Caracterización molecular del gen plasmídico spvR en aislados clínicos de Salmonella spp remitidos al Instituto Nacional de Salud durante el 2015

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(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. AS. ESCUELA PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA. CI. AS. BI O. LO. G. IC. Y PARASITOLOGÍA. EN. Caracterización molecular del gen plasmídico spvR en. DE. CI. aislados clínicos de Salmonella spp. remitidos al Instituto. CA. Nacional de Salud durante el 2015. AUTORA:. TERESA LUCILA MORILLOS SILVA. ASESOR:. Dr. MARCO LEONCIO SALAZAR CASTILLO. BL. IO TE. Tesis para Obtener el Título de Biólogo - Microbiólogo. TM, MSc. WILLI QUINO SIFUENTES. BI. CO-ASESOR:. Dra. ICELA MARISSA RODRÍGUEZ HARO TRUJILLO – PERÚ 2018. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BI O. LO. G. IC. AS. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO QUE OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO – MICROBIÓLOGO. Dr. Orlando Gonzáles Nieves. DE. CI. EN. CI. AS. RECTOR. Dr. Rubén Vera Véliz. BI. BL. IO TE. CA. VICE-RECTOR ACADÉMICO. Dr. Steban Alejandro Ilich Zerpa SECRETARIO. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Dr. Freddy Mejía Coico. LO. G. IC. AS. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. EN. CI. AS. BI O. DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. CI. Dr. William Zelada Estraver. BI. BL. IO TE. CA. DE. SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. Dr. Jaime Asunción Agreda Callirgo. DIRECTOR DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEL ASESOR El que suscribe: Dr. Marco Leoncio Salazar Castillo, asesor de la presente tesis titulada: Caracterización molecular del gen plasmídico spvR en aislados clínicos de Salmonella. IC. AS. spp. remitidos al Instituto Nacional de Salud durante el 2015.. G. CERTIFICA:. LO. Que ésta ha sido desarrollada, de acuerdo al reglamento establecido por la Facultad de. BI O. Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, estando en conformidad con su correspondiente proyecto, y que el informe ha sido redactado acogiendo las. AS. observaciones y sugerencias alcanzadas.. BI. BL. IO TE. EN. CA. DE. Trujillo, Setiembre de 2018.. CI. reglamento correspondiente.. CI. Por lo tanto, autorizo a Morillos Silva Teresa Lucila, continuar con el trámite del. ______________________________________ Dr. Marco Leoncio Salazar Castillo. ASESOR. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. PRESENTACIÓN. AS. SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:. En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de Grados y Títulos. IC. de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo a vuestra consideración y criterio, el. G. informe de tesis titulado: Caracterización molecular del gen plasmídico spvR en aislados. LO. clínicos de Salmonella spp. remitidos al Instituto Nacional de Salud durante el 2015, con. Trujillo, Setiembre de 2018. ____________________________________ Br. Morillos Silva Teresa Lucila. BI. BL. IO TE. CA. DE. CI. EN. CI. AS. BI O. el propósito de obtener el Título Profesional de Biólogo –Microbiólogo.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC. AS. MIEMBROS DEL JURADO. LO. G. ___________________________________________________ Dra. Manuela Natividad Luján Velásquez. CI. EN. CI. AS. BI O. PRESIDENTE. ___________________________________________________. DE. Dr. Marco Leoncio Salazar Castillo. BI. BL. IO TE. CA. SECRETARIO. ___________________________________________________ Ms. C. Juan Héctor Wilson Krugg VOCAL. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN Los docentes que suscriben, miembros del jurado dictaminador, declaran que el presente informe de tesis ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales, siendo. BI O. LO. G. IC. AS. aprobado por unanimidad.. ___________________________________________________. AS. Dra. Manuela Natividad Luján Velásquez. DE. CI. EN. CI. PRESIDENTE. ___________________________________________________. SECRETARIO. BI. BL. IO TE. CA. Dr. Marco Leoncio Salazar Castillo. ___________________________________________________ Ms. C. Juan Ector Wilson Krugg VOCAL. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEDICATORIA A mis ángeles, Mi Mamá Teresa y Mamita Luchita, quienes partieron al llamado de Dios, mujeres fuertes. AS. que pese a sus limitaciones supieron sacar adelante a sus hijos, y ese ejemplo es reflejado hoy en los nietos.. IC. Gracias por darme tanto amor, valores, educación y fortaleza. A mi madre, quien siempre me apoyo. LO. G. para salir adelante y triunfar.. BI O. en cada uno de los retos que me propuse, aquella mujer quien me dio la vida y. AS. me demostró que los estudios son. la puerta libre del ingreso al triunfo,. CI. la persona que desinteresadamente. EN. me apoyo en el transcurso de mis estudios y acciones. A mi padre, quien pese a las circunstancias,. CI. siempre me dio palabras de aliento para continuar,. A Dios, por prestarme vida para poder lograr mis metas propuestas que son dedicadas a mis abuelas y mis padres.. BI. BL. IO TE. CA. DE. y me enseño que uno debe luchar por lo que anhela.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AGRADECIMIENTO Agradezco a cada una de las personas quienes me apoyaron para la culminación de este proyecto. Al Dr. Ronnie Gavilán, por el apoyo al aceptar realizar mis prácticas en el Laboratorio de. AS. Referencia Nacional de Enteropatógenos del Instituto Nacional de Salud ya que gracias a ello. IC. pude realizar mi trabajo de investigación.. durante mi investigación y por el continuo apoyo que me ha brindado.. G. Al Mg. Willi Quino, quien me guio desde principio a fin en cada una de las actividades que realice. LO. Al Tec. Lab. Gustavo Bellido, por guiarme desde mi primer día en el laboratorio, gracias por sus. BI O. enseñanzas que me permitieron desarrollar y perfeccionar mis habilidades en bacteriología adquiridas en mi etapa de formación estudiantil.. A la Lic. Verónica Hurtado por sus consejos, apoyo y paciencia para enseñarme las pruebas. AS. moleculares aplicadas en mi investigación.. CI. A mis Asesores, el Dr. Marco Salazar y la Dra. Icela Rodríguez por el apoyo que me brindaron desde el día que les propuse esta investigación, y siempre estuvieron para guiarme y aconsejarme. EN. en este camino, quienes fueron parte de mi formación profesional durante mis estudios en mi casa. CI. de estudios, la Universidad Nacional de Trujillo.. A mis padres porque desde el inicio a fin me apoyan en la realización de cada uno de mis ideales,. DE. como es la culminación de mi carrera profesional. Un agradecimiento especial al INSTITUTO NACIONAL DE SALUD y CIENCIACTIVA del. CA. CONCYTEC por el financiamiento de mi tesis en el marco del proyecto de investigación: “Epidemiología Molecular y Genética de la Salmonelosis Multiresistente” Convenio N° 135-. BI. BL. IO TE. 2015-FONDECYT.