Efecto de la radiación ultravioleta sobre el crecimiento de Bacillus sp productor de celulasas

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(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. ÁT IC. A. Y. CO. M. UN I. CA. CI. Ó. N. ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. AS. DE. IN. FO. RM. Efecto de la radiación ultravioleta sobre el crecimiento de Bacillus sp. productor de celulasas. TE. M. TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO DE. DE. SI S. BIÓLOGO - MICROBIÓLOGO. ASESOR: Dr. Luis Alberto Llenque Díaz. DI. RE. CC. IO. N. AUTOR: Br. Evelin Katia Gutiérrez Castro. TRUJILLO-PERÚ. 2014 i. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE. CI. Ó. N. TRUJILLO. UN I. CA. Dr. Orlando Velásquez Benítez. ÁT IC. A. Y. CO. M. RECTOR. RM. Dra. Vilma Méndez Gil. Dr. Santiago Uceda Duclos. PROFESOR SECRETARIO GENERAL. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. M. AS. DE. IN. FO. VICE-RECTORA ACADÉMICA. ii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CA. CI. Ó. N. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. UN I. Dr. José Mostacero León. FO. RM. ÁT IC. A. Y. CO. M. DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. DE. IN. Dr. William Zelada Straver. Dra. Bertha Soriano Bernilla. CC. IO. N. DE. SI S. TE. M. AS. PROFESOR SECRETARIO DE FACULTAD. DI. RE. DIRECTORA DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. iii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. PRESENTACIÓN. CI. Ó. N. SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:. CA. En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de Grados y. UN I. Títulos de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y Parasitología de la. CO. M. Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo a vuestra. Y. consideración y criterio el presente trabajo de tesis titulado:. Trujillo, Julio del 2014. DE. IN. FO. RM. ÁT IC. A. “Efecto de la radiación ultravioleta sobre el crecimiento de Bacillus sp productor de celulasas ” con el cual pretendo obtener el Título Profesional de Biólogo Microbiólogo.. AS. ___________________________. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. M. Br. Evelin Katia Gutiérrez Castro. iv. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MIEMBROS DEL JURADO. N. Los suscritos, miembros del jurado, declaran que la presente tesis ha sido ejecutada en. CI. Ó. concordancia con las normas de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y. Y. CO. M. UN I. CA. Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo.. ÁT IC. A. _________________________________ Dr. Heber Robles Castillo. M. AS. DE. IN. FO. RM. PRESIDENTE. Dr. Luis Alberto Llenque Díaz SECRETARIO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. _________________________________. _________________________________ Ms.C. Anibal Quintanilla Diaz VOCAL v. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN DEL INFORME DE TESIS. N. Los profesores que suscriben, miembros del Jurado Examinador, declaran que el. CI. Ó. presente Informe de Tesis titulado: “Efecto de la radiación ultravioleta sobre el. CA. crecimiento de Bacillus sp productor de celulasas ”, ha cumplido con los requisitos. UN I. formales y fundamentales, siendo APROBADO por UNANIMIDAD por los miembros. ÁT IC. A. Y. CO. M. del jurado.. _________________________________. RM. Dr. Heber Robles Castillo. M. AS. DE. IN. FO. PRESIDENTE. Dr. Luis Alberto Llenque Díaz SECRETARIO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. _________________________________. _________________________________ Ms.C. Anibal Quintanilla Diaz VOCAL. vi. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. N. CERTIFICACION DEL ASESOR. CA. CI. Ó. El que suscribe, profesor asesor de la tesis titulada:. UN I. “Efecto de la radiación ultravioleta sobre el crecimiento de Bacillus sp productor de. CO. M. celulasas ”,. ÁT IC. A. Y. CERTIFICA:. RM. Que ha sido desarrollada, de acuerdo al reglamento establecido por la Facultad de. FO. Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, estando en conformidad con. IN. su correspondiente proyecto, y que el informe ha sido redactado acogiendo las. AS. DE. observaciones y sugerencias alcanzadas.. con el trámite del. TE. M. Por lo tanto, autorizo a Evelin Katia Gutiérrez Castro. DE. SI S. reglamento correspondiente.. RE. CC. IO. N. Trujillo, Julio del 2014. DI. _________________________________ Dr. Luis Alberto Llenque Díaz ASESOR. vii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CI. Ó. N. DEDICATORIA. M. UN I. CA. A mi Dios y mi Virgencita de la Puerta. CO. Que son mi fortaleza y mi guía, por mostrarme día a día que con humildad, paciencia y. A. Y. sabiduría todo es posible, a DIOS quien me dio la vida y la ha llenado de bendiciones. ÁT IC. en todo este tiempo, a ti MAMITA de la Puerta que has estado conmigo a cada paso. RM. que doy, cuidándome y dándome fortaleza para continuar, a ellos que con su infinito. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. M. AS. DE. IN. FO. amor me han dado la sabiduría suficiente para culminar mi carrera universitaria.. viii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. A mis padres VÍCTOR Y JULIA, pilares fundamentales en mi vida, por sus sabios consejos,. Ó. N. su entrega por todo lo que me han enseñado, por. CA. CI. estar conmigo incondicionalmente siempre que los. UN I. necesito, a ellos les debo lo que soy, quienes han sido. M. la guía y el camino para poder llegar a este punto de. CO. mi carrera que con su ejemplo, dedicación y palabras. Y. de aliento nunca bajaron los brazos para que yo. RM. ÁT IC. A. tampoco lo haga aún cuando todo se complicaba.. FO. A mi hermana PAOLA a ti que nunca. IN. titubeaste para ayudarme, por ser. mi apoyo. Gracias por tu tiempo, tus consejos y tu cariño. SI S. TE. M. AS. DE. incondicional por tu colaboración en todo momento.. DE. A mis hermanos JHONY Y RONALD por su. IO. N. colaboración y ánimo, que de una u otra manera son. CC. la razón por la cual me vi en este punto de mi vida. RE. para alcanzar este triunfo a puertas del título. DI. profesional tan anhelado. ix. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. A mis corazones. YOAN, DAMARIS,. ABRAHAM, JAYRO Y XIMENA, sus. Ó. N. risas me hacen crecer y sentirme muy. CA. CI. afortunada a ustedes mis pequeños que han. CO. M. UN I. sido mi inspiración para ser mejor cada día.. Y. A MI COSITA por su amor, apoyo. ÁT IC. A. comprensión por compartir momentos de alegría, tristeza y demostrarme que siempre. RM. podré contar con él, por siempre estar a mi lado. FO. en las buenas y en las malas, dándome ánimos. por amarme como tú lo puedes hacer!. A todos ustedes, con amor. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. M. AS. DE. IN. de fuerza y valor para seguir a delante. ¡Gracias. x. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AGRADECIMIENTO. N. A mi asesor, el Dr. Luis Alberto Llenque Díaz gracias por su tiempo, por su apoyo,. CI. Ó. por la orientación, por darme la oportunidad de trabajar en su laboratorio, compartir. CA. sus conocimientos, por su asesoría y sabiduría que me transmitió para la realización de. UN I. mi tesis desde el inicio hasta su culminación. Fue un gran honor para mí el haber estado. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. M. AS. DE. IN. FO. RM. ÁT IC. A. Y. CO. M. en su equipo de trabajo.. “Ahora puedo decir que todo lo que soy es gracias a todos ustedes”. xi. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN Se determinó el efecto de la radiación ultravioleta sobre el crecimiento de Bacillus sp. Ó. N. productor de celulasas, aislado de bagazo de caña de azúcar. Para lo cual se realizó una. CI. siembra de la bacteria en agar carboximetilcelulosa 1% (CMC), y se preparó una. UN I. CA. suspensión en Solución Salina Fisiológica estéril equivalente (SSFE) al tubo Nº1 del. M. nefelómetro de Mac Farland y se inoculó 1mL en 99 mL de caldo CMC al 1%. CO. suplementado una fuente de nitrógeno y sales minerales contenidos en un biorreactor. A. Y. esterilizado, y se puso en funcionamiento en agitación constante de 200 rpm a 37°C por. ÁT IC. 6 h. Luego se centrifugó el contenido a 4 000 rpm por 15 min, seguidamente ser realizó. RM. dos lavados de la población bacteriana con SSFE, y se preparó una suspensión en buffer. FO. fosfato pH 6.0, equivalente a la concentración del tubo N° 1 del nefelómetro de Mac. IN. Farland. Finalmente, se colocó 1.5 mL de esta suspensión en placas Petri y se irradió. DE. con luz ultravioleta a 44 cm de distancia por 10, 20, 30, 40, 50, y 60 segundos,. AS. respectivamente. A cada suspensión bacteriana irradiada, se realizó diluciones y se. TE. M. sembró 1 mL de dilución por el método de incorporación en agar CMC, se incubó a 37. SI S. ºC por 24 h. Pasado este tiempo, se hizo recuentos de las colonias con ayuda de una. DE. cámara cuenta colonias y se expresó en UFC/mL. Los resultados obtenidos en relación. IO. N. al tiempo de exposición fueron graficado haciendo uso del software EXCEL,. CC. determinándose que la radiación ultravioleta tiene un efecto bactericida, por la. RE. disminución de la población bacteriana en función del tiempo de irradiación,. DI. deduciéndose que para lograr obtener el 0,1 % de sobrevivientes, posiblemente mutados, fue de 40 segundos.. xii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INDICE Página. CI. Ó. N. Autoridades de la Universidad Nacional de Trujillo ................................................... ii. UN I. CA. Autoridades De La Facultad De Ciencias Biológicas................................................... iii. CO. M. Presentación .............................................................................................................. iv. A. Y. Miembros del Jurado ..................................................................................................... v. ÁT IC. Aprobación .................................................................................................................. vi vii. FO. RM. Certificación del asesor…………………………………………………………...…. IN. Dedicatoria ............................................................................................................... viii. AS. DE. Agradecimientos .......................................................................................................... xi. TE. M. Resumen ..................................................................................................................... xii. SI S. Índice ......................................................................................................................... xiii. N. DE. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 1. CC. IO. OBJETIVOS .............................................................................................................. 12. DI. RE. MATERIAL Y MÉTODOS ........................................................................................ 13 1. Material biológico ..................................................................................... 13 2. Procedimiento ........................................................................................... 13. xiii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.1. Reactivación, siembra y evaluación de la actividad celulolítica del cultivo de Bacillus sp. …………………………..……………………. 13 2.2. Construcción de biorreactores ............................................................ 14. CI. Ó. N. 2.3. Preparación de inoculo bacteriano ..................................................... 14. CA. 2.4. Inoculación de los biorreactores y Obtención del cultivo en fase log.... 15. UN I. 2.5. Irradiación con luz ultravioleta……………………………………….. 15 16. CO. M. 2.6. Siembra y Recuento de Unidades Formadoras de Colonias (UFC/mL).. 2.7. Procesamiento de datos……………………………………………………. 16. A. Y. 2.8. Determinación del 0.1%de sobrevivientes…………………………………. 16. ÁT IC. RESULTADOS .......................................................................................................... 17. FO. RM. DISCUSIÓN .............................................................................................................. 20. DE. IN. CONCLUSIÓN........................................................................................................... 25. AS. SUGERENCIAS ......................................................................................................... 26. TE. M. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 27. SI S. ANEXOS ................................................................................................................... 34. ……………………………………………………………………….35. RE. CC. IO. N. DE. Anexo 1: Tabla N° 1. Composición química del medio de cultivo Agar(CMC). DI. Anexo 2: Figura N° 2. Observación microscópica de Bacillus sp. con objetivo 100X del microscopio compuesto....................................................... 36. xiv. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Anexo 3: Figura N° 3. Siembra de Bacillus sp en agar CMC por puntura ………….……………………………………………………………37 Anexo 4: Figura N° 4.. Observación del halo de hidrólisis del. CI. Ó. N. carboximetilcelulosa por Bacillus sp, por el método de Rojo de. UN I. CA. Congo………………………………………………………………38. M. Anexo 5: Figura N° 5. Construcción e implementación del biorreactor agitado,. CO. con frasco de vidrio de 10 cm de alto por 7 cm de diámetro, de 250. Y. mL de capacidad; con 4 “bafles” de 4 cm de altura. Se acondicionó. ÁT IC. A. un motor de 6V y un agitador tipo Roushton con 9 paletas de. RM. plástico……………………………………………………………39. equivalente. al. IN. estéril. FO. Anexo 6: Figura N° 6. Suspensión bacteriana en solución salina fisiologica tubo. Nº1. del. nefelómetro. de. AS. DE. MacFarland…………………………………………………………40. M. Anexo 7: Tabla N° 2. Composición química del medio de cultivo Caldo. SI S. TE. Carboximetilcelulosa………………………………………………41 Biorreactor en agitación constante de 200 rpm en. DE. Anexo 8: Figura N° 7. IO. N. sistema de incubación a 37°C/6h.