CONTROL D E 'LA P R O D U C C I O N D E AFLATOXINAS EN LA FERMENTACION SOLIDA DE LA YUCA

Texto completo

(1)

J

G A B R I E L A M A R I A N A RODRIGUEZ SERRANO

M A T R I C U L A 8 1 3 3 5 4 6 7 C L A V E 8 6 4 - 0 1 4

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J I N G E N I E R I A B I O Q U I M I C A I N D U S T R I A L

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TRIMESTRE ~ 8 7 - I - ,

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UAM-I LABORATORIO 5 - 1 5 7

FECHA DE 1 N . I C I O : OCTUBRE D E 1 9 8 5

/FECHA 'DE T E R M I N A C I O N : MARZO DE 1 9 8 7

~~~

1

G U T O R J A V I E R B A R R I O S GONZALEZ DEPARTAMENO . . DE BIOTECNOLOGIA

J T I * , M "CONTROL DE LA PRODUCCION DE AcLATOXINAS EN LA PROFESOR A S O C I A D O

FERMENTACION S O L I D A DE L A YUCA"

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(2)

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C O N T R O L D E 'LA P R O D U C C I O N D E

A F L A T O X I N A S

E N

L A F E R M E N T A C I O N

S O L I D A D E L A Y U C A

Reporte Final de Servicio Social realizado por: Gabriela Rodrlguez Serrano

en el Departamento de Biotecnologla de la Universidad Autbnoma

Metropolitana Iztapalapa. Marzo de 1987

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C O N T E N I D O

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Resomen

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I " lndice de figuras i i

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Indice de tab'las

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Introduccibn 1

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~~ 1

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~ .... 1 . 1 La yuca como materia prima ..

...

1

. - L . 1 . 2 Fermentación S b l i d a . . .

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I . . _.. -.I 1.3 Micotoxinas

...

2

2 Objetivos

...

9

3 Materiales y Metodos

...

. .

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9

3 . 1 3.2 3 . 3 3 . 4 3.5 4 4 . 1 4 . 2 5 5 . 1 1 . 2 6 7 Microorganísmos

...

9

Medios de cultivo para hongos

...

9

Sistema de fermentacibn..

...

9

Thcnicas anallticas..

...

z

...

1 0 Medidas de seguridad toxicolbgica

...

1 1 7 Resultados

...

12

Factores ambientales

...

32

Crleccibn y evaluacibn de un metodo de extraccibn

. . .

16

Discusibn

. . .

17

Factores ambientales.

...

17

Seleccibn y evaluacibn de un metodo de extraccibn

...

20

C o n c l ~ E i o n e r

...

21

(3)

i

RESUMEN

La utilizacibn d e algunos productos agrlcolas en la alimentacibn animal se ha visto limitada por s u bajo contenido proteico, como es el caso de la yuca, que en la dietas es fuente de calorlas basicamente. Una forma de aumentar s u valor nutritivo es mediante el enriquecimiento proteico por el crecimiento de hongos filamentosos en medio sblido.

Sin embargo, durante dicho proceso se puede correr el^ riesgo.de tener .contaminaciones por otro tipo de hongos capaces de producir toxinas. Por tal- m motivo es necesario estudiar los factores ambientales que afektan la produccibn de aflatoxinas en la fermentacibn en sustrato sbildo y de esta manera tener bases

para definir la estrat.egia de seguridad toxicolbgica d e t ~ ~ proceso. ~ ~ ~

Las condiciones de fermentación estuvieron basadas en los metodos utilizados por Raimbault ( 1 9 8 0 ) , que emplea yuca

gelatinizada adicionada de sales de amonio y fosfatos, el medio de cultivo' f u e inoculado con esporas de Aspergillus parasiticus y ~

A. niger. La e.xtraccibn de aflatoxinas del medio se realirb con diferentes solventes con agitacibn. Se probaron dos metodos de purificacibn: separacibn Ilquido-llquido y

separacibn por afinidad. La cuantificacibn de las toxinas se hizo al revelar placas de cromatografla con luz ultravioleta.

La temperatura, la aireacibn y la coexistencia de A . n i g e r y

A. f l a w s son factores que afectan notablemente la

' produccibn de aflatoxinas. A temperaturas mayores a 29 ' C , la

produccibn de toxinas se abate notablemte, de tal forma que a 35'C se encontrb un produccibn 100 veces menor. Se encontrb que a niveles d e aireacibn elevados ( 4 I/h g M C ) la produccibn de aflatoxinas es pequeña. La presencia de A. niger en et medio de fermentacibn da lugar a una disminucibn del 83 % en

la cantidad de toxina producida.

Por otra parte la yuca tiene una sustancia fluorescente que interfiere con

la

determinacibn de las aflatoxinas, p o r l o que se buscp un metodo de purificacibn que evitara esta interferencia, s e enconirb que el metodo de separacibn por

afinidad e s muy sensible a cualquier cambio y por lo tanto se necesita un estudio con mayor detalle.

De este e s t . u d i o resaltan algunas r e g l a s interrsantes que tríi?daii segur i dad p r oce s ii d e ens i quec i m i en t ci F r CI t % i cc

d r l a yuca ccin A . n y g e r , entre las que destaca F I c c r I ? r c ~ I de la temperatura y l a aireacibn, y t a l v e z lo ma's i m p s r t a n t e sea evitar cualquier tipo d e c.ontaminaciLn durante el p r o c e s a .

~

.

(4)

i i

INDlCE DE FIGURAS

1 . 1 Estructura qulmica de las aflatoxinas

...

04

4.1 Efecto de la temperatura en l a produccibn de

aflatoxinas por fermentacibn en sustrato sblido

...

12

4 . 2 Cinetica, de produccibn de aflatoxinas en medio sblido

.

13

4 . 3 Efecto de la aireacíbn en ia produccibn de

aflatoxinas por fermentacibn en sustrato sblido 13

.

~~ ~ ~ ~~~

~.

. . .

...

~~~ ~~

~~

4 . 4 Efecto de diferentes niveles de aireacibn en la ~~~ ~ ~

produccibn de aflatoxinas por fermentacibn es sustrato

sblido

...

14

~ ~~~~~

4.5 Efecto de la humedad en la produccibn de aflatoxinas

.

1

por fermentacibn en- sustrato sblido

...

15

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~~ ...

I

..

lNDlCE DE TABLAS

. .