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN La salmonelosis, causada por la bacteria Salmonella spp. es una de las enfermedades de transmisión alimentaria más comunes y ampliamente extendidas. Se estima que afecta anualmente. AS. a decenas de millones de personas de todo el mundo y provoca más de cien mil defunciones. Salmonella es un patógeno intracelular que invade células intestinales no fagocíticas y. IC. macrófagos en un proceso complejo que requiere múltiples genes. El objetivo del presente trabajo. G. fue buscar el gen plasmídico spvR, mediante técnicas moleculares, en aislados clínicos de Salmonella spp. remitidos al Instituto Nacional de Salud durante el 2015; se evaluaron 101. LO. aislados de Salmonella spp., el serotipo más frecuente del total de aislados estudiados fueron. BI O. Salmonella Infantis (57%), seguido de S. Enteritidis (24 %), S. Typhimurium (10 %), S. Paratyphi B (3 %), S. Derby (2 %), mientras que la frecuencia de S. Corvallis, S. Choleraesuis , S. Agona y S. Rostock con un 1%. En la determinación de la presencia del gen plasmídico spvR. AS. a partir de ADN total y plasmídico de todos los aislados en estudios, se encontró que el 100% de los aislados de Salmonella Infantis (58/58), S. Paratyphi B (3/3), S. Corvallis (1/1), S.. CI. Choleraesuis (1/1), S. Agona (1/1) no presentaron el gen plasmídico spvR, mientras que el 100%. EN. de Salmonella Rostock (1/1), 96% S. Enteritidis (23/24), 50% S. Derby (1/2), 50% S. Typhimurium (5/10) presentaron el gen plasmídico spvR. Se concluye que en las cepas estudiadas,. CI. el gen plasmídico spvR, se encontró en aislados clínicos de Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Rostock y Salmonella Derby.. BI. BL. IO TE. CA. DE. Palabras Claves: Aislados clínicos, Salmonella, plásmido, virulencia, spvR, PCR.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ABSTRACT Salmonellosis, caused by the bacterium Salmonella spp. It is one of the most common and widespread foodborne diseases. It is estimated that annually affects tens of millions of people. AS. around the world and causes more than one hundred thousand deaths. Salmonella is an intracellular agent that invades non-phagocytic intestinal cells and macrophages in a complex. IC. process that requires multiple genes. The objective of the present study was detect by molecular. G. techniques, the spvR plasmidic gene in clinical analysis of Salmonella spp. referred to the National Institute of Health during 2015; 101 isolates of Salmonella spp. were evaluated, the most frequent. LO. serotype of the total studies was Salmonella Infantis (57%), followed by S. Enteritidis (24%), S.. BI O. Typhimurium (10%), S. Paratyphi B (3% ), S. Derby (2%), while the frequency of S. Corvallis, S. Choleraesuis, S. Agona and S. Rostock was 1%. Also in the molecular study of the presence of the spvR plasmidic gene from total DNA and plasmid DNA of all the strains in studies, it was. AS. determined that 100% of the isolates of Salmonella Infantis (58/58), S. Paratyphi B (3/3), S. Corvallis (1/1), S. Choleraesuis (1/1), S. Agona (1/1) did not present the spvR plasmidic gene,. CI. while 100% Salmonella Rostock (1/1) ), 96% S. Enteritidis (23/24), 50% S. Derby (1/2), 50% S.. EN. Typhimurium (5/10) had the spvR plasmidic gene. It is concluded that in the isolates studied, the spvR plasmidic gene was found in the clinicians of Salmonella Enteritidis, Salmonella. CI. Typhimurium, Salmonella Rostock and Salmonella Derby.. BI. BL. IO TE. CA. DE. Key words: Clinical analysis, Salmonella, plasmid, virulence, spvR, PCR.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ÍNDICE AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO .................................. ii. AS. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS .................................... iii DEL ASESOR ............................................................................................................................ iv. IC. PRESENTACIÓN ........................................................................................................................ v MIEMBROS DEL JURADO ...................................................................................................... vi. G. APROBACIÓN.......................................................................................................................... vii. LO. DEDICATORIA ....................................................................................................................... viii. BI O. AGRADECIMIENTO................................................................................................................. ix RESUMEN .................................................................................................................................. x ABSTRACT................................................................................................................................ xi. AS. ÍNDICE ...................................................................................................................................... xii INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 1. II.. MATERIAL Y METODOS ............................................................................................... 11. CI. I.. EN. III. RESULTADOS .................................................................................................................. 13 IV. DISCUSIÓN....................................................................................................................... 17. CI. V. CONCLUSIONES.............................................................................................................. 21 VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 22. DE. ANEXOS ................................................................................................................................... 30 Anexo 01. Flujograma de Extracción DNA(Thermo Scientific, 2016b)................................. 30. CA. Anexo 02. Flujograma de Extracción Plásmido(Thermo Scientific, 2016a) ........................... 31 Anexo 03. Protocolo de PCR para el gen plasmídico spvR .................................................... 32. BI. BL. IO TE. Anexo 04. Resultados de la búsqueda del gen plasmídico spvR mediante PCR ..................... 33. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. I.. INTRODUCCIÓN. Salmonella es un patógeno intracelular anaerobio facultativo, Gram (-), pertenece a la familia Enterobacteriaceae; tiene flagelos peritricos que permiten su movimiento en el medio, a. AS. excepción de S. Gallinarum/Pullorum que no presentan flagelo. La clasificación se sigue según lo establecido por el World Health Organization (WHO), que clasifica a Salmonella en dos especies:. IC. Salmonella enterica, constituida por seis subespecies entericae(I), salamae(II), arizonae(IIIa),. G. diarizonae(IIIb), houtenae(IV) e indica(VI), y Salmonella bongori.(Loureiro et al., 2010; Eng. LO. et al., 2015). Según el esquema de Kauffman-White, la clasificación de los serovares de Salmonella están. BI O. determinados en base a la estructura antigénica: el antígeno O (somático) y el antígeno H (flagelar), hay algunas cepas que cuentan con un tercer antígeno de superficie, el antígeno capsular (K) el cual está presente en Salmonella Paratyphi C, Dublin y Typhi. El antígeno O es. AS. un lipopolisacárido presente en la pared celular de la bacteria, el antígeno H está compuesto de. CI. flagelina, este antígeno puede ser mono o difásico. El antígeno Vi no actúa como un requisito para la invasión a células epiteliales, sino como un factor protector de los antígenos somáticos. EN. (O) contra la acción de anticuerpos o el complemento, estos anticuerpo son los que facilitan la fagocitosis; las bacterias que presentan este antígeno capsular son resistentes a la fagocitosis en. CI. ausencia de anticuerpos específicos. Actualmente, existen más de 2500 serovares de Salmonella, y aproximadamente un 50% de estos son serotipos de Salmonella enterica subsp enterica.(Eng. DE. et al., 2015; García et al., 1992; Parra et al., 2002). CA. La nomenclatura de Salmonella es compleja y los científicos usan diferentes sistemas para referirse y comunicarse sobre este género, la cual aún continua en constante evolución; sin. IO TE. embargo el sistema de nomenclatura usado por CDC basado en las recomendaciones establecidas por el Centro Colaborador de la OMS explican que debido a la no aprobación oficial del serotipo y para acortar informes, Salmonella enterica subsp. enterica serotipo Typhimurium, por ejemplo,. BL. se acorta a Salmonella ser. Typhimurium o Salmonella Typhimurium.