Validación del método analítico por espectrofotometría uv/vis para la cuantificación de tabletas de metronidazol 500 mg

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE FARMACIA Y BOQUÍMICA. IA. Y. TESIS I. BI. O Q. UI. M. IC. A. ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. AC. Validación del método analítico por espectrofotometría uv/vis para la. DE. FA R. M. cuantificación de tabletas de metronidazol 500 mg. ALVARADO CHÁVEZ, Cristhian José. IO TE. CA. AUTORES:. BI. BL. GONZALES NONATO, Juan Diego. ASESOR:. Dr. CASTILLO SAAVEDRA, Ericson Felix. TRUJILLO - PERÚ 2017. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRESENTACIÓN Señores miembros del jurado dictaminador: Dando cumplimiento a lo establecido por el reglamento de grados y títulos de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, sometemos a su consideración y elevado criterio profesional, la siguiente tesis titulada:. IC. A. “VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO POR ESPECTROFOTOMETRÍA. UI. M. UV/VIS PARA LA CUANTIFICACIÓN DE TABLETAS DE METRONIDAZOL. Y. BI. O Q. 500 mg”. AC. IA. Es propicia esta oportunidad para manifestarle nuestro más sincero reconocimiento a. M. nuestra alma mater y a toda su plana docente, que con su capacidad y buena voluntad. FA R. contribuyeron a nuestra formación profesional.. DE. Dejamos a su criterio señores miembros del jurado dictaminador la calificación del. Trujillo, 16 de Agosto del 2017. BI. BL. IO TE. CA. presente informe.. -------------------------------------------------. --------------------------------------------. Alvarado Chávez Cristhian José. Gonzales Nonato Juan Diego. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA. BI. O Q. UI. M. IC. A. A Dios porque gracias a él hemos podido terminar nuestros estudios ya que con su sabiduría dirigió y guío nuestros pasos. Ha sido el todopoderoso, quien ha iluminado nuestro sendero cuando más oscuro ha estado, enseñándonos a encarar las adversidades sin perder nunca la dignidad ni desfallecer en el intento.. BI. BL. IO TE. CA. DE. FA R. M. AC. IA. Y. A nuestros padres: Alvarado Corcuera Ángel y Chávez García Amada; Gonzales Arroyo Juan y Nonato Vemaza Victoria, quienes, con su inmenso cariño, dedicación, experiencia, apoyo moral y económico nos supieron guiar por el sendero del bien y culminar exitosamente nuestra etapa académica hasta ser profesionales.. A nuestros hermanos en general por acompañarnos con sus consejos en cada momento de nuestra vida y por ser la fuente de inspiración para poder superarnos día a día.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. AGRADECIMIENTO. IC. A. A Dios por la vida y salud que nos ha brindado durante todos estos años y así poder culminar nuestros estudios.. AC. IA. Y. BI. O Q. UI. M. A nuestros padres por el apoyo moral y económico, ya que gracias a ellos pudimos culminar nuestra formación académica de manera exitosa.. IO TE. CA. DE. FA R. M. A nuestros hermanos, por sus aportes a nuestra educación durante todas las etapas y por estar siempre cuando los necesitamos.. BI. BL. A nuestro asesor, que con sus conocimientos y su alto nivel profesional nos orientó a culminar este trabajo, ya que sin él no hubiese sido posible.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. JURADO DICTAMINADOR. PEDRO MARCELO ALVA PLASENCIA. IC. A. ________________________________________. AC. IA. Y. BI. O Q. UI. M. Presidente. FA R. M. ERICSON FELIX CASTILLO SAAVEDRA. Asesor. BI. BL. IO TE. CA. DE. ________________________________________. SEGUNDO MANUEL MIRANDA LEYVA _________________________________________ Miembro. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN El presente estudio tuvo como objetivo validar el método de espectrofotometría UV/Vis para la cuantificación de metronidazol en tabletas recubiertas multifuente, para lo cual se procedió a determinar los parámetros de: especificidad, linealidad, precisión y exactitud, basándonos en la farmacopea vigente.. A. Para ello se trabajó con una muestra aleatoria, cuyo método de trabajo y análisis se basó. M. IC. en diluciones y lectura en espectrofotómetro a 275 nm de longitud de onda, donde se. O Q. UI. obtuvo la máxima absorbancia (λ máx.).. BI. Se obtuvo conformidad en las especificaciones de todos los parámetros evaluados. En. IA. Y. el parámetro de especificidad se realizó la prueba de degradación forzada, resultando. AC. favorable ya que esta no afectó de forma considerable la estabilidad del analito. FA R. M. evaluada.. DE. En cuanto al parámetro de linealidad, fue conforme puesto que para la muestra se. CA. obtuvo un coeficiente de correlación (r) aceptable tanto para el sistema como para el. IO TE. método.. BL. En la precisión y exactitud evaluadas también se obtuvieron resultados conformes a lo. BI. esperado en sus especificaciones. Por lo que se concluyó que el método analítico estudiado es específico, lineal, exacto y preciso. Aplicable por lo tanto para el dosaje de metronidazol multifuente tabletas recubiertas por espectrofotometría UV/Vis, en el rango de 0,016 mg/mL a 0,030 mg/mL. Palabras clave: Metronidazol, espectrofotometría UV/Vis, validación, repetibilidad.. i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT The present study aimed to validate the UV / Vis spectrophotometry method for the quantification of metronidazole in multifuente coated tablets, for which the parameters of: specificity, linearity, precision and accuracy were determined, based on the current pharmacopoeia. For this purpose, a random sample was used, whose working and analysis method was. IC. A. based on dilutions and spectrophotometer readings at 275 nm wavelength, where the. UI. M. maximum absorbance (λmax) was obtained.. O Q. Conformity was obtained in the specifications of all evaluated parameters. In the. Y. BI. specificity parameter the forced degradation test was performed, proving favorable. AC. IA. since this did not affect considerably the stability of the evaluated analyte.. FA R. M. As for the linearity parameter, conformity was obtained since for the sample a. DE. correlation coefficient (r) acceptable for both the system and the method was obtained.. CA. In the precision and accuracy evaluated also obtained results in accordance with what. IO TE. was expected in its specifications.. BL. Therefore it was concluded that the analytical method studied is specific, linear,. BI. accurate and precise. Therefore applicable for dosing of metronidazole multi-coated tablets coated by UV / Vis spectrophotometry.. Key words: Metronidazole, UV / Vis spectrophotometry, validation, repeatability.. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE RESUMEN .................................................................................................................... i ABSTRACT ................................................................................................................. ii I. INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 1 II. MATERIAL Y MÉTODO....................................................................................... 9 1. MATERIAL ...................................................................................................... 