OBTENCIÓN DEL PERFIL ELECTROFORETICO Y EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS PROTEICOS ACUOSOS A PARTIR DE HOJAS Y SEMILLAS DE Conyza trihecatactis (Fam. Asteraceae) ANTE LAS CEPAS DE Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Fusarium oxysporium, Botrytis sp. y Colletotrichum sp.
AUTOR
JULIANA MARCELA VÁSQUEZ TIBOCHA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTA D.C
OBTENCIÓN DEL PERFIL ELECTROFORETICO Y EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS PROTEICOS ACUOSOS A PARTIR DE HOJAS Y SEMILLAS DE Conyza trihecatactis (Fam. Asteraceae) ANTE LAS CEPAS DE Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Fusarium oxysporium, Botrytis cinerea y Colletotrichum sp.
AUTOR
JULIANA MARCELA VÁSQUEZ TIBOCHA
__________________________ ________________________ Dra. Ingrid Schuler García Dr. Gerardo Moreno
OBTENCIÓN DEL PERFIL ELECTROFORETICO Y EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS PROTEICOS ACUOSOS A PARTIR DE HOJAS Y SEMILLAS DE Conyza trihecatactis (Fam. Asteraceae) ANTE LAS CEPAS DE Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Fusarium oxysporium, Botrytis cinerea y Colletotrichum sp.
AUTOR
JULIANA MARCELA VÁSQUEZ TIBOCHA
_____________________________ ____________________________ Dr. Ricardo Vera Bravo Dr. Jorge Robles
Director Evaluador
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución No 13 de Julio de 1946.
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de grado. Solo velara por qué no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que la tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar
AGRADECIMIENTOS:
NOTA:
Este trabajo de grado se encuentra financiado bajo el proyecto de investigación de
convocatoria interna titulado “Evaluación de la actividad antimicrobiana y
antifúngica de las fracciones proteicas de los extractos polares de hojas y semillas de las especies Pentacalia nitida, Pentacalia ledifolia, Conyza trihecatactis y Conyza bonariensis nativas de los páramos colombianos”. Dirigido por el profesor
INDICE DE CONTENIDO:
Pág.
Lista de Abreviaturas 9
Resumen 10
1. Introducción 11
2. Justificación y Planteamiento del Problema 12
3. Marco Teórico 13
3.1 Péptidos Antimicrobianos 13
3.2 Microorganismos 15
3.3 Conyza trihecatactis 16
3.4 Precipitación de Proteínas 17
3.5 Electroforesis SDS-PAGE 12% 18
3.6 Electroforesis Tricina-SDS-PAGE 18
3.7 Cromatografía de Intercambio Iónico 18
4. Objetivo General 19
4.1 Objetivos Específicos 19
5. Metodología 20
5.1 Recolección del material vegetal 20
5.2 Microorganismos 20
5.3 Extracción de Proteínas 20
5.4 Precipitación de Proteínas 21
5.5 Cromatografía de Intercambio Iónico 22
5.6 Electroforesis 23
5.7 Actividad antimicrobiana 23
5.7.1 Actividad antibacteriana 23
5.7.2 Actividad antifúngica 23
6. Resultados y Discusión 25
6.1 Recolección y selección del material vegetal 25
6.2 Microorganismos 25
6.2.1 Escherichia coli 25
6.2.2 Staphylococcus aureus 25
6.2.3 Listeria monocytogenes 25
6.2.4 Fusarium oxysporum 25
6.2.5 Colletotrichum sp. 26
6.2.6 Botrytis sp. 26
6.3 Extracción de Proteínas 26
6.4 Precipitación de Proteínas 28
6.5 Cromatografía de Intercambio Iónico 33
6.6 Electroforesis Tricina SDS-PAGE 34
7. Conclusiones 35
8. Recomendaciones 36
9. Anexos 37
9.1 Recolección y selección del material vegetal 37
9.2 Microorganismos 38
9.3 Cromatografía de Intercambio Aniónico 41
9.4 Actividad antimicrobiana 42
9.4.1 Actividad antibacteriana 42
9.4.1.1 Ensayo difusión en agar 42
9.4.1.2 Ensayo en microdilución 45
9.4.2 Actividad antifúngica 46
10. Bibliografía 48