1.1 Efectos de la cepa y condiciones de cultivo en l.as ~ ~~

~~~~~ concentraciones~ relativas de aflatoxinas formadas...

...

03

1 . 2 Caracterlsticas de las aflatoxinas

...

05

..

~~

.... ~~

.... 1 . 3 Produccibn de aflatoxinas en diferentes sistemas

de cultivo salidos

...

06 4.1 Efecto de la presencia de A . niger en la produccibn

-,..

de aflatoxinas

...

16

4.2 Analisis cromatogrhfico de las fracciones obtenidas

ai pasar por, una coiumna de purificacibn

...

16

4 . 3 Variabilidad encontrada en el método CB-I (AOAC 1 9 8 0 )

-

de purificacibn d e AT en columna

...

17

(5)

1

"

CONTROL DE LA PRODUCCION D E AFLATOXINAC (AT)

EN

LA FERMENTACION SOLIDA (FS) DE LA YUCA í Manihot-esculenta 1

''

1 . I NTRODUCC I ON

1 . 1 LA YUCA COMO MATERIA PRIMA

. ..

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. .

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~.

1

La yuca e s originaria de Sudamerica, sur y oeste de Mexico, y I

desde hace 2000 años se ha adaptado. a latitudes dentro de una franja que va de 30' al'.sur y norte del ecuador, (Pursglove, 1968; Kay, 1973; Phi i I ips, 1974).

La yuca se puede usar para consumo humano, alimentacibn animal y uso industral en diversas formas, destac&ndose.-e~l ensilado d e

yuca para alimentacibn animal. Ademas existen diferentes

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~. ~ ~~

i

razones que han propiciado la rhpida expansibn del cultivo de

I:

la yuca (Okibo, 1980). S e adapta a sueios, pobres, resiste- la--^^^

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B

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i

sequla y el ataque de la langosta, se propaga facilmente por resiembra de trozos de tallo, la productividad (Ton/ha) e s relativamente alta, y e s una excelente fuente de^ calorras. se^

Llegan a .producir 75 ton/Ha con 250 O00 cal/Ha/dla (De Vries, 1967). El..-cuItivo es relativamente barato, requiriendo poco deshierbado al momento de 'la siembra y no tiene epoca crltica d e siembra.

i

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Aunque las ralces de la yuca son ricas en calorlas, son severamente deficientes en protelnas ( 1 - 2 % ) , grasas ( 0 . 5 % ) ,

algunos minerales y vitaminas.

En Mexico existe un plan oficial para estimular la produccibn de la yuca y l a SARH (1984) ha estimado que hay alrededor de 300

O00 hectareas de tierras marginales que son adecuadas para el cultivo de esta planta, ademas existen oportunidades para cambiar la composici-on de la yuca, mejorando directamente l a s

variedades de cultivo en l o s diferentes programas de produccibn (CARH 1984). El u s o de la yuca ha sido limitado por la necesidad

d e un enriquecimiento proteico adecuado, recientemente se han

desarrollado metodologlas para el enriquecimiento proteico de la yuca (Raimbault, 1980), ademas de existir estudios para aprovechar el potencial de cultivo a travEs del beneficio

contenido de glucbsidos cianogenicos.

S e ha demostrado que l a fermentacibn de l a yuca puede llevar

consigo un enriquecimiento proteico en un factor d e 6 a 8

(Hendershot. e t . ai. 1972; Senez, 1979).

integral de hojas y ralces (Cruz, 1984), y reduccibn del I

1.2 FEHMENTAC I O N SOL 1 D A ..

.

.~

Entre las m e t ü d o l u g l i s drsarrül lacias para el enriquecimiento

iFCC), como una alternativa a las tecnoioglas actualmente usadas

.-

prot.eico se ha propuesto la fermentacibn en sustrato shlido

r ..

.I.,

(6)

2

en

el

aprovechamiento de productos agrlcolas primarios. Este proceso se relaciona con la utilizacibn del material insoluble en agua mediante el crecimiento y actividad metabólica de hongos

y bacterias; sin embargo no debe ser confundido con el cultivo superficial que usa tanto medio llquido como sblido. Una forma general de definir el medio 'sólido en el campo de las fermentacione e s : material orgánico hümedo no suspendido en . ~

agua. Los niveles de humedad van desde 12 % (donde la actividad biológica cesa) hasta 80 X aproximadamente, aunque desde luego . . . .

e l nivel m á x i m o

de

retencibn de agua depende del tipo de material que s e emplee como sustrato (Hesseltine, 1972; Knapp,---

1978; Raímbault, 1980; Moo Young, et. ai., 1983).

Algunas de l a s posibles repercusiones de l a aplicacibn de la

FSS

..

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I

. ~ ~~~ ~~

son:

~. ~~

-

Disminución en la importación de granos tanto para ~ ~-

alimentación humana como animal (producción de protelna

-

Mejoramiento nutricionai y conservacibn de productos

-

Obtención de enzimas y ~ ~ - ~ posiblemente otros metabolitos con costos menores d e extraccibn y purificación o con

la

posibilidad de ser administrados o utilizados directamente.

Sin embargo existen ventajas y desventajas en el uso de la fermentacibn sblida (Moo-Young, et.

ai.,

1983):

unicelular). 1.

agrlco

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~~~ ~~

-Ventajas -Desventajas

Requiere menos energla Problemas de transferencia Reduce el vol6men de reactor de calor y masa por la baja No es necesaria una etapa humedad y conductividad del

de recuperacibn medio

- menor control sobre los parhmetros ambientales

1.3 MICOTOXINAS

t

En Bsta tecnica de fermentacibn s e utilizan principalmente mohos de diversos generos para llevar a cabo el proceso. L A S

mohos o tambien llamados hongos filamentosos han jugado un importante papel en la v i d a del hombre, plantas y animales, produciendo antibibticos, entimas y otras sustancias d e gran uti 1 idad, p e r o tambien son capaces de producir compuestos t.eixicos (micotoxinasj que representan u n peligro por los efectos que causan. tsnto en e l hombre comer en animalrs ~Emmons. et. ai.,

1 9 7 7 ) .

(7)

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Fusarium. Las micotoxinas mas peligrosas (carcinhgenas) y

comünes son las llamadas aflatoxinas ( A T ) producidas por

Aspergillus, las cuales han sido ampliamente estudiadas por

10% daños que causan a l o s seres vivos. Se han aislado de productos alimenticios como malz, trigo, cebada, centeno, frijol, soya, arroz, cacahuate, harina de pescado, pimienta negra, harina de trigo, y pastas alimenticias como macarrbn Y

espagueti. Las aflatoxinas son una serie de metabolitos secundarios producidos POS Aspergillus f l a v u s y Aspergillus

parasiticus, cuya velocidad de slntesis varia respecto a las

diferentes condiciones del medio ambiente (Tabla 1 . 1 )

._

T A B L A 1.1-Efectos.de la cepa y condiciones de cultivo en l a s

concentraciones relativas de aflatoxinas formadas

. . .

Aflatoxinas Totales Conc. Relativas

Cepa Medio Producidas B l 82 G l 62 Ref.

\ (mg/l o m g / K g ) ( % total 1

-_______-_______________________________---_---

1 Medio sintetico 45 87 4 9 < I a cultivo estatico

25-265 & 4 1 5 1 b

."

2 Cacahuates

._.

3 Cacahuates 14 98 2 o O b

-

4 T r í g a

" . 870 35 9 48 7 C

..

4 Trigo + metionina 1 7 0 0 4 4 1 38 7 C

~ . . 5 Sacarosa-aminohcidos 86

sumergido (a)

7 2 h r , 20'

c

26 O 7 4 O d

-,..

5 I b i d , 25

'

154 7 0 O 30 O d

I ... ^

La Referencias: Cepas:

*-

-

b. Cüdner et al. 1963 2. Aspergillus f l a r ' u s ( 5 cepas)

r- d . C l e g l e r e t a l . 1966 4. Asprrgi I I u s i l a ~ ' u s N R R L E I Y Y

5 . As-pergi I ius i l a vifs NFrRL 3000

a. Mateles y Adye, 1965 1. Aspergillus f l a v u s ATCC 15517

c. Hesseltine et al,lY66 3. A s p e r g i l l o s f l a v u s M R E 1

.

~. ....

E 5 t a 5 t o Y i c o I ti g i c ü s

dependiendo de l a dosis y del tiempo de exposicibn, llegando a

ser letal para los organismos que lo asimilan. En animales

comi~u e 5 t o 5 p r es en t a n d i f E' I ente s g I a do s

(8)

.. .

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4

superiores existe variacien de especie a especie respecto a la susceptibilidad, pero la dosis letal medía (LDso) se

encuentra en el rango de 0.5 a 10 mgikg del peso del cuerpo de muchos animales experimentales. Los efectos toxicolbgicos de la aflatoxina 81 han sido estudiados en cblulas in vitro y se reporta en concentraciones d e 1-5 microgramos/ml (Legator and Wthrow, 1964; Daniels, 19651.La exposicibn crbnica da como

resultado la induccibn de tumores malignos. Las aflatoxinas producidas por los hongos del genero Aspergillus, causan cáncer en ratas en dosis de 1 0 a 15 ppm. En Estados Unidos. The United States Food and Drug Administration ha establecido un nivel

de aceptabilidad de 25 ppm para cacahuates sin elaborar y 20 ppm

para productos finales del cacahuate de consumo humano.

I .

Figura 1 . 1 Estructura de las aflatoxinas B l (a) y Gl ( b )

L a estructura qulmica de las aflatoxinas se muestra en la Figura ~

1 . 1 (Asa0 et. ai., 1963, 1965; van Dorp et. al., 1963; Chang et,

como cloroformo, metano1 o acetona. Se les ha designado por B o G

se distinguen la B 2 y G 2 o dihidroaflatoxinas B y G por tener uno saturacibn en el anillo furano terminal. Las caracterlsticas flsicas y qulmicas s e muestran en la Tabla 1.2.

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I_.

P “ al., 1963). Son extraldas moderadamente por solventes polares

...

por emitir una fluoresencia azul o verde (blue, green), tambibn

r-

La incidencia de contaminacibn de hongos y la subsecuente produccibn de las afiatoxinas depende de las condiciones climaticas que prevalecen durante la cosecha, transporte, condiciones y tiempo de almacenaje, temperatura, tiempo de aireacibn, presencia de otros microorgariismos, tratamientos qul m icos. cantidad de esporas que infectan y tiempo de almacenaje, siendo la humedad un factor importante para facilitar

la colonizacibn de hongos. Por tal rarbn e s import.ante determinar cuales son l a s condiciones necesarias para ia produccibn d e aflatoxinas y evitar dichas condicjones diirante el

almacenamiento de aiimrntos, disminuyendo el riesgo d e In

(9)

5

TABLA

1.2 Caracterlsticas de las aflatoxinas

_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - - -

Punto de

Fbrmula Peso F u s i bn LDs o Mutagenicidad Aflatoxina Molecular Molecular ('C) < m g / K g ) Relativa(1)

81 C17H1206 312 268-269 O. 36 1 O 0 I

i

M i C17H1207 328 299 ca. O. 36 3 ,j

.I

G I C17H1207 328 244-246.- - O. 78 3

82 ~~ C17H1406 '

.

314 286-289 1.69 0.2

G2 ~ C17H1407 330 237-240 2.45

o.

1