9 1.1. MUESTRA ................................................................................................. 9 1.2. REACTIVOS .............................................................................................. 9. A. 1.3. EQUIPOS ................................................................................................... 9. M. IC. 1.4. OTROS..................................................................................................... 10. UI. 2. MÉTODO ....................................................................................................... 10. O Q. 2.1. SELECCIÓN DE TÉCNICA ANALÍTICA .............................................. 10. BI. 2.2. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA............................................................ 10. Y. 2.3. RECOLECCIÓN DE DATOS .................................................................. 10. IA. 2.3.2. CONDICIONES ESPECTROFOTOMÉTRICAS ............................ 10. AC. 2.3.3. PREPARACIÓN DE REACTIVOS ................................................ 11. FA R. M. 2.3.4. PREPARACIÓN DEL ESTÁNDAR ............................................... 11 2.3.5. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA ............................................. 12. DE. 2.3.6. CÁLCULOS ................................................................................... 12. CA. 2.4. VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO ......................................... 13 2.4.1. DESARROLLO DE LOS PARÁMETROS DE VALIDACIÓN ...... 13. IO TE. 2.4.1.1. ESPECIFICIDAD ............................................................... 13. BL. 2.4.1.1.1. PREPARACIÓN Y EVALUACIÓN DEL PLACEBO ..... 13. BI. 2.4.1.1.1.1. PREPARACIÓN DEL PLACEBO ................................ 13 2.4.1.1.1.2. ANÁLISIS DEL PLACEBO ......................................... 13 2.4.1.1.2. EVALUACIÓN DEL PRINCIPIO ACTIVO .................... 14 2.4.1.1.2.1. PREPARACIÓN DEL ESTÁNDAR ............................. 14 2.4.1.1.2.2. DEGRADACIÓN ÁCIDA ............................................ 14 2.4.1.1.2.3. DEGRADACIÓN ALCALINA ..................................... 14 2.4.1.1.2.4. OXIDACIÓN ................................................................ 15 2.4.1.1.2.5. FOTÓLISIS................................................................... 15 2.4.1.1.2.6. TERMÓLISIS ............................................................... 15 2.4.1.1.3. EVALUACIÓN DE LA FORMA FARMACÉUTICA ..... 16 1. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.4.1.1.3.1. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA ............................ 16 2.4.1.1.3.2. HUMEDAD RELATIVA .............................................. 16 2.4.1.1.3.3. FOTÓLISIS................................................................... 16 2.4.1.1.3.4. TERMÓLISIS ............................................................... 17 2.4.1.2. ENSAYO DE LINEALIDAD ............................................. 18 2.4.1.2.1. LINEALIDAD DEL SISTEMA ....................................... 18 2.4.1.2.2. LINEALIDAD DEL MÉTODO ....................................... 18 2.4.1.3. PRECISIÓN........................................................................ 19. A. 2.4.1.3.1. REPETIBILIDAD ............................................................ 19. IC. 2.4.1.3.1.1. REPETIBILIDAD DEL SISTEMA ............................... 19. UI. M. 2.4.1.3.1.2. REPETIBILIDAD DEL MÉTODO ............................... 20. O Q. 2.4.1.3.2. PRECISIÓN INTERMEDIA ............................................ 20. BI. 2.4.1.4. EXACTITUD...................................................................... 20. Y. 2.4.1.5. RANGO .............................................................................. 21. IA. 2.5. ANÁLISIS DE DATOS .................................................................. 22. AC. 1. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ...................................................... 22. M. 1.1. EVALUACIÓN ESTADÍSTICA ESPECIFICIDAD .......... 22. FA R. 1.2. EVALUACIÓN ESTADÍSTICA LINELIDAD .................. 23 1.3. EVALUACIÓN ESTADÍSTICA PRECISIÓN ................... 25. DE. 1.4. EVALUACIÓN ESTADÍSTICA EXACTITUD ................. 25. CA. III. RESULTADOS..................................................................................................... 31. IO TE. IV. DISCUSIÓN ......................................................................................................... 35 V. CONCLUSIONES ................................................................................................ 35. BL. VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 36. BI. ANEXOS .................................................................................................................... 41. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I.. INTRODUCCIÓN. En el país, la entidad reguladora responsable de asegurar que los productos farmacéuticos se fabriquen de forma uniforme y controlada, de acuerdo a las normas de calidad en relación al uso que se les pretende dar y conforme a las condiciones exigidas para su comercialización que garanticen la salud de la población, es la Dirección. IC. A. General de Medicamentos, Insumos y Drogas (DIGEMID). 1. M. Según el artículo 176° del Manual de Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) de la. O Q. UI. Dirección General de Medicamentos, Insumos y Drogas (DIGEMID) declara: “Los. BI. procedimientos de ensayos descritos en los documentos deben ser validados en el. IA. Y. contexto de las instalaciones disponibles, antes de ser adoptados para las pruebas. FA R. M. AC. correspondientes”.1. La validación es un requisito imprescindible para el cumplimiento de las buenas. DE. prácticas de laboratorio que se encuentra normado por agencias regulatorias y. IO TE. CA. Farmacopeas para el registro de nuevos medicamentos.2. BL. Por consiguiente, se define validación como el proceso establecido para la obtención de. BI. pruebas documentadas, mediante estudios sistemáticos y demostrativos de laboratorio, que un método de análisis es lo suficientemente fiable y reproducible para producir el resultado esperado.3 De manera específica, la validación de métodos analíticos se define como el establecimiento de la evidencia documentada de que un procedimiento analítico conducirá, con un alto grado de seguridad, a la obtención de resultados precisos y. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. exactos, dentro de las especificaciones y los atributos de calidad previamente establecidos.3. Asimismo, otros autores definen la validación analítica como un proceso mediante el cual se demuestra la aplicabilidad de un método analítico, y se fundamenta en la determinación de diversos parámetros que se aplican de acuerdo con la categoría de. A. ensayo a la que pertenezcan. Estas categorías se hacen necesarias debido a la gran. M. IC. cantidad de ensayos analíticos existentes; facilitando así el estudio y el tipo de. BI. O Q. UI. información que se requiere para la validación. 