Efecto de nanopartículas de oro sobre la capacidad de regeneración de Dugesia tigrina

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(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. EN CI. AS. BI O. LO. G. IC AS. FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. DE. CI. Efecto de nanopartículas de oro sobre la capacidad de regeneración de Dugesia tigrina. CA. TESIS PARA OPTAR BIÓLOGO. BL. IO. TE. POR EL TÍTULO DE:. BI. AUTOR: Br. MELANIE ALESSANDRA ARANA PAREDES ASESOR: Mg. JUAN CARLOS RODRÍGUEZ SOTO TRUJILLO – PERÚ 2018 i. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. EN CI. AS. RECTOR. BI O. Dr. Orlando Gonzáles Nieves. LO. G. IC AS. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. Dr. Rubén Vera Véliz. Dr. Weyder Portocarrero Cárdenas VICE-RECTOR DE INVESTIGACIÓN. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI. VICE-RECTOR ACADÉMICO. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. EN CI. AS. BI O. DECANO. G. Dr. Freddy Roger Mejia Coico. LO. ______________________________. IC AS. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. ______________________________ Dr. William Elmer Zelada Estraver. ______________________________ Dr. Freddy Peláez Peláez. IO. TE. CA. DE. CI. SECRETARIO. BI. BL. DIRECTOR DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC AS. PRESENTACIÓN. Señores miembros del Jurado. G. En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el régimen de Grados y Títulos de la. LO. Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo a vuestra. BI O. consideración y elevado criterio el presente informe de tesis titulado:. Efecto de nanopartículas de oro sobre la capacidad de regeneración de Dugesia tigrina.. DE. CI. Trujillo, 04 de diciembre del año 2018. EN CI. AS. Con el cual pretendo obtener el Título Profesional de Biólogo.. CA. _______________________________. BI. BL. IO. TE. Br. Melanie Alessandra Arana Paredes. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC AS. DEL ASESOR. El que suscribe, profesor asesor de la presente tesis para optar por el Título Profesional de. G. Biólogo, certifica que ha sido desarrollada de conformidad con los objetivos propuestos y que el. LO. informe ha sido revisado y acoge las observaciones y sugerencias alcanzadas.. BI O. Por lo tanto autorizo a la Br. Melanie Alessandra Arana Paredes a continuar con los trámites. CI. EN CI. AS. correspondientes.. DE. _______________________________. BI. BL. IO. TE. CA. Mg. Juan Carlos Rodríguez Soto. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC AS. MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR. EN CI. AS. BI O. PRESIDENTE. LO. Dr. Miguel Jaime Chamochumbi. G. ________________________. _____________________________. CI. MsC. Abhel Arthur Calderon Peña. _______________________________ Mg. Juan Carlos Rodríguez Soto VOCAL. BI. BL. IO. TE. CA. DE. SECRETARIO. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEDICATORIA. IC AS. La presente tesis se la dedico a mi padre, Jaime, aunque la distancia física nos separa, sigue inspirándome con la impresionante sabiduría y ejemplo en el que fue, a mi parecer, muy poco. LO. G. tiempo que la vida nos permitió estar juntos.. A mi madre, Gladys, por ayudarme a mejorar en el día a día y enseñarme el verdadero. BI O. significado de la perseverancia, el respeto y el compromiso, porque sin su dedicación no estaría. AS. aquí ahora.. A mis hermanas, Dayana y Paola por su constante cariño y apoyo en cada paso del camino, a. EN CI. pesar de la distancia que muchas veces estuvo entre nosotras.. A mi hermana, Karina, por sus acertados consejos, en todas las nuevas experiencias, y las. CI. sonrisas que logra inspirar en el día a día.. DE. A mi sobrina, Danna, por todos los buenos recuerdos y su refrescante forma de ver la vida.. BI. BL. IO. TE. CA. Y a todas las personas que hicieron posible esta tesis.. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC AS. AGRADECIMIENTOS. Expreso mi más profundo agradecimiento a mi asesor de tesis, Mg. Juan Carlos Rodríguez Soto,. BI O. LO. G. por guiarme en la elaboración de esta tesis con toda dedicación y visión profesional.. Al profesor Dr. Claver Wilder Aldama Reyna, director del Laboratorio de Óptica y Láseres de la. AS. Universidad Nacional de Trujillo, por el apoyo brindado en la ejecución de la presente. EN CI. investigación.. CI. A la Universidad Nacional de Trujillo por el financiamiento para la síntesis de nanopartículas de. DE. oro mediante el proyecto PIC N°11-2014 III Convocatoria de Proyectos de Investigación. BI. BL. IO. TE. CA. Científica financiados con recursos de Canon Minero.. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ÍNDICE. IC AS. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO.................................................. ii AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ................................................... iii PRESENTACIÓN........................................................................................................................................ iv DEL ASESOR .............................................................................................................................................. v. G. MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR ...................................................................................... vi. LO. DEDICATORIA ......................................................................................................................................... vii AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................................. viii. BI O. ÍNDICE ........................................................................................................................................................ ix LISTA DE TABLAS Y FIGURAS .............................................................................................................. x. AS. RESUMEN ................................................................................................................................................. xii ABSTRACT............................................................................................................................................... xiii. EN CI. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................................ 1 MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................................................... 9 Obtención y crianza del material biológico .................................................................................. 9. 2.1.1.. Obtención de Dugesia tigrina ............................................................................................... 9. CI. 2.1.. 2.1.2 Determinación de la especie Dugesia tigrina .............................................................................. 9 Crianza de Dugesia tigrina ................................................................................................. 