~~~ ~~~ ~ ~~~

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________________________________________---_---

~~

La slntesis de las afiatoxinas se lleva a cabo a traves d e ~ ~ ~ l a

ruta de los policetidos. ~~

I

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L o s primeros estudios fisiolbgicos de hongos utilizaron medios

de cultivo que no propiciaban la produccibn de aflatoxinas. Usando el medio de Czapek modificado (0.9 m g % I , caracterizado por ser un medio complejo . complementado con extractos naturales se obtuvieron mejores resultados. Davis y colaboradores (19661,

reportaron un medio con 15-20 % de sacarosa y 2 X de extracto de levadura capaz de dar rendimientos buenos de aflatoxinas (60 m g

X ) ; sin embargo existla la necesidad de establecer un medio mas

definido para estudi~os detallados. Mateles y Aydie (1965) disefiaron un medio de cultivo definido que producia 10 m g X .

Posteriormente Reddy y colaboradores (1979) reportaron que los medios llquidos utilizados hasta entonces eran inhibitorios para

la produccibn de aflatoxinas, encantrandose que era necesario utilizar bajas concentraciones de sales, en particular de fosfatos y manganeso. Este descubrimiento s e hizo despues de haber hecho numerosas investigaciones en medios aparentemente inadecuados.

Debido a estas diferencias, y al uso de distintas cepas en ~Ia literatura se encuentran resultados contradictorios. De esta manera se encontraron las condiciones bptimas de produccibn y crecimiento de las cepas de Aspergillus q u e son capaces de sintetizar aflatoxinas (de longh et. ai., 1962; van der Zijden,

1962; Nesbitt et. ai., 1962). Concretamente de estos estudios s e

encontrb que el pH bptimo para la produccibn de aflatoxinas esta entre 4 y 5 ; sin embargo estudios d e incorpnraribn de acetato con C 14 a aflatoxinas producidas por c C l u l a s en r e p o s o ,

muestran mayor eficiencia a pH de 3-5. üatos que ssien de ! o

establecido son reportados por L i e y M a r t h (1968). e n c u e n t r a n que

en un .medio d e c u l t i v o con caselna se daba una buena prnduccibn a pH extremos (2-9.51.

(10)

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6

Yuca

-

Yuca +

sa I es

Taro

T a r o +

peptona

Malz

A r r o z

Trigo

Avena

Harina e n matraces 1

Humedad relativa

-

alta

C i m i lar 2

Cimi lar 2

FSS en columna 1

FSS en matraces 2 agitados

FSS e n matraces 3

agitados

FCC en matraces 2 agitados

7-28 140 O00

180 O00

~

56

10

5 '

*

530

10

5 '

*

5 300

10

4'

*

4 700

5

2'

*

10 exp 6

3

1

*

1 . 2 exp 6

6 600 O00

\ c

d

d

d

Referencias Cepas

a. Nartey, 1966 1 . A . f l a v u s

b. Tsai et al, 1981 2. A. parasiticus NRRL 2999 c. Cilman et al, 1979 3 . A. parasiticus NRRL 3145

d. Hesseltine, 1972

1

*

Tiempo al que la aflatoxina comienza su produccibn

F C S : Fermentaci6n en Ciistrato Sblido

En cuanto a la temperatura Ciptima, existen variaciones de cepa a cepa, pero todas caen en el rango de 25 a 3O'C y la tenperatura de produccibn de aflatoxinas se encuentra 1 O ' C por debajo de la de crecimiento del h ü n g u . West ( 1 9 7 3 ) , reportt cin aumento en la producción de toxina a l incrementar l a temperatura de 15 a 21'C despues de 1 dia de incubacibn, Y a 28'C al fina izar el segundo dla de incubacibn. Respecto al efecto de la luz,

(11)

7

establecib como un parametro importante en la bioslntesis de

aflatoxinas, con resultados que dejan ver que si se incuba con aireacibn, la biomasa, el consumo de sustrato y la formacibn de producto aumentan hasta el tercer dla de incubacibn; pasado este tiempo, se producla ma5 aflatoxina en cultivos estacionarios y ai respecto s e ' d i c e que es mejor la aireacibn

limitada, no excesiva. Shih y Marth (1974bi, opinan que el grado de aerobiosis gobierna la produccibn de aflatoxinas. P o r o t r o

lado, ai aumentar la relacibn C 0 2 / 0 2 o coeficiente respiratorio, 5e abate la produccibn de aflatoxinas.