(Brenner et al., 2000) La vía de transmisión es fecal-oral en algunos casos por medio de alimentos y aguas contaminados. BI. como la carne de aves, huevos y productos derivados, también se incluye frutos y vegetales frescos. Generalmente la mala cocción de la carne de porcinos, aves y el ganado vacuno son una fuente principal de contaminación e infección por Salmonella.(Eng et al., 2015) La salmonelosis es una de las enfermedades diarreicas con mayor frecuencia, cuya tasa de mortalidad y morbilidad incrementa en lactantes, niños menores de 5 años, ancianos e. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. inmunocomprometidos, es por esa razón que esta enfermedad viene siendo considerada de interés en salud pública.(Parra et al., 2002) Salmonella enterica es el principal agente etiológico de mayor prevalencia siendo la causa principal de infecciones en sangre, serovares como Salmonella enterica Typhi, Paratyphi A, Paratyphi B y Paratyphi C son las que causan el cuadro clínico de una fiebre tifoidea (salmonelas. AS. tíficas); mientras que hay otros serovares que causan un cuadro clínico de gastroenteritis. IC. considerándose así la forma más común de salmonelosis debido a que son ubicuos y cuyo huésped. no solo es el hombre sino también los animales, estos serovares son denominados salmonelas no. LO. G. tíficas (NTS) (Crump et al., 2015). La salmonelosis es una zoonosis, considerada así ya que es capaz de hacer daño tanto al humano. BI O. como a animales, siendo su reservorio más importante las aves. Está considerada como la segunda zoonosis de origen alimentario después de Campylobacter ya que su prevalencia aumento 20 veces en países de desarrollo durante los años 1980-1990.(Flores, 2010). AS. En el año 2002 se estimó que la fiebre tifoidea causaba 21.7 millones de hospitalizaciones y. CI. 216000 muertes, mientras que la fiebre paratifoidea 5.4millones, en el año 2010 se estimó 11.9 millones de hospitalizaciones y 129000 muertes en países de ingresos bajo y moderados donde. EN. los casos de Salmonella tifoidea son endémicos, la fiebre tifoidea parece haberse vuelto común en países del África siendo de mayor prevalencia Paratyphi A, en estos países las salmonelas no. CI. tífica es asociada a enfermedades como el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH), Malaria, desnutrición, se estima que en el año 2006 aproximadamente que Salmonelas no tíficas (NTS). DE. causo 93.8 millones de enfermedades diarreicas y 155000 muertes y en el año 2010 se estimó que las NTS causaban 3.4millones de infecciones invasivas y 681000 muertes, siendo el 57% de casos. CA. de infección y muerte ocurridos en África. Sin embargo en países cuyos ingresos son altos, la enfermedad desencadenada por salmonelas tíficas generalmente se adquiere por viajes a estas. IO TE. áreas endémicas, en estos países industrializados la salmonella no tífica es la de mayor predominancia y su vía de transmisión son los alimentos contaminados.(Crump et al., 2015) En países desarrollados la salmonelosis es una de las zoonosis de mayor prevalencia tal es el caso. BL. de Estados Unidos, Canadá, Inglaterra, Noruega y Dinamarca. Aproximadamente 18 mil. BI. hospitalizaciones y 500 defunciones se dan en Estados Unidos cuyo agente etiológico principal son Salmonella Enteritidis y Salmonella Typhimurium, en países como Dinamarca hay un programa de control para la prevención de esta enfermedad mediante la erradicación de la infección en animales de consumo doméstico. (Castillo et al., 2008; Flores, 2010) En Francia durante el 2005 hubo casos de salmonelosis y el 70% fue causado por tres serotipos Enteritidis, Typhimurium y Hadar. (Flores, 2010). Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Perú es un país que no escapa ante esta infección debido al alto consumo de carne de aves ya que se puede dar por el mal estado de los lugares en que benefician a estos animales donde las condiciones sanitarias son deficientes ya que hay deficiencia de servicios como agua, refrigeración e inadecuada evisceración. (Zambrano et al., 2013) Un estudio realizado en el 2010 detectó el aumento de casos de Salmonella en aislamientos clínicos que en su mayoría provenía. AS. de menores de edad, en este estudio se identificó un tercer serotipo Salmonella enterica serovar. Infantis, infección asociada al consumo de alimentos contaminados.(Zamudio et al., 2011) Por. IC. medio del Sistema de Vigilancia Epidemiológica, durante el 2003 - 2007 se han reportado 134. G. brotes de Enfermedades trasmitidas por alimentos (ETA), de estos el 42.5% fueron relacionados. LO. con casos agudos de Salmonella.(MINSA, 2008) Así mismo, informes pasados indican que entre los años 2010 a 2012 se reportaron 35 brotes de ETAS por año del cual el 47% se relacionó con. BI O. Salmonella y que estas muestras provenían de una fuente de infección como los preparados de Mayonesa.(MINSA, 2012). AS. Salmonella es capaz de causar tres cuadros clínicos de la enfermedad: gastroenteritis, fiebre entérica e infección diseminada no tifoidea siendo invasiva pues traspasan la barrera intestinal.. CI. Estos cuadros clínicos son causados por las salmonellas no tíficas a excepción de la fiebre tifoidea que su único agente etiológico son las salmonellas tíficas (Salmonella enterica serovar Typhi y. EN. Paratyphi) (Sánchez & Cardona, 2003) Incluso hay serovariedades que después de producir la enfermedad clínica y la enfermedad asintomática, persisten en el huésped por un periodo de. CI. tiempo largo, este es el caso de Salmonella Typhi, S. Dublin y S. Pullorum; el caso de las dos. DE. primeras serovariedades la excreción bacteriana prolifera al patógeno en la vesícula biliar. (Silva & López, 2012). CA. Así mismo estos cuadros clínicos, según serotipo, para desarrollar la enfermedad sintomática dependen de la dosis infectiva (106-108), del estado inmunológico del huésped, los factores de. IO TE. virulencia que el serotipo expresa, y una eficaz intervención médica a tiempo. (Ochoa & Rodríguez, 2005; Sánchez & Cardona, 2003) Salmonella ingresa al organismo vía oral, y va a modular su expresión de genes en el trayecto de. BL. infección ya que soportara diversos factores ambientales tales como el pH ácido, aumento de temperatura, baja tensión de oxígeno y alta osmolaridad. En el proceso de infección, esta bacteria. BI. pasa por diversos mecanismos: Adhesión, invasión, replicación, resistencia a mecanismos de defensas y daño al huésped por la expresión de diversos factores de virulencia.(Ochoa & Rodríguez, 2005) La respuesta adaptativa de Salmonella a la tolerancia de acidez tiene la capacidad de sobrevivir al pH ácido del estómago, y la alta osmolaridad del intestino delgado, ingresando a las células epiteliales del intestino (íleon) y resistiendo la fagocitosis mediada por los macrófagos y células. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. dendríticas, coloniza el tejido linfoide subyacente y los ganglios linfáticos mesentéricos. Su célula diana es el macrófago debido a que la bacteria forma la vacuola intracelular (SCV) donde contendrá a Salmonella y así poder evadir la actividad lítica del lisosoma, y multiplicarse propagarse en el tejido intestinal o en el resto del organismo.