LISTA DE ABREVIATURAS
AW: Actividad de agua BCA: Ácido Bicinconinico
Caldo BHI: Caldo Infusión cerebro corazón EDTA: Ácido etilendiaminotetracético HCl: Ácido clorhídrico
HEPES: Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-pipetazinaetanosulfonico LTP: Proteínas de transferencia de lípidos
PAGE: Electroforesis en gel de poliacrilamida PDA: Agar Papa Dextrosa
RESUMEN
1. INTRODUCCION
Desde la antigüedad se tiene conocimiento de que las plantas contienen un gran número de sustancias con actividad inhibitoria frente a levaduras, bacterias y hongos filamentosos; se han reportado más de 1340 plantas como fuente de estos compuestos por lo tanto prometen ser una nueva alternativa al uso de productos antimicrobianos sintetizados químicamente, a los cuales microorganismos patógenos ya han creado resistencia principalmente por alteraciones y mutaciones en la pared celular o genes transportados por plásmidos (1).
Algunas sustancias de plantas del género Conyza se les atribuye actividad antimicrobiana, aisladas principalmente de metabolitos secundarios (2). Este género es uno de los más complejos dentro de la familia Asteraceae, no solo por su carácter cosmopolita sino por la cantidad de especies que lo forman (3) y se encuentra ampliamente distribuido en las zonas tropicales y subtropicales, con cerca de 100 especies. Dentro de este género se encuentra la planta Conyza trihecatactis, más conocida como venadillo (4), sobre la cual se realizó el estudio. Fue recolectada vía al Páramo de Sumapaz que se encuentra ubicado en el Departamento de Cundinamarca entre 3700-4000 M.S.N.M con un área de 46.000 ha, considerado el segundo centro biogeográfico de importancia en la cordillera Oriental Colombiana con más de 200 géneros de plantas vasculares y endémicas (5). C. trihecatactis es una hierba que se caracteriza porque crece hasta 150 cm, su tallo es erguido, ramificado en la parte superior, presenta numerosas hojas simples y alternas, las flores están dispuestas en capítulos pequeños agrupados en una inflorescencia terminal, las lígulas son blanquecinas, muy cortas y el fruto
es un aquenio piloso (6). Puesto que esta planta ha sido poco estudiada representa una posible fuente de compuestos antimicrobianos.
2. JUSTIFICACION Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA:
La producción de antimicrobianos sintéticos genera gran cantidad de subproductos que causan daños al ambiente y afectan la salud de las personas, además de la resistencia que ciertos microorganismos patógenos han creado contra estas sustancias (8), por lo tanto se han realizado estudios sobre algunos metabolitos secundarios de origen vegetal para comprobar su actividad antimicrobiana y su posible aplicación farmacéutica. Sin embargo, en Colombia se han realizado pocas investigaciones en las que se busque este tipo de actividad en extractos proteicos acuosos vegetales por tal razón, en este estudio preliminar se quiso extraer y evaluar la presencia de este tipo de compuestos con características antimicrobianas a partir de las hojas y las semillas de Conyza trihecatactis como una fuente renovable no contaminante, los cuales tienen interés tanto en el ámbito de la salud como en alimentos y biotecnología para reemplazar aquellos compuestos sintetizados químicamente. Por otra parte se obtuvo el perfil electroforético de la planta con el fin de analizar las diferentes proteínas presentes en el extracto y adicionalmente se empleo de manera indirecta como un control de la cantidad de proteína aislada en semillas y hojas.