Respecto a los nutrientes, la fuente de carbono es un f a c t o r ~ m u y ~ ~

importante y dentro de los e estudios hechos al respecto s e

encuentran discrepancias. De ello se concluye que como buenas fuentes de carbono s e tienen la sacarosa, glucosa, maltosa. ribosa, glicerol, ac. laurico y sebPsico. Los aminoacidos no

inducen la produccibn de aflatoxinas y la mayor parte de los

Bcidos de 2 a 10 carbonos inhiben el crecimiento del hongo asi como la slntesis de la toxina.

Debido a la gran incidencia de toxinas en sustratos sblidos, se ha estudiado ampliamente el potencial de formacibn de aflatoxinas en^ alimentos fermentados orientales como salsa de saya, miso, temphe, (Hesseltine et. al., 1960; Matsura, Manabe y

Ctao, 1970; Yocotsuka y Casaki, 1982). Tales hechos se tienen coma precedentes para l o s estudios que se realizaron en fermentaciones sbiidas (Tabla 1 . 3 ) .

Antes de entrar a los estudios hechos en fermentaciones sblidas es importante mencionar los criterios que deben ser practicados en

los sistemas que utilizan hongos para madurar quesos. pates y

fermentaciones con hongos son:

mico tox i nas.

. ~

\

~

a ) Uso de hongos puros que no sean capaces de pí-oduci.r

b ) Uso de materia p r i m a libre de micotoxinas.

c) Asegurar que no exista riesgo de contaminacibn por hongos, por aire, aparatos durante el proceso, transportacibn y

almacenaje de productos.

A eilü se deben estudios hechos del comportamiento del hIiigo productus de aflatoxinas en sustrato sblido (Bennet y Shotwell,

1979; Vesonder y Hesseltine 1 9 8 1 ) . Silman et. ai. (1979),

eetudit el efecto de

l a

humedad s o b r e la produccibn de aflatoxinas en malz en fermentacibn en sustrat.c sblic!o en matraces. Se obtuvo una buena produccibn con humedades d e 3 2 . 4 , f 4 . 5 , y 26.4 %; !a p ~ o d u c . c , i b n f u e casi nula con valore; de TI0

Sa a 2 9 ' C . pero se mejorb a 3 3 ' C .

P o r otro ledo, Lindenfelsere y Ciegier (1975). estudiaron la

Firoduccibn de ocratoxinas en malz en una fermentacibn sblida (en un reactor tipo cilindro rotatorio). En tal experimento se observb que la humedad bptima fue del 30 % p a r a

(12)

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el proceso y que a humedades mayores no solo decrecla la produccibn, sino que presentb problemas de adherencia de granos y contamina cibn bacteriana. Con humedades menores a 26 %

no se produjo la toxina. La gran diferencia entre las humedades bptima y mlnima produccibn indican que esos dos sistemas son

muy diferentes y por lo tanto inducen diferentes fisiologias.

Los metodos de extraccibn, purificacíbn y cuantificacibn

de aflatoxinas se han desarrollado mediante tbcnicas de particibn con solventes tales como cloroformo y metanol, y tbcnicas cuantitativas de cromatografla en placa fina. LogrCindose que las aflatoxinas queden libres de las substancias que interfieren con su identificacibn y cuantificacibn (de

Iongh et. a l . , 1962, 1964; Adye y Mateies, 196h). Thomas y colaboradores ( 1 9 7 5 ) desarrollaron un metodo ítnportante

de

extraccibn y purificacibn a partir de malf. dicho ~

procedimiento puede ser tomado como base para adaptar el mbtodo a otros sustratos. A s t mismo se han desarrollado varios procedimientos de purificacibn en columna (AOAC, 1980). 'con la misma precision que el metodo de Thomas pero con la diferencia que el analisis se realiza con mayor rapidez, y se emplea una cantidad menor de solvente, asimismo que la manipulacibn de la toxina es menor.

..

La cuantificacibn de la fluoresencia natural de las aflatoxinas en cromatografla en placa fina se hace por comparacibn visual con luz ultravioleta o por fluorodensiometrla del cromatograma de la muestra contra un patrbn. La mayor desventaja de la cromatografla en placa fina cuando s e cuantifica por comparacibn visual es la alta variabilidad. Otra desventaja es el largo tiempo requerido para un analisis, usualmente 2 horas. Este factor llega a ser significativo cuando se requieren resultados rApidos de muchas muestras.

Los procedimientos recientes que involuiran el uso de cromatografla llquida de alta presibn (HPLC), dan mayor

exactitud en la cuantificacibn individual de aflatoxinas e involucran tratamientos previos de cromatografla preparativa. Es sumamente importante el establecimiento de un metodo de purificacibn adecuado de la muestra para conseguir el mayor t

rendimiento en el siguiente paso, que serla el analisis en e l HPLC, presentando un metodo seguro, sensible y de menor tiempo total de ejecucibn.

(13)

9

2. OBJETIVOS

I . Determinar la influencia de diversos factores ambientales sobre la produccibn de aflatoxinas en la fermentacibn sblida

de la yuca (FCY). Los parametros a probar son:

a) Temperatura b) Aireacibn c) Humedad

d) Coexistencia de Aspergillus niger y Aspergillus parasiticus.

T I . Establecer u n metodo para la cuantificacibn y extracci6n

de aflatoxinas mas rapid0 y seguro a partir d e l a yuca.

3. METODOS

3.1 Microorganismos: S e utilizaron Aspergillus parasiticus

NRRL 2999 y Aspergillus niger cepa coleccibn U A H - I nümero

31.

3.2 Medios de Cultivo: 3.2.1 De Conservacibn

-

Yuca-Agar. 1 0 g de harina de yuca (malla 3 0 ) , 1.5 g de (NH4j2CO4, 0.5 g de KH2P04, 0.5 g de urea, 7.5 g de agar y

io0

m i

de agua destilada; pH de 5.0-5.5 ajustado con H3P04.

El

medio se inocula con esporas y se incuba a 29'C durante 8 dlas. Posteriormente los tubos se colocan en el refrigerador a A'C y s e

resiembran cada 3 meses.