4, 5, 6. Y. Los métodos analíticos a validar, están diferenciados en tres categorías según la. AC. IA. clasificación de la United States Pharmacopeia (USP) versión 39, así; la primera. FA R. M. categoría está compuesta por los métodos analíticos para la cuantificación de los principales componentes del fármaco, o de principios activos en productos. DE. farmacéuticos terminados; en la segunda categoría se encuentran los métodos analíticos. CA. , para la determinación de impurezas o productos de degradación en el producto. IO TE. farmacéutico terminado, incluyendo ensayos cuantitativos y pruebas de límites; y. BL. finalmente, la tercera categoría contempla los métodos analíticos para evaluar las. BI. características físicas de las formas farmacéuticas terminadas, tales como disolución o liberación de fármacos.7 Un punto necesario a tratar es la validación frente a métodos oficiales y/o farmacopeas en los que se puede diferenciar entre validación de métodos de análisis de principios activos y especialidades farmacéuticas.8. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. En los principios activos de síntesis, los métodos oficiales o de farmacopeas se consideran validados siempre y cuando se apliquen a principios activos con la misma ruta de síntesis y por lo tanto el mismo perfil de impurezas que aquellos que declara la monografía.8. En las especialidades farmacéuticas no es recomendable utilizar ningún método especial. A. o de farmacopea totalmente validado para una especificación, puesto que difícilmente. M. IC. tendrán los mismos componentes ni la misma proporción de estos. No obstante, pueden. O Q. UI. emplearse como puntos de partida métodos desarrollados para especialidades tipo, como. BI. lo establecen diferentes organismos reguladores, tales como: Pharmacopeia European. Y. (EP), USP o Pharmacopeia British (BP), que permitirán obviar una gran parte del. FA R. M. AC. IA. desarrollo analítico.8. En la actualidad, se reconocen tres tipos de validaciones, entre las que se pueden. DE. diferenciar: retrospectiva, prospectiva y revalidación. La validación retrospectiva. CA. consiste en establecer una evidencia documentada de la idoneidad de un producto o. IO TE. proceso, basándose en la evaluación de los datos históricos acumulados existentes del. BL. mismo, siempre y cuando no se hayan modificado los procedimientos, maquinarias,. BI. tamaño de lote y características de las sustancias empleadas. 9, 10, 11 Asimismo, la validación prospectiva, consiste en la verificación del cumplimiento de las condiciones establecidas para un método analítico, y se llevan a cabo antes de la comercialización del producto.10. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Por otro lado, la revalidación, informa de la existencia de un cambio que pueda afectar la idoneidad del método analítico establecido por la validación, es decir una validación total o parcial de dicho método analítico. 11, 12. Las características de desempeño del método de validación para productos farmacéuticos, se expresan en función de la especificidad, linealidad, precisión y. A. exactitud, garantizando el cumplimiento de las especificaciones establecidas por los. O Q. UI. M. IC. organismos internacionales.. BI. La especificidad representa la capacidad de un método analítico para evaluar de manera. Y. inequívoca el analito en presencia de aquellos componentes que puedan estar presentes. AC. IA. en la muestra, como: impurezas, productos de degradación y componentes de la matriz.. FA R. M. Este criterio estandarizado se debe determinar antes de iniciar el estudio de cualquier otro parámetro de validación, dado que debe conocerse en qué grado la respuesta del. DE. método es únicamente proporcionada por el analito, sin interferencia de otras sustancias. IO TE. CA. relacionadas de una forma u otra.13, 14, 15. BL. La linealidad es la capacidad del método analítico para obtener resultados directamente. BI. proporcionales a la concentración o cantidad del analito en un rango definido. Se determina mediante el tratamiento matemático de los resultados obtenidos en el análisis, a diferentes cantidades o concentraciones. El rango, se define como el intervalo entre la concentración superior e inferior del analito para el cual se ha demostrado la correcta precisión, exactitud y linealidad del método descrito. La selección del rango y del número de puntos experimentales está estrictamente relacionada con la aplicación del método.3, 4, 14. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Por otra parte, la precisión expresa la cercanía de coincidencia (grado de dispersión) entre una serie de mediciones obtenidas. Es el grado de concordancia entre el resultado de las pruebas individuales cuando se aplica el método repetidamente a múltiples muestreos de una serie homogénea en las condiciones prescritas. El objetivo de este estudio es conocer la variabilidad del método de ensayo, esta variabilidad es debida a. A. errores aleatorios inherentes a todo método de ensayo, como consecuencia de estos. M. IC. errores, los análisis efectuados sobre muestras idénticas, en las mismas circunstancias,. O Q. UI. no conducen generalmente a resultados idénticos. Los factores susceptibles de influir. BI. sobre los resultados de un ensayo no pueden ser siempre controlados (analista, tiempo,. AC. IA. Y. reactivos, equipo instrumental, etc.)13, 14, 15. FA R. M. Asimismo, la precisión de un método analítico se expresa también como la desviación estándar o desviación estándar relativa (coeficiente de variación) de una serie de. CA. IO TE. reproducibilidad).15. DE. mediciones, y es considerada a tres niveles (repetibilidad, precisión intermedia,. BL. La repetibilidad, refleja la precisión de un método cuando se desarrolla bajo las mismas. BI. condiciones, utilizando la misma muestra analizada por el mismo analista, en el mismo laboratorio, con los mismos equipos y reactivos y durante una misma sesión de trabajo en un periodo corto.16. La precisión intermedia estudia la variabilidad del método, efectuando una serie de análisis sobre la misma muestra, pero en condiciones operativas diferentes (diferentes analistas, tiempo, aparatos, etc.).13,. 15. Por otro lado, la reproducibilidad estudia la. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. variabilidad del método bajo condiciones operativas diferentes, en diferentes laboratorios.16. Finalmente, el parámetro exactitud, indica la capacidad del método analítico para obtener resultados lo más próximos posibles al valor verdadero, debe ser demostrada en todo el rango especificado para el método analítico. A diferencia de la precisión, que. M. IC. A. refleja el error aleatorio, la exactitud refleja el error sistemático o la tendencia a él. 1, 17. O Q. UI. La exactitud se expresa como el porcentaje de recuperación de la cantidad valorada con. BI. respecto a la cantidad conocida del analito añadida a la muestra o como la media. Y. obtenida y el valor aceptado como verdadero, considerando los intervalos de. FA R. M. AC. IA. confianza.18. De manera general, en los estudios de validación de métodos analíticos se debe. DE. considerar los límites de detección y cuantificación, para obtener una mayor. CA. confiabilidad del resultado esperado. En este sentido, el límite de detección representa la. IO TE. cantidad más pequeña de analito en una muestra que puede ser detectada por una única. BL. medición, con un nivel de confianza determinado, pero no necesariamente cuantificada. BI. con un valor exacto, es comúnmente expresado como concentración del analito. 