandas luego de la migración en gel de agarosa al 1% del ADN extraído de HMA de las diferentes zonas de muestreo. CE: Control de extracción. CO: Corrales. C+: Control positivo. UG: Uña de Gato. PP: Puerto Pizarro. CB: Cabuyal. CA: Casitas.. En la tabla 2 obtuvimos los diferentes programas optimizados para cada seminested PCR. La optimización del programa de PCR, condujo a probar diferentes temperaturas de desnaturalización, hibridación y polimerización. además de los tiempos y ciclos. Para cada combinatoria de Primers son 35 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ciclos, siendo la desnaturalización inicial y polimerización final de 1 ciclo. Para identificar el género Glomus los Primers internos son NS5+GLOM5.8R e. AS. ITS4+GLOM1310 y para Gigaspora es NS5+GIGA5.8R.. semi-nested. PCR. de. HMA. para. identificar. los. géneros. Glomus. LO G. 3. IC. Tabla N° 2. Temperaturas y tiempos optimizados en cada etapa de PCR en las. IO TE. CA. DE. CI. EN. CI A. S. BI O. (NS5+GLOM5.8 e ITS4+GLOM1310) y Gigaspora (NS5+GIGA5.8).. La tabla 3, se observa los resultados obtenidos de cada semi-nested PCR para. BL. la identificación de HMA de los géneros Glomus y Gigaspora presentes en la. BI. rizosfera de O. ficus-indica a partir de las muestras de raíz de cultivos trampa de las cinco zonas de muestreo.. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla N° 3. Intensidad de bandas representadas por positivos leves (+L) y. fuertes (+F) para la identificación de HMA mediante pruebas de Semi-nested PCR, utilizando primers específicos para los géneros Glomus (NS5+GLOM5.8. AS. e ITS4+GLOM1310) y Gigaspora (NS5+GIGA5.8) en las diferentes zonas de. BI. BL. IO TE. CA. DE. CI. EN. CI A. S. BI O. LO G. IC. muestreo.. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DISCUSION Los HMA varían en su tolerancia al pH, y la esporulación en ciertas especies disminuye con el aumento de pH (Suchitra et al., 2012). Para el género Glomus. AS. la esporulación de HMA aumenta con pH de 6 a 9 y para el género Gigaspora aumenta su esporulación con un pH de 5 a 6 dependiendo de la especie. IC. (Valsakumar et al., 2007). Según el rango de pH encontrado en el suelo de las. LO G. 5 zonas de muestreo el cual fue de 7.74 a 8.37 (Tabla 1), nos permitiría indicar que el suelo la rizosfera de O. ficus-indica seria rica en esporas del género. BI O. Glomus según las condiciones de pH encontradas.. S. Los niveles de nitrógeno oscilaron a partir de 0.04% (Uña de Gato) a 0.16%. CI A. (Puerto Pizarro). Las hifas de los HMA tienen la capacidad de absorber y. EN. transportar el nitrógeno del suelo a las raíces (Clark y Zeto, 2000). El nitrógeno suprime la colonización de las raíces por HMA (Mosse y Phillips, 1971;. CI. Valsakumar et al., 2007); tal como lo reportado para el cultivo de higo donde. DE. encontraron que los HMA colonizaron las raíces de este cultivo sólo cuando carecía de Nitrógeno (Buwalda y Goh 1982; Valsakumar et al., 2007). Estas. CA. investigaciones podrían justificar la presencia de las esporas de HMA. IO TE. encontradas en las zonas de muestreo de O. ficus-indica con relación a la baja cantidad de nitrógeno encontrado en el suelo donde crece esta especie.. BL. Las plantas que se benefician con HMA, son aquellas que tienen. limitada. BI. cantidad de fósforo, esto puede ser explicado principalmente porque a baja. cantidad de fósforo en la planta, las hifas de HMA ayudan a captar mayor cantidad de fósforo por lo que hay la necesidad de una mayor cantidad de HMA. En nuestra investigación observamos que los niveles de fósforo variaron de 25.38 ppm (Puerto Pizarro) a 46.53 ppm (Corrales), con este bajo nivel 20. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. podríamos afirmar que hay la presencia de hifas de HMA que permitan el transporte de fósforo hacia la planta (Clark y Zeto, 2000). En un nivel adecuado de potasio disponible en la zona de estudio se puede. AS. atribuir a la prevalencia de los demás minerales (Clark y Zeto, 2000). El. IC. contenido de potasio de muestras de suelo variaron de 137.60 ppm (Uña de. LO G. Gato) a 1,628.00 (Casitas), los cuales revelan que las muestras de suelo analizadas estaban en una cantidad necesaria, por lo nos da a conocer que los. BI O. demás minerales están presentes en cada zona de muestreo (Valsakumar et al., 2007).. S. En el protocolo optimizado de extracción de ADN de HMA, usamos para la. CI A. maceración el nitrógeno líquido, este va a permitir la lisis celular o ruptura de la. EN. célula. El empleo del nitrógeno líquido en el protocolo optimizado de extracción. CI. de ADN a partir de raíces frescas es utilizado porque ha permitido aumentar el rendimiento y la calidad del material genético obtenido (Kang y Yang, 2004;. DE. Nichols y Smith, 2004).. CA. Además usamos el buffer CTAB 2x el cual está compuesto por PVP, β-. IO TE. mercaptoetanol, NaCl, Tris HCl (pH 8), EDTA (pH 8) y CTAB, con una concentración de 5%, 4%, 1.4 M, 100 Mm, 20mM y 3% respectivamente (Khan et al., 2007; Michiels et al., 2003; Shafiqua y Stephan, 2013); usamos estas. BL. concentraciones de estos componentes químicos porque va a permitir la. BI. eliminación de metabolitos secundarios y los polisacáridos en la extracción de ADN, ya que el buffer CTAB actúa como detergente y se une a los polisacáridos eliminándolo durante el proceso de extracción. (Michiels et al.,. 2003; Khan et al., 2007; Kumar et al., 2003).. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. En. la. fase. de. purificación. usamos. fenol. buferiado. y. cloroformo. alcohol/isoamilico con la finalidad de visualizar tres fases (ADN, proteínas y lípidos) en el tubo de 1.5 ml, lo cual solo separamos con facilidad el ADN. AS. genómico. Para la fase de precipitación utilizamos isopropanol helado y lo incubamos a -20 °C durante toda la noche porque la cantidad y calidad del. IC. ADN aislado depende de la temperatura de precipitación y la duración según. LO G. Michiels et al., (2003).. BI O. En el lavado usamos etanol al 75% que es el que va a permitir la eliminación de sales presentes en la muestra, además dejamos secar a temperatura ambiente. S. el pellet para la evaporación de restos de etanol y lo resuspendemos en T.E. o. CI A. Tris-HCL PH 8.0 que sirve de tampón y estabilizador de PH y EDTA PH 8.0 que. EN. es un quelante de iones divalentes (Shafiqua, G y Stephan, R., 2013). Para el tratamiento con ARNasa utilizamos 1 µl con la finalidad de eliminar restos de. CI. ARN y obtener ADN puro (Khan et al., 2007).. DE. Una vez obtenido el ADN genómico (figura 5) se llevó a migrar en un gel de. CA. agarosa al 1% con la finalidad de observar la presencia del ADN genómico. En el transiluminador conteniendo el gel de agarosa (figura 6) observamos bandas. IO TE. positivas fuertes y leves, las bandas positivas fuertes para la zona de Corrales, Cabuyal y Casitas, se debe a que si hay una buena concentración de ADN y. BL. por otro lado las bandas positivas leves para las zonas de Uña de Gato y. BI. Puerto Pizarro, se debe a que no hay buena cantidad de ADN debido que no es muy fácil obtener ADN fúngico según Michiels et al., (2003).. Usamos la técnica de Semi-nested PCR debido a que presenta una mayor especificidad en comparación con una PCR simple. Semi-nested PCR es buena alternativa para obtener la amplificación de una secuencia, mediante el 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. uso de dos reacciones consecutivas de PCR. Esta técnica está basada en el uso de 2 juegos de primers universales que en nuestra investigación son ITS4 y NS5 y tres primers internos como GLOM5.8R, GLOM1310 y GIGA5.8R. AS. (Redecker, 2000). En la primera reacción de PCR utilizamos los dos juegos de primers universales y Para la segunda reacción de PCR, uno de los primers. IC. utilizados en la primera reacción es utilizada de nuevo, es decir uno es de los. LO G. universales y el otro primer es el interno.. BI O. Optimizamos el programa de PCR (Tabla 2) para la primera y segunda reacción, los cuales la PCR in vitro cuenta con las siguientes etapas:. S. desnaturalización del ADN quien va permitir la ruptura de los enlaces puente de. CI A. hidrogeno, hibridación de los iniciadores donde los primers se acoplan a la. EN. cadena molde para así poder iniciar la replicación del ADN y la polimerización del ADN que va a permitir la elongación o extensión a partir de los primers o. CI. iniciadores (Tamay