10. DE. 2.1.3.. Obtención de nanopartículas de oro ............................................................................................ 10. 2.3.. Caracterización de nanopartículas de oro (NPsAu) .................................................................... 10. 2.4.. Diseño Experimental ................................................................................................................... 11. 2.5.. Aplicación de los Tratamientos................................................................................................... 12. 2.6.. Manejo estadístico de los datos ................................................................................................... 12. TE. CA. 2.2.. IO. RESULTADOS........................................................................................................................................... 15 DISCUSIÓN ............................................................................................................................................... 25. BL. CONCLUSIONES ...................................................................................................................................... 35. BI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................................ 36 ANEXOS .................................................................................................................................................... 42. ix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. LISTA DE TABLAS Y FIGURAS. IC AS. Fig. 1. Esquema del diseño experimental en bloques completamente aleatorio. Donde los bloques I, II, III, IV, V, VI y VII, están constituidos por los tipos de. fragmentos superior, inferior, izquierdo, derecho, cefálico, medio y caudal,. NPsAu),. T2. (0.45. ppm. NPsAu). y. T3. LO. T1 (0.9ppm. G. respectivamente. Así también se observan los tratamientos To (0 ppm NPsAu), (0.225. ppm. BI O. NPsAu)……………………………………………………….………..............12. AS. Fig. 2. Tipos de cortes realizados a los especímenes de Dugesia tigrina, originando siete tipos. de. EN CI. fragmentos.………………………………………………………………………13 Tabla 1. Tiempo promedio en horas de formación del blastema a partir de fragmentos. CI. de Dugesia tigrina enfrentados a diferentes concentraciones de nanopartículas de. DE. oro. CA. (NPsAu)…………………………………………………………………………..14. TE. Tabla 2. Tiempo promedio en horas de formación total del individuo a partir de fragmentos de Dugesia tigrina enfrentados a diferentes concentraciones de. BL. IO. nanopartículas de oro (NPsAu). ………………………………………………....15. Tabla 3. Análisis de varianza para el tiempo de formación del blastema a partir de. BI. diversos fragmentos de Dugesia tigrina enfrentados a diferentes concentraciones. de. nanopartículas. de. oro. (NPsAu).. …………………………………………………………………………...……….16. x Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla 4. Análisis de varianza para el tiempo de formación total del individuo a partir de diversos fragmentos de Dugesia tigrina enfrentados a diferentes concentraciones nanopartículas. de. oro. (NPsAu).. IC AS. de. ……………………………………………………………………………………16. G. Tabla 5. Comparación de medias para el tiempo de formación del blastema a partir de. LO. diversos fragmentos de Dugesia tigrina enfrentados a diferentes concentraciones. BI O. de nanopartículas de oro (NPsAu). ………………………………………….......17. AS. Tabla 6. Comparación de medias para el tiempo de formación de individuo a partir de diversos fragmentos de Dugesia tigrina enfrentados a diferentes concentraciones. EN CI. de nanopartículas de oro (NPsAu). ………………………………………….......18 Figura 3. Tiempo en horas de formación del blastema a partir de fragmentos de. CI. Dugesia tigrina enfrentados a diferentes concentraciones de nanopartículas de oro. DE. (NPsAu)..…………………………………………………………………………19 Figura 4. Tiempo en horas de formación total del individuo a partir de fragmentos de. CA. Dugesia tigrina enfrentados a diferentes concentraciones de nanopartículas de oro. 5.. Regeneración. de. Dugesia. tigrina.. IO. Figura. TE. (NPsAu). …………………………………………………………………………20. BI. BL. ……………………………………………………………………………….………..21. xi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC AS. RESUMEN. La presente investigación determinó el efecto de cuatro concentraciones de nanopartículas de oro. G. (0 ppm, 0.225 ppm, 0.450 ppm y 0.900 ppm) sobre la capacidad de regeneración de Dugesia. LO. tigrina, para esto, se realizaron cortes de tipo transversal, longitudinal y doble transversal que. BI O. dieron origen a los fragmentos de la parte superior e inferior, fragmentos izquierdo y derecho, y fragmentos cefálico, medio y caudal, respectivamente. Estos cortes fueron expuestos a los. AS. tratamientos consistentes en las distintas concentraciones de NPsAu, se midieron los tiempos de. EN CI. formación visible de blastema y de formación total de individuo. Al realizar las lecturas en el microscopio óptico se observó que el tratamiento 3 (0.9 ppm NPsAu) promovió el menor tiempo de formación visible de blastema con 49.37 horas, y, en cuanto a la formación total del individuo,. CI. el tratamiento blanco (0 ppm NPsAu) presentó el menor tiempo con 179.43 horas. Por otro lado,. DE. el fragmento cefálico regeneró más rápido en tiempo de formación de blastema con 57.90 horas y el fragmento superior al que se aplicó el tratamiento 3, obteniendo individuos completos a las. CA. 145,2 horas. Así mismo, se observó una tasa de mortalidad de hasta 60% alcanzada por los. TE. fragmentos izquierdo, derecho, cefálico y medio, luego de haber alcanzado la formación de. IO. blastema, por lo que se puede afirmar que incluso las nanopartículas no citotóxicas pueden. BL. causar efectos negativos en las células. Finalmente, el análisis de varianza realizado a los. BI. resultados obtenidos indicó diferencias significativas tanto entre los bloques como entre los tratamientos. Palabras clave: Regeneración, blastema, Dugesia tigrina, nanopartículas de oro.. xii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ABSTRACT. IC AS. The present investigation determined the effect of four concentrations of gold nanoparticles (0 ppm, 0.225 ppm, 0.450 ppm and 0.900 ppm) on the regeneration capacity of. G. Dugesia tigrina, for this, transversal, longitudinal and double transversal cuts were made and. LO. gave rise to the upper and lower part, left and right fragments, and cephalic, middle and caudal. BI O. fragments, respectively. These cuts were exposed to the treatments consisting of the different concentrations of AuNPs, the times of visible blastema formation and total formation of the. AS. individual were measured. When performing the readings in the optical microscope it was. EN CI. observed that treatment 3 (0.9 ppm NPs-Au) promoted the lowest visible blastema formation time with 49.37 hours, and, regarding the total formation of the individual, the target treatment (0 ppm) NPs-Au) presented the lowest total training time of the individual with 179.43 