19. Por otra parte, el límite de cuantificación expresa sobre la cantidad más pequeña de analito en una muestra que puede ser cuantitativamente determinada con exactitud aceptable. Es un parámetro del análisis cuantitativo para niveles bajos de compuestos en matrices de muestras y se usa particularmente para impurezas y productos de degradación, y se expresa como concentración del analito. 19. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. En nuestro país existe una gran diversidad de productos farmacéuticos de los cuales destacan medicamentos de moderada a elevada rotación, esto debido a su relevancia por el alto consumo y aceptación por parte de la población y de los prescriptores.. En los servicios de ginecología y obstetricia de los establecimientos de salud a nivel de. A. la región La Libertad se utiliza metronidazol (MTZ) como medicamento antibacteriano,. M. IC. antiparasitario y anti fúngico, clasificado dentro de la clase de nitroimidazoles. Su. O Q. UI. indicación original fue para el tratamiento de infecciones provocadas por Trichomonas. BI. vaginalis, pero con el paso del tiempo se ha ido ampliando el espectro de su acción,. Y. utilizándose hoy en día en el tratamiento de una variedad de infecciones provocadas por. FA R. M. AC. IA. diferentes tipos de organismos.20. Inicialmente MTZ fue aprobado por la Food Drug Administration (FDA) para uso. DE. humano en 1963, se encuentra disponible en formulación oral, parenteral, vaginal y. CA. tópica.20 Actualmente está indicado para absceso por anaerobios, disentería amebiana,. IO TE. absceso hepático amebiano, infección por anaerobios, meningitis bacteriana, vaginosis. BL. bacteriana, profilaxis pre operatoria del tracto gastrointestinal y del colon, rosáceas.. BI. tricomoniasis.21. Respecto al espectro de acción de MTZ, son sensibles la mayoría de bacterias anaeróbicas gram (-) incluyendo Bacteroides fragilis, B. distasonis, B. ovalus, B. thetaiotaomicron, B. ureolyticus, B. vulgatus, Porphyromonas asaccharolytica, P.gingivalis, Fusobacterium y Veillonella. Algunas cepas de Mobiluncus, también la mayoría de anaeróbicas gram (+) incluyendo Clostridium difficile, C. perfringens,. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Peptococcus y Peptostreptococcus, Haemophylus vaginalis, Entamoeba histolytica, Trichomona vaginalis, Giardia lamblia. Pueden ser sensibles: Helicobacter pylori, y no sensibles: Actinomyces, Lactobacillus, Propionibacterium, hongos, virus y la mayoría de aeróbicos o anaeróbicos facultativos.21 En la USP 39 se establecen las características de MTZ respecto a parámetros de cuantificación de principio activo, utilizando una longitud de onda de máxima. A. absorbancia a 319 nm, detectado por equipo High Performance Liquid Chromatographic. M. IC. (HPLC), en el rango Ultra Violeta (UV). No obstante, el método oficial para la. O Q. UI. determinación de MTZ; utiliza la absorción al infrarrojo y HPLC. En este contexto, ante. BI. la necesidad de contar con un método analítico, sencillo, rápido y económico que. Y. permita la determinación de MTZ, se promueve el desarrollo de métodos alternativos,. AC. IA. como la espectrofotometría UV/Vis que permita estandarizar y normalizar un método de. FA R. M. ensayo, y así utilizarlo para el control de calidad de productos que se están. DE. comercializando en nuestra región y país. 7. CA. Por lo expuesto anteriormente, se planteó el siguiente problema:. IO TE. ¿Cumple la validación del método analítico espectrofotométrico UV/Vis para la. BL. cuantificación de tabletas de metronidazol 500 mg con las especificaciones de. BI. especificidad, linealidad, precisión y exactitud establecidas por la Farmacopea Americana? Para ello los objetivos propuestos fueron: - Validar el método analítico por espectrofotometría UV/vis para la cuantificación de tabletas de metronidazol 500 mg. - Evaluar los parámetros de validación para verificar el cumplimiento de los criterios establecidos por la Farmacopea Americana.. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II. 1.. MATERIAL Y MÉTODO MATERIAL. 1.1. MUESTRA La muestra estuvo conformada por 250 tabletas de un producto multifuente del mercado nacional, las que declararon contener 500 mg de metronidazol como. M. IC. A. ingrediente farmacéutico activo (IFA) por tableta.. O Q. UI. 1.2. REACTIVOS. BI. - Metronidazol estándar. Y. - Ácido sulfúrico grado ACS. AC. IA. - Ácido clorhídrico grado ACS. FA R. M. - Hidróxido de sodio grado ACS - Peróxido de hidrogeno grado ACS. CA. IO TE. 1.3. EQUIPOS. DE. - Metanol grado ACS. BL. - Espectrofotómetro UV/Vis. Marca: GENESYS 10UV. BI. - Balanza analítica. Marca: METTLER TOLEDO. Modelo: AB2004 - Baño María. Marca: MEMMERT - Ultrasonido Marca: BRANSON 3510 - pH-metro Marca: METTLER TOLEDO - Lámpara UV Marca: DESAGA HEIDELBERG (30 W/254-366 nm) - Agitador magnético Marca: CIMAREC - Estufa Marca: MEMMERT 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 1.4. OTROS -. Material de vidrio y cerámico de uso de común en el laboratorio.. 2.. MÉTODO 23. 2.1. SELECCIÓN DE LA TÉCNICA ANALÍTICA. A. Se procedió conforme método alternativo espectrofotométrico establecido en la. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA. BI. 2.2. O Q. UI. M. IC. monografía oficial de la USP 39.. Y. Se recolectaron al azar y de manera estratégica por muestreo 250 tabletas de. RECOLECCIÓN DE DATOS. CA. DE. 2.3. FA R. M. AC. IA. metronidazol 500 mg de un mismo lote y verificando la fecha de expiración.. IO TE. 2.3.1 Determinación del peso promedio de las tabletas Se registró el peso individual de 20 tabletas y se procedió a calcular el promedio de. BI. BL. los valores obtenidos.. 2.3.2 Condiciones espectrofotométricas. Equipo. : Espectrofotómetro UV/Vis. Celda. : 1cm de trayectoria óptica. Longitud de onda. : 275 nm. Blanco. : Ácido clorhídrico 0,1 N. Solvente. : Ácido clorhídrico 0,1 N 10. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Determinación de la longitud de onda de máxima absorbancia (λ) Se preparó una solución stock para lo cual se pesaron 20 mg de metronidazol estándar, se transfirieron a una fiola de 25 ml y se aforo con ácido clorhídrico 0,1 N. Luego a partir de esta solución se preparó la solución patrón, para lo cual se midieron 1,25 ml de solución stock y se transfirieron a una fiola de 50 ml, se procedió a aforar con ácido clorhídrico 0,1 N. De esta solución, se pipetearon 5 alícuotas de 0.0; 0,5;. IC. A. 1,0; 1,5 y 2.0 ml a fiolas de 25 ml aforándose con ácido clorhídrico 0,1 N. UI. M. obteniéndose las soluciones muestra con concentraciones teóricas de 0, 16, 32, 48 y. BI. O Q. 64 ug/ml respectivamente.32. Y. Para cada una de las soluciones muestra, se obtuvieron los datos de absorbancia. AC. IA. (ABS) de cada 5 nm en el rango de 250 a 330 nm. Luego se procedió a graficar los. 2.3.3 Preparación de reactivos. FA R. M. datos obtenidos (ABS vs λ), determinándose el λ máx. a 275 nm.32. DE. Se midieron 8,4 mL de ácido clorhídrico concentrado a un balón aforado de 1000. IO TE. CA. mL, se aforó con agua destilada.. BL. 2.3.4 Preparación del estándar. BI. Se pesaron 25 mg de metronidazol estándar, se llevó a un matraz aforado de 50 mL, luego se adicionaron 30 mL de ácido clorhídrico 0,1N; se llevó a sonicar por 10 minutos, después se enrasó con ácido clorhídrico 0,1N y se homogenizó, se filtró con papel Whatman N°40, de este filtrado se transfirieron 2 mL a un matraz aforado de 50 mL, se enrasó con ácido clorhídrico 0,1 N y se homogenizó. Finalmente se procedió a leer en espectrofotómetro a 275 nm utilizando como blanco ácido clorhídrico 0,1 N. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.3.5 Preparación de la muestra Se seleccionaron 20 tabletas de metronidazol 500 mg, se trituró, homogenizó y pesó un equivalente a 20 mg de metronidazol (calculado a partir del peso promedio de la tableta), luego se llevó a un matraz aforado de 100 mL, se adicionaron 50 mL de ácido clorhídrico 0,1 N, se procedió a sonicar por 10 minutos, luego se enrasó con ácido clorhídrico 0,1 N, se agitó durante 5 minutos, decantó y filtró con papel. A. Whatman N°40. De este filtrado se transfirieron 5 mL a un matraz aforado de 50. M. IC. mL, luego se enrasó con ácido clorhídrico 0,1 N y homogenizó. Finalmente se llevó. AC. IA. Y. BI. O Q. UI. al espectrofotómetro a 275 nm utilizando como blanco ácido clorhídrico 0,1 N.. FA R. M. 2.3.6 Cálculos. 𝐴𝑏𝑠𝑚𝑝 𝑊 𝐹𝐷 ̅̅̅̅)𝑥(𝑃𝑜𝑠𝑡 ) Metronidazol mg/tab = ( 𝐴𝑏𝑠 ) x (𝑊 𝑠𝑡 ) 𝑥 (𝑓𝑑 𝑠𝑡 ) 𝑥 (𝑃𝑝 𝑚𝑝. 𝑚𝑝. DE. 𝑠𝑡. CA. Donde:. IO TE. Absmp = Absorbancia de la muestra problema. BL. Absst = Absorbancia del estándar. BI. Wmp = Peso de la muestra problema Wst = Peso del estándar Fdmp = Factor de dilución de la muestra problema FDst = Factor de dilución del estándar Pp = Peso promedio de tabletas Post = Potencia del estándar. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.4. VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO. La validación del método analítico se desarrolló siguiendo el procedimiento descrito en la Farmacopea Americana, en la cual se establecen los parámetros a validar.. 2.4.1 DESARROLLO DE PARÁMETROS A VALIDAR. A. ENSAYO DE ESPECIFICIDAD. IC. 2.4.1.1. UI. M. Se procedió a evaluar su especificidad frente a los excipientes, comprobando la. BI. AC. Preparación y evaluación del placebo. M. 2.4.1.1.1. IA. Y. degradación que puedan interferir en el análisis.. O Q. inalterabilidad sometiendo a situaciones de estrés para generar compuestos de. FA R. 2.4.1.1.1.1 Preparación del placebo. DE. Se preparó una cantidad para aproximadamente 200 tabletas, siguiendo las. IO TE. CA. instrucciones de fabricación (orden de fabricación).. BL. 2.4.1.1.1.2 Análisis del placebo. BI. Se procedió a pesar un equivalente al placebo de 2 tabletas de metronidazol, se llevó a un matraz aforado de 100 mL y se adicionó 50 mL de ácido clorhídrico 0,1 N, luego se procedió a sonicar por 10 minutos, se enrasó con ácido clorhídrico 0,1 N y se agitó por 5 minutos. Se dejó decantar y luego se filtró con papel Whatman N° 40, del filtrado se midieron 5 mL y se transfirieron a un matraz aforado de 50 mL, seguidamente se enraso con ácido clorhídrico 0,1 N y se homogenizó.. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. La solución preparada se procedió a analizar de acuerdo a las condiciones espectrofotométricas indicadas en el punto 2.3.2. 2.4.1.1.2 Evaluación del principio activo El analito fue sometido a situaciones de estrés como: degradación ácida, degradación alcalina, oxidación, fotolisis y termólisis.. A. 2.4.1.1.2.1 Preparación del estándar. O Q. UI. M. IC. Conforme a lo establecido en el punto 2.3.4. BI. 2.4.1.1.2.2 Degradación ácida. Y. Se pesaron 25 mg de metronidazol estándar, se llevó a un matraz aforado de 50 mL y. AC. IA. se adicionaron 30 mL de ácido clorhídrico 0,1 N, se procedió a sonicar por 10. FA R. M. minutos, luego se enraso con ácido clorhídrico 0,1 N, se homogenizó y se filtró con papel Whatman N° 40. Se midieron 2 mL de esta solución y se transfirieron a un. DE. matraz aforado de 50 mL, luego se adicionaron 5 mL de ácido sulfúrico 0,01N,. CA. seguidamente se enrasó con ácido clorhídrico 0,1 N y se homogenizó.. IO TE. La solución preparada se procedió a analizar de acuerdo a las condiciones. BI. BL. espectrofotométricas indicadas en el punto 2.3.2.. 2.4.1.1.2.3 Degradación alcalina Se pesaron 25 mg de metronidazol estándar, se llevó a un matraz aforado de 50 mL y se adicionaron 30 mL de ácido clorhídrico 0,1 N, se procedió a sonicar por 10 minutos, luego se enrasó con ácido clorhídrico 0,1 N, se homogenizo y se filtró con papel Whatman N° 40. Se midieron 2 mL de esta solución y se transfirieron a un. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. matraz aforado de 50 mL, luego se adicionaron 5 mL de Hidróxido de Sodio 0,01 N, seguidamente se enrasó con ácido clorhídrico 0,1 N y se homogenizó. La solución preparada se procedió a analizar de acuerdo a las condiciones espectrofotométricas indicadas en el punto 2.3.2. 2.4.1.1.2.4 Oxidación. A. Se pesaron 25 mg de metronidazol estándar, se llevó a un matraz aforado de 50 mL y. M. IC. se adicionaron 30 mL de ácido clorhídrico 0,1 N, se procedió a sonicar por 10. O Q. UI. minutos, luego se enrasó con ácido clorhídrico 0,1 N, se homogenizó y se filtró con. BI. papel Whatman N° 40. Se midieron 2 mL de esta solución y se transfirieron a un. Y. matraz aforado de 50 mL, luego se adicionaron 5 mL de Peróxido de hidrogeno 3%. AC. IA. v/v, seguidamente se enrasó con ácido clorhídrico 0,1 N y se homogenizó.. FA R. M. La solución preparada se procedió a analizar de acuerdo a las condiciones. CA. 2.4.1.1.2.5 Fotólisis. DE. espectrofotométricas indicadas en el punto 2.3.2. IO TE. Se pesaron 25 mg de metronidazol estándar, se llevó a un matraz aforado de 50 mL y. BL. se adicionaron 30 mL de ácido clorhídrico 0,1 N, se procedió a sonicar por 10. BI. minutos, luego se enrasó con ácido clorhídrico 0,1 N, se homogenizó y se filtró con papel Whatman N° 40. Se midieron 2 mL de esta solución y se transfirieron a un matraz aforado de 50 mL, luego se enrasó con ácido clorhídrico 0,1 N y se homogenizó. La solución anterior se expuso a luz ultravioleta por seis horas. La solución preparada se procedió a analizar de acuerdo a las condiciones espectrofotométricas indicadas en el punto 2.3.2. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.4.1.1.2.6 Termólisis Se pesaron 25 mg de metronidazol estándar, se llevó a un matraz aforado de 50 mL y se adicionaron 30 mL de ácido clorhídrico 0,1 N, se procedió a sonicar por 10 minutos, luego se enrasó con ácido clorhídrico 0,1 N, se homogenizó y se filtró con papel Whatman N° 40. Se midieron 2 mL de esta solución y se transfirieron a un matraz aforado de 50 mL, luego se enrasó con ácido clorhídrico 0,1 N y se. A. homogenizó. La solución anterior se expuso a temperatura de 65° C por seis horas.. M. IC. La solución preparada se procedió a analizar de acuerdo a las condiciones. BI. O Q. UI. espectrofotométricas indicadas en el punto 2.3.2. AC. IA. Y. 2.4.1.1.3 Evaluación de la forma farmacéutica. FA R. M. Se sometió a situaciones de estrés como: fotólisis, humedad relativa y termólisis.. DE. 2.4.1.1.3.1 Preparación de la muestra. IO TE. CA. Conforme a lo establecido en el punto 2.3.5. BL. 2.4.1.1.3.2 Humedad relativa. BI. Se pesó un equivalente a 20 mg de metronidazol (calculada a partir del peso promedio de la tableta), se llevó a un matraz aforado de 100 mL y se adicionaron 50 mL de ácido clorhídrico 0,1 N, se procedió a sónica por 10 minutos, luego se enrasó con ácido clorhídrico 0,1 N, se agitó durante 5 minutos. Se dejó decantar y se filtró con papel Whatman N° 40, del filtrado se midieron 5 mL y se llevó a un matraz aforado de 50 mL, seguidamente se enrasó con ácido clorhídrico 0,1 N y se homogenizó. La solución anterior se expuso a humedad relativa 70 % por seis horas.. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. La solución preparada se procedió a analizar de acuerdo a las condiciones espectrofotométricas indicadas en el punto 2.3.2. 2.4.1.1.3.3 Fotólisis Se pesó un equivalente a 20 mg de metronidazol (calculada a partir del peso promedio de la tableta), se llevó a un matraz aforado de 100 mL y se adicionaron 50. A. mL de ácido clorhídrico 0,1 N, se procedió a sonicar por 10 minutos, luego se enrasó. M. IC. con ácido clorhídrico 0,1 N, se agitó durante 5 minutos. Se dejó decantar y se filtró. O Q. UI. con papel Whatman N° 40, del filtrado se midieron 5 mL y se llevó a un matraz. BI. aforado de 50 mL, seguidamente se enrasó con ácido clorhídrico 0,1 N y se. Y. homogenizó. La solución anterior se expuso a luz ultravioleta por seis horas.. AC. IA. La solución preparada se procedió a analizar de acuerdo a las condiciones. DE. 2.4.1.1.3.4 Termólisis. FA R. M. espectrofotométricas indicadas en el punto 2.3.2. CA. Se pesó un equivalente a 20 mg de metronidazol (calculada a partir del peso. IO TE. promedio de la tableta), se llevó a un matraz aforado de 100 mL y se adicionaron 50. BL. mL de ácido clorhídrico 0,1 N, se procedió a sonicar por 10 minutos, luego se enrasó. BI. con ácido clorhídrico 0,1 N, se agitó durante 5 minutos. Se dejó decantar y se filtró con papel Whatman N° 40, del filtrado se midieron 5 mL y se llevó a un matraz aforado de 50 mL, seguidamente se enrasó con ácido clorhídrico 0,1 N y se homogenizó. La solución anterior se expuso a temperatura de 65° C por seis horas. La solución preparada se procedió a analizar de acuerdo a las condiciones espectrofotométricas indicadas en el punto 2.3.2. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.4.1.2 ENSAYO DE LINEALIDAD Se determinó la linealidad del sistema, para lo cual se trabajó con estándares. También se determinó la linealidad del método, trabajando con estándares y con la matriz del producto. 2.4.1.2.1 Linealidad del Sistema. IC. A. Para la evaluación de este parámetro se preparó tres curvas de calibración; pesando. M. cinco estándares correspondientes a cinco concentraciones de dicho analito, las. BI. Procedimiento. Y. -. O Q. UI. cuales estuvieron en un intervalo de: 80%, 90%, 100%, 110% y 120%.. IA. Se realizaron pesadas independientes de: 20 mg; 22,5 mg, 25 mg, 27,5 mg y 30 mg. M. AC. de metronidazol, se llevaron por separado a matraces aforados de 50 mL, se les. FA R. adicionaron 30 mL de ácido clorhídrico 0,1 N y se procedió a sonicar por 10. DE. minutos, luego se llevó a volumen con ácido clorhídrico 0,1 N, se homogenizó y se. CA. filtró con papel Whatman N° 40. Se procedió a medir 2 mL de cada solución anterior. IO TE. y se transfirieron por separado a matraces aforados de 50 mL, se enrasó con ácido clorhídrico 0,1 N y se homogenizó.. BI. BL. Las concentraciones teóricas obtenidas fueron las siguientes: 0,016 mg/mL; 0,018 mg/mL; 0,020 mg/mL; 0,022 mg/mL y 0,030 mg/mL respectivamente. Las. soluciones. preparadas. fueron. analizadas. conforme. las. condiciones. espectrofotométricas indicadas en el punto 2.3.2. 2.4.1.2.2. Linealidad del Método. Para la evaluación de este parámetro se pesó independientemente muestras de estándar de metronidazol agregadas a un placebo, preparado con los excipientes del 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. producto, de manera que se pudo obtener cinco niveles de concentración diferentes (80, 90, 100, 110 y 120%). -. Procedimiento. Se realizaron pesadas independientes de 16 mg, 18 mg, 20 mg, 22 mg y 24 mg de metronidazol estándar, las cuales se añadieron a 15mg, 13mg, 11mg, 9mg y 7mg de placebo respectivamente, de tal forma que a cada peso del estándar de metronidazol,. IC. A. le correspondió un peso de placebo, luego se llevaron por separado a matraces. UI. M. aforados de 100 mL, a cada matraz aforado se adicionaron 50 mL de ácido. O Q. clorhídrico 0,1 N y se procedió a sonicar por 10 minutos, seguidamente se enrasó con. BI. ácido clorhídrico 0,1 N y se agitó durante 5 minutos. Cada solución anterior se dejó. IA. Y. decantar y se filtró con papel Whatman N° 40, del filtrado se midieron 5 mL de cada. AC. una de ellas y se transfirieron por separado a matraces aforados de 50 mL, luego se. FA R. M. enrasó con ácido clorhídrico 0,1 N y se homogenizó.. DE. Las concentraciones teóricas obtenidas fueron las siguientes: 0,016 mg/mL; 0,018. soluciones. preparadas. fueron. analizadas. conforme. las. condiciones. IO TE. Las. CA. mg/mL; 0,020 mg/mL; 0,022 mg/mL y 0,030 mg/mL respectivamente.. BI. BL. espectrofotométricas indicadas en el punto 2.3.2. 2.4.1.3 ENSAYO DE PRECISIÓN Se evaluó en términos de Repetibilidad y Precisión Intermedia. 2.4.1.3.1. Repetibilidad 2.4.1.3.1.1. Repetibilidad del Sistema. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Se prepararon dos soluciones estándar de acuerdo a lo descrito en el punto 2.3.4 y de acuerdo a las condiciones espectrofotométricas establecidas en el punto 2.3.2, para lo cual se realizaron tres lecturas de cada una. 2.4.1.3.1.2. Repetibilidad del Método A partir de un pool hecho con las muestras a analizar, se prepararon seis muestras. A. individuales de concentración aproximada al 100%, de acuerdo al punto 2.3.5 y de. M. IC. acuerdo a las condiciones espectrofotométricas descritas en el punto 2.3.2, se. O Q. UI. realizaron tres lecturas de cada una.. Y. BI. 2.4.1.3.2 Precisión Intermedia. IA. El análisis se llevó a cabo por dos analistas en días diferentes, igual que en la. M. AC. repetibilidad partimos de un pool de las muestras a analizar y se realizaron 10. FA R. determinaciones individuales de concentración aproximada al 100 %, procediendo a. DE. su preparación según el punto 2.3.5 y de acuerdo a las condiciones. CA. espectrofotométricas descritas en el punto 2.3.2, se realizaron tres lecturas de cada. IO TE. una.. BL. 2.4.1.4 ENSAYO DE EXACTITUD. BI. Para la evaluación de este parámetro se empleó el método de “Placebo cargado”, el cual consiste en adicionar una cantidad de analito sobre el placebo equivalente al peso de dos tabletas. La adición de los estándares, se realizaron a tres niveles de concentración: 80%, 100% y 120%, realizándose tres determinaciones repetidas de cada concentración.. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. -. Procedimiento. Se realizaron pesadas independientes de 16 mg, 20 mg y 24 mg de metronidazol estándar, las cuales se añadieron a 1550 mg de placebo, de tal forma que a cada peso del estándar de metronidazol le correspondió un peso de placebo, luego se llevaron por separado a matraces aforados de 100 mL, a cada matraz aforado se adicionaron 50 mL de ácido clorhídrico 0,1 N y se procedió a sonicar por 10 minutos,. A. seguidamente se enrasó con ácido clorhídrico 0,1 N y se agitó durante 5 minutos.. M. IC. Cada solución anterior se dejó decantar y se filtró con papel Whatman N° 40, del. O Q. UI. filtrado se midieron 5 mL de cada una de ellas y se transfirieron por separado a. BI. matraz aforados de 50 mL, luego se enrasó con ácido clorhídrico 0,1 N y se. Y. homogenizó.. AC. IA. Las concentraciones teóricas obtenidas fueron las siguientes: 0,016 mg/mL; 0,020. Las. soluciones. preparadas. FA R. M. mg/mL y 0,030 mg/mL respectivamente. fueron. analizadas. conforme. las. condiciones. IO TE. CA. DE. espectrofotométricas indicadas en el punto 2.3.2.. BL. 2.4.1.5. RANGO. BI. Se estableció que el rango de este método analítico es de 80% a 120% y se verificó que el método analítico funciona correctamente cuando se aplica a muestras que contienen principio activo a concentraciones iguales a los limites superior e inferior, así como dentro del intervalo de concentración definido.. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.5 ANÁLISIS DE LOS DATOS. 1. ANÁLISIS ESTADÍSTICO23 Los datos obtenidos fueron sometidos a análisis estadístico mediante el programa estadístico. Statistical Package for. the. Social Sciences (SPSS). versión. 22,. considerando parámetros descriptivos como: promedios, desviación estándar,. A. coeficiente de variación porcentual, coeficiente de regresión y coeficiente de. M. IC. determinación. También se utilizaron pruebas inferenciales como t-Student y test Q. EVALUACION. ESTADÍSTICA. DEL. PARÁMETRO. DE. IA. Y. 1.1.. BI. O Q. UI. de Cochran, ambas con un nivel de significancia del 5% (ᾱ = 0,05).. AC. ESPECIFICIDAD. FA R. M. Se realizó el análisis de los componentes de interés tomando como referencia la concentración de cada uno de ellos en la muestra aplicando el método analítico. DE. correspondiente, los excipientes en conjunto fueron tomados como placebo o matriz.. IO TE. CA. Para determinar el porcentaje de interferencia se procedió de las siguientes maneras:. Para muestra con principio activo. BI. BL. Para muestra sin principio activo. PInterferencia=. 𝐿𝑒𝑐𝐼𝑛𝑑𝑖𝑣𝑖𝑑𝑢𝑎𝑙 𝐿𝑒𝑐𝑆𝑡. 𝑥 100. PInterferencia=|100𝑥 (1 −. 𝐿𝑒𝑐𝐼𝑛𝑑𝑖𝑣𝑖𝑑𝑢𝑎𝑙 𝐿𝑒𝑐𝑆𝑡. )|. Donde: PInterferencia. : Porcentaje de interferencia. LecIndividual. : Lectura individual de muestra. LecSt. : Lectura del estándar. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 1.2. EVALUACIÓN ESTADÍSTICA DEL PARÁMETRO DE LINEALIDAD Se determinó para ambos la curva de calibración que relaciona respuesta (absorbancia, área, altura, etc.) con concentraciones o cantidad de analito. Se calculó la recta de regresión con el método de ajuste de los mínimos cuadrados o cálculos directos. Los datos obtenidos a partir de la mejor recta, se utilizaron para estimar matemáticamente el grado de linealidad.. A. Se informó el coeficiente de correlación, la ordenada al origen y la pendiente de la. M. IC. recta de regresión.. O Q. UI. La recta de calibración fue del tipo:. BI. y = bx + a. Y. Donde:. AC. FA R. M. y: Absorbancia, área, altura, etc. IA. x: Concentración o cantidad del analito. IO TE. CA. b: Valor de la pendiente. ∑ 𝑦−∑ 𝑥. b=. 𝑛. ∑ 𝑥𝑦−∑ 𝑥 ∑ 𝑦 𝑛 ∑ 𝑥2 −(∑ 𝑥)2 𝑛. BL. a=. origen). DE. a: Término independiente (intercepto, estimador de la ordenada de. BI. Se halló el coeficiente de correlación “r” que refleja el grado de relación o ligazón entre las variables x e y.. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Test de Linealidad: Coeficiente de variación de los factores de respuestas (f) 𝑦. F= 𝑥 Cf=. Donde:. 𝑆𝑓 𝑥100 𝐹. y= Absorbancia, área, etc. x= Concentración mg/mL. O Q. Y. BI. F= Promedio de f. UI. M. Sf= Desviación estándar de f. IC. A. Cf= Coeficiente de variación de f. AC Varianza del error experimental total. 2 𝑆𝑥𝑦 ∑ 2(∑ 𝑥)2 𝑥 𝑛. 𝑆2. 𝑥𝑦=. BI. BL. IO TE. Sb2=. CA. DE. Varianza de la pendiente b. FA R. M. siguientes formulas estadísticas:. IA. En la significación estadística de la varianza de la pendiente b, se aplicó las. ∑𝑦 2−𝑎 ∑ 𝑦−𝑏 ∑ 𝑥𝑦 𝑛−2. Sb= √𝑆𝑏2. : Desviación de la pendiente. Sbrel (%)= Sb x 100/b. : Desviación estándar relativa. Texp = b/Sb. : Test de t-Student. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Test de proporcionalidad: Varianza del término. Desviación estándar del. Desviación estándar relativa. del Independiente Sa 2 =. término independiente. 2 𝑆𝑏. ∑𝑥 2 𝑛. término independiente. Sa= √𝑆𝑎2. Sarel(%)= Sa x100/a. Límite de confianza del término independiente. Test de t-Student. a – 𝑡𝑆𝑎 < a < a + 𝑡𝑆𝑎. O Q. UI. M. IC. A. texp = a/Sa. Y. BI. 1.3. EVALUACIÓN ESTADÍSTICA DEL PARÁMETRO DE PRECISIÓN. IA. Se expresó como el coeficiente de variación (dispersión de los datos respecto a la. Donde: S = Desviación estándar. 𝑋̅ = Media aritmética de los resultados. BI. BL. IO TE. CA. DE. CV (%) = S x 100/ 𝑥̅. FA R. M. AC. media) de una serie de medidas, se calculó mediante la siguiente fórmula estadística:. 1.4. EVALUACIÓN ESTADÍSTICA DEL PARÁMETRO DE EXACTITUD La exactitud se expresó como el porcentaje de recuperación en la valoración de una cantidad conocida de analito añadida sobre la muestra. Para el cálculo del porcentaje de recuperación, se realizó la siguiente expresión matemática:. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRecuperación = CEncontrados x 100/ CAñadida. Se aplicó el test de igualdad de varianzas: test de G de Cochran, y para confirmar se utilizó el test de t- Student.. 100−𝑅√𝑛. A UI. M. Test de t de Student. 𝐶𝑉. AC. IA. Y. BI. O Q. TExp =. Test de G de Cochran. IC. 2 𝑆𝑀𝑎𝑥 2 2 𝑆1 +𝑆2 +𝑆32 +⋯𝑆𝑛2. GExp =. M. Donde:. FA R. S2: Varianza. DE. R: Recuperación media. CA. n: Número de determinaciones. BL. IO TE. CV: Coeficiente de variación. BI. Las especificaciones y los criterios de aceptación establecidos en la Farmacopea de los Estados Unidos de Americana (USP) son:15. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ESPECIFICACIONES. CRITERIOS DE ACEPTACION. ESPECIFICIDAD. Interferencia no mayor a 2% r2 no menor de 0.990 y = bx + a. LINEALIDAD. Test de Linealidad CV Factor de respuesta menor de 5% DS de la pendiente (b) menor de 2% t de Student exp mayor que t tablas. A. Test de proporcionalidad. IC. t de Student exp menor t tablas Repetibilidad. UI. M. PRECISION. O Q. Repetibilidad del sistema: CV no mayor a 2%. BI. Repetibilidad del método: CV no mayor a 2%. Y. Precisión Intermedia. IA. CV entre 2 analistas no mayor a 2% Porcentaje recuperado de 98 – 102% de lo declarado. M. AC. EXACTITUD. CV no mayor a 2%. FA R. Test de G de Cochran exp menor G tablas. BI. BL. IO TE. CA. DE. Test de t de Student exp menor t tablas. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. III RESULTADOS Tabla 1. Especificidad del método espectrofotométrico UV/Vis para la cuantificación. ABSORBANCIA. RESULTADOS. Estándar. 0,854. ---. Muestra. 0,849. ---. Termólisis Estándar. 0,846. Estable. Termólisis Muestra. 0,847. Fotólisis Estándar. 0,850. Fotólisis Muestra. 0,852. Hidrólisis Alcalina Estándar. 0,848. Hidrólisis Acida Estándar. 0,847. Oxidación Estándar. 0,852. Estable. 