~ _ .

,

-

PDA (papa-dextrosa-agar), Bioxon.

3.2.2 D e Esporulacibn: 100 g de harina de yuca (malla 3 0 ) , 8 g

de tNH2)2C04, 4 g de KH2P04, 2 g de urea y 100 m i d e a g u a

destilada; pH de 3.5 ajustado cün H3P04 9 N. La incubacibn s-e lleva a cabo durante 8 dlas a 29'C para A. parasiticus y

35'C para A. niger en incubadoras de uso microbiolbgico.

3.2.3 De produccibn

-

Medio d e yuca (Raimbault & Alazard, 1980), cuya composicibn e s yuca, sales de amonio y potasio.

-

Medio '?ES (Davis et. a l , i 9 6 6 ) , 20 % de sacarosa, 2 % de extracto de levadura.

3.3 Sistema d e Fermentacibn: Fermentacibn en Custrato Cblido. Se u t i l i z b un sistema de fermentacibn en cclumnas similar al desarrollado por R a i m b a u l t . y A!azard i 1 9 8 C ) . ;.a

temperatcra f u e controlada p o r un termoregulador Haake

E2

con una

precisibn de 0 . i ' C en u 7 bar?o d e agua. Sa p a s b aire a t r a v e s

d e dichas col~imnss previamente s a t u í a d ü con j g u a a la temperatura

d e incubacibn. Cada columna contenla 10 g da materia seca, el

contenido d e humedad inicial fue de 50 % y el pH inicial de 5-5.5.

(14)

to

inbculo tenla 2 x 107 esporas/g de harina seca para A.

n i g e r y de 1 . 3

x

107 esporas/g de harina seca en el caso d e

A . parasiticus. Las columnas se cubrieron con papel aluminio y

se les colocb porciones de algodbn en la parte superior e inferior de las mismas. La parte superior que no se alcanza a cubrir con el algodbn es limpiada perfectamente para evitar esporulacibn. Se montaron tantas columnas como muestras, siendo

.la

toma de muestra por duplicado cada 1 2 hrs o mas en puntos crlticos. Las columnas se transfieren posteriormente a vasos de precipitado (en caso de que la columna esporule se esteriliza a 15

Ib/pulg2 por 5 min), s e homogeniza para tomar muestras y hacer los

respectivos anAlisis. ~

3.4 Tecnicas Anallticas

3 . 4 . 1 La biomasa fue estimada por ~ el mbtodo de Lowry (Stewart,

1975). ~

3.4.2 Determinacibn de aflatoxinas:

y 20 % ) s e separa el micelío del caldo de fermentacibn mediante

filtracibn. La solucibn filtrada se transfiere a un embudo de separacibn y es extralda dos veces con 2 5 m i de cloroformo, la solucibn orghnica se pasa a traves de sulfato de sodio

anhidro, se evapora en un rotavapor ( 6 O . C ) hasta aproximadamente 2 mi. El concentrado es transferido a un vial en donde se evapora a sequedad bajo una corriente de nitrbgeno. Posteriormente se rasuspende el concentrado en un volcimen de 4 a i l de benceno-acetonitrilo ( 9 8 + 2 ) para hacer las pruebas de cuantificacibn en cromatografla en placa fina.

1. Para el medio YES (extracto de levadura y sacarosa al 2 %

I I . Metodos de extraccibn y purificacibn propuesto por

Barrios-Gonzalez et. ai. ( 1 9 8 5 ) :

m l de solucibn metanol-agua (60+40). Licuar a alta velocidad por

3 min.

-

Filtrar en papel filtro de poro' grande y transferir el filtrado a un embudo de separacibn d e 500 mi.

-

Agregar 30 mi de hexano mas 15 mi de solucibn de NaCl saturada para romper la emulsibn.

-

Para la decoloracibn, se prepara un gel con 100 m i de agua destilada mas 1 0 m l de F e C 1 3 al 1 0 %. Agregar NaOH al 4 % hasta pH de 4 . 5 y mantener agitado todo el tiempo para preparar el gel. Transferir el filtrado desengrasado obtenido en el paso anterior a

un vaso de precipitado y afiadir un voli~men igual de gel d e

cloruro ferrico, agitar durante 1 o 2 minutos.

-

Filtrar sobre papel filtro de poro grande en un embudo de srpar ac ibn.

-

Agregar al f i l t r a d o decolorado 25 ml de cloroformo. agitar y

dejar reposar. Se recupera ia fase de c l o r o f o r m o y s e repite la operaciln una vez mas.

-

Juntar los dos extractos de oloroformo y filtrar a traves de

-

Pesar 5 g de muestra y colocarlo en la licuadora. Agregar 70

(15)

1 1

un embudo con 2.5 g de Na2SO4 anhidro (con base de algodbn) a un matraz para llevar a evaporacibn.

-

En un rotavapor se evapora a una temperatura no mayor a 6 0 ’ C

el filtrado hasta aproximadamente 2 m l y se transfiere a un vial para evaporar a sequedad bajo una corriente de nitrbgeno.

111. Mbtodo CB-I e.n columna de la AOAC ( 1 9 8 0 ) para ~~

extraccibn y purificacibn: Para un tamailo de muestra de 50 g

se reporta un tamaRo de columna de 2 2 m m X 300 m m preparada de la siguienta manera:

-

Se . . . . coloca una b a s e . de fibra de vidrio en el fondo de la

columna, en seguida 5 gl de Na2S04~~anhidro y se agregan 30 ml de cloroformo, 10 g s e silica MercK 7734 para cromatografla en

-

columna,y 15 g de Na2504 anhidro. ~~ ~

-

La extraccibn de la muestra se hace con 250 ml de

cloroformo, 25 ml de tierra de diatomeas y ~ 2 5 m l de agua. Se agita ~.

por 30 min y posteríormente se filtra el extracto, colectando l o s primeros 50 ml para agregarlos a la~columna.

-

Despu&s de agregada la muestra en la columna, se eluye con 150 ml de hexano, 150 ml de eter anhidro y 150 ml de Cloroformo-Metano1 (97:3). En esta Liltima fracci~en se e l u y e - l a ~ ~ ~ ~~~

af latoxina. . .-

-

La muestra se evapora en un rotavapor a temperatura no mayor a

6 0 ’ C casi a sequedad, el concentrado se transfiere a un vial y se

evapora bajo una corriente de nitrbgeno.

3.4.3 Cuantificacibn de aflatoxinas por cromatografla en placa

fina: ~~

-

Disolver el extracto en 500 microlitros de benceno acetonitrile (98+2).

-

Aplicar la muestra sobre una placa activada (Sllica Gel 60 H

MercK).

-

C o r r e r las placas en Cter etllico, 5ecar en la misma

pos icibn Y correr posteriormente con tricloroetileno -cloroformo-metano1 ( 8 + l t l ) .

-

Se revelan las placas bajo luz ultravioleta de onda larga y se compara la fluoresencia y el R f ’ de la muestra con la concentracibn de patrbn mas cercano para calcular la conccntracibn de la muestra tanto en la placa como en la muestra o i inal.