(Barreto et al., 2016) Salmonella por endocitosis, invade a células M, activa una respuesta inflamatoria en la mucosa. AS. intestinal, lo cual explicaría el cuadro clínico de salmonelosis, la diarrea, esta respuesta. IC. inflamatoria es mediada por la liberación de prostaglandina, estimula la producción de AMPc y. después de ingresar al intestino delgado, debe atravesar la mucosa intestinal. LO. Salmonella. G. la secreción activa de líquidos. (Sánchez & Cardona, 2003). adhiriéndose al epitelio intestinal por medio de fimbrias, evadiendo las enzimas digestivas, las. BI O. sales biliares, la secreción de IgA y la inmunidad innata del hospedero para así poder ingresar al epitelio subyacente. El mecanismo por el cual Salmonella invade las células de su huésped es conocido como trigger, induciendo señales en las células epiteliales que inducen rearreglos en el. AS. citoesqueleto dando lugar a los ruffling en la superficie alterando así el borde del cepillo epitelial & Rodríguez, 2005; Ohl & Miller, 2001). CI. e inducir el englobamiento de la bacteria en una vacuola intracelular. (Haraga et al., 2008; Ochoa. EN. La invasión que se da en las células M permite que Salmonella interactúe con las células del epitelio intestinal a través de su superficie basolateral pasando así a la submucosa donde es. CI. fagocitada por macrófagos (macropinocitosis) y células dendríticas, formando la SCV donde se replicaran, los macrófagos son eliminados por la acción de caspasa 1(apoptosis) acción que. DE. permite que Salmonella viaje al torrente sanguíneo donde será opsonizada por el complemento y así localizarse en hígado, bazo o medula ósea; a través de las células dendríticas intestinales emite. CA. prolongaciones para internalizar a las bacterias presentes en el lumen permitiendo la sobrevivencia y replicación intracelular para luego diseminarse a diferentes sitios lo que conlleva. IO TE. a una enfermedad sistémica. (Silva & López, 2012; Haraga et al., 2008; Ochoa & Rodríguez, 2005) Tanto la replicación intra y extracelular de la bacteria, dará como resultado un aumento de Salmonella en el sistema reticuloendotelial donde habrá una recirculación periódica que conlleva. BL. a nuevos focos de infección.(Gilchrist et al., 2015). BI. Este microorganismo presenta dos sistemas de secreción tipo III (SST3) codificados por dos islas de patogenicidad (SPI-1 y SPI-2), este sistema de secreción permite que la bacteria tenga la capacidad de secretar e inyectar proteínas de patogenicidad en el citosol de la célula del huésped. La SPI-1 es requerida para el ingreso de la bacteria a la célula huésped, mientras que la SPI-2 es importante para la persistencia intracelular en macrófagos y para el establecimiento de infección sistémica.(Ohl & Miller, 2001; Saldarriaga, 2001; Sánchez & Cardona, 2003) Los TTSS han evolucionado para modificar la función de la célula huésped pues transloca proteínas que alteran. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. tales funciones como transducción de señales, reordenamiento del citoesqueleto, tráfico de membrana y expresión de genes de citoquinas.(Ohl & Miller, 2001) Una región de DNA cuyo tamaño es de 40kb localizado en el centisoma 63 del cromosoma de Salmonella es requerido para el ingreso del patógeno a la célula huésped (Suárez & Rüssmann, 1998), esta región es la Isla de Patogenicidad 1 (SP-1) que secreta moléculas efectoras las cuales. AS. actúan durante la fase temprana de la infección, permitiendo que Salmonella penetre el epitelio. IC. intestinal y tejido subepitelial, estas proteínas efectoras que ingresan mediante esta isla de patogenicidad son diversas, entre ellas está el grupo de genes que codifican la invasión de la. G. mucosa: inv-spa y prg-org, y otras proteínas involucradas también en la invasión pero que son. LO. secretas al interior de la célula huésped, entre ellas están la SipA, SopA, SopB, SopE2; las cuales interactúan en la célula huésped alterando la dinámica de la F-actina, transducción de señales, facilitando así. BI O. secreción de quimiocinas, el tráfico de membranas y la formación de uniones estrechas, la invasión del. enterocito y la replicación intracelular de este. AS. microorganismo.(Sánchez & Cardona, 2003; Zhang et al., 2018). Otra región del DNA de 40kb localizado en el centisoma 30.7 del cromosoma de Salmonella. CI. denominado SPI-2 y que es descrito en Salmonella Typhimurium, es requerido para la infección. EN. sistémica, la cual se expresa al ingresar a la célula huésped, esta isla confiere a las células la capacidad de que Salmonella pueda proliferar dentro de los macrófagos. (Paesold et al., 2002;. CI. Suárez & Rüssmann, 1998). La Isla de patogenicidad 1 fue adquirida por Transferencia Horizontal de Genes (HGT), es por. DE. ello que el género Salmonella ha ganado esa habilidad para invadir las células huésped; así como la SPI-1, la Isla de patogenicidad 2 también fue adquirida por HGT, la cual tiene diferentes grupos. CA. de genes que codifican el inyectisoma (SST3), la translocación de proteínas y además tiene dos. IO TE. proteínas efectoras: SseF y SseG.(Jennings et al., 2017) La isla de patogenicidad 2 cuya función principal es facilitar la replicación de las bacterias intracelulares dentro de las vacuolas intracelulares (SCV) (Waterman & Holden, 2003). Diversos estudios han señalado que esta región, presenta diversos efectores los cuales varían según los. BL. serotipos de Salmonella. La gran mayoría de serovares presentan en común un conjunto de. BI. efectores “centrales” cuya función es crítica para la virulencia en el huésped. También hay efectores que parecen estar presentes en serovares que causan el cuadro gastrointestinal que están adaptados al huésped. Otro grupo más está los efectores “accesorios” donde encontramos al locus spv y otros efectores que son codificados en elementos genéticos móviles y que se encuentran en diferentes serotipos.(Jennings et al., 2017) Estos efectores de la SPI-2 van a inhibir la señalización ante una respuesta inmune innata ya que si hay una activación se va a eliminar el patógeno, es por ello que entre los efectores más importantes que se han estudiado y sobretodo que han demostrado. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. inhibir esta respuesta inmune son GtgA, SseK1, SseK2, SseK3, SspH1, GogB, SpvC y SpvD.(Jennings et al., 2017) Algunas serovariedades de Salmonella enterica presentan un locus, denominado spv, el cual promueve la virulencia ya que altera la fisiología de la actina durante la infección intracelular.(Guiney & Lesnick, 2005) Un plásmido cuyo tamaño varía entre 50 y 100kb, el. AS. tamaño va a depender del serotipo y según estudios realizados en modelos murinos indica que. IC. este plásmido va a contribuir a la supervivencia de la bacteria dentro de los macrófagos. Estos. plásmidos han sido encontrados en serotipos como Salmonella Dublin, Salmonella Cholerasuis,. G. Salmonella Pullorum, Salmonella Typhimurium y Salmonella Enteritidis; siendo los dos últimos. LO. serotipos los agentes de mayor frecuencia ya que presentan un amplio rango de hospederos, capaz de causar un cuadro gastroentérico y séptico. Si bien se ha mencionado que el tamaño del. BI O. plásmido varía según los serotipos, todos presentan una región común de 8kb altamente conservada, donde se encontrara el locus spv (Salmonella plasmid virulence), contiene cinco genes: spvRABCD los cuales son transcritos como un operón; el spvR es activador transcripcional. AS. de los genes estructurales spvABCD en estudios “in vitro” estos genes son regulados durante la. CI. fase estacionaria de crecimiento y por el medio intracelular.