0,850. Estable. Estable Estable Estable Estable Estable. CA. DE. Humedad Relativa Muestra. FA R. AC. IA. Y. BI. O Q. UI. M. IC. A. ESTÁNDAR/MUESTRA. M. de metronidazol 500 mg tabletas.. IO TE. Tabla 2. Parámetro de linealidad del método espectrofotométrico UV/Vis para la. BI. BL. cuantificación de metronidazol 500 mg tabletas. LINEALIDAD. ESPECIFICACIONES. RESULTADOS. LINEALIDAD DEL ESTANDAR Ecuación de la recta. Y=bX +a. Y=38,692X + 0,0718. Coeficiente de correlación. Mayor a 0,995. 0,99989999. Coeficiente de determinación. Mayor a 0,990. 0,9998. Coeficiente de variación de. No mayor a 5,0%. 1,280980397. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. los factores respuesta Coeficiente de variación porcentual de (b). No mayor a 2,0%. 1,8321. Pruebas de t de Student. t exp, > t tabla (t tabla= 2,160). 54,58355662. LINEALIDAD DE LA MUESTRA Y=bX +a. Y=36,807X + 0,0974. Coeficiente de correlación. Mayor a 0,995. 0,99984999. Coeficiente de determinación. Mayor a 0,990. 0,9997. Coeficiente de variación de. No mayor a 5,0%. M. IC. A. Ecuación de la recta. O Q. UI. 1,744756505. BI. los factores respuesta. IA. Y. Coeficiente de variación No mayor a 2,0%. Pruebas de t de Student. t exp, > t tabla (t tabla= 2,160). 1,5407 64,90595777. DE. FA R. M. AC. porcentual de (b). CA. Tabla 3. Parámetro de exactitud del método espectrofotométrico UV/Vis para la. BL. EXACTITUD. IO TE. cuantificación de metronidazol 500 mg tabletas.. BI. Porcentaje de recuperación. ESPECIFICACIONES. RESULTADOS. 98,00 – 102,00%. 99,350. t exp. < t tabla. 1,2. promedio Prueba t de Student. (t tabla= 2,306) Prueba G de Cochran. t exp. < t tabla. 0,16. (t tabla= 0,871). 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 4. Parámetro de precisión del método espectrofotométrico UV/Vis para la cuantificación de metronidazol 500 mg tabletas. PRECISIÓN. ESPECIFICACIONES. RESULTADOS. REPETIBILIDAD DEL SISTEMA Coeficiente de variación. Menor a 2,0%. 0,16736316. de lecturas del estándar. IC. 0,23620985. M. Menor a 2,0%. UI. Coeficiente de variación. A. REPETIBILIDAD DEL METODO. O Q. de lecturas de la muestra. Y. Menor a 2,0. 0,132866461. IA. Coeficiente de variación. BI. PRECISION INTERMEDIA. BI. BL. IO TE. CA. DE. FA R. M. AC. de lecturas de analistas. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(40) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IV. DISCUSIÓN. En el presente estudio se validó el método de espectrofotometría UV/Vis para la cuantificación de metronidazol en tabletas recubiertas multifuente, para lo cual se determinaron los parámetros de dosaje: especificidad, linealidad, precisión y exactitud.. IC. A. El parámetro de especificidad mostró conformidad para la degradación forzada, ya. UI. M. que esta no afectó de forma considerable la estabilidad del analito evaluada, sin. O Q. embargo, se observó una degradación marcada cuando las muestras fueron. BI. sometidas a la acción de temperatura, ácidos y bases fuertes.. IA. Y. En la tabla 1, respecto a este parámetro al aplicar el análisis estadístico, se obtuvo. AC. un porcentaje de interferencia no mayor al 2% lo que representó un resultado. FA R. M. satisfactorio.. DE. Para las muestras sometidas a estrés, el porcentaje de interferencia se convierte en. CA. un indicativo de degradación que ha sufrido la molécula. 22. IO TE. Para los métodos cromatográficos dicho porcentaje de interferencia permite. BL. determinar la especificidad (selectividad) del método respecto al diluyente, fase. BI. móvil y matriz de la forma farmaceutica.24 Para los productos de degradación sometidos a ciertas condiciones, la Asociación Española de Farmacéuticos de la industria (A.E.F.I) hace mención que se puede lograr una degradación del 10 % al 20 %. Con la finalidad de evaluar la degradación o la interferencia de los excipientes. 25 En la Tabla 2, respecto al parámetro de linealidad para el sistema también hubo conformidad, puesto que para el estándar se obtuvo un coeficiente de correlación 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(41) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. (r) de 0,9999; siendo el valor de t de Student experimental mayor que el t Tabla (54,584> 2,160) para un nivel de probabilidad (α) de 0,05; por lo que la pendiente difiere significativamente de cero.. El análisis estadístico de regresión lineal para la muestra ofreció al método un coeficiente de correlación (r) de 0,9998; el valor de t de Student experimental fue. A. mayor que el t Tabla (64,906> 2,160) para un α de 0,05; cumpliendo así el criterio. M. IC. de aceptación de pendiente distinta de cero (t exp > t tabla). Resultado que está. O Q. UI. relacionado con la sensibilidad del método de forma que a mayor pendiente mayor. BI. sensibilidad (respuesta del método frente a los cambios de la concentración del. AC. IA. Y. analito).23. FA R. M. En el test de linealidad la Desviación estándar relativa o Coeficiente de variación porcentual (DSR) de la pendiente (b) para el estándar y la muestra fueron: 1,8321. DE. y 1,5407 respectivamente. La FDA sugiere que el coeficiente de variación de los. CA. factores de respuesta debe estar por debajo del 15 % para ser considerado. BL. IO TE. aceptable. Con lo que se corroboró la relación lineal.26. BI. Con respecto al parámetro de exactitud, en los resultados presentados en la tabla 3, el porcentaje de recuperación promedio fue de 99,35%; la prueba t-Student para evaluar la recuperación del método resultó 1,2042 siendo menor al t de tabla de 2,306; lo que significa que no hubo diferencia significativa entre variables.. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(42) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. La exactitud se determina teóricamente utilizando material de referencia certificado (MRC), si es posible métodos de referencia, estudios en colaboración o mediante comparación con otros métodos. 28. Lo normal es estimar la exactitud utilizando muestras añadidas con tres concentraciones distintas (baja, media y alta) que abarquen la totalidad del rango. A. de trabajo. La concentración de estas adiciones estándar debe ser distinta de la. M. IC. utilizada para preparar las curvas de calibración y debe prepararse con una. O Q. UI. solución estándar de trabajo distinta. Los criterios de aceptación de la exactitud. Y. BI. deben ser similares a los utilizados para medir la precisión.27. AC. IA. Para evaluar la influencia de la concentración sobre los resultados se aplicó la. FA R. M. prueba G de Cochran (Q de Cochran), dando como resultado 0,1599 siendo menor que el G tabular. Por lo tanto, tampoco hubo diferencia significativa respecto a las. DE. varianzas dando un resultado positivo de precisión.. CA. El test G de Cochran es un test utilizado para comprobar la igualdad de varias. IO TE. muestras relacionadas en una variable dicotónica. Es un test equivalente al “test de. BL. Mc Nemar” para más de dos poblaciones. El contraste de hipótesis tiene como. BI. hipótesis nula la igualdad de proporciones.29. En la precisión, evaluada como repetibilidad y precisión intermedia mostradas en la tabla 4, la repetibilidad tuvo un coeficiente de variación determinado para el sistema de 0,1674% y para el método un coeficiente de variación de 0,2362%; en ambos casos menores al 2% no existiendo diferencia significativa.. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.