3.4.4 Humedad: el contenido de humedad en las muestras de

fermentacibn sblida f u e determinado por peso seco ( A O A C 19.30)

a 1 0 5 ’ C durante 24 h r 5 .

3.4.5 pH: a 1 g de muestra hlirneda fermentada s e le adiciuna 10

m i d e a g u a destilada, s e agita la mezcla p o r 5 m i n y E! p3 s e mide

directamente en el s o b r e n a d a n t e .

3.5 Medidas d e Seg’iridid ToxicolDgica: el material contaminado

s e sumerge por 10-20 m i n en la siguiente mezcla vulum8trica: una parte de agua-una parte de hipoclorito de sudio ai 5 % (solucibn

(16)

- L

.

r < - t

i

12

blanqueadora comercial). Cuando la Cantidad de aflatuxinas e s alta

( 2 5 ngimicrolitro), entonces se usa la siguiente

mezcla volumetrica: nueve partes de agua-nueve partes de

blanqueador comercial-dos partes de.acetona.

h

4

1

#!

4 . RESULTADOS

4 . 1 Efecto de los Factores ambientales en la '!

duccibn de . .I .. aflatoxinas en^ la fermentacibn sblida de la yuca. ~.

~ ~ ~ . . .

~ ~~~~~~ I

~~

~

. ~~ . ~~

4 . 1 . 1 Efecto de l a temperatura.

Las

AT. Los resultados se ilustran en la Figura 4 . 1 e indican que l a

,

produccibn de AT a 35.C es 100 veces menor~---que a 29.C. A - ~~ ,

temperaturas mayores la producción de micotoxinas es siempre menor.

columnas de fermentacibn s e incubaron durante a 30 y 36 h r s - ' : ~~~ ~~~ ~ ~~~~

I

~~ debido a que en esos tiempos se d á la maxima produccibn de

i

. . ..

00

Q I

I

0

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i

x !

~ ~~

6 C

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G.

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1

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-

I

6

~~~

1

i

I ! !

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IS

'Tomparatrra V C )

FIGURA a.1 Efecto de la temperatura en la Droduccibn ~. C ] P

_ _

aflatoxinas pur Fermentacibn en Sustrato Solido CFCI). Concentracibn de aflatoxinas C - t l - ) , biomasa ( % de protelna) í +

) , pH (*), y humedad )-C ( % ) .

1i.1.2 Efecto de la aireacibn.

Se rralizb un experimento en el cual fue interrumpida la aireacibn ? las 28 h r s de empezada la fermentacibn y se

(17)

I,

!

.. ..

13

.-.

. i b

-. restituyo a las 4 5 hrs, se tiene un perfil fermentativo.(Figura 1:

4 . 3 ) en et cual se observa una concentracibn constante de biomasa durante el tiempo que no se suministrb aire. A l ser restituida la aireacibn, la biomasa decae rapidamente de 16 a 12

X ,

j

i

pero a partir de las 50 hrs vue'lve a crecer a una velocidad muy

.--

....

be ja.

o

I

~

..

*

u .O 10 O

Tiernpo(hc*as)

F I G U R A 4.2 Cinetica de produccibn de aflatoxinas por Fermentacibn en Custrato Sblido (FSS). Concent~racibn de aflatoxinas (-&-&-), Biomasa (c).), p H (*), Y humedad (-.

""0

'"- ~

'3

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b 4 40

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1

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I

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I . . '0 . 10 10 *O 10 co 70

.

O

Tiempo (horad

F I G U R A A.3 E f e c t o d e l a airríicihn en l a produc c i b n de

aflatoxinac por FCS. Concentracibn d e aflatoxinas C - r c f ) ,

(18)

1 4

La cinetica de AT presenta un comportamiento diferente ai usualmente observado (Figura 4 . 3 ) . ya que comienza su produccibn a las 24 hrs para posteriormente tener un fuerte aumento en la velocidad de produccibn a las 30 h r s y seguir asi con velocidad constante hasta las 72 hrs, a diferencia del comportamiento normal

(Figura 4 . 2 ) .

El pH s e elevo mas de lo normal a las 24 Y 30 h r s , para

finalmente alcanzar un valor de 4.

1

<Q O Q SO m

-

80 i o (o.

i

~~ ~~. A.noi.á (d@n/&

I

~~~

I

,~ ~-

~~ ~

FIGURA 4 . 4 Efecto de diferentes niveles de aireacion en- la produccibn de aflatoxinaspor FCC. Concentracibn de aflatoxinas

í-), biomasa , C-) pH (*>, humedad

(w.

En

otra experiencia se probaron diferentes flujos de aire (de O a

67 ml/min/col). Los r e s u l t a d o s - ~ ~ (Figura 4 . 4 ) demuestran que la biomasa no se ve afectada por los diferentes flujos, no siendo asi en l a produccidn de AT en donde s e ve un aumento en la bioslntesis d e las t.0xina.s conforme aumenta e l flujo de aire. Tambien se ve afectada. l a r e i a c i h n AT B / A T G ( R i G ) , siendo de

1 con bajos flujos ( O a 1 3 . 5 ml/min/lO g de M . C . ) y 2 en flujos

altos d e aireacidn ( 2 0 a 6 7 ml/min/lO g de M.S.).

4.1.3 Efecto de la humedad.

La Figura 4.5 representa el efecto de la humedad en la producibn de l a s AT. A humedades por debajo d e l 40 %. la p r u d u ~ c i d n es practicamente nula y crece fuertemente c~nfur-me aumenta E.]

(19)

efecto en el pH. En ningün caso se encontraron variaciones de humedad a lo largo de l a frrmentacibn.

HOmodod hi&,\

PA)

F I G U R A 4.5 Efecto de l a humedad en la producclan de af~iatoxinas~

p o r Fermentacibn en Custrato Cbilido. Concentracibn de

aflatoxinas (-), biomasa ttf,, pH C*) y humedad

w.

La curva )de produccibn de AT a 30 h r s sigue el mismo comportarnientN3 que la obtenida a 50 hrs.

4 . 1 . 4 Efectl3 de ' l a coexistencia de A . n i g e r y A .

parasiticus.

Para llevar a cabo este estudio se usb un inbculo de 2 x

lo7

esporas de A . n i g e r / g de M . C . (cepa 1 0 ) y 1.3 x

lo7

esporas

e

A . p a r a s i t i c u s / g . de M.C. Las columnas se

incubaron a 29'C durante 36 h r s . Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 4 . 1 .

De eiios podemos ver claramente que hay una reduccibn del 83 96

(20)

Organismo

B

G B+G X Humedad Biomasa pH (final)

( X ) ( k )

A. parasiticus 1772 1063 2835 3120

2555 851 3046

-_

A. parasi t icus .~

+ A . niger 368. 193 579 517

332 124 456

_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ^ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ -

60.3 11.3 4.25

~~

64. O 20.0 4.0

~~ ~.

