Departamento de Ciencias Biológicas
LABORATORIO: ACTIVIDAD ENZIMÁTICA - CATALASA
Introducción
Las enzimas son catalizadores orgánicos necesarios para que ocurran la mayoría de las reacciones químicas de las células vivas. Para cada paso de una reacción química hay una enzima que realiza una tarea específica. Las enzimas sólo entran de forma temporera en la reacción química y no sufren cambio permanente por lo que regresan a su configuración original y pueden ser utilizadas nuevamente para otra reacción química similar. Las mismas poseen un “sitio activo” donde la molécula del sustrato se acomoda formando una unión temporera. La forma del sitio activo de la enzima es de tal naturaleza que sólo el sustrato específico para la enzima encaja perfectamente en él. Esta fase temporera de unión entre el sustrato y la enzima se conoce como “complejo enzima-sustrato”.
Las enzimas catalizan o aceleran reacciones químicas permitiendo que las mismas ocurran en menos tiempo y utilizando menos energía. Existen también catalizadores inorgánicos, que no son enzimas, y que pueden utilizarse para acelerar reacciones químicas fuera de las células vivas. Dado que las enzimas son principalmente proteínas (algunas reacciones químicas utilizan RNA como catalizador orgánico), sus funciones pueden ser afectadas por alteraciones en temperatura, en pH, en concentración del sustrato, entre otros factores que afectan su estructura química.
La reacción química que estudiaremos es la siguiente:
H
2O
2---> H
2O + O
Peróxido de Agua Oxígeno Hidrógeno
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA – CATALASA PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
INFORMACIÓN DE SEGURIDAD
1. Durante este laboratorio estarás trabajando con peróxido de hidróxido al 2%, el cual es peligroso para los ojos y la piel. Si entras en contacto con el mismo, lava bien tus manos con agua.
2. También estarás trabajando con un baño de agua caliente. Ten cuidado al realizar este experimento para así evitar quemarte con el agua caliente, al tocar la plancha de calentar o al tocar el “beaker”.
3. El estudiante que vaya a añadir las gotas de HCl (Ácido clorhídrico), favor de utilizar guantes.
Objetivos:
1. Determinar la actividad de la enzima catalasa en un extracto de papa midiendo la cantidad de oxígeno generado en un tiempo dado.
2. Estudiar el efecto del pH sobre la actividad de la enzima catalasa.
3. Estudiar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.
PROCEDIMIENTO
Parte 1: Determinación de la Actividad de la catalasa
Figura 1: Aparato experimental para medir la actividad de la catalasa al colectar el gas de oxígeno que se produce de la descomposición del peróxido de hidrógeno (H2O2).
1.1 Determinación de la Actividad de la Catalasa
Lea los pasos 1 – 6 antes de comenzar el experimento.
Recuerde cambiar las puntas de las pipetas luego de añadir cada solución.
Utilice los guantes que se le provee.
1. Llene el cilindro graduado de 25 ml con agua sumergiéndolo completamente en el envase plástico. Mantenga el cilindro bajo agua inclinándolo hacia arriba ligeramente para permitir que las burbujas de aire escapen. Invierta el cilindro teniendo en cuenta que el borde debe mantenerse bajo el agua.
2. Debido a que el cilindro graduado está invertido, deberá hacer las lecturas de las marcas al revés. Esté seguro de identificar la marca de 5 ml antes de proceder.
3. Agite bien el extracto de papa y añada 8ml del extracto con la pipeta automática al interior del matraz cónico con brazo lateral.
5. Una vez tapado el matraz, agite el mismo golpeándolo suavemente por el fondo.
6. Utilizando un cronómetro mida la cantidad de tiempo requerida para producir 5 ml de O2. Comience a medir el tiempo inmediatamente después de añadir el H2O2. Registre sus resultados en la Hoja de Datos que se encuentra al final de este documento.
7. Desconecte el matraz y límpielo sólo con agua volviendo a colocarle los tubos según la Figura 1.
8. Repita los pasos 1 al 7 dos veces más.
9. Si los resultados de sus tres pruebas son cercanos, promedie sus resultados y anote este valor en la Hoja de Datos. Si tiene un resultado que es muy diferente de los otros (por un factor de 2x más o menos), no lo incluya en su promedio. En cambio, lleve a cabo una cuarta prueba y promedie los resultados más cercanos.