(Gulig et al., 1993; Ochoa &. EN. Rodríguez, 2005; Patiño et al., 2011; Saldarriaga, 2001; Zúñiga et al., 2006) Este operón está regulado positivamente por la corriente aguas arriba (5’ -> 3’), el gen spvR. CI. codifica a la proteína SpvR, un regulador transcripcional de la familia LysR que reconoce y se une a secuencia de repetición de su propio promotor y al spvA, este inicio de la transcripción en. DE. los promotores requiere del factor sigma RpoS, el cual es inducido por el entorno intracelular de la célula huésped y que permitirá la expresión de spv por Salmonella spp. después de la. CA. fagocitosis, así mismo el análisis genético que se realizó en estudios de ratones demuestra que tanto los genes spvR como spvBC son necesarios para la virulencia del locus spv, mientras que. IO TE. los otros dos genes spvA y spvD no tienen un fenotipo de virulencia en ratones. El gen spvR que codifica a la proteína SpvR es esencial para la expresión de spvABCD.(Guiney & Fierer, 2011; Libby et al., 2001). BL. La proteína SpvB tiene dos dominios separados por siete residuos de prolina (excepto en S. Dublin que son nueve residuos), el domino N-terminal y el dominio C-terminal, este último tiene la. BI. actividad ADP-ribosiltransferasa que codifica los monómeros de G-actina y evita su polimerización en filamentos de F-actina, esta proteína se transloca en la vacuola de Salmonella hacia el citoplasma de la célula huésped mediante la SPI-2.(Guiney & Fierer, 2011) Existen trabajos realizados en Salmonella Dublin donde los genes spvR y spvB son esenciales para la virulencia en ratones, así mismo la proteína SpvB que al ser una ADP-ribosiltransferasa parece ser el principal factor de virulencia del locus spv puesto que se hay estudios donde esta enzima. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. está presente en la toxina del cólera, difteria, entre otras que vienen a ser los principales factores de virulencia para una gran variedad de bacterias patógenas extracelulares.(Concha et al., 2004) Estudios in vitro en macrófagos humanos indican que este gen spvB es necesario para la citotoxicidad de macrófagos y para potenciar la proliferación bacteriana intracelular durante la infección, los cuales evidencian que spvB es expresado por Salmonella después de la invasión de. AS. células epiteliales o fagocitosis por macrófagos, y que la funciona como una toxina ADPribosilante intracelular que es crítica para la patogénesis de la infección por Salmonella.(Lesnick. IC. et al., 2001). G. La proteína SpvC tiene actividad de fosfotreonina liasa que inactiva de forma irreversible a. LO. MAPquinasas de la célula huésped mediante la eliminación de fosfato y la modificación de treonina, esta proteína también es translocada por la SPI-2. Tanto spvB como spvC se requieren. BI O. para producir el fenotipo de virulencia del locus spv.(Guiney & Fierer, 2011). El plásmido se encuentra en los serovares no tíficos de Salmonella, siendo los más frecuentes los. AS. serovares de Salmonella enterica subsp. I, en este plásmido cuyo tamaño es variable no solo se encuentra el locus spv, sino también otros loci que involucran la biosíntesis de fimbrias y la. CI. resistencia al suero, todos estos pueden jugar un rol en los diferentes estados de infección durante. EN. el proceso. Así mismo los serovares tíficos como Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A, Salmonella Paratyphi B y Salmonella sendai no presentan este plásmido, sin embargo el serovar. CI. Salmonella Paratyphi C si presenta el plásmido cuyo tamaño es de 54kb y cuya función es desconocida.(Rotger & Casadesús, 1999). DE. La salmonelosis se asocia con una morbilidad de mediana a grave e incluso esta puede darse en animales de granja situación que conlleva a pérdidas económicas en estas industrias, este locus. CA. spv esta asociadas con aquellas cepas que causan la bacteriemia no tíficas, siendo los genes. IO TE. esenciales para el fenotipo de la virulencia: spvR, spvB y spvC.(Derakhshandeh et al., 2013) Este plásmido de virulencia está involucrado en las enfermedades septicémicas causadas por serovares no tíficos tal es el caso de Salmonella Enteritidis y Salmonella Typhimurium, han sido estudiados a partir de aislamientos clínicos como sangre y muestras extrainstestinales así como. BL. también en heces.(Rotger & Casadesús, 1999) Estos serovares que presentan el gen plasmídico y. BI. las que no lo presentan tienen la misma capacidad invasiva del epitelio, sin embargo las cepas que portan este locus spv persisten en hígado, bazo y nódulos linfoides, favoreciendo así la supervivencia de la cepa en el huésped.(Saldarriaga, 2001) Los cuadros clínicos por una infección de Salmonella van desde una infección gastrointestinal hasta un cuadro de septicemia, también puede llegar a infectar diferentes órganos abdominales llegando a producir colecistitis peritonitis, absceso abdominal, e incluso pasa a través de las heces al tracto urinario y piel causando cistitis e infecciones de piel; la manifestación clínica más. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. frecuente es la gastroenteritis cuyo agente etiológico son el grupo de serovares no tíficos de Salmonella enterica donde la invasión depende del SST3-SP1 que llega a invadir la lámina propia y el aumento de la producción de citocinas que provocan el aumento de polimorfosnucleares signo de diarrea inflamatoria. (Rodríguez et al., 2006; Tükel et al., 2006) La gastroenteritis permanece localizada en el intestino y en los ganglios linfáticos mesentéricos, el periodo de incubación es. AS. corto (12-72h), y el cuadro clínico empieza con náuseas y vómitos, seguido de dolor abdominal. y deposiciones diarreicas que suelen tener PMN, puede aparecer fiebre (38-39°C), el periodo de. IC. la enfermedad en menor a 10 días, lo que sugiere que la infección se elimina ante una eficiente. G. respuesta inmune. Así mismo S. enterica tiene la capacidad de sobrevivir en el interior de los. LO. macrófagos, ya que este es el nicho de supervivencia que la bacteria prefiere pues aquí ingresan las proteínas efectoras dependientes del SPI-1 y SPI-2.(Raffatellu et al., 2006). BI O. En pacientes inmunocomprometidos, pacientes aparentemente sanos, esta infección intestinal, aparentemente simple, puede llegar a ser una infección extra-intestinal ya que los macrófagos son. AS. incapaces de destruir a la bacteria produciendo una bacteriemia ya que este agente etiológico viajara a través del torrente sanguíneo, los síntomas se manifiestan con la presencia de fiebre que. CI. puede persistir semanas llegando a producir shock séptico. En este sentido el operón promueve el rápido crecimiento y supervivencia de Salmonella en el huésped, el rápido crecimiento y. EN. supervivencia de Salmonella en el huésped, este hecho se ha estudiado en animales murinos donde este operón spv tiene la función de potenciar la diseminación sistémica del patógenos, el cual está. DE. 1998; Rodríguez et al., 2006). CI. asociado con aquellos serotipos que causan el cuadro de bacteriemia no tifoidea.(Rodríguez et al.,. Diferentes trabajos describen la prevalencia no solo del regulador transcripcional spvR sino. CA. también de los genes spvB y spvC, donde indica que la presencia de estos genes era diferente en los serotipos. Estos serotipos obtenidos a partir de brotes o caso individuales de aislamientos. IO TE. fecales humanos de pacientes con el cuadro clínico de gastroenteritis de un laboratorio de Irán, así como en animales como aves de corral, indico que los serovares más comunes que contienen este locus spv son S. Typhimurium y S. Enteritidis, indicando que estos genes no son necesarios. BL. para causar gastroenteritis en los humanos. Sin embargo, spv si guarda relación con el cuadro clínico de bacteriemias por Salmonella no tíficas la cual ha sido diagnosticada mediante. BI. hemocultivos positivos a SNT, uno de los primeros casos se conoció en Salmonella Choleraesuis, serotipo que portaba este plásmido de virulencia. Así mismo las infecciones por Salmonella Dublin se presentan como un cuadro de bacteriemia sin gastroenteritis. Evaluaron mediante técnicas moleculares como PCR convencional, que este gen spvR amplificaba un producto de 894pb donde la prevalencia de este gen spvR fue de un 46.6%. (Derakhshandeh et al., 2013; Guiney & Fierer, 2011a).. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Los serotipos más comunes como S. Typhimurium y S. Enteritidis son los agentes etiológicos más frecuentes que causan el cuadro de bacteriemia en humanos, a pesar que también es capaz de causar el cuadro clínico de gastroenteritis, se supone que el cuadro de bacteriemia se refleja sobre el cuadro clínico inicial, la gastroenteritis, para ello estudios han trabajado en la prevalencia del gen spv tanto en muestra sanguínea como heces sería igual sin embargo estudios de aislamientos. AS. clínicos en Estados Unidos 10/10 de aislamientos de sangre presentaban el locus spv, mientras. IC. que 19/29 aislamientos fecales tenían este gen.(Guiney & Fierer, 2011). Estudios realizados en Salmonella Typhimurium y S. Dublin, nos dan a conocer que la. G. patogénesis de una infección sistémica es caracterizada por la supervivencia y proliferación en. LO. los macrófagos, para lo cual emplearon monocitos humanos derivados de patógeno, estudio in vitro, y observaron la proliferación de la bacteria, esta citopatología es dependiente de la. BI O. expresión de los genes spv, un locus de virulencia que remarca y promueve la habilidad de Salmonella para producir la enfermedad sistémica. Evaluaron que después de 24h de producida. AS. la infección, estos cultivos de macrófagos contenían dos poblaciones de esta bacteria, una de ellas era una proliferación celular y la otra era una población bacteriana estática en los macrófagos, es. CI. por tal razón que explican que si hay una mutación ya sea en el activador transcripcional spvR o en la proteína SpvB puede haber una reducción del efecto citopatológico de la infección por. EN. Salmonella, por ello se puede asumir que la presencia de este locus spv y que requiere de los fenotipos spvR, spvBC está relacionado con la gravedad de la enfermedad, ya que si está presente. CI. puede producir la enfermedad sistémica, sin embargo esto también depende del estado. DE. inmunológico del paciente. (Libby et al., 2001). Las pruebas moleculares, como la reacción en cadena de la polimerasa, son muy usadas para. CA. detectar genes de virulencia de Salmonella, que son encontrados en el genoma cromosómico así como en el extra-cromosómico (plásmidos).(Rexach et al., 1994). IO TE. Estudios en Colombia, también han estudiado la presencia de este gen en aislados de Salmonella tífica y no tífica, para ello identificaron bioquímica y serológicamente las serovariedades y para confirmar el serotipo aplicaron pruebas moleculares. Para la búsqueda del gen spvR cuyo tamaño. BL. del cebador es 890pb, aplicaron técnicas moleculares como PCR a partir de la extracción de DNA genómico y plasmídico, asimismo secuenciaron los productos de amplificación, a partir de ello. BI. obtuvieron resultados S. Enteritidis y S. Typhimurium presentan este gen spvR. (Patiño et al., 2011) También se hicieron estudios en heces de aves, donde encontraron este gen plasmídico (spvR) en Salmonella Dublin, S. Derby, S. Galllinarum, S. Enteritidis, S. Pullorum, S. Typhimurium amplifican para este gen.(Mahon & Lax, 1993) Este gen también ha sido estudiado en brotes transmitidos por alimentos en Brasil, durante los años 1999-2000 donde analizaron que. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. la presencia del gen spvR estaba ligada a la presencia del serotipo de S. Enteritidis ya que este fue el serovar de mayor frecuencia.(Geimba et al., 2004) En Perú hay pocos estudios sobre los mecanismos de patogenicidad de Salmonella spp. lo que conlleva al desconocimiento de la interacción con el hospedero, así mismo, el reporte de la presencia de DNA extra-cromosómico (plásmidos) los que han sido asociados con factores de. AS. virulencia como es el caso del operón spv, el cual requiere del gen estructural spvR para el inicio. IC. de la transcripción de los genes estructurales y desencadenar el aumento de virulencia durante la replicación bacteriana, por la tanto la severidad de la enfermedad. Es por ello que la. G. caracterización molecular de este gen en los asilados clínicos de Salmonella sería de mucha. LO. importancia en Salud Pública, ya que el Laboratorio de Referencia Nacional de Enteropatógenos del Centro Nacional de Salud Pública/INS recibe aislados bacterianos de los diferentes. BI O. establecimientos de Salud tanto de Lima y Provincias, notándose un constante aumento de serovares de Salmonella aislados a partir de muestras clínicas (heces, orina y sangre), es por ello. AS. que se requiere evaluar y confirmar la presencia de mecanismos de virulencia. Diferentes estudios han hecho experimentos in vivo en modelos murinos, sin embargo por. CI. cuestiones éticas no se puede realizar lo mismo en humanos, para ello se continua estudiando este. EN. gen, una de las técnicas moleculares que se usan con mayor frecuencia es el PCR convencional, el protocolo que se empleara es descrito en Metodología, esta técnica es rápida y de fácil uso, ya. CI. que en pocas horas se puede obtener un resultado.. La presente tesis fue desarrollada en el Laboratorio de Referencia Nacional de Enteropatógenos. DE. del Centro Nacional de Salud Pública/INS, el cual se desarrolló en marco del proyecto de investigación “Epidemiología Molecular y Genética de la Salmonelosis Multiresistente”. CA. Convenio N° 135-2015-FONDECYT. La presencia del gen plasmídico spvR está relacionado con los serotipos de Salmonella no tíficas, para ello el presente estudio tiene como objetivo determinar. IO TE. la frecuencia del gen plasmídico spvR en aislados clínicos de Salmonella spp. remitidos al Instituto Nacional de Salud durante el 2015, mediante técnicas moleculares como PCR; así mismo, determinar la frecuencia de las serovariedades del género Salmonella proveniente de. BI. BL. dichos aislados.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. II. 1.. MATERIAL Y METODOS. Material: 1.1. Muestra: 103 aislados de Salmonella spp. provenientes de diversos establecimientos de. AS. Salud remitidos al Laboratorio de Referencia Nacional de Enteropatógenos del Centro Nacional de Salud Pública del Instituto Nacional de Salud durante enero a diciembre del. IC. 2015.. Método:. BI O. 2.1. Diseño de investigación: Descriptivo de corte transversal. LO. 2.. G. 1.2. Unidad de Muestra: Aislado de Salmonella spp.. 2.2. Metodología de recolección de datos: Muestreo no probabilístico. AS. 2.3. Procedimientos y análisis estadístico de datos:. Obtención de la muestra: Se colectaron los 103 aislados de Salmonella. EN. 2.3.1.1.. CI. 2.3.1.Métodos:. spp. remitidos en el año 2015 del cepario del Laboratorio de Referencia. Reaislamiento e identificación bioquímica: Las cepas se reactivaron en. DE. 2.3.1.2.. CI. Nacional de Enteropatógenos del Instituto Nacional de Salud.. caldo TSB(Biolife); luego se sembró en un medio selectivo Agar SS (Oxoid). CA. en el que se seleccionó una colonia incolora con centro negro (H2S + y Lac ), se sembró en TSI (Oxoid) y LIA (Oxoid) donde se obtuvo la característica. IO TE. bioquímica del género Salmonella spp. TSI: K/A- ++++ LIA: K/K-. Posterior a esto se sembró en Agar TSA(Biolife) para obtener un cultivo puro. De las 103 cepas reaisladas, 02 cepas fueron no viables.. BI. BL. 2.3.1.3.. Pruebas moleculares: A partir del cultivo puro se realizó la extracción. de ADN genómico, el cual se sembró en caldo TSB y se centrifugo a 14000RPM para la obtención del pellet, a partir de este se continuo con el protocolo del Kit de extracción DNA genómico ThermoFisher (Anexo 01)(Thermo Scientific, 2016b). Así mismo se realizó la extracción de plásmido según el protocolo del Kit Thermo Fisher Gene Jet Plasmid Miniprep (Anexo 02) (Thermo Scientific, 2016).. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Amplificación del DNA: el procedimiento se realizó según las recomendaciones de la enzima Taq DNA Polimerasa (Thermo Scientific). Las secuencias de los primers y las reacciones de PCR se realizaron bajo las condiciones descritas según el protocolo de (Patiño et al., 2011) (Anexo 03), en cada reacción de PCR se incluyó un control positivo (Salmonella. AS. Typhimurium ATCC 14028) y un control negativo (Vibrio cholerae ATCC. IC. 14033), así como un blanco que contenía la mezcla del Master Mix.. Detección de los productos de amplificación (Electroforesis): Los. G. productos de amplificación obtenidos se analizaron mediante electroforesis,. LO. usando geles de Agarosa al 1,5% en tampón T.A.E 1X con 10uL de Sybr a 100V por 40minutos. Se usó 2uL del buffer de carga 6X con 8uL de Producto. BI O. de PCR, y 5uL del marcador de peso molecular para cuantificación de DNA 100pb. La visualización de los productos de amplificación se realizó en un. AS. transiluminador UV. 2.3.2.Análisis estadístico de datos:. CI. Se realizó una base de datos en Microsoft Office Excel 2007 y procesados en. BI. BL. IO TE. CA. DE. CI. EN. STATA 14.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. III.. RESULTADOS. En el presente estudio se analizaron 101/103 cepas, dos aislados fueron no viables es por ello que los datos han sido eliminados del estudio.. AS. Cumpliendo con los objetivos del estudio, se analizó la frecuencia de los serotipos de Salmonella que fueron remitidos al Laboratorio de Referencia Nacional de Enteropatógenos. IC. del Instituto Nacional de Salud donde se aprecia que el serotipo de mayor frecuencia es. G. Salmonella Infantis (57%), serotipo que viene siendo estudiado debido a su multiresistencia. BL. AS. IO TE. CA. S. 0 En te rit id is S. In fa nt is S. R os to S. ck C ho le ra es ui s S. Ag S. on a Ty ph im ur iu m S. C or va lis S. D er S. by Pa ra ty ph iB. DE. 20. CI. 40. EN. CI. 60. Porcentaje (%). 80. 100. BI O. LO. a antibióticos seguido de Salmonella Enteritidis (24%) y Typhimurium (10%).. Serotipo de Salmonella. BI. Figura 1: Frecuencia de serotipos de Salmonella spp. remitidos al Laboratorio de Referencia Nacional de Enteropatógenos del Instituto Nacional de Salud durante el 2015.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. De los 101 serotipos de Salmonella spp. analizados, solo 30 serotipos presentan este gen. IC. AS. plasmídico de virulencia.. LO. G. 29.7 %. EN. CI. AS. BI O. 70.3 %. spvR +. CI. spvR -. Figura 2: Fracción de serotipos de Salmonella spp. que presentan el gen spvR en los. DE. aislados remitidos al Laboratorio de Enteropatógenos del Instituto Nacional de. BI. BL. IO TE. CA. Salud durante el 2015. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. A partir de estas el 100% de los aislados de Salmonella Infantis (58/58), Salmonella Corvallis (1/1), Salmonella Paratyphi B (3/3), Salmonella Choleraesuis (1/1), Salmonella Agona (1/1) no presentan el gen plasmídico spvR, mientras que el 100% de Salmonella Rostock (1/1), 96% Salmonella Enteritidis (23/24), 50% Salmonella Derby (1/2), 50% Salmonella Typhimurium (5/10) amplificaron para el gen plasmídico spvR analizados en el DNA. Frecuencia de Serotipos de Salmonella spp. que presentan el gen plasmídico. IC. Tabla 1:. AS. genómico (spvR+).. AS. spvR N % 1 4 58 100 0 0 1 100 1 100 5 50 1 100 1 50 3 100 71. CI. CI. EN. N 23 0 1 0 0 5 0 1 0 30. Total N 24 58 1 1 1 10 1 2 3 101. % 100 100 100 100 100 100 100 100 100. BI. BL. IO TE. CA. DE. Salmonella Enteritidis Salmonella Infantis Salmonella Rostock Salmonella Choleraesuis Salmonella Agona Salmonella Typhimurium Salmonella Corvallis Salmonella Derby Salmonella Paratyphi B TOTAL. spvR + % 96 0 100 0 0 50 0 50 0. BI O. spvR Serotipo. LO. de Enteropatógenos del Instituto Nacional de Salud.. G. spvR, analizados a partir de DNA total, en los aislados remitidos al Laboratorio. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Asimismo se hizo el análisis del ADN plasmídico de todos los serotipos que no amplificaron a partir del ADN total para este gen, se confirmó que el 100% de este grupo fueron negativas para el gen spvR. Tabla 2:. Frecuencia de Serotipos de Salmonella spp. que no presentan el gen plasmídico. G. IC. Laboratorio de Enteropatógenos del Instituto Nacional de Salud.. AS. spvR, analizados a partir del DNA plasmídico, en los aislados remitidos al. N 1 58 1 1 5 1 1 3 71. AS. BI O. % 100 100 100 100 100 100 100 100. CI. EN. N 1 58 1 1 5 1 1 3 71. % 100 100 100 100 100 100 100 100. BI. BL. IO TE. CA. DE. CI. Salmonella Enteritidis Salmonella Infantis Salmonella Choleraesuis Salmonella Agona Salmonella Typhimurium Salmonella Corvallis Salmonella Derby Salmonella Paratyphi B TOTAL. Total. LO. spvR -. Serotipo. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IV.. DISCUSIÓN. Desde el año 2010, a través de la vigilancia laboratorial del Instituto Nacional de Salud con la Red Nacional de Laboratorios en el Perú, se han reportado casos de Salmonella en aislamientos clínicos humanos dentro del cual la población que se vio afectada fueron los niños atendidos en. AS. diferentes Hospitales de Lima, así como también aislamientos de alimentos; durante el estudio. realizado en el año 2010 el Instituto Nacional de Salud, reportó 33 aislamientos de Salmonella. IC. enterica serovar Infantis, considerándose la tercera serovariedad más frecuente de Salmonella en. G. el Perú, cuyo vehículo de transmisión fue asociada al consumo de alimentos contaminados como. LO. huevos y productos avícolas.(Zamudio et al., 2011) En el Instituto Nacional de Salud del Niño, a partir del año 2010, se obtuvieron aislamientos de Salmonella a partir de muestras de heces en. BI O. niños con infección gastrointestinal, a los cuales se les hicieron el perfil de resistencia a antibióticos dando como resultado que estos eran productores de BLEE. (Colquechagua et al., 2015; Escalante, 2015) Dos brotes de salmonelosis se reportaron en el año 2011, el primero fue. AS. asociado al consumo de mayonesa en la ciudad de Trujillo, y el segundo brote se dio en Bagua, en este mismo año se reportaron casos de salmonelosis en internos de Medicina los cuales estaban. CI. asociados al consumo de alimentos en mal estado, esta fue la vía de transmisión de este agente. EN. etiológico.