~ ~~ ~ ~~~

~ . .~

4.2 Celeccibn y evaluacibn de un metodo~-para y purificacibn de aflatoxinas a partir de yuca. ' ~.

Se tuvieron problemas con e l ~ e m p a q u e de la columna y fa elueibn

de l o s solventes que s e resolvieron manteniendo~ ia coIumna~a.-~menor temperatura con una chaqueta de enfriamiento y agua fria (15'C).

Las cantidades utilizadas tantu de AT B l como de AT G 1 fueron de

500 n g ~ ~ y se analizaron todas las fracciones colectadas como se muestra en la Tabla 4.2.

TABLA 4.2 Anatisis cromatografico de las fracciones obtenidas al pasar 500 ng de AT Bl y 500 ng de AT G l por una columna de purificacibn

. . .

Fraccibn Solvente Fluoresencia Vol. resuspendido

I150 m i ) (ng/microlitro) tmicrolitros)

_ _ - _ _ _ _ _ - _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - - -

500

- _ - - -

1 CHCi3

*

2 Hexano

3 Eter

4 MeOH-CHC13 25

_ - _ - _

n

9 ,

_ _ _ _ _

*

Colo son 50 ml colectados de muestra, no es solvente d e

I avado.

En tabla Li.3 se muestran los resultados de los experimentos que se

(21)

17

" .

.-

Tabla 4.3 Variabilidad encontrada en e l metodo CB-I (AOAC 1980)

de purificacibn de AT en columna.

_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - - - _ - - - _ - - -

NLimero de Substancia Origen Solvente de

experimento AT SFY elucibn

I.

. -

1 Bl

-

std CHCL3-MeOH

.

,,, 2 Bl

-

std CHC13-MeOH

3 Bl

-

std CHC13-MeOH

4 B 1.

-

std CHC13-MeOH \ ~-

7 G l

-

std CHC13-MeOH

8

-

CFY std CHC13-MeOH, eter ----

9

-

SFY std CHC 13

10

-

CFY std CHC 13

1 1

-

SFY std CHC 13

.dj 12 91 SFY std Hexano, eter

1 3 B l SFY std hexano, eter

1 4 B l SFY s t d hexano, eter

15 B 1 , G l SFY Ferm hexano, eter . - -

. . .

.-

NOTA: En este metodo las AT deben salir en la fraccibn de CHCl3-MeOH.

. *

. -

5 . DISCUS ION

5 . 1 Efecto de los factores ambientales en la produccibn de

.-

aflatoxinas en la fermentacibn sblida de la yuca.

,-

.. .

..

c _

...

.

L

..

-.

..

I. ..

C .

. .

-.*

..

-

*.*

5 . 1 . 1 Efecto de la temperatura.

En este trabajo se encontrb que la temperatura afecta de manera importante la produccibn de AT. Conforme aumenta de 29'C, disminuye l a produccibn de AT. A 35,'C la produccibn es 8 veces menor que a 29'C y a 40'C disminuye aun mas. Desde el punto de vista practico estos resultados indican que la temperatura es un importante parametro en el control de la FSY para dar seguridad toxicolbgipa ai procesc d e enriquecimiento proteico, por lo cual se le debe tener muy bien controlado. Esto significa que durhnte el proceso d e enriquecimiento proteico de la yuca se debe mantener una temperatura d e 35'C y no permitir que baje de

e s e nivel, de lo contrario e l l c puede representar u n peligro toxicolbgico s i e l proceso s e i l e e o a contaminar acsidentalmente con esporas d e A . p a r a s i t l c u s .

5.1.- E f e c t o de l a aireacibn.

(22)

18

La humedad es un parametro muy importante y fundamental en las fermentacibnes en sustrato sblido. Los resultados obtenidos demuestran que a bajas humedades, la.produccibn de aflatoxinas

I

.

,.

I ."

. .

.,...

~. .

secundarios benefices con el uso de la FCY.

Por otro lado, quiz& el efecto estimulante sobre la produccibn de AT en la interrupcibn de la aireacibn por 24 hrs se debe a que hubo buen flujo de aire durante la fase de crecimiento exponencial, dando lugar a una influencia positiva en la fase de produccibn como sucede con otro tipo de metabolitos secundarios

(23)

19

I

t

5 . 1 . 4 Efecto de la coexistencia de A. n i g e r y A.

parasi t i c u s .

i

En estudios de los factores que influyen en la produccibn de AT i

interaccibn competitiva entre A. f l a v u s y~ A. n i g e r . ~~

Asnworth et al (1965) encontrb que las AT no se forman cuando . .

en cereales y en productos ‘ . a g r l c o l a s se incluyen la

f

ambas especies son inoculadas juntas en cacahuate. Tsbouchi et.

al. ( 1 9 8 1 ) reportb la total inhibicibn de la produccibn de

A T - cuando se inocularon ambas especies en arroz. Finalmente, Horn

y Wicklow (i983)-- encontraron el.mismo efecto en malz. De este ultimo estudio los autores reportaron:

malz. ~~~

i

~~ .~

1 . A. n i g e r no excluye l a poblacibn d e A. f l a v u s de¡~

2. A. n i g e r no degrada la toxina.

3. El metabolismo de A. n i g e aja el pH io suficiente ( 3 a

j

~~

i

toxina. ~ ~ ~~ ~. ~~ . /

I

4 ) para afectar la bioslntesis. ~~ .

4 . Junto con el efecto del pH hay uno o mas metabolitos ‘ i

producidos por A. n i g e r que inhiben. la produccibn de la.

Considerando este panorama, se planeb una fermentacibn en sustrato sblido inoculando A . niger (cepa N o 3 1 ) y A.

p a r a s i t i c u s , para ver el fenbmeno de inhibicibn que se da’ en este sistema usando A. p a r a s i t i c u s en sustitucibn de A.

f l a v u s . En los resultados se observa un 83 X de reduccibn

i

(fenbmeno de inhibicibn) en la produccibn . de AT--por ~1.

presencia de ambas especies en

el

medio de cultivo. E l pH final

I

fue de 4 , mas alto que el reportado por Horn y Wicklow (1983),

generalmente muy cercano a 3 . Esto significa que la inhibicibn fue producida por un factor metabblico producido por A .

niger.

1

I

i

Debido a la alta concentracibn de esporas usadas en este experimento, hubo la posibilidad de qye la germinacibn de esporas fuera inhibida (Anaya y Barrios-Gonzhlez. 1986). Sin embargo, la alta concentracibn de biomasa encontrada indica un buen crecimiento.

1

Desds un punto de vista practico, este fenbmeno ecolbgico parece ser la garantla mas importante para la seguridad toxicolbgica en el proceso de enriquecimiento proteico de la yuca. Sin ernhargo e s una parte del estudio q u e necesita mas

invest i gacibn a i respecto. Estus resultadus debrran continuarse con estudics sobre el efecto de diferentes cenrentraciones d e e s p o r a s d e A .

parasi

t i c u s (simulandci diferectes grados de contaminaciün en una ’ferment.acibn sblida), y de esta f o r m a evaluar el grado de proteccibn que

brinda este factor. Es impurtante verificar si esta proteccibn ecolbgica es tambien obtenida con otra cepa ( A. niger No

1 0 ) usada en el proceso de enriquecimiento proteico de la yuca.