hours. On. CI. the other hand, the cephalic fragment regenerated faster in blastema formation time with 57.90. DE. hours and the upper fragment on which the Treatment 3 was applied developed complete individuals on 145,2 hours. Likewise, it was observed that a mortality rate of up to 60% reached. CA. by the left, right, cephalic and middle fragments, after having reached blastema formation,. TE. therefore, even the non-citotoxical nanoparticles can cause negative effects on cells. Finally, the. IO. analysis of variance performed on the results revealed estatistically signifficant diferences. BL. between the treatments and between the blocks used. Regeneration,. blastema,. Dugesia. tigrina,. gold. nanoparticles.. BI. Keywords:. xiii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INTRODUCCIÓN. IC AS. La nanotecnología es un campo científico que se concentra en el estudio de materiales a una escala de 10-9 m, a dichas partículas se les denomina nanopartículas. G. (NPs), y su empleo se da en áreas como la biotecnología, ciencias materiales,. LO. informática, desarrollo de medicinas e ingeniería. Las NPs atrajeron la atención de. BI O. numerosos investigadores, debido a que presentan propiedades físicas y químicas distintas a sus versiones en macromoléculas (Minakshi et al., 2011; Khan et al.,. AS. 2014).. EN CI. Frecuentemente se clasifica a las nanopartículas por el material del que están constituidas y el tamaño que presentan, pues se ha observado que las propiedades. CI. físico químicas que presentan están directamente relacionadas con estas. DE. características (Belyakova & Slovokhotov, 2003). Nogi et al. (2012) describieron las características físicas de los distintos tipos de nanopartículas y clasificaron a las. CA. mismas según estas cualidades, donde se encuentran la longitud de onda que emiten,. TE. el tipo de poro que presentan, su radio atómico y los tipos de materiales que las. IO. constituyen que pueden ser metálicos, inorgánicos, orgánicos, biofarmacéuticos y de. BI. BL. aerosol; así mismo la forma y el tamaño.. En los últimos años, muchas investigaciones se han encaminado hacia el. control de la forma y el tamaño de nanopartículas metálicas debido a que. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. influencian directamente las propiedades magnéticas, catalíticas, eléctricas y ópticas. IC AS. de las mismas (Khlebtsov & Dykman, 2010).. Entre las nanopartículas metálicas, las nanopartículas de oro (NPsAu), o. G. también denominadas coloides de oro resaltan por las marcadas diferencias de sus. LO. versiones de mayor escala a primera vista, por ser una solución color rojo vinosa y por tener propiedades antioxidantes. Estas partículas presentan tamaños variables. suboctaédricas,. octaédricas,. decaédricas,. icosaédricas,. múltiples. AS. esféricas,. BI O. que van desde 1 nm hasta 8 μm. También se presentan en distintas formas, ya sean. enredadas, forma irregular, tetraédricas, nanotriangulares, nanoprismas, planchas. EN CI. hexagonales y nanorods (Minakshi et al., 2011; Ganeshkumar et al., 2012).. CI. Las nanopartículas de oro se pueden obtener mediante distintos métodos, ya. DE. sean químicos, físicos o biológicos. Los métodos químicos, incluyen el método de obtención a partir de un quitosano tiolado insoluble (Rezende et al., 2010), el. CA. método de crecimiento de siembra a partir de glicol polietileno, el método por. TE. reducción en glicol etileno con NaOH como agente reductor mediado con temperatura, el método del surfactante asistido usando el ligando bifuncional. IO. Bromuro de Hexadecilo Trimetil Amonio (CTAB, en inglés), entre otros más.. BL. Dentro de los métodos físicos se incluye al método con irradiación γ para sintetizar. BI. NPsAu de tamaño controlable y alta pureza, a la irradiación con microondas, así como también se incluye la tecnología de ablación láser, un método que ha tomado gran importancia en los últimos años (Khan et al., 2014).. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. La ablación láser es un método físico de extracción de nanopartículas, que mediante la ayuda de un rayo láser infringe en una placa de material de alta pureza. IC AS. para obtener partículas a nanoescala, se conoce que también se pueden reconfigurar, fragmentar o combinar tipos de nanopartículas. En cuanto a nanopartículas de oro,. G. se conoce que se pueden obtener formas esféricas de hasta 3.6 nm (Wender et al.,. LO. 2011). Este método ha permitido múltiples aplicaciones de este tipo de. BI O. nanomateriales en distintas áreas de las ciencias de la salud incluyéndose. AS. investigaciones en las cuales se aplicaron en distintos tipos de células.. Las investigaciones más resaltantes sobre NPsAu aplicados a distintos tipos. EN CI. de células y moléculas revelan diferentes propiedades. Chithrani & Chan (2007) obtuvieron resultados beneficiosos para la facilitación de la endocitosis de proteínas. CI. como la transferrina, a la que se adicionó NPsAu, en células HeLa. Ello indica que. DE. las nanopartículas de oro (NPsAu) mantienen una alta receptividad en las membranas celulares. Por otro lado, Thaxton et al. (2009), probaron la síntesis de. CA. lipoproteínas de alta densidad adheridas a nanopartículas de oro (HDL-NPsAu),. TE. donde se observó la estrecha relación que tienen con las HDL-NPsAu, lo que. BL. IO. demuestra que no desnaturalizan a las estructuras a las cuales se adhieren.. Khan et al. (2014) y Van Rijt & Habibovic (2017) han mostrado la. BI. capacidad de detección de variados iones metálicos, pues tienen rol clave en la síntesis de biosensores, la aplicación mediada de medicamentos específicos, obtención de bioimágenes de células cancerosas y aplicaciones para estimular la regeneración celular. Siendo este último un punto de interés permanente, pues la 3. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. sociedad científica busca metodologías que promuevan una mejor regeneración en cuanto a medidas en tiempo. De esta manera, se hace necesario el diseño de. IC AS. diferentes compuestos en sistemas biológicos para comprobar dicha capacidad. G. (Angulo, 2017; Herrera, 2018).. LO. En el mundo animal, existen diversas especies que muestran una habilidad. BI O. para reemplazar partes de su cuerpo o tejidos perdidos, denominada regeneración, esto ha atraído la atención de numerosos estudios y trabajos. Existen distintos. AS. organismos modelos de regeneración, entre estos se incluyen a las hidras y a las. EN CI. planarias (Pechenik, 2016).. Las planarias, animales pertenecientes a la clase Turbellaria, se caracterizan. CI. por ser organismos de vida libre, ser acelomados triploblásticos y poseer simetría. DE. bilateral. Probablemente los más primitivos con simetría bilateral y en haber desarrollado un verdadero mesodermo. Estos animales habitan tanto en ambientes. CA. acuáticos marinos como dulceacuícolas. Especies del género Dugesia, que son de. TE. agua dulce, son un constante objetivo de estudios científicos para medir la. BL. IO. regeneración (Pechenik, 2016; Urrutia, 2015).. La reproducción en planarias se ve facilitada gracias a su condición. BI. hermafrodita simultánea, es decir, cada individuo puede actuar como macho y hembra a la vez, esto le permite poder reproducirse con cualquier individuo de su misma especie, aunque se ha observado que muchos de estos organismos pueden reproducirse de forma asexual por fragmentación (Pechenik, 2016). 4. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. El género Dugesia se dio a conocer desde 1766 cuando Peter Simon Pallas. IC AS. realizó un ensayo sobre la disección de una planaria, que fue capaz de regenerar a partir de su cabeza a un organismo completo, y desde esa época se ha continuado. G. realizando numerosos estudios de estos invertebrados, situándolos como uno de los. LO. principales modelos biológicos de regeneración (Newmark & Sánchez-Alvarado,. BI O. 2000; Allen et al., 2016). Actualmente se estudia los mecanismos que influyen en la señalización de la herida previa a regionalización, donde células madres totipotentes. AS. conocidas como neoblastos, presentes en etapa adulta, promueven la regeneración. EN CI. del fragmento injuriado (Reddien & Sánchez-Alvarado, 2004).. Los neoblastos son considerados los únicos tipos de células somáticas que se. CI. reproducen mitóticamente en planarias adultas (Reddien & Sánchez-Alvarado,. DE. 2004), estos se encuentran comúnmente en el parénquima. Cuando se produce algún tipo de injuria, los neoblastos inician su proliferación, luego migran a la zona. CA. afectada y generan lo que se conoce como blastema; a partir de la formación de este,. TE. se da la diferenciación celular y una serie de cambios en el tejido a reemplazar para generar nuevas estructuras de un nuevo animal con las propiedades necesarias. BI. BL. IO. (Reddien et al., 2005).. El primer estudio de la regeneración en invertebrados fue realizado por. Morgan (1898), donde expone dos tipos de regeneración, la epimorfosis y la morfolaxis. El primer término refiere a la formación del blastema, a partir del cual se generará un tejido adulto; al observar una planaria en regeneración bajo 5. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. microscopio puede notarse que el blastema se caracteriza por ser un tejido no pigmentado cuya formación tiene origen bajo el tejido injuriado. En contraste, el. IC AS. segundo término, la morfolaxis, refiere al tipo de regeneración que tiene como característica principal la formación de un individuo completo a partir de un. G. fragmento de dicho organismo y en el cual debe darse una reorganización a nivel. BI O. LO. celular.. Sin embargo, el modelo propuesto por Morgan (1898) ha sido rebatido. AS. numerosas veces, pues no se toma en cuenta que la formación del blastema y la regeneración completa del individuo pueden suceder a la vez o que estos eventos. EN CI. estén directamente relacionados. Por esto, numerosos autores, han tratado de. CI. tipificar la regeneración que ocurre en las planarias.. DE. Agata et al. (2003), propusieron un modelo de regeneración llamado “regeneración intercalar”, en el cual describen a los blastemas formados por las. CA. regiones anteriores y posteriores como centros de señalización para dirigir una. TE. reorganización de tejidos de tipo intercalar, así como de información posicional. Distintos autores como Kato et al. (1999) y Saito et al. (2003) respaldan este. IO. modelo debido a que toma en cuenta que existe información posicional, por la cual. BL. la regeneración es gradual y, la forma del individuo y órganos no es afectada al. BI. terminar el proceso regenerativo (Agata et al., 2007).. A nivel molecular, la regeneración de la mayoría de los animales acelomados, desde hidras hasta humanos, sigue una vía de señalización que es 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. activada por los ligandos Wnt, de los cuales se han descrito aproximadamente 13 familias (Willert & Nusse, 2012). Esta vía puede ser o no dependiente del factor de. IC AS. transcripción βcatenina, denominada canónica o no canónica (Gómez, 2017). Para el caso de las planarias, la vía de señalización Wnt es de tipo canónica, y se hacen. LO. G. presentes dos tipos de ligandos Wnt (Chai et al., 2010).. BI O. Sánchez-Alvarado (2006) esclareció otra parte del mecanismo en que las planarias recuperan las partes perdidas de su cuerpo y originan un nuevo organismo.. AS. Al realizar un corte horizontal en una planaria, esta origina una cabeza a partir de la región posterior y una porción caudal de la región anterior, esto sugiere que estos. EN CI. organismos tienen una capacidad regenerativa de tipo bidireccional.. CI. En los últimos años han resaltado los estudios en especies animales que son. DE. modelos de regeneración en exposición a distintos compuestos que tienen propiedades cicatrizantes como los extractos de plantas, compuestos orgánicos. CA. aislados o macronutrientes. Dado que las NPsAu ya son empleadas desde hace. TE. algunos años para acelerar el proceso de cicatrización en caso de heridas graves en personas (Van Rijt & Habibovic, 2017), es de suma importancia evaluar y medir su. IO. efecto en los procesos de regeneración natural para obtener una dosis estandarizada. BL. para su uso en tratamientos médicos orientados a la aceleración en los procesos de. BI. cicatrización. La presente investigación pretende dar a conocer el efecto que tienen las. nanopartículas de oro sobre la regeneración de Dugesia tigrina, determinar la concentración de NPsAu más adecuada para obtener una mayor capacidad 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. regenerativa y el tipo de fragmento que regenera más rápido en el tiempo y frente a. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI. EN CI. AS. BI O. LO. G. IC AS. las diferentes concentraciones.. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MATERIALES Y MÉTODOS. IC AS. 2.1. Obtención y crianza del material biológico 2.1.1. Obtención de Dugesia tigrina. LO. G. Se obtuvieron ejemplares de Dugesia tigrina en la zona de Conache, distrito de Laredo, Provincia de Trujillo, con coordenadas 08°06.477” S. BI O. 078°56.339” W. Al momento de la captura, se utilizaron fragmentos frescos de hígado de pollo que se expusieron por periodos de 5 minutos,. AS. dando oportunidad para que las planarias se pudieran adherir. Se. EN CI. colectaron tanto los especímenes como plantas de su hábitat en envases de 4 litros de capacidad. Se seleccionaron ejemplares libres de. CI. laceraciones visibles y en etapa adulta. Finalmente, los ejemplares se trasladaron al Laboratorio de Zoología de la Facultad de Ciencias. DE. Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo para su respectiva. CA. determinación taxonómica.. BI. BL. IO. TE. 2.1.2 Determinación de la especie Dugesia tigrina. Los ejemplares obtenidos fueron determinados como la especie. Dugesia tigrina, con la ayuda de claves taxonómicas y registros en bases de datos internacionales tanto del género como la especie. Dicha identificación se llevó a cabo en el Laboratorio de Zoología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo.. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.1.3. Crianza de Dugesia tigrina Los ejemplares de D. tigrina se colocaron en peceras de 30 cm x18. IC AS. cm x 25cm, con aireación de 2 horas por día, utilizando agua. declorinada y como alimento hígado de pollo fresco, expuesto durante. G. 45 minutos, cada 24 horas; el cambio de agua declorinada se realizó. BI O. 2.2. Obtención de nanopartículas de oro. LO. cada 2 días.. AS. En el laboratorio de Óptica y Láseres de la Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas de la Universidad Nacional de Trujillo, con la ayuda del láser Nd:. EN CI. YAG de marca “Q-Smart450” (1064 nm) se irradió a una placa de oro de alta pureza con radiación infrarroja de 36,6 milijoule/pulso con la técnica de. CI. Ablación Láser Pulsada en Medio Líquido teniendo como medio agua bidestilada. DE. en un beaker con capacidad de 10 ml ubicado sobre una placa giratoria durante 10 minutos, evitando de esta forma la ablación de un área restringida (Aldama et. CA. al., 2016). Este proceso se repitió 10 veces, para obtener un volumen total de 100. TE. ml, de una solución rojo de vinosa de nanopartículas de oro (NPsAu). Se. IO. sintetizó una solución saturada, que luego de caracterizada, fue utilizada para. BL. obtener las tres concentraciones de nanopartículas de oro, 0.9 ppm, 0.45 ppm y. BI. 0.225 ppm que constituyeron los tratamientos T3, T2 y T1 respectivamente.. 2.3. Caracterización de nanopartículas de oro (NPsAu). 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. La caracterización de nanopartículas de oro (NPsAu) obtenidas por ablación láser en el laboratorio de Óptica y Láseres de la Facultad de Ciencias Físicas y. IC AS. Matemáticas de la Universidad Nacional de Trujillo, se realizó por el personal del laboratorio siguiendo un protocolo de caracterización de nanopartículas, con. G. lo cual se determinó el tamaño, la forma y la concentración de las NPsAu. Este. LO. último parámetro se calculó por medio de diferencia de masas, teniendo en cuenta el peso inicial de la placa de oro de alta pureza que fue irradiada con el. BI O. láser Nd: YAG 1064 “Q-Smart450”, teniendo como resultado una concentración. AS. de 9,0 μg/100 mL, equivalentes a 0.9 ppm NPsAu (T3). La forma de las nanopartículas obtenidas por este método fueron esféricas, con un diámetro. EN CI. aproximado de 22 nm; estos datos fueron obtenidos por espectroscopía de. DE. 2.4. Diseño Experimental. CI. absorción atómica (Rivera et al., 2016).. CA. El diseño experimental utilizado fue un Diseño Experimental en Bloques Completamente Aleatorio (DEBCA) (Fig. 1), donde la población total de la. TE. muestra estuvo constituida por 280 fragmentos de D. tigrina, en proporciones. IO. semejantes, el tipo de corte que se realizó a los individuos determinó los. BL. bloques. Se realizó cortes de tipo transversal, longitudinal y doble transversal. BI. que dieron origen a los fragmentos de la parte superior e inferior, fragmento izquierdo y derecho, y fragmentos cefálico, medio y caudal, respectivamente (Fig. 2).. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.5. Aplicación de los Tratamientos Los tratamientos se aplicaron a cada unidad experimental durante 10. IC AS. minutos, tiempo definido previamente en una evaluación piloto, en la cual los individuos completos fueron colocados por 30 minutos. Los tratamientos. G. fueron las diferentes concentraciones de NPsAu, teniendo un tratamiento. LO. control (T0: 0ppm) y tres concentraciones de NPsAu (T3: 0.9 ppm, T2: 0.45. BI O. ppm y T1: 0.225 ppm).. 2.6. Manejo estadístico de los datos. AS. Los datos obtenidos de la evaluación de las variables estadísticas, tiempo. EN CI. de formación del blastema y el tiempo de formación completa del individuo, fueron colocados en tablas y figuras, obteniéndose estimadores de tendencia. CI. central y los de dispersión, así como análisis de varianza y test de comparación de medias, utilizando la versión de prueba del paquete estadístico. BI. BL. IO. TE. CA. DE. Statgraphics Plus Versión 18.0.. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) DE. CI. EN. CI. AS. BI. O. LO. G IC AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Fig. 1. Esquema del diseño experimental en bloques completamente aleatorio. Donde los bloques I, II, III, IV, V, VI y VII, están constituidos. CA. por los tipos de fragmentos superior, inferior, izquierdo, derecho, cefálico, medio y caudal, respectivamente. Los tratamientos lo constituyen las diferentes concentraciones de NpsAu, T0 (0 ppm NPsAu), T1 (0.225 ppm NPsAu), T2 (0.45 ppm NPsAu) y T3 (0.9ppm. BI. BL IO. TE. NPsAu).. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) EN CI. AS. BI O. LO. G. IC AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI. Fig. 2. Tipos de cortes realizados a los especímenes de Dugesia tigrina. (1) Fragmento superior, (2) fragmento inferior, (3) fragmento izquierdo, (4) fragmento derecho, (5) fragmento cefálico, (6) fragmento medio, (7) fragmento caudal.. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESULTADOS. En la presente investigación, se determinó la capacidad de regeneración de. IC AS. Dugesia tigrina expuesta a distintas concentraciones de nanopartículas de oro (NPsAu), que conformaron los tratamientos (T0: 0 ppm NPsAu, T1: 0.225 ppm. G. NPsAu, T2: 0.450ppm NPsAu y T3: 0.900 ppm NPsAu), obteniéndose los. BI O. LO. siguientes resultados.. En la Tabla 1 se observan los tiempos promedio en horas de la formación del. AS. blastema a partir de diferentes fragmentos de Dugesia tigrina enfrentados a cuatro. EN CI. concentraciones de nanopartículas de oro.. En la Tabla 2 se observan los tiempos promedio en horas de la. CI. formación del blastema a partir de diferentes fragmentos de Dugesia tigrina. CA. DE. enfrentados a cuatro concentraciones de nanopartículas de oro.. En la Tabla 3 se observa el análisis de varianza aplicado para el. TE. tiempo de formación del blastema a partir de diferentes fragmentos de. IO. Dugesia tigrina enfrentados a cuatro concentraciones de nanopartículas de. BI. BL. oro.. En la Tabla 4 se observa el análisis de varianza para el tiempo de formación total del individuo a partir de diferentes fragmentos de Dugesia tigrina enfrentados a cuatro concentraciones de nanopartículas de oro. 15. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. En la Tabla 5 se observa Comparación de medias para el tiempo de. enfrentados a cuatro concentraciones de nanopartículas de oro.. IC AS. formación del blastema a partir de diferentes fragmentos de Dugesia tigrina. LO. G. En la Tabla 6 se observa la comparación de medias para el tiempo de formación total de individuo a partir de diferentes fragmentos de Dugesia tigrina. BI O. enfrentados a cuatro concentraciones de nanopartículas de oro.. AS. En la figura 3 se muestra el Tiempo en horas de formación del blastema. EN CI. a partir de diferentes fragmentos de Dugesia tigrina enfrentados a cuatro concentraciones de nanopartículas de oro y la conformación de los grupos. CI. homogéneos para cada bloque.. DE. En la figura 4 se muestra Tiempo en horas de formación total del individuo a partir de diferentes fragmentos de Dugesia tigrina enfrentados a. CA. cuatro concentraciones de nanopartículas de oro y la conformación de los. TE. grupos homogéneos para cada bloque.. IO. En la figura 5 se muestran las distintas etapas de la regeneración de. BI. BL. Dugesia tigrina.. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla 1. Tiempo promedio en horas de la formación del blastema a partir de. B \ Tx. T0. T1. T2. T3. I. 83.8. 52.8. 52.8. 50.4. G. concentraciones de nanopartículas de oro.. IC AS. diferentes fragmentos de Dugesia tigrina enfrentados a cuatro. PROM. II. 88.8. 52.8. 49.8. 49.2. 60.15. III. 86.0. 55.2. 52.8. IV. 85.2. 55.2. 52.8. V. 88.8. 50.4. VI. 95.4. VII. 90.4. PROM. 88.34. AS. BI O. LO. 59.95. EN CI. 48.0. 54.0. 62.00. 54.0. 61.80. 44.4. 57.90. 51.6. 50.4. 62.25. 55.2. 52.8. 43.2. 60.40. 53.31. 51.51. 49.37. CI. 51.6. DE. Fuente: Tablas de datos obtenidos de los ensayos en laboratorio (Anexos 9, 10, 11 y 12). NPsAu.. CA. Leyenda: TRATAMIENTOS: Concentraciones de nanopartículas de oro (NPs-Au) T0: 0 ppm NPsAu, T1: 0.225 ppm NPsAu, T2: 0.450 ppm NPsAu, T3: 0.900ppm. BI. BL. IO. TE. BLOQUES: I: Fragmento superior II: Fragmento inferior III: Fragmento izquierdo IV: Fragmento derecho V: Fragmento cefálico VI: Fragmento medio VII: Fragmento caudal. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla 2. Tiempo promedio en horas de la formación total del individuo a partir. T0. T1. T2. T3. I. 177.0. 200.4. 198.0. 145.2. II. 177.0. 201.6. 199.2. 148.0. III. 181.0. 201.6. 200.4. 198.0. IV. 181.0. 201.6. 200.4. V. 179.0. 190.8. 188.4. VI. 182.0. 184.8. VII. 179.0. 183.6. PROM. 179.43. 194.9. PROM 180.15 181.45. BI O. LO. B \ Tx. G. concentraciones de nanopartículas de oro.. IC AS. de diferentes fragmentos de Dugesia tigrina enfrentados a cuatro. 195.25 195.25. 180.0. 184.55. 198.0. 187.40. 183.6. 196.8. 185.75. 193.5. 180.6. AS. 198.0. CI. EN CI. 184.8. DE. Fuente: Tablas de datos obtenidos de los ensayos en laboratorio (Anexos 13, 14, 15 y 16). CA. Leyenda: TRATAMIENTOS: Concentraciones de nanopartículas de oro (NPs-Au) T0: 0 ppm NPsAu, T1: 0.225 ppm NPsAu, T2: 0.450 ppm NPsAu, T3: 0.900 ppm. NPsAu. BI. BL. IO. TE. BLOQUES: I: Fragmento superior II: Fragmento inferior III: Fragmento izquierdo IV: Fragmento derecho V: Fragmento cefálico VI: Fragmento medio VII: Fragmento caudal. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla 3. Análisis de varianza para el tiempo de formación del blastema a partir de fragmentos. de. Dugesia. tigrina. enfrentados. concentraciones de nanopartículas de oro.. Cuadrado. Valor-P. Entre Tratamientos. 72196.2. 3. 24065.4. 736.03. 0.0000. Entre Bloques. 562.743. 6. 93.7905. 2.87. 0.0100. Error Experimental. 8827.94. 270. 81586.8. 279. LO. 32.6961. p ≤ 0,05. EN CI. (CORREGIDO). Razón-F. BI O. TOTAL. Medio. AS. Cuadrados. Gl. cuatro. G. Suma de. Fuente de variación. a. IC AS. diferentes. CI. Tabla 4. Análisis de varianza para el tiempo de formación total del individuo a partir de diferentes fragmentos de Dugesia tigrina enfrentados a cuatro. Suma de. CA. Fuente de. DE. concentraciones de nanopartículas de oro.. Gl. Razón-F. Valor-P. 6337.94. 44.94. 0.0000. 6. 1195.51. 8.48. 0.0000. 35537.7. 252. 141.022. 62449.2. 261. Cuadrados. Entre Tratamientos. 19013.8. 3. Entre Bloques. 7173.05. Error Experimental. IO. TE. variación. BL. TOTAL. Medio. p ≤ 0,05. BI. (CORREGIDO). Cuadrado. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla 5. Comparación de medias para el tiempo de formación del blastema a partir de diferentes fragmentos de Dugesia tigrina enfrentados a cuatro. 3 2 1 0 3 2 1 0 2 3 1 0 2 3 1 0 3 2 1 0 3 2 1 0 3 2 1 0. 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10. 50.4 52.8 52.8 83.8 49.2 49.8 52.8 88.8 54.0 54.0 55.2 86.0 52.8 54.0 55.2 85.2 44.4 48.0 50.4 88.8 50.4 51.6 51.6 95.4 43.2 52.8 55.2 90.4. II. III. CA. V. DE. CI. IV. AS. I. BI. BL. IO. TE. VI. VII. Grupos Homogéneos X X X. G. Media. LO. Casos. X. X X X. BI O. Tratamientos. EN CI. Bloques. IC AS. concentraciones de nanopartículas de oro.. X. X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X. Leyenda: TRATAMIENTOS: Concentraciones de nanopartículas de oro. T0: 0 ppm NPsAu, T1: 0.225 ppm NPsAu, T2: 0.450 ppm NPsAu, T3: 0.900 ppm NPsAu BLOQUES: I: Fragmento superior II: Fragmento inferior III: Fragmento izquierdo IV: Fragmento derecho V: Fragmento cefálico VI: Fragmento medio VII: Fragmento caudal. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Tabla 6. Comparación de medias para el tiempo de formación total de individuo a partir de diferentes fragmentos de Dugesia tigrina enfrentados a cuatro. Media. I. 3 0 2 1 3 0 2 1 0 3 2 1 0 1 3 2 0 3 2 1 0 1 2 3 0 1 2 3. 10 10 10 10 10 10 10 10 10 6 10 10 7 13 6 10 10 4 10 10 7 13 10 6 10 10 10 10. 145.2 177.0 198.0 200.4 148.0 177.0 199.2 201.6 181.0 198.0 200.4 201.6 181.0 196.8 198.0 200.4 179.0 180.0 188.4 190.8 182.0 184.2 184.8 198.0 179.0 183.6 196.8 196.8. CA. V. DE. CI. IV. AS. III. EN CI. II. BI. BL. IO. TE. VI. VII. Grupos Homogéneos X. G. Casos. X. LO. Tratamientos. X X. BI O. Bloques. IC AS. concentraciones de nanopartículas de oro.. X X X X. X X XX X X X X X X XX XX X X X X X X X X X. Leyenda: TRATAMIENTOS: Concentraciones de nanopartículas de oro. T0: 0 ppm NPsAu, T1: 0.225 ppm NPsAu, T2: 0.450 ppm NPsAu, T3: 0.900 ppm NPsAu. BLOQUES: I: Fragmento superior II: Fragmento inferior III: Fragmento izquierdo IV: Fragmento derecho V: Fragmento cefálico VI: Fragmento medio VII: Fragmento caudal. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) TE. CA. DE. CI. EN. CI. AS. BI. O. LO. G IC AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BL IO. Figura 3. Tiempo en horas de formación del blastema a partir de diferentes fragmentos de Dugesia tigrina enfrentados a cuatro concentraciones de nanopartículas de oro. Leyenda: Tratamientos: T0: 0 ppm NPsAu, T1: 0.225 ppm NPsAu, T2: 0.450 ppm NPsAu, T3: 0.900 ppm NPsAu.. BI. Bloques: I: fragmento superior, II: fragmento inferior, III: fragmento izquierdo, IV: fragmento derecho, V: fragmento cefálico, VI: fragmento medio, VII: fragmento caudal.. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) DE. CI. EN. CI. AS. BI. O. LO. G IC AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CA. Figura 4. Tiempo en horas de formación total del individuo a partir de diferentes fragmentos de Dugesia tigrina enfrentados a cuatro concentraciones de nanopartículas de oro.. TE. Leyenda: Tratamientos: T0: 0 ppm NPsAu, T1: 0.225 ppm NPsAu, T2: 0.450 ppm NPsAu, T3: 0.900 ppm NPsAu.. BI. BL IO. Bloques: I: fragmento superior, II: fragmento inferior, III: fragmento izquierdo, IV: fragmento derecho, V: fragmento cefálico, VI: fragmento medio, VII: fragmento caudal. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) IC AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. C.. AS. BI O. D.. LO. G. B.. A.. CA. DE. CI. EN CI. E.. F.. G.. TE. H.. BI. BL. IO. Figura 5. Regeneración de Dugesia tigrina. A: Fragmento caudal con blastema en proliferación a las 42 horas de realizada la injuria. B: Fragmento superior con blastema formado a las 54 horas de realizada la injuria. C: Fragmento izquierdo a 132 horas de practicada la injuria. D: Especímen con regeneración completa. E: Fragmento medio no viable a la regeneración. F: Fragmento superior, presentando contracción muscular a las 12 horas después de la injuria. G-H: Fragmentos con formación de blastema a las 48 horas de practicada la injuria.. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DISCUSIÓN. IC AS. Las planarias del género Dugesia son ampliamente utilizadas en estudios de regeneración celular y morfogénesis, ello gracias a su alta capacidad de reconstituir. G. a un organismo completo a partir de un fragmento de cualquier parte corporal. La. LO. regeneración es para ellas un método de reproducción asexual (Allen et al. 2016).. BI O. En los últimos años se ha estudiado el efecto sobre la regeneración de planarias de distintos tipos de compuestos, de naturaleza orgánica (Urrutia, 2015) como. AS. inorgánica (Prabhu & Poulose, 2012; Rzigalinski et al., 2009; Zarate-Cruz et al.,. EN CI. 2016).. La regeneración en los organismos vivos es desencadenada por la herida o,. CI. en el caso de las planarias, por la injuria practicada. El primer evento en la regeneración en las planarias es la contracción muscular que ocurre segundos. DE. después de haber practicado la injuria, la cual funciona como un mecanismo. CA. protector para cerrar la herida ante posibles contaminantes (Newmark & Sanchez Alvarado, 2002). Luego, los rabditos, células especializadas ubicadas en el tejido. TE. epitelial, liberan un moco, el cual se intuye que tiene propiedades de protección. IO. inmunológica, que sella la herida (Martin, 1978). Más adelante se inicia la. BL. multiplicación de células indiferenciadas alrededor de la herida (Sánchez Alvarado. BI. & Newmark, 1998). Una de las etapas determinantes en la regeneración de Dugesia tigrina es la. formación del blastema, un tejido conformado por células en proliferación, que claramente puede diferenciarse de otras partes del individuo por presentar una 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. notable carencia de color (Morgan, 1898). El blastema se define como la acumulación de células indiferenciadas, que carecen de pigmentación y que se. IC AS. pueden observar cerca a sitios específicos del daño tisular, o también, durante la fase embrionaria en distintos organismos (Egger et al., 2006). El proceso de. G. regeneración en planarias es directamente relacionado con células madre. LO. totipotentes, denominadas neoblastos, ampliamente distribuidas en el tejido del. BI O. mesénquima dorsal y ventral, además también están presentes como agrupaciones en las líneas media y bilateral del mesénquima dorsal (Orii, Sakurai & Watanabe,. AS. 2005).. EN CI. En la Tabla 1 se muestra el tiempo promedio de la formación del blastema a partir de diferentes fragmentos de Dugesia tigrina enfrentados a cuatro concentraciones de nanopartículas de oro. Al analizar los promedios globales de los. CI. tratamientos, obviando el de los bloques, notamos una diferencia corta entre los. DE. tratamientos que contienen concentraciones de NPsAu (T1:0.225 ppm, T2:0.450 ppm y T3:0.900 ppm) pero a la vez marcada de estos frente al tratamiento control. CA. (T0: 0ppm NPsAu). Así, el T0 (0 ppm) logró desarrollar el blastema a las 88,34. TE. horas en promedio, mientras que el T1 (0.225 ppm) lo hizo a las 53,31 horas, el T2. IO. (0.450 ppm) lo hizo a las 51,51 horas y el T3 (0.900 ppm) lo hizo a las 49,37 horas.. BL. Los tiempos obtenidos por los tratamientos con NPsAu fueron tiempos más cortos que los obtenidos en otras investigaciones, como las de Urrutia (2015), Herrera. BI. (2018) y Angulo (2017), quienes sometieron fragmentos de D. tigrina a las diversas. concentraciones de diferentes sustratos vegetales.. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(40) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Los valores globales de los tratamientos en la Tabla 1 nos permite determinar que a mayor concentración de NPsAu el tiempo de formación de. IC AS. blastema es más corto, sin importar el tipo de fragmento evaluado; todo ello se debería a que las NPs-Au, en las concentraciones estudiadas, estarían actuando en. G. los complejos proteicos de regeneración de D. tigrina acelerando el proceso de. LO. formación de blastema, así como actuaron positivamente en las investigaciones de. BI O. Chithrani & Chan (2007) donde las NPsAu facilitaron la endocitosis de proteínas. Por otro lado, si tomamos en cuenta solo los promedios de los bloques con. AS. formación de blastema visible, obviando los tratamientos, tenemos que los. EN CI. fragmentos cefálico (bloque V) y caudal (bloque VII) presentan los menores tiempos promedio de formación de blastema, alcanzando las 43,2 y 44,4 horas respectivamente, seguido de 49,2 horas del fragmento inferior (bloque II), 50,4. CI. horas de los fragmentos superior (bloque I) y medio (bloque VI), y 54,0 horas de. DE. los fragmentos izquierdo (bloque III) y derecho (bloque IV). Estos resultados indican que los fragmentos, sometidos a diferentes concentraciones de NPsAu,. CA. obtenidos por corte transversal y doble transversal brindan tiempos más cortos para. TE. la formación de blastema que los fragmentos obtenidos por corte longitudinal. Así. IO. mismo, se puede observar que el tipo de corte único, ya sea transversal o. BL. longitudinal, posee tiempos de formación de blastema más homogéneo que los. BI. obtenidos por doble corte transversal. Cuando analizamos la Tabla 1 teniendo en cuenta los bloques y los. tratamientos, se observa que el fragmento caudal (bloque VII) enfrentado al tratamiento T3 (0.900 ppm NPsAu) alcanzó el promedio en horas más corto (43,2 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(41) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. horas) para la formación visible de blastema, en dicho bloque el tratamiento control (T0: 0 ppm NPsAu) tardó en promedio 90,4 horas, teniendo una diferencia cercana a. IC AS. las cuarenta y siete horas. Otras diferencias importantes por encima de las cuarenta horas figuran para los bloques V y VI, teniendo el resto de bloques (I, II, III y IV). G. con diferencias por encima de las treinta y dos horas.. LO. Estas diferencias observadas en la Tabla 1, en cuanto al tiempo de formación. BI O. del blastema, se llevaron al análisis de varianza respectivo (Tabla 3), encontrándose la presencia de diferencias significativas tanto entre los tipos de fragmento (bloques). AS. como entre las concentraciones de NPsAu (tratamientos). El posterior análisis de. EN CI. comparación de medias (Tabla 5) nos detalla que las diferencias están presentes en cada uno de los bloques, teniendo así, la presencia mínima de dos grupos. CI. homogéneos diferentes en cada bloque.. En el bloque I (fragmento superior) se observan dos grupos homogéneos, el. DE. primero constituido por los tres tratamientos con presencia de NPsAu (T1, T2 y T3). CA. frente a un segundo grupo constituido únicamente por el tratamiento control (T0). El mismo comportamiento poseen los diferentes bloques que muestran dos grupos. TE. homogéneos diferentes entre sí, como son los bloques II (fragmento inferior),. IO. bloque III (fragmento izquierdo), bloque IV (fragmento derecho) y bloque VI. BL. (fragmento medio). En tanto que, el bloque V (fragmento cefálico) presenta tres. BI. grupos homogéneos, el primero constituido por los tratamientos T3 (0.900 ppm NPsAu) y T2 (0.450 ppm NPsAu), un segundo grupo formado por T2 (0.450 ppm NPsAu) y T1 (0.225 ppm NPsAu), dejando al tratamiento control (T0: 0ppm NPsAu) como único integrante del tercer grupo homogéneo. El bloque VII 28. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(42) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. (fragmento caudal) también presenta tres grupos homogéneos, teniendo un primer grupo integrado solo por el T3 (0.900 ppm NPS-Au), un segundo grupo integrado. IC AS. por T2 (0.450 ppm NPsAu) y T1 (0.225 ppm NPsAu), y el tercer grupo integrado por el tratamiento control (T0: o ppm NPsAu).. G. En cuanto a la Tabla 2 se observa los tiempos promedios en horas para la. LO. formación total del individuo de los diferentes tipos de fragmentos de Dugesia. BI O. tigrina, sometidos a diferentes concentraciones de nanopartículas de oro. También se observan diferencias importantes entre los promedios globales. Si tenemos en. AS. cuenta solo a los tratamientos y obviamos a los bloques, podemos señalar al T3. EN CI. (0.900 ppm NPsAu), que conteniendo concentración de NPsAu alcanzó el tiempo más corto para la formación completa del individuo, en un tiempo promedio de 180,6 horas, frente al T2 (0.450 ppm NPsAu) que tuvo el tiempo promedio de. CI. 193,5 horas y el T1 (0.225 pm NPsAu) con 194,9 horas. Sin embargo, el T0 (o. DE. ppm NPsAu) alcanzó el tiempo más corto, con 179,43 horas.. CA. Estos resultados determinan que a mayor concentración de NPsAu el tiempo de formación de individuo completo disminuye, sin importar el tipo de fragmento. TE. evaluado; sin embargo, a pesar de ello no se logró obtener valores menores a los del. IO. tratamiento control. Ante estos resultados podemos tomar en cuenta la conclusión a. BL. la que llegaron Pernodet et al. (2006), pues afirman que incluso las nanopartículas. BI. de oro (NPsAu) no citotóxicas pueden ocasionar daño celular, efecto que se puede visualizar en la regeneración de D. tigrina, observando tiempos mayores en la formación total del individuo, al alcanzar tiempos mayores que el tratamiento control y una mortalidad alcanzada de hasta 60%, en los fragmentos izquierdo, 29. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(43) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. derecho, cefálico y medio. Es importante a la vez señalar que no existiría diferencias significativas entre los resultados promediales de los tratamientos T0 (0 ppm. IC AS. NPsAu) y T3 (0.900 ppm NPsAu). Ahora, si tomamos en cuenta solo los promedios de los bloques con. G. formación total de individuo completo, obviando los tratamientos, tenemos que el. LO. fragmento superior (bloque I) presentó el menor tiempo promedio, alcanzando. BI O. 180,15 horas, seguido de 181,45 horas del fragmento inferior (bloque II), 184,55 horas del fragmento cefálico (bloque V), 185,75 horas del fragmento caudal. AS. (bloque VII), 187,40 horas del fragmento medio (bloque VI) y 195,25 horas de los. EN CI. fragmentos izquierdo (bloque III) y derecho (boque IV). Estos resultados indican que los fragmentos obtenidos por diferentes tipos de corte transversal, sometidos a diferentes concentraciones de NPsAu, brindan tiempos más cortos que los. CI. fragmentos obtenidos por corte longitudinal.. DE. Cuando analizamos la Tabla 2 teniendo en cuenta los bloques y los. CA. tratamientos, se observa que los fragmentos superior (bloque I) e inferior (bloque II) enfrentados al tratamiento T3 (0.900 ppm NPsAu) alcanzaron el promedio en. TE. horas más corto para la formación total del individuo, con 145,2 y 148,0 horas. IO. respectivamente. En dicho bloque el tratamiento control (T0: 0 ppm NPsAu) tardó. BL. en promedio 177,0 horas, teniendo una diferencia cercana a las treinta horas. El. BI. bloque V (fragmento cefálico) muestra una diferencia corta, de una hora, frente al tratamiento control (T0), teniendo mayores diferencias a favor del tratamiento control en los bloques III (fragmento izquierdo), IV (fragmento derecho), VI (fragmento medio) y VII (fragmento caudal). 30. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(44) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Las diferencias observadas en la Tabla 2, en cuanto al tiempo de formación total del individuo, a los que se aplicó el análisis de varianza respectivo (Tabla 4),. IC AS. encontrándose la presencia de diferencias significativas tanto entre los tipos de fragmento (bloques) como entre las concentraciones de NPsAu (tratamientos). El. G. posterior análisis de comparación de medias (Tabla 6) nos detalla que las. LO. diferencias están presentes en cada uno de los bloques, teniendo así, la presencia de. BI O. por lo menos dos grupos homogéneos diferentes en cada bloque.. En la presente investigación se descartan las posibilidades de citotoxicidad. AS. de las NPsAu debido a surfactantes o ligandos, pues estos no fueron empleados en. EN CI. la síntesis de la solución inicial de las nanopartículas. El tamaño de partícula, por otro lado, si podría ser tomado en cuenta, este fue de 22 nm de diámetro, aproximadamente. Dado que se afirma que tanto el efecto benéfico de las. CI. nanopartículas como su toxicidad están estrechamente relacionadas con el tamaño. DE. de la partícula, pues facilita su ingreso a distintos tipos de membranas u organelos celulares. Además, se afirma que este tipo de nanomaterial tiene una alta relación. CA. dependiente partícula-superficie (Boisselier & Astruc, 2009).. TE. En la tabla 6 observamos que los bloques I (fragmento superior) y II. IO. (fragmento inferior) poseen similar comportamiento, en ellos se observa tres grupos. BL. homogéneos, el primero constituido por el tratamiento T3 (0.900 ppm NPsAu), un. BI. segundo grupo formado por el T0 (0 ppm NPsAu) y un tercer grupo formado por el T2 (0.450 ppm NPsAu) y T1 (0.225 ppm NPsAu). El bloque VII presenta también tres grupos homogéneos, pero de diferente conformación a los anteriores. En este bloque un grupo homogéneo lo constituye el T0 (0ppm NPsAu), otro el T1 0.225 31. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..