3. MARCO TEORICO
Conyza trihecatactis es una planta nativa de Colombia localizada principalmente en el Páramo de Sumapaz. Se han realizado estudios sobre el tipo de metabolitos secundarios encontrados en hojas tales como diterpenos tipo labdanos y diterpenos xilosidos, ent-esclareol (7) sin embargo no se han reportado investigaciones que demuestren la actividad antimicrobiana de metabolitos primarios proteicos en hojas y semillas. No obstante se han llevado a cabo estudios con otras especies que han mostrado actividad antimicrobiana, específicamente péptidos, los cuales han sido ampliamente estudiados en hojas, flores y raíces (9). A continuación se presenta una breve explicación acerca de las diferentes clases de péptidos con actividad antimicrobiana y el mecanismo de acción aislados de otras plantas.
3.1 Péptidos antimicrobianos:
Alrededor de 106-107 Células/cm2 de microorganismos, principalmente bacterias, están situados en la filosfera de las plantas, específicamente en las hojas, los cuales hacen parte de la ecología vegetal estableciéndose un equilibrio que se altera principalmente por colonización de un microorganismo patógeno causando enfermedades infecciosas a la planta (10), por lo tanto con la evolución han generado numerosos mecanismos de defensa para minimizar los efectos de estos ataques. Además de compuestos fenólicos, alcaloides y metabolitos secundarios los péptidos antimicrobianos desempeñan un papel clave en la defensa contra microorganismos patógenos, empleando diferentes mecanismos de acción, los cuales hacen parte de la respuesta innata de las plantas, es decir corresponden a metabolitos primarios. Estos metabolitos primarios proteicos tienen un gran potencial en el ámbito clínico puesto que pueden ser empleados en tratamientos de enfermedades bacterianas en humanos, en la industria de alimentos como biopreservativos, bioinsecticidas y el desarrollo de plantas genéticamente modificadas que tengan mayor resistencia contra fitopatógenos. Diferentes proteínas de bajo peso molecular han sido ampliamente estudiadas desde un principio en tejidos de plantas tales como raíces, hojas, semillas y flores, y se han podido identificar diferentes péptidos con capacidad antimicrobiana de los cuales los más estudiados son las defensinas, proteínas de transferencia de lípidos (LTP), heveinas, proteínas de unión a la mirosinasa y tioninas (9)(11).
Defensinas: Más conocidas como alfa tioninas son unos de los péptidos
de plegamiento tridimensional estabilizado por cuatro puentes disulfuro que incorporan cisteínas. El mecanismo de acción de estos péptidos se basa en interacciones no covalentes entre los péptidos y los esfingolípidos o glicosilceramidas de las membranas celulares de los insectos, inhibe el crecimiento de los hongos por interacciones electrostáticas que conduce a una desestabilización por la inducción de absorción de Ca+ y K+ (9,11).
Proteínas de transferencia de lípidos (LTPs): Son péptidos solubles y
catiónicos, encontrados en varias especies de plantas como cebada, vid, trigo, espinaca y cebolla, principalmente en flores y hojas. Están subdivididas en LTP1s y LTP2s, las cuales presentan pesos moleculares de 9 y 7 KDa respectivamente, son llamadas así porque están implicados en el transporte de lípidos y esfingolípidos a través de la membrana celular, asociados con la biosíntesis de cutina y moléculas de señalización en la respuesta inmune. Al igual que las defensinas en su estructura presentan ocho cisteínas formando cuatro puentes disulfuro y parecen tener un papel importante durante el ataque de patógenos, estrés salino y cambios bruscos de temperatura (9, 11).
Heveinas: Son pequeños péptidos que se unen a la quitina, se encuentran
principalmente en flores, constan de 43 residuos de aminoácidos, fueron aislados en un principio de la planta del latex de caucho y contienen ocho puentes disulfuro. El modo de acción consiste en la penetración a las hifas, por su afinidad a la quitina, que conduce a la ruptura de las células (9).
Proteínas de unión a la mirosinasa (MBPs): Son catiónicas, tienen dos puentes
disulfuro, están involucradas en el desarrollo de la planta y en actividades de defensa, principalmente contra insectos y otros patógenos. El mecanismo de acción ha sido poco estudiado pero se cree que actúan