(24)

-

I

. .

. , , . , I

-.

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I- , ,-

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... , "~." ..., :.,

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..

I

5 . 2 Celecibn y evaluacibn de un mbtodo para la extraccibn y purificacibn de aflatoxinas a partir de yuca.

El motivo principal de buscar un'nuevo mbtodo de extraccibn y

de la yuca ( C F Y ) , la cual interfiere con la cuantificacibn de la aflatoxina B l por emitir la misma fluoresencia con luz UV, tanto en cromatografla en placa fina como en cromatografla de

llquidos de alta presibn (Hutchins, 1 9 8 3 ) . Con la bhsqueda-.-

!

purificacibn se debe a la presencia de una sustancia fluorecente

di

I,

1:

I

de otro mbtodo se pretende eliminar dicha interferencia a ~ ~~~ ~ ~~

traves de un paso de'purificacibn intermed40, es decir, que al

4

I

~~~

final solo se obtenga la^ aflatoxina pura.

Cuando se corrib

la

muestra del patrbn en la columna, con los

solventes indicados en el manual de la AOAC ( 1 ~ 9 8 0 ) , se encontrb

que el H e r rompia el empaque, alterando la uniformidad de la

E

columna, consecuentemente el solvente no eiuyb a traves de I

ella, sin lograr n~inghn resultado positivo. ~~~

f

~~ ~ ~

~~~

a temperatura a q u e - ~ se lleva a cabo la elucibn inf.luye de :nera importante e n la separacibn de l o s componentes, se 'ectb que una t.emperatura elevada era la causante del

rrrpimiento de la columna. Para solucionar ta~l problema se diseño

,

una columna de doble pared, de tal forma que la chaqueta d e . !

enfriamiento mantuvo frla la columna asegurando su homogeneidad. I

~~~~~

Los resultados obtenidos son satisfactorios con los estandares de aflatoxinas, y a que se eluyeron en l a ~ ~ f r a c c i b n de MeOH-CHC13

(3+97), lo cual es un resultado esperado; sin embargo en l o s

Liltimos experimentos realizados se encontrb variacibn en el metodc tanto en la SFY como en las soluciones patrbn de AT, pues eluyeron e a las fracciones de tiexano y eter, siendo esto un resultado no esperadü pues normalmente las aflatoxinas eluyen en

la fraccibn de MeOH-CHC13. Posiblemente esto puede ser atribuido ai cambio de humedad y temperatura en el medio ambiente y a que no se tuvo cuidado en mantener esto factores cons tan t e s .

El metodo de purificacibn de AT en c ~ l u m n a es mas delicado que el de extraccibn Ilquido-liquido en embudos de separacibn. Es necesario conocer mejor e l metodo de columna, encontrar y controlar l o s factores que estan causando si^

variabi!idad. Es ~toiible que estos factores sean la humedad y

temperatura ambiental.

!

factores que ocasicnari la variabiiidad, se c~n:ir-me si

s e p a r a o no las A T y la CFY. En caso de que no s

p n d r l a :

a ) Colectar fracciones m 8 s pequeiías del so

elucibn. Es decir, la s-eparacibn podrla estarse real

P x r j tr-abajc's futurüs, s e recümienda que u n & L=Z controlados l o s

separen se

el mCtc.do

(25)

.

I

~ ,. pero ambos compuestos estar saliendo con el mismo solvente. A l

tomar una fraccibn tan grande (150 ml), se estarla perdiendo

;/

i

I

., .

~~

esa separacibn. ;!

b ) Otra alternativa serla .utilizar un vollimen mayor de I

_"

&ter en el proceso pues se sabe. que la SFY es mas soluble en I. este solvente que las afiatoxinas.

,I

- .

~~

c :

~~

r l

~~~ . ~~ ~~~ ~~.

~ ~~ ~.

6 . CONCLUSIONES

En este trabajo se Fomprobb que las aflatoxinas son^ metabolitos secundarios ya que su produccibn esta~.Iigada a la disminucibn

estacionario, comienza la produccibn de Ias~toxinas.

,_,l

I .,

~~ ~ .

..

... en el crecimiento, es decir, cuando la biomasa llega a un estado

!

~~ ~~.

-~

-

~~ ~ S e encontrb que fa temperatura bptima de produccibn--de

r- aflatoxinas es de 29'C. De la m i s m a ~ f o r m a una aireacibn baja

estimula la formacibn de las toxinas (menor a 4 l / k g M:S.). y ~~ (

.

_.

' presencia^ de A. n f g e r produce un efecto en el metabolismo

r.- :undarío de-^^ A. p a r a s f ticus que~~prov-oca una disminucibn en

produccibn de la toxina. I ..

Con el metodo de purificacibn y extraccibn probado se dedujo

que se debe tener especial cuidado en las condiciones ambientales

..

del lugar de trabajo ya causan variaciones en la velocidad d'e

elucibn, y de esa forma s e podra obtener un metodo seguro y

. _ / confiable. En cuanto a - ~ i a eliminacibn de la substancia~que

interfiere con la cuantificacibn de la aflatoxina~E1.i faltan experimentos por hacer, teniendo la alternativa de usar *.I substancias que sean muy afines a la misma y la eliminen .antes que

salgan l a s af 1atoxina.s de l a columna.

E l control de las condiciones d e operacibn de fermentacibn dan la seguridad toxicolbgica requerida, la regulacibn

- . adecuada de la temperatura y la aireacibn dar& como resultado

un producto libre de toxinas.

Finalmente las condicione5 en l a 5 que normalmente se lleva a cabo el enriquecimiento proteico d e l a yuca por el crecimiento de

..._

-.

-

*..

r-

_I

I , _ A s p e r g j i l u s riiger no favorecen l a producciein de aflatoxinas.

1

..

,-

(26)

22

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Figure

Figura  1 . 1   Estructura de  las aflatoxinas  B l   (a)  y  Gl  ( b )

Figura 1 .

1 Estructura de las aflatoxinas B l (a) y Gl ( b ) p.8
TABLA  1.2 Caracterlsticas de  las aflatoxinas

TABLA 1.2

Caracterlsticas de las aflatoxinas p.9
FIGURA  a.1  Efecto  de  la  temperatura  en  la  Droduccibn  ~.  C ] P   _ _

FIGURA a.1

Efecto de la temperatura en la Droduccibn ~. C ] P _ _ p.16
FIGURA  4 . 4   Efecto  de diferentes niveles de aireacion en- la  produccibn  de aflatoxinaspor FCC

FIGURA 4 .

4 Efecto de diferentes niveles de aireacion en- la produccibn de aflatoxinaspor FCC p.18
TABLA  4.2  Anatisis  cromatografico de  las fracciones obtenidas  al  pasar 500 ng  de  AT  Bl  y  500  ng de  AT  G l   por una  columna de purificacibn

TABLA 4.2

Anatisis cromatografico de las fracciones obtenidas al pasar 500 ng de AT Bl y 500 ng de AT G l por una columna de purificacibn p.20

Referencias

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