Parte 2: Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad de la catalasa.
2.1 Efecto del pH
Su profesor le indicará la cantidad exacta de ácido (HCl) necesaria para cambiar el pH de la preparación de catalasa de un pH 7 a un pH 5. Su profesor le indicará qué volumen de ácido usar. Añada la cantidad designada utilizando una pipeta con la punta limpia.
1. Agite suavemente su tubo de centrifugado para distribuir uniformemente el extracto de papa.
2. Utilizando una punta de pipeta limpia, añada 8 ml de la catalasa al matraz con “brazo lateral” limpio.
3. Con la pipeta, añada la cantidad de ácido designada por su profesor. Esté seguro de añadir el ácido directamente a la preparación de catalasa y no a lo largo de los lados del matraz.
3.2 Efecto de la temperatura
Nota: Asegúrese que no se consuma toda el agua hirviendo del envase.
1. Agite suavemente el tubo de centrifuga con la catalasa.
2. Añada 8ml de catalasa al matraz con “brazo lateral” limpio y colóquelo en un baño de agua hirviendo por 1 minuto.
3. Luego que haya pasado el tiempo, enfríe el matraz y su contenido, colocándolo en hielo por 1 minuto.
4. Añada 8 ml de H2O2 al matraz, tápelo fuertemente y mida el tiempo de la producción de oxígeno (vea sección 2.1). Puede detener el experimento si no ocurre reacción luego de transcurridos 5 minutos. Anote sus observaciones en las Hojas de Datos.
PROCEDIMIENTO DE LIMPIEZA
Es esencial que limpie su área de trabajo adecuadamente luego de terminar este experimento.
1. Retire la barra de mezclar del fondo del matraz con “brazo lateral”.
2. Vierta las muestras de la licuadora, del matraz y de los tubos en el envase que le proveyó su profesor. Asegúrese de retirar antes las barras de mezclar del fondo de los tubos.
3. Limpie su área de trabajo con papel toalla.
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA – CATALASA
Nombre: Sección:
Profesor: Fecha:
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA CATALASA
Para cada prueba, anote el tiempo requerido en producir 5ml de O2, en la Tabla de Datos 1.
Tabla de Datos 1: Medidas de la Actividad de la Catalasa
Actividad Enzimática (pH 7)
Prueba Tiempo (segundos)
1 2 3
4 (si es necesaria) Promedio
EFECTO DEL PH Y DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA CATALASA
Efecto del pH
Anote la cantidad de ácido utilizada:
Anote el tiempo requerido para generar 5ml de oxígeno en la presencia de ácido (provea la medida de tiempo en minutos y segundos, y en total de segundos).
Tiempo = minutos y segundos
Tiempo = total de segundos.
Pregunta 2: Compare la actividad de la catalasa observada a un pH 7 y un pH 5. De estos dos valores, ¿Cuál es el valor de pH donde se observa una actividad óptima la enzima catalasa?
Pregunta 3: Podemos comparar la diferencia en la actividad bajo condiciones ácidas (pH 5) con la observada a un pH 7. Como una medida de la actividad usaremos el tiempo tomado por la enzima para generar 5ml de oxígeno, una enzima muy activa producirá este volumen con más rapidez que una enzima menos activa.
(a) Para condiciones ácidas, calcule el por ciento de diferencia en la actividad utilizando la ecuación que se muestra a continuación. Recuerde que el uso de los |..| indica el valor absoluto (es decir, un número sin signo +/-).
% de diferencia = |tiempo a un pH ácido ― tiempo a un pH 7 | x 100
Anote el tiempo requerido para generar 5 ml de oxígeno luego que la catalasa fue colocada en agua caliente (provea su respuesta en minutos y segundos y en total de segundos). Si no obtuvo actividad de la catalasa, escriba una nota sobre este hecho.
Tiempo = minutos y segundos
Tiempo = total de segundos.
Pregunta 4: ¿Cómo se diferencia el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática del efecto cuando se añade el ácido? Explique este efecto de la temperatura.