de Dios et al., 2013). la. primera. reacción. del. DE. En. programa. optimizado. tuvimos. que. la. CA. desnaturalización inicial fue de 95°C por 4 minutos, desnaturalización del ADN de 95°C por 40 segundos, hibridación de los primers a 50°C por 30 segundos,. IO TE. seguido por una polimerización a 72°C por 40 segundos y la polimerización final a 72°C por 5 minutos; con un total de 35 ciclos. En la segunda reacción el. BL. programa optimizado tuvieron las mismas temperaturas y el tiempo, tanto como. BI. para la desnaturalización y polimerización, pero solo se cambió la temperatura de hibridación de los primers, dependiendo de los juegos de primers que se usaron; para los juegos de primers NS5+GLOM5.8R tuvo como temperatura de hibridación de 51°C, ITS4+GLOM1310 a 50°C y para NS5+GIGA5.8R de 53°C.. Destacamos la optimización de la temperatura de hibridación para que sea la 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. óptima, ya que esta temperatura adecuada permite la estabilidad y especificidad del producto o amplicon (Tamay de Dios et al., 2013). El producto de las 3 semi-nested PCR fueron migrados en gel de agarosa de. AS. 1.5%. En la primera semi-nested PCR se observó bandas fuertes para las. IC. zonas de Casitas y Cabuyal y bandas leves para las zonas de Corrales, Puerto. LO G. Pizarro y Uña de Gato. En las bandas fuertes podemos afirmar que hay una buena concentración de ADN y hemos obtenido ADN de alta calidad y del. BI O. tamaño esperado, ya que ha sido posible eliminar en la extracción de ADN la mayor cantidad de los polisacáridos, compuestos polifenólicos, y las sustancias. S. húmicas, que inhiben en la amplificación por PCR y en cuanto a las bandas. CI A. leves podemos indicar que no hay una buena concentración de ADN o puede. EN. deberse a que el ADN aislado no es la cantidad necesaria para la amplificación por PCR según Khan et al., (2007) o también al momento de la extracción del. CI. ADN a partir de las raíces de las plantas, los compuestos que inhiben a. DE. menudo la amplificación por PCR no se eliminó totalmente, que por lo general la inhibición de la PCR se debe como ya se había mencionado por sustancias. CA. como polisacáridos, ácidos húmicos o fenólicos y estos se han reportado en. IO TE. asociación con el ADN de tejidos de plantas y especialmente la presencia de compuestos fenólicos vegetales en las raíces colonizadas por HMA. BL. (Grandmaison et al., 1993; Redecker, 2000). Con todo esto hacemos mención. BI. que en las zonas de Casitas y Cabuyal para la primera semi-nested PCR con los primers NS5+GLOM5.8R obtuvimos mejores resultados en comparación con las zonas de Corrales, Puerto Pizarro y Uña de Gato. Para la segunda semi-nested se observó bandas fuertes para las zonas Casitas, Cabuyal y Puerto Pizarro y bandas leves para Corrales y Uña de Gato. En las zonas 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Casitas, Cabuyal y Puerto Pizarro para la segunda semi-nested PCR con los primers ITS4+GLOM1310 obtuvimos mejores resultados en comparación con las zonas de Corrales y Uña de Gato. Para la tercera semi-nested se observó. AS. banda fuerte solo para la zona de Corrales y bandas leves para Casitas, Cabuyal, Puerto Pizarro y Uña de Gato. En la zona de Corrales para la tercera. IC. semi-nested PCR con los primers NS5+GIGA5.8R obtuvimos mejores. LO G. resultados en comparación con las zonas de Casitas, Cabuyal, Puerto Pizarro y. BI O. Uña de Gato.. Según Redecker, (2000) para los juegos primers ITS4+GLOM1310 y. S. NS5+GLOM5.8R determina para el género Glomus y para el juego de primer. CI A. NS5+GIGA5.8R determina para el género Gigaspora. En nuestros resultados. EN. obtuvimos bandas positivas (Figura 13) para los 3 juegos de primer, debido a esto indicamos que para las 5 zonas de muestreo tenemos la presencia de. BI. BL. IO TE. CA. DE. CI. Glomus y Gigaspora.. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(40) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CONCLUSIONES 1.- Se logró aislar e identificar HMA nativos presentes en la rizósfera de Opuntia ficus-indica en suelos áridos de Tumbes, Perú, mediante el método de. AS. tamizado y pruebas de semi-nested PCR.. BI. BL. IO TE. CA. DE. CI. EN. CI A. S. BI O. LO G. rizosfera de O. ficus-indica en suelos áridos de Tumbes, Perú.. IC. 2.