(Carrasco et al., 2011) En el año 2011, en Piura hubo un brote por consumo de pollos contaminados con Salmonella Enteritidis (MINSA, 2015). CI. En el presente estudio, se analizaron 101 cepas Salmonella spp. las cuales fueron remitidas al. DE. Instituto Nacional de Salud a partir de diferentes establecimientos de Salud de Lima durante el 2015, los cuales provienen de aislamientos clínicos de humanos. Tal como lo sucedido en el año 2010 sobre el incremento de Salmonella enterica serovar Infantis a partir de aislamientos. CA. pediátricos, durante el 2015 el 57.43% del total de aislamientos de Salmonella fueron serotipificados como S. Infantis; así mismo, los casos de Salmonella Enteritidis con un 23.76%. IO TE. y Salmonella Typhimurium con un 9.90% vienen a ser considerados también los serotipos no tíficos de mayor frecuencia, mientras que un 2.97% fueron aislamientos positivos a Salmonella Paratyphi B considerado como serotipo tíficos. El incremento de estas serovariedades así como. BL. de otras (Salmonella Agona (0.99%), Salmonella Rostock (0.99%), Salmonella Choleraesuis (0.99%), Salmonella Corvallis (0.99%), Salmonella Derby (1.98%) (Figura 1)) vienen siendo un. BI. problema en salud pública; ya que si bien las serovariedades tíficas pueden causar los cuadros de fiebre tifoidea, las serovariedades no tíficas de Salmonella pueden causar cuadros de septicemia(Uribe & Suárez, 2006), o simplemente permanecer como estado portador el cual ha sido estudiado en personas que padecieron una infección aguda por estos agentes etiológicos: Salmonella Enteritidis y Salmonella Dublin lo mismo sucedió en personas sanas infectadas con Salmonella debido a su labor con aves u otras especies animales(Uribe & Suárez, 2006; Kotova. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. et al., 1988), y causar infecciones debido a la bacteriemia que estas pueden desarrollar desencadenando problemas que pueden llegar a la muerte del paciente (es común en pacientes inmunocomprometidos), en adultos la bacteriemia producida por Salmonella no tífica puede presentar una complicación grave como el desarrollo de arteritis (infección que implica la aorta abdominal) mientras que en niño las infecciones producidas por este agente etiológico pueden ser. AS. meningitis, artritis séptica, osteomielitis, colangitis y neumonía.(Acheson & Hohmann, 2001;. IC. Uribe & Suárez, 2006). Se tiene el primer reporte de Salmonella Agona en el año 1972 de origen humano y no humano. G. como harina de pescado en países como Austria, Finlandia, Hungría, Holanda y Yugoslavia. LO. además de datos sobre cuadros de gastroenteritis en Inglaterra y Estados Unidos. Estudios realizados en el Laboratorio de Referencia Nacional de Enteropatógenos del Instituto Nacional. BI O. de Salud en Perú informaron la presencia de este serotipo desde 1971, se reportaron casos en Chiclayo y Arequipa. Este serovar ha ido adquiriendo importancia en Perú ya que no solo se. AS. pueden aislar a partir de pacientes con cuadro de gastroenteritis sino también a partir de muestras de harina de pescado, el cual es un producto identificado como fuente mundial de propagación. CI. del serotipo, hasta ahora la distribución del serovar viene siendo amplia, en el presente estudio durante el 2015 se ha remitido al Laboratorio de Referencia Nacional de Enteropatógenos una. EN. cepa de Salmonella Agona.(Grados, 1974). CI. Los síntomas asociados con Fiebre tifoidea o Salmonelosis dependen de la respuesta del huésped a la invasión por el agente etiológico, así como al mecanismo de patogenicidad de la bacteria en. DE. el interior (invaden el epitelio de la mucosa intestinal), si la bacteria es capaz de superar estas barreras podrá sobrevivir en el huésped lo que permitirá diseminarse en todo el cuerpo, para ello. CA. Salmonella requiere de factores de virulencia que están agrupados en regiones extensas del cromosoma a las que se les denomino islas de patogenicidad, la isla de patogenicidad 1 (SP-1). IO TE. codifica aquellos genes para la invasión mientras que la isla de patogenicidad 2 (SP-2) codifica genes para la supervivencia intracelular de Salmonella.(Hallstrom & McCormick, 2011) Existen genes que codifican factores de virulencia que residen en grandes plásmidos de virulencia,. BL. como es el caso del locus spv, se han reportado que entre los más de 2500 serovares de Salmonella, ocho contienen este plásmido de virulencia, entre ellos están los que causan daño en el hombre. BI. como Salmonella Choleraesuis, Dublin, Enteritidis y Typhimurium(Chu & Chiu, 2006) Cinco genes plasmídicos como spvR, spvA, spvB, spvC, spvD son suficientes para expresar el fenotipo virulento relacionado con el plásmido, los cuales están dispuestos en un operón regulado positivamente por el gen SPVR; a pesar que los plásmidos son de diferentes tamaño que oscilan entre 50-100kb dependiendo del serotipo, hay una región de 8kb común y altamente conservada que es suficiente para reemplazar al plásmido completo y permitir la infección sistémica en. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. modelos murinos estudiados.(Guiney & Fierer, 2011; Gulig et al., 1993; Krause, Fang, & Guiney, 1992) Se realizó la búsqueda del gen regulador transcripcional spvR en los serotipos de Salmonella spp. remitidos al Instituto Nacional de Salud durante el 2015, así mismo del total de aislamientos se encontraron que 30/101 aislamientos clínicos de Salmonella son spvR + (aproximadamente. AS. 29.7%) para este gen mientras que 71 aislamientos clínicos son spvR - (aproximadamente 70.3%).. IC. (Figura 2). G. A partir de ello se analiza que los serotipos que presentan este gen de regulación transcripcional. LO. (spvR) en su mayoría son los serovares no tíficos (30/98), los aislamientos clínicos remitidos al Instituto Nacional de Salud que presentan con mayor frecuencia este gen son: Salmonella. BI O. Enteritidis, cuyo plásmido es denominado pSEV y presenta un tamaño de 60kb (Chu & Chiu, 2006) donde el locus de 8kb está presente en 23/24 (96%) cepas aisladas a partir de muestras clínicas, Salmonella Typhimurium cuyo plásmido pSTV de 94.7kb (Chu & Chiu, 2006) presenta. AS. el gen plasmídico en 5/10 (50%) de aislamientos, estos resultados son esperados ya que se han realizado diferentes estudios como en Colombia, Brasil donde buscan este gen en brotes. CI. transmitidos por alimentos y encontraron la presencia del gen en los mismos serovares analizados. EN. a partir de los aislados clínico remitidos al INS/Perú.(Geimba et al., 2004; Patiño et al., 2011) Asimismo para corroborar que este gen regulador está en el plásmido de estas cepas se revisó los. CI. mapas genéticos de estos serovares en la plataforma del GenBank y se confirmó la presencia de este gen regulador transcripcional de virulencia (spvR) en estos serotipos. (NC_016855.1, 2017;. DE. NZ_CP007508.1, 2017) Sin embargo estos no han sido los únicos serovares aislados que presentan el regulador transcripcional, del mismo modo los serovares S. Derby (1/2), S. Rostock. CA. (1/1) son spvR+, no se han encontrado casos que estos serotipos presenten este locus spv sin embargo si presentan plásmidos, es por ello que es interesante analizar las secuencias de estos. IO TE. serovares que han amplificado para determinar la posición de este gen. A pesar que los serovares de Salmonella Infantis, Salmonella Choleraesuis (pSCV), Salmonella Agona y Salmonella Corvallis presenten plásmidos, esta región no ha sido encontrada en los aislamientos analizados. BL. (spvR-), lo que concuerda con que se encuentran con mayor frecuencia en serovares como Typhimurium y Enteritidis (Tabla 1), se han realizado estudios en Salmonella Infantis donde se. BI. confirma que este gen no está presente en esta serovariedad y hasta el presente no se han descritos casos en Infantis(Di Conza et al., 2012). Sin embargo, si se ha descrito que S. Choleraesuis presenta esta región (Chiu et al., 2004) sin embargo se tiene en cuenta que para que se dé la expresión de virulencia necesita de otros factores para que pueda transcribir así como también de las respuesta del huésped ya que este serotipo ha sido analizado en porcinos y la muestra analizada en el estudio es de origen humano, si bien es cierto que estos plásmidos son esenciales para la infección sistémica, en modelos murinos es letal, la única expresión de virulencia se da gracias al. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

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