…………………….……………42. DI. RE. CC. Anexo 9: Figura N° 8. suspensión. de. Centrífuga que fue utilizada para centrifugar la Bacillus. sp.. después. de. cada. lavado. con. SSFE…………………………………………………………………43. Anexo 10: Figura N° 9. Siembra de Bacillus sp. en Agar CMC..…................44. xv. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Anexo 11: Figura N° 10. Colonias de Bacillus sp en placas con agar CMC,. después de 24 horas de incubación, realizado para hacer el recuento. con. luz. CI. Ó. irradiación. N. en placa de las unidades formadoras de colonia después de la. UN I. CA. ultravioleta…………………………………………………………...45. CO. M. Anexo 12: Figura N° 11. Recuento en placa de las unidades formadoras de. Y. colonia de Bacillus sp a las 10 segundos de haber sembrado en Agar. A. CMC, a las 24 horas de incubación (expuestos a UV). RM. ÁT IC. ……………………………………………………………………...46. FO. Anexo 13: Figura N° 12. Recuento en placa de las unidades formadoras de. DE. IN. colonia de Bacillus sp a las 20 segundos de haber sembrado en. AS. Agar CMC, a las 24 horas de incubación (expuestos a. SI S. TE. M. UV)……………………………………………………………….47. Anexo 14: Figura N° 13. Recuento en placa de las unidades formadoras de. Agar CMC, a las 24 horas de incubación………………………48. CC. IO. N. DE. colonia de Bacillus sp a las 30 segundos de haber sembrado en. DI. RE. Anexo15: Figura N° 14. Recuento en placa de las unidades formadoras de colonia de Bacillus sp a las 40 segundos de haber sembrado en Agar CMC, a las 24 horas de incubación................................................49. xvi. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Anexo 16: Figura N° 15. Recuento en placa de las unidades formadoras de colonia de Bacillus sp a las 50 segundos de haber sembrado en. CI. Ó. N. Agar CMC, a las 24 horas de incubación ………………..……...50. CA. Anexo 17 Tabla N° 3. Rrecuentos de las colonias en cada una de las repeticiones. relación. al. M. en. tiempo. de. CO. sembrada. UN I. del ensayo y promedios, expresadas en UFC/mL, en cada placa. Y. exposición…………………………………………………………51. ÁT IC. A. Anexo 18: Cálculos para determinar el 0,1% de sobrevivientes………………52. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. M. AS. DE. IN. FO. RM. Anexo 19: Fórmula para determinar la de desviación estándar………….……53. xvii. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. I.. INTRODUCCIÓN. Es ampliamente conocido que el papel es uno de los productos de mayor. Ó. N. uso en la vida del hombre y que se fabrica a partir de una materia prima. CA. CI. renovable como son las fibras de árboles, pero también de otras especies. UN I. vegetales, como paja, bagazo de la caña de azúcar, bambú, algodón, lino, entre. M. otros. La celulosa es el principal componente de la membrana celular de la. CO. mayor parte de las plantas y donde una célula vegetal joven contiene. ÁT IC. algodón contiene más de 90% de celulosa. [1]. A. Y. aproximadamente un 40% de celulosa y la madera un 50 %, mientras que del. RM. La celulosa es el carbohidrato más abundante en la biomasa vegetal,. FO. forma el 40-60 % de la pared celular de las plantas [2]; estructuralmente, en su. IN. forma nativa consiste en una cadena lineal de unidades de glucosa con enlaces. AS. DE. glicosídicos β- 1,4[3], por lo que constituye una abundante fuente de carbono.. M. Los organismos no pueden obtener energía directamente del polisacárido, pero. TE. sí de sus monómeros (azucares reductores) para metabolizarlos vía glucolisis;. SI S. entonces, para que los microorganismos hagan uso de los azucares reductores. . Esta reacción de hidrólisis es llevada a cabo por un complejo enzimático. IO. N. [5,6]. DE. necesitan desprenderlos de la celulosa por medio de una reacción de hidrólisis. grupo de enzimas de la glicosil hidrolasas [7].. DI. RE. CC. con diferentes formas de acción llamado complejo celulasas, pertenecientes al. 1. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Teniendo en cuenta la estructura química de la celulosa, se define como un polisacárido lineal formado por residuos de glucosa unidos por enlaces beta 1- 4 (β-1,4), donde esta configuración β, le permite a la celulosa formar cadenas. CI. Ó. N. largas y lineales, las cuales se presentan unidas entre sí por medio de enlaces de. Estas. CA. puentes de hidrógeno dando lugar a la formación de microfibrillas.. UN I. regiones, conocidas como regiones cristalinas, son altamente ordenadas y le dan. CO. M. las características de insolubilidad, rigidez y resistencia al ataque enzimático [8].. Y. Sin embargo, es menos conocido que la celulosa se encuentra comercialmente. A. disponible en una gran variedad de presentaciones y se utiliza en las industrias. RM. ÁT IC. de los detergentes, textil y alimenticia, entre otras [9].. FO. Existe la posibilidad de romper la molécula de fibra celulósica. IN. (polímero) en unidades más pequeñas, gracias a la acción de algunas enzimas. DE. llamadas celulasas. Las celulasas son producidas por una variedad de bacterias y. AS. hongos aeróbicos o anaeróbicos, mesófilos o termófilos. Sin embargo solo. TE. M. algunos de ellos producen celulasas extracelulares capaces de hidrolizar la. SI S. celulosa. A partir de los hongos aeróbicos, tales como: Trichoderma reesei,. DE. Penicillium pinophilum, Fusarium solani y Taloromyces emersonii de los cuales. N. se han obtenido los complejos celulolíticos que presentan un sistema enzimático [10]. . Otros microorganismos productores de celulasas. CC. IO. completo de celulasas. RE. incluyen a las bacterias aeróbicas mesofílicas y termofílicas (Cellulomonas sp.,. DI. Cellvibrio sp y Thermomonospera sp.), y las bacterias anaeróbicas mesofílicas y termofílicas (Acetivibrio cellulolyticus, Ruminococcus albus y Clostridium thermocellum) [11].. 2. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Las celulasas tienen un amplio rango de aplicaciones potenciales en biotecnología y muchas endoglucanasas termoestables tienen un gran potencial para usos industriales. En la mayoría de los casos son usadas junto con. CI. Ó. N. hemicelulasas, pectinasas, ligninasas y otras enzimas relacionadas [12] .. UN I. CA. Específicamente tienen importantes aplicaciones en la agricultura, en la. M. industria papelera, en textiles especialmente en la mejora de la calidad de telas. CO. así como en detergentes que proporcionan mejor limpieza sin degradar las fibras;. Y. en la industria de alimentos mejorando texturas, sabores y aromas; en la mejora. ÁT IC. A. de las fermentaciones de cervezas, vinos y otras bebidas alcohólicas; pero. RM. principalmente en la industria de la bioconversión de materiales celulósicos en. FO. alimentos para ganado altos en energía con mejores tasas de digestión y. IN. absorción de nutrientes, en la producción de proteína unicelular, lípidos, ácidos. DE. orgánicos, etanol solventes y otros productos químicos con un alto valor. AS. agregado como biocombustibles [13] .. TE. M. Las bacterias son microorganismos ubicuos por naturaleza y cada uno. SI S. con requerimientos nutricionales diferentes; entre ellos los descomponedores de. DE. material vegetal son actualmente los más importantes por la gran ayuda que. N. brindan en el equilibrio del ecosistema[14]. El género Bacillus es reconocido. CC. IO. industrialmente por sus altas tasas de crecimiento y producción de enzimas. DI. RE. hidroliticas; este género ha sido reclasificado muchas veces y algunas de sus especies han sido transferidas al género Paenibacillus. [15].. Estudios realizados. con cepas nativas, aisladas de un bosque pantanoso, muestran que Bacillus, en condiciones de agitación a 50, 100 y 200 rpm, no presenta actividad sobre su. 3. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. sustrato; es decir no secreta una cantidad considerable de celulasas para ser detectadas por los métodos analíticos [16].. N. Las bacterias del genero Bacillus son aerobias y termofílicas que también. CI. Ó. producen enzimas celulolíticas con actividad básicamente endo-β-1,4-glucanasa. UN I. CA. y exo-β-1,4-glucanasa; pero tienen la característica particular de presentar. [2].. Las especies del genero Bacillus son atractivas. CO. luego de la hidrólisis. M. resistencia a ser inhibidas por la glucosa o celobiosa que es liberada al medio. Y. industrialmente por varias razones incluyendo sus altas tasas de crecimiento que. ÁT IC. A. permiten tiempos de fermentación cortos, su gran capacidad de secreción. RM. extracelular e enzimas en presencia de determinados sustratos, esta capacidad. FO. secretoria presenta un potencial para la producción heteróloga de proteínas [17].. especial. DE. IN. Así mismo, estas bacterias Gram positivas pueden formar una estructura resistente. llamada. endospora. [18]. ,. que. son. estructuras. M. AS. extraordinariamente resistentes a estrés en el ambiente como calor, radiación. SI S. TE. UV, desecación y limitación de nutrientes.. DE. Las bacterias poseen un genotipo que se transmiten por herencia y un. N. fenotipo que depende de las circunstancias que les rodean, las mismas que. CC. IO. pueden sufren variaciones en sus caracteres y son de dos tipos; fenotípicas o. RE. adaptaciones y genotípicas (mutaciones). El estudio de la genética bacteriana. DI. permite entender mejor las funciones esenciales de su material genético y las características que rigen su comportamiento, su capacidad de adaptación al medio ambiente, la expresión de metabolismo que le permite colonizar como. 4. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. consecuencia de su desarrollo y algunos de los potenciales genes de interés industrial responsables de la degradación de polisacáridos [17].. N. La radiación es la propagación de energía por el espacio, y para J. W.. CI. Ó. Ritter, descubridor de la radiación ultravioleta (UV), ésta posee energía. UN I. CA. suficiente para extraer electrones externos de algunos átomos, redistribuir los. M. átomos de las moléculas en nuevas moléculas. Así tenemos que, mediante dosis. CO. elevadas de luz UV pueden desnaturalizarse las proteínas, que, si son esenciales,. Y. pueden producir la muerte biológica. Este efecto se utiliza para esterilizar el. ÁT IC. A. agua y la sangre, para trabajar en cámaras de cultivos celulares o similares, y. RM. para mantener estéril el instrumental procedente de autoclaves, mediante la. FO. irradiación en vitrinas con luz UV a longitudes de onda inferiores a los 290 nm.. IN. Otra principal característica de la radiación UV es la posibilidad de producir. DE. reacciones químicas, en éstas se basan los diferentes efectos, que son. M. AS. dependientes de la energía, es decir, de la longitud de onda [19].. TE. Las radiaciones UV son emitidas por numerosas fuentes naturales (sol,. SI S. estrellas) y artificiales (lámparas de UV), así tenemos que se produce luz UV. DE. mediante tubos o lámparas fluorescentes. Estos tubos están rellenos de argón,. IO. N. con una pequeña cantidad de vapor de mercurio a baja presión, de forma que. CC. emiten radiación ultravioleta al paso de la corriente, y donde la pared interna del. DI. RE. tubo está recubierta con una capa de fósforo, que hace de filtro. A bajas presiones, en el vapor de mercurio hay una línea espectral predominante de 253,3 nm, que es eficientemente absorbida por el fósforo. Esto conduce a una reemisión de radiaciones de mayor longitud de onda, por un fenómeno de 5. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. fluorescencia, dependiente de la naturaleza química del material de fósforo. Los compuestos fosfóricos tienen capacidad para producir la fluorescencia en la región visible (tubos fluorescentes para iluminación), en la UVA o en la UVB. N. .. CI. Ó. [20]. UN I. CA. Para la correcta aplicación de UV con fuentes artificiales, hay que tener. M. en cuenta aspectos físicos generales de la fototerapia, como la ley del inverso del. CO. cuadrado de la distancia y la ley del coseno de Lambert. Según la primera, la. Y. intensidad del haz decrece proporcionalmente a 1-d2, lo que significa, por. ÁT IC. A. ejemplo, que reducir la distancia de la fuente a la mitad aumenta la dosis cuatro. RM. veces más. La ley del coseno determina que la máxima intensidad se obtenga en. FO. la incidencia perpendicular sobra la piel y que, conforme más oblicua sea la. IN. incidencia de la radiación, su intensidad disminuya en función del coseno del. DE. grado de desviación [21].. M. AS. Los rayos UV no tienen actividad ionizante, pero provocan cambios. TE. químicos en las moléculas absorbentes, de modo que aparecen moléculas. SI S. alteradas denominadas genéricamente fotoproductos, los mismos que originan la. DE. inactivación de macromoléculas. Las consecuencias de inactivar proteínas o. IO. N. ARN no se dejan sentir a efectos de letalidad, ya que existen muchas copias de. CC. cada uno de estos tipos de macromoléculas, y se pueden volver a sintetizar; en. DI. RE. cambio, la inactivación del único cromosoma de la bacteria tiene efectos letales primarios y efectos mutagénicos secundarios. Por lo tanto, el espectro de acción biológica de la luz UV equivale al de absorción de la luz UV por el ADN [22].. 6. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. La radiación UV es absorbida por los nucleótidos, las bases moleculares del ADN y ARN de los microorganismos, según la longitud de onda, con valores cerca de 200 y 260 nm debido al enlace doble entre las posiciones 4 y 5 de las . Es decir, la luz absorbida promueve la. N. [23]. CI. Ó. bases púricas y pirimidínicas. [19]. . Si bien la formación de dímeros de tiamina –. UN I. moléculas dobles o dímeros. CA. formación de enlaces entre nucleótidos adyacentes, con lo que se crean. CO. M. tiamina son los más comunes, también suelen ocurrir dímeros de citosina -. Y. citosina, citosina- tiamina y dimerización del uracilo. La formación de un. RM. ÁT IC. ADN y ARN, lo que impide su reproducción [24].. A. número suficiente de dímeros dentro de un microbio impide que este replique su. FO. Una mutación es el cambio, en general irreversible, de una característica. IN. del genoma. Este cambio, que por otro lado puede no ser observado. DE. inmediatamente a nivel del fenotipo, se transmite como un nuevo rasgo. AS. hereditario y se presenta bajo las formas más variadas y sutiles. Las mutaciones. TE. M. son muy frecuentes y presentan un interés considerable para los genetistas,. SI S. además de su intrínseco valor evolutivo, por ser generadoras de diversidad. DE. genética. Todos los seres vivientes, sin excepción, sufren mutaciones en sus. N. genomas y este proceso es fundamentalmente aleatorio. Las mutaciones pueden. CC. IO. presentarse sobre células somáticas o germinales, en células embrionarias o. RE. adultas, en cada caso con consecuencias diferentes. Pueden afectar tanto. DI. secuencias que codifican para proteínas como secuencias regulatorias o repetitivas. Las mutaciones tienen ventajas e inconvenientes: una ventaja es que la aparición de mutaciones permite a los individuos adquirir una variabilidad. 7. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. genética y por consecuencia evolucionar; un inconveniente es que la mayor parte de esas mutaciones tienen efectos deletéreos o la muerte [25].. N. Un mutágeno es un agente físico, químico o biológico que altera o. CI. Ó. cambia la información genética, usualmente el ADN de un organismo y ello. UN I. CA. incrementa la frecuencia de mutaciones por encima del nivel natural. La. M. radiación UV es el mutágeno físico más empleado en el laboratorio para obtener. CO. mutaciones en las bacterias, siendo su efecto principal el originar dímeros de. Y. pirimidina intracatenarios (con creación de una anillo ciclobutano entre dos. ÁT IC. A. bases pirimidicas y consecutivas). Las proporciones de lesiones son las [19]. . Los dímeros de pirimidina son. RM. siguientes: 50% T-T, 40% T-C, 10% C-C. FO. lesiones moleculares formadas a partir de bases de citosina o timina en el ADN a. IN. través de reacciones fotoquímicas. La luz ultravioleta induce la formación de. DE. enlaces covalentes por reacciones localizadas en los dobles enlaces C = C. Estas. AS. lesiones pre-mutagenicas alteran la estructura del ADN y por lo tanto inhiben las [26]. .. TE. M. polimerasas y replicación de arresto. SI S. Las mutaciones inducidas ocurren al azar y sin direccionalidad aparente,. DE. es bastante probable que los mecanismos de resistencia se diversifiquen en [27]. . Sin embargo, a pesar de la. IO. N. diferentes poblaciones de microorganismos. CC. naturaleza aleatoria de esos eventos, queda la posibilidad de que durante el. DI. RE. proceso de selección llegue a darse una convergencia de las distintas poblaciones hacia un mecanismo de resistencia único, especialmente si les confiere mayor ventaja adaptativa. En la naturaleza hay organismos extremadamente resistentes a la radiación. El origen de su alta resistencia es difícil de explicar. Su capacidad 8. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. de reparar diversos tipos de daño, es más que suficiente para neutralizar el escaso daño que se genera en su hábitat natural. Un ejemplo es la bacteria Deinococcus radiodurans que como su nombre lo sugiere, posee una. Ó. N. extraordinaria resistencia a la radiación ionizante, luz ultravioleta y muchos. UN I. CA. CI. otros agentes que dañan el ADN [28].. M. Trabajando con dos cepas marinas antárticas que fueron expuestas a. CO. diferentes radiaciones de luz ultravioleta utilizando diferentes protocolos. Y. experimentales y filtros interferenciales, se demostró que dentro de cierto rango. ÁT IC. A. de dosis UV -B, parecen indicar que la mortalidad bacteriana muestra cierta Las. RM. independencia del tiempo en el que se acumula la dosis de UV- B.. FO. diferencias interespecificas en la sensibilidad a la radiación UV observada en las. modificaciones. en. la. estructura. y dinámica. del. DE. pueden determinar. IN. cepas estudiadas, muestran que un incremento en los niveles de radiación UV. AS. bacterioplancton marino antártico [29].. TE. M. Muchos microbios con un sistema metabólico funcional tienen varios. SI S. mecanismos de reparación de los ácidos nucleicos dañados, siendo la [30]. . La fotodimerización de tiaminas adyacentes. DE. fotoreactivación uno de ellos. N. resultantes de la absorción UV de los ácidos nucleicos es invertida por una. CC. IO. enzima fotoreactivada que usa luz entre 300 y 500 nm para activar la partición. RE. del dímero [31].. DI. Los dímeros pueden ser reparados por fotorreactivación o la reparación por escisión de nucleótidos, pero los dímeros no reparados constituyen el inicio de la. mutagénesis en las bacterias. [32]. . Entonces, las mutaciones aparecen. 9. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. principalmente como consecuencia del mecanismo. post-replicativo de. reparación propenso a error [33].. N. Con menor frecuencia la luz UV ocasiona hidratación de la citocina, lo. CI. Ó. que da origen a transiciones. Un tipo de mutantes que se puede obtener son los. UN I. CA. afectados en el uso de azúcares u otras fuentes de carbono y energía, es decir que estos mutantes pierden la capacidad de metabolizar determinados sustratos, pero. CO. M. pueden recurrir a otros alternativos. Para aislar estos mutantes se puede recurrir. Y. en muchos casos al uso de medios diferenciales que incorporan indicadores de. ÁT IC. A. pH, que cambian de color en función del uso o no del sustrato en cuestión. Por. RM. ejemplo: si quisiéramos aislar mutantes Lac- de E. coli, sembraríamos en Agar. FO. Mac Conckey. Los mutantes Lac- dan colonias transparentes, mientras que el. IN. fenotipo silvestre Lac+ da colonias rojas opacas con un precipitado alrededor de. DE. sales biliares [22].. M. AS. Hay que destacar que, gracias a las mutaciones, actualmente existe gran. TE. biodiversidad metabólica de los microbios. Si no fuera por las variaciones que. SI S. producen las alteraciones en el ADN, no habría variabilidad fenotípica, ni. DE. adaptación a los cambios ambientales. Por lo tanto, las mutaciones tienen su. IO. N. parte positiva, ya que todo proceso biológico tienes sus ventajas e. DI. RE. CC. inconvenientes [25]. Los cultivos bacterianos aislados de los ambientes naturales producen y. excretan una cantidad de enzimas inducibles de acuerdo a su capacidad natural y en función de la concentración de los sustratos presentes a su alrededor, pero que. 10. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. estás cantidades excretadas pueden ser sintetizadas en mayor cantidad por modificación de su material genético mediante el uso de agentes mutagénicos.. N. En este sentido, con la intención de contribuir con información científica. CI. Ó. válida para completar el protocolo de mejoramiento genético de los cultivos. UN I. CA. bacterianos productores de celulasas mediante la radiación ultravioleta, se. M. propone evaluar el efecto de la radiación ultravioleta sobre el crecimiento de. CO. Bacillus sp productor de celulasas y determinar el tiempo en que se logra obtener. Y. el 0,1 % de sobrevivientes, población con una alta probabilidad de haber mutado. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. M. AS. DE. IN. FO. RM. ÁT IC. A. en los genes que participan en la síntesis de celulasas.. 11. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. OBJETIVO (S) A. OBJETIVO GENERAL. N. Determinar el efecto de la radiación ultravioleta sobre el crecimiento de Bacillus. UN I. CA. CI. Ó. sp productor de celulasas. M. B. OBJETIVOS ESPECIFICOS. CO. Determinar la cinética de muerte de una población de Bacillus sp con luz. A. Y. ultravioleta, a 44 cm de distancia, a los tiempos de 10, 20, 30, 40, 50, y 60. RM. ÁT IC. segundos.. FO. Determinar el tiempo de irradiación con luz ultravioleta, en las condiciones de. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. M. AS. productor de celulasas.. DE. IN. ensayo, para alcanzar el 0,1 % de sobrevivientes de la población de Bacillus sp. 12. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MATERIAL Y MÉTODOS 3. Material. Ó. N. Material Biológico. CA. CI. Cultivo de Bacillus sp FGB-C15, productor de celulasas, aislado de. UN I. bagazo de caña de azúcar (Moreno, 2013), y proporcionados por el. M. laboratorio de Fisiología y Genética Bacteriana de la Universidad. A. Y. CO. Nacional de Trujillo.. ÁT IC. 4. Procedimiento. RM. 4.1. Reactivación, siembra y evaluación de la actividad celulolítica del. IN. FO. cultivo de Bacillus sp.. DE. A partir de las colonias de Bacillus sp conservadas en refrigeración,. M. AS. se realizó una siembra en superficie en agar carboximetilcelulosa 1%. TE. (CMC) (ANEXO 1) y se incubó a 37ºC por 18 horas para obtener. SI S. cultivo joven (ANEXO 2). . Luego a partir del cultivo bacteriano. DI. RE. CC. IO. N. DE. reactivado se preparó una suspensión en solución salina fisiológica estéril (SSFE) equivalente al tubo Nº1 del nefelómetro de Mac Farland y se sembró en agar CMC por puntura 10 ul de suspensión bacteriana, por duplicado (ANEXO 3); las placas se secaron en. estufa por 10 min y se incubó a 37ºC por 24 horas. Luego Se medió los halos de hidrólisis por el método de rojo de Congo (Xu y cols, 2007) (ANEXO 4). 13. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 4.2. Construcción de biorreactores agitados. Se construyeron 02 biorreactores con frascos de vidrio de 10 cm de. CI. Ó. N. alto por 7 cm de diámetro, de 250 mL de capacidad; con 4 “bafles”. CA. de 4 cm de altura, se acondicionó un motor de 6V y un agitador tipo. UN I. Roushton con 9 paletas de plástico, a cada uno (ANEXO 5). Los. CO. M. frascos y agitadores fueron esterilizados haciendo uso de lejía al 2.5. Y. % por 30 minutos y luego serán irradiados con luz ultravioleta de. ÁT IC. A. una lámpara de 300 watt, a una distancia de 30 cm por 60 min.. FO. RM. 4.3. Preparación de inoculo bacteriano. DE. IN. A partir del cultivo reactivado, se recogió varias colonias con un asa. AS. y se realizó una suspensión bacteriana (inóculo) a una turbidez. M. equivalente al tubo 3 de la escala de MacFarland en solución salina. SI S. TE. fisiológica estéril, y se homogenizó manualmente por 30 seg.. DI. RE. CC. IO. N. DE. (ANEXO 6).. 14. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 4.4. Inoculación de los biorreactores y Obtención del cultivo en fase log. CI. Ó. N. A un biorreactor conteniendo 99 ml de caldo CMC al 1 % (g/L:. CA. CMC, 10.0; (NH4)2SO4, 0.50; CaCl2, 0.50; KHPO4, 0.10; KH2PO4,. UN I. 0.10; Peptona, 2.50; Extracto de levadura, 0.25; pH 6.0) (ANEXO. CO. M. 7). , se le agregó 1mL del inóculo bacteriano. A partir de esto se. Y. hizo funcionar el biorreactor en agitación constante de 150 rpm y se Luego, se centrifugó el. ÁT IC. A. incubó a 37°C por 6 h. (ANEXO 8). contenido a 4000 rpm por 15 min.. (ANEXO 9). Finalmente se. RM. realizó dos lavados de la población bacteriana con SSFE y, luego se. FO. preparó una suspensión en buffer fosfato pH 6.0, equivalente a la. AS. DE. IN. concentración del tubo N° 1 del nefelómetro de Mac Farland. SI S. TE. M. 4.5. Irradiación con luz ultravioleta. Se colocó 1.5 ml de esta suspensión en cada placa Petri y se irradió. ultravioleta (florecente marca OSRAM HNS 30W FOR, de luz UVC con longitud de onda de 283 – 200 ) a 44 cm de distancia. También se hizo una siembra de la población inicial, sin irradiar.. DI. RE. CC. IO. N. DE. por 10, 20, 30, 40, 50, y 60 segundos, respectivamente, con luz. 15. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 4.6. Siembra y Recuento de Unidades Formadoras de Colonias (UFC/mL). A cada suspensión bacteriana irradiada, se realizó diluciones seriadas. CI. ,10-6; 20seg.: 10-6, 10-5 ; 30seg.: 10-5, 10-4 ; 40seg.: 10-4, 10-3 ;. CA. 7. Ó. N. en solución salina fisiológica estéril (0seg.: 10-8 ,10-7; 10seg.: 10-. UN I. 50seg.: 10-3, 10-2 ; 60seg.: 10-2, 10-1) y se sembró 1 mL de dilución. CO. M. por el método de incorporación en agar CMC (ANEXO 10), se incubó a 37 ºC por 24 h. Pasado este tiempo, luego se realizaron los. ÁT IC. A. Y. recuentos de las colonias con ayuda de una cámara cuenta colonias y. FO. DE. IN. 4.7. Procesamiento de datos. RM. se expresará en UFC/mL en cada placa sembrada.. AS. Los resultados de los recuentos de la población bacteriana obtenidos. M. en relación al tiempo de exposición con luz ultravioleta fue graficado. TE. haciendo uso del software EXCELL 2010 en escala logarítmica y se. SI S. graficó la curva de muerte experimental y la tendencia que siguió el. exposición en las condiciones del ensayo.. DI. RE. CC. IO. N. DE. efecto de la luz ultravioleta desde los cero seg. hasta los 60 seg. de. 4.8. Determinacion del 0.1%de sobrevivientes A partir de la curva de muerte graficada se determinó el tiempo de irradiación con luz ultravioleta en las condiciones de ensayo para lograr obtener el 0,1 % de sobrevivientes de la población bacteriana. 16. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESULTADOS En la figura N° 01, se registra las poblaciones Bacillus sp (UFC/mL) de. N. sobrevivientes después de ser irradiados con luz ultravioleta a diferentes. CI. Ó. tiempos, en segundos, observando que las poblaciones van disminuyendo a. CA. medida que se aumenta el tiempo de exposición; así mismo, se determinó. UN I. gráficamente que el tiempo de exposición con luz ultravioleta, y en las. CO. M. condiciones de ensayo, para obtener el 0.1% de sobrevivientes fue de 40. ÁT IC. A. Y. segundos.. En la figura N° 02, se observa las colonias de Bacillus sp. en la placa con. RM. Agar CMC que crecieron después de la irradiación con UV a 40 segundos,. FO. caracterizado por presentar colonias tamaño medianas , planas,. DE. IN. blanquecinas, forma irregular, bordes lobulados, dan la apariencia de. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. M. AS. estar secas.. 17. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) DE. IN. FO. RM. ÁT IC. A. Y. CO. M. UN I. CA. CI. Ó. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. Figura N° 01. Curva de supervivencia de la población promedio de Bacillus. M. sp sometido a diferentes tiempos de irradiación con luz. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. ultravioleta, según las condiciones de ensayo.. DI. .. 18. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) TE. M. AS. DE. IN. FO. RM. ÁT IC. A. Y. CO. M. UN I. CA. CI. Ó. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. SI S. Figura N° 02. Colonias de Bacillus sp en placas con agar CMC, después de. DE. 24 horas de incubación, realizado para hacer el recuento en. irradiación con luz ultravioleta... DI. RE. CC. IO. N. placa de las unidades formadoras de colonia después de la. 19. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. II. DISCUSIÓN. Ó. N. Las bacterias del genero Bacillus son aerobias y termofílicas que producen. CA. CI. enzimas celulolíticas con actividad básicamente endo-β-1,4-glucanasa y exo-β-. UN I. 1,4-glucanasa; con la ventaja particular de presentar resistencia a ser inhibidas. M. por la glucosa o celobiosa que es liberada al medio luego de la hidrólisis[2]. Son. CO. atractivas industrialmente por varias razones incluyendo sus altas tasas de. A. Y. crecimiento que permiten tiempos de fermentación cortos, su gran capacidad de. ÁT IC. secreción extracelular de enzimas en presencia de determinados sustratos, esta. RM. capacidad secretoria presenta un potencial para la producción heteróloga de. FO. proteínas[13]. Así mismo, estas bacterias Gram positivas pueden formar una [10]. , que son estructuras. IN. estructura especial resistente llamada endospora. DE. extraordinariamente resistentes a estrés en el ambiente como calor, radiación UV,. SI S. TE. M. AS. desecación y limitación de nutrientes.. Existen microorganismos que degradan la celulosa, hemicelulosa o pectina en la. DE. naturaleza mediante la excreción de diferentes complejos enzimáticos, donde. IO. N. varias enzimas actúan específicamente a nivel enlaces covalentes entre las. CC. unidades de carbohidratos, y esta habilidad para digerir la pared celular de los. DI. RE. vegetales depende de la forma, diversidad y modo de acción de dichas enzimas. En. consecuencia,. se. hace. necesario. mejorar. genéticamente. dichos. microorganismos productores de celulasas; un método es la utilización de luz ultravioleta. 20. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Las bacterias celulolíticas tienen genes que producen las celulasas y puede ser alterada por luz UV, en este trabajo se propuso evaluar el efecto de la radiación ultravioleta sobre el crecimiento de Bacillus sp productor de celulasas, el mismo. CI. Ó. N. que tuvo un efecto bactericida sobre la población irradiada, al observarse que la. CA. población es reducida aproximadamente en un ciclo logarítmico cada 10. Y. CO. M. UN I. segundos.. ÁT IC. A. Los resultados de los recuentos bacterianos (UFC/mL) obtenidos en relación al. RM. tiempo de exposición (0 a 60 segundos) con luz ultravioleta que se presentan en la. FO. tabla N° 03 (Anexo N° 17 ), fueron graficado haciendo uso del software EXCELL. IN. 2010 en escala logarítmica y se construyó la curva de muerte experimental y. DE. corregida de la población de Bacillus sp, el mismo que sirvió para determinar el. AS. tiempo de radiación con luz ultravioleta, en las condiciones de ensayo, para logra. TE. M. obtener el 0,1 % de sobrevivientes, siendo este de 40 segundos, con una alta. DI. RE. CC. IO. N. DE. celulasas.. SI S. probabilidad de haber mutado en los genes que participan en la síntesis de. La luz UV no tiene actividad ionizante pero provoca cambios químicos en las moléculas absorbentes, de modo que aparecen moléculas alteradas denominadas 21. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. genéricamente fotoproductos, los mismos que originan la inactivación de macromoléculas. [22]. . En este sentido, los microorganismos son fisiológicamente. inactivados cuando son sometidos a la acción de la luz UV por el daño. CI. Ó. N. fotoquímico de sus ácidos nucleicos, debido a que la radiación UV es absorbida. CA. por los nucleótidos, bloques constitutivos del ADN y ARN de la célula, según la [34]. UN I. longitud de onda, con los valores más altos cerca de 200 y 260 nm. ; en este. CO. M. caso, el genoma de la población de Bacillus sp, productor de celulasas, absorbe la. Y. luz UV y promueve la formación de enlaces covalentes entre nucleótidos. RM. ÁT IC. A. adyacentes, con lo que se crean moléculas dobles o dímeros.. FO. Si bien la formación de dímeros de tiamina-tiamina son los más comunes,. DE. IN. también suelen ocurrir dímeros de citosina-citosina, citosina-tiamina, y dimerización del uracilo. Tal es así, que la formación de un número suficiente de. M. AS. dímeros dentro de un microbio impide que éste replique su ADN y ARN, lo que. TE. impide su reproducción, que se traduzca en muerte celular como se observa en la. SI S. Figura N° 01, donde la población es reducida en razón al tiempo de exposición.. DE. Muy similar a lo que ocurre cuando E. coli en agua de bebida es irradiado con. IO. N. luz o UV y se forman algunos subproductos que traen como consecuencia la. CC. muerte bacteriana y que esta depende de la longitud de onda de la luz UV que. DI. RE. absorbe el ADN [35]. El tiempo de exposición a la radiación ultravioleta como cualquier otro desinfectante, es vital para asegurar un buen desempeño, pero no es fácil, en la 22. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(40) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. práctica, determinar con exactitud el tiempo de contacto (ya que éste depende del tipo de flujo y de las características del equipo), pero el período debería estar relacionado con la dosificación necesaria, de cualquier modo, las exposiciones. CI. Ó. N. normales son del orden de 10 a 20 segundos. Para un grado determinado de. CA. inactivación de microorganismos, el tiempo requerido de exposición del agua a. UN I. la luz ultravioleta es inversamente proporcional a la intensidad de la luz que. CO. [36]. . En este proyecto se trabajó con la. Y. dispersión de la luz debido a la distancia. M. penetra el agua, teniendo en cuenta la capacidad de absorción del agua y la. ÁT IC. A. población de Bacillus sp que estuvo suspendido en buffer fosfato pH 7.0 y los tiempos fueron incrementándose cada 10 s, de tal manera que la radiación UV. RM. atravesó el líquido y actuó sobre las bacterias en suspensión, al mismo tiempo. FO. que alteró el genoma bacteriano, evidenciándose con la reducción de la. SI S. TE. M. AS. DE. IN. población inicial.. DE. Los cultivos bacterianos aislados de los ambientes naturales producen y excretan. N. una cantidad de enzimas inducibles de acuerdo a su capacidad natural y en [15]. , como es. CC. IO. función de la concentración de los sustratos presentes a su alrededor. RE. el caso de la bacteria Bacillus sp bacteria Gram positiva esporulados utilizado en. DI. el ensayo, pero que estás cantidades excretadas pueden ser sintetizadas en mayor cantidad por modificación de su material genético mediante el uso de agentes mutagénicos, como es el caso de la radiación UV. En este sentido, se ha logrado determinar información importante como es el tiempo de radiación con luz UV 23. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(41) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. para lograr obtener el 0.1% de sobrevivientes de la población inicial, y de esta manera seguir contribuyendo con información científica válida para completar el protocolo de mejoramiento genético de los cultivos bacterianos productores de. UN I. CA. CI. Ó. N. celulasas mediante la radiación ultravioleta. [26]. Cabe destacar que las mutaciones permiten generar una gran biodiversidad. [38]. . Si bien es cierto, las mutaciones tienen su. Y. producen en el ADN microbiano. CO. M. metabólica de los microbios, producto de las variaciones o alteraciones que se. ÁT IC. A. parte positiva, como todo proceso biológico tiene ventajas e inconvenientes. Por. RM. lo tanto, cabe la posibilidad de continuar los trabajos con esta bacteria para. FO. evaluar la capacidad hidrolítica de la celulosa de la población de sobrevivientes. IN. para seleccionar aquellas colonias que tienen la probabilidad de haber mejorado su. M. AS. DE. rendimiento proteico y enzimático.. SI S. TE. En la figura N° 02, se observa las colonias de Bacillus sp que ha sobrevivido después de haber sido sometidos a 40 segundos de irradiación UV que podría. DE. haber sido alterado o modificado a nivel genético respecto a la producción de [36]. , pero que evidencia que metabolizando la Carboximetilcelulasa,. IO. N. celulasas. DI. RE. CC. mantiene sus características metabólicas de la colonia.. 24. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(42) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CONCLUSIÓN. N. La irradiación con luz ultravioleta tuvo un efecto bactericida sobre la. CI. Ó. población de Bacillus sp. productor de celulasas, en las condiciones de. UN I. CA. ensayo.. CO. M. La irradiación con luz ultravioleta de la población de Bacillus sp in vitro. Y. describe una cinética de muerte en relación al tiempo de exposición desde. FO. RM. ÁT IC. A. los10 s. hasta los 60 s.. IN. El tiempo de exposición con radiación ultravioleta para lograr obtener el 0, 1. DE. % de sobrevivientes de la población de Bacillus sp, en las condiciones de. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. M. AS. ensayo, fue de 40 s con una intensidad de luz UV obtenido con lámpara UV. 25. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(43) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. SUGERENCIAS. N. 1. Se sugiere monitorear el efecto de la luz UV sobre el cultivo evaluado. CI. Ó. de Bacillus sp. para verificar si hubo o no modificación a nivel. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI S. TE. M. AS. DE. IN. FO. RM. ÁT IC. A. Y. CO. M. UN I. CA. genético referido a la producción de celulasas.. 26. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(44) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. N. 1. LECTA GROUP. Formación. Fabricación de papel Barcelona: Torraspapel,. UN I. CA. CI. Ó. S.A, 2008.. M. 2. Erikson K, Wood T. Biodegradation of wood cellulose: Biosynthesis and. CO. biodegradation of wood components. Academic Press, New York. 1985: 469-. ÁT IC. A. Y. 503.. RM. 3. Dongowski G, Sembries S, Bauckhage K, Will F, Dietrich H. Degradation of. FO. apple cell wall material by commercial enzyme preparations. Nahrung/Food.. AS. DE. IN. 2002; 46: 105-111.. TE. M. 4. Castellanos J, Sandoval A, Urtiz N. Obtención de variantes hiperactivas e. SI S. inactivas de la endocelulasas cel9 de Myxobacter sp. Acta universitaria ed.. IO. N. DE. Guanajuato, México; Universidad de Guanajuato 2006 :22-26. DI. RE. CC. 5. Ovando S, Waliszewski K. Preparativos de celulasas comerciales y aplicaciones en procesos extractivos. Universidad y Ciencia ed. Veracruz, México; Instituto Tecnológico de Veracruz 2005: 111-120. 27. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(45) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 6. Sener B. Potenciales y Viabilidad del Uso de Bioetanol y Biodiésel para el Transporte en México. 2006 7. Ljungdahl L, Eriksson K. Ecology of microbial cellulose degradation.. CA. CI. Ó. N. Advances in Microbiology and Ecology. 1985; 8: 237-299. A. Y. CO. M. fiber from cornstalks. Polymer. 2005; 46(15):5494-5500. UN I. 8. Reddy N, Yang Y. Structure and properties of high quality natural cellulose. ÁT IC. 9. Mwaikambo L, Ansell M. Chemical modification of hemp, sisal, jute, and. FO. RM. kapok fibers by alkalization. Journal of Applied Polymer Science. 2002;84:12. DE. IN. 10. Erikson K, Wood T. Biodegradation of wood cellulose: Biosynthesis and. AS. biodegradation of wood components. Academic Press, New York. 1985: 469-. SI S. TE. M. 503.. DE. 11. Beguin P, Aubert J. The biological degradation of cellulose. FEMS. CC. IO. N. Microbiology Reviews. 1993; 13: 25-58. cellulases. Research Journal of Microbiology. 2011; 6 (1) 41-53.. DI. RE. 12. Karmakar M, Ray R. Current trends in research and application of microbial. 28. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..