- Se identificó HMA de los géneros Glomus y Gigaspora asociados a la. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(41) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Anaya, M. (2003). “Historia del uso de Opuntia como forraje en México” en Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación, de. agricultura. [En. línea].. Mexico.. Disponible. en:. AS. Departamento. LO G. IC. http://www.fao.org/docrep/007/y2808s/y2808s05.htm#BM05. BI O. Anderson, E. (2001). The cactus family. Portland, Pentland, Oregon: Timber.. Buwald.a, J. y Goh, K. (1982). Host-fungus competition for carbon as a cause. S. of growth depressions in vesicular arbuscular mycorrhizal ryegrass. Soil Biology. EN. CI A. and Biochemistry. 14, 103-106.. Clark, R. y Zeto, S. (2000). Mineral acquisition by arbuscular mycorrhizal. DE. CI. plants. Journal of Plant Nutrition. 23(7), 867-902.. CA. Coyne, M. (2000). Microbiología del suelo. Un enfoque exploratorio. Micorrizas.. IO TE. Paraninfo. Madrid, España. 416 p.. Ferrera,. R.,. Gonzales,. M.,. Rodriguez,. M.. (1993).. Manual. de. BI. BL. agromicrobiología. (1° ed.). Mexico: Trillas S.A.. Gerderman, J. y Nicholson, T. (1963). Spores of mycorrhizal endogene species extracted from soil by wet sieving and decanting. Transactions of the British Mycological Society. 46, 235-244. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

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(44) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Michiels, A., Van den Ende, W., Tucker, M., Van Riet, L. y Van Laere, A. (2003). Extraction of high-quality genomic DNA from latex-containing plants.. AS. Analytical Biochemistry, 315, 85–89.. MINAM. (2011). La desertificación en el Perú. Cuarta Comunicación Nacional. IC. del Perú a la Convención de Lucha contra la Desertificación y la Sequía. 77. LO G. pags.. BI O. Mosse, B. y Phillips, J. (1971). The influence of phosphate and other nutrients on the development of vesicular-arbuscular mycorrhiza in culture. Journal of. CI A. S. General Microbiology, 69, 157-166.. EN. Nichols, R. y Smith, H. (2004). Optimization of DNA extraction and molecular. CI. detection of Cryptosporidium oocysts in natural minera water sources. Journal. DE. of Food Protection, 67, 524-532.. CA. Nobel, P. (2002). Cacti: Biology and use. University of California press. Berkley,. IO TE. Los Angeles, Londres. Pag. 291.. BL. Ostolaza, C. (2010). 101 Cactus del Perú. Ministerio del Ambiente. Pág. 538.. BI. Ostolaza, C. (2014). Todos los Cactus del Perú. Ministerio del Ambiente. Pág. 538.. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(45) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Philippot, L., Raaijmaker, J., Lemanceau, P. y W. H. van der Putten, (2013). Going back to the roots: the microbial ecology of the rhizosphere. Nature. AS. Reviews Microbiology, 11, 789- 799.. Phillips, J. y Hayman, D. (1970). Improves procedures for clearing roots and. IC. staining parasitic and vesicular arbuscular mycorrhizall fungi for rapid. LO G. assessment of infection. Transactions of the British Mycological Society, 55,. BI O. 158-161.. Prieto, O., Belezaca, C., Mora, W., Garces, F.; Sabando, A. y P. Cedeño.. CI A. S. (2012). Identificación de hongos micorrizicos arbusculares en sistemas agroforestales con cacao en el trópico húmedo ecuatoriano. Agronomia. CI. EN. Mesoamericana, 23(2), 233-239.. DE. Redecker, Dirk. (2000). Specific PCR primers to identify arbuscular mycorrhizal. CA. fungi within colonized roots. Mycorrhiza, 10, 73–80.. IO TE. Reynolds, J., Maestre, F., Huber-Sannwald, E., Herrick, J. y Kemp, P. (2005).. Aspectos. y. 2005/3.. biofísicos. de. la. desertificación.. “Disponible. en:. BL. Ecosistemas.. socioeconómicos. http://www.revistaecosistemas.net/articulo.. BI. asp?Id=131&Id_Categoria=2&tipo=portada” Reynolds, S. (2003). “El nopal (Opuntia spp.) como forraje” en Organización De Las Naciones Unidas Para La Agricultura y la Alimentación. Roma. Disponible en: http://www.fao.org/docrep/007/y2808s/y2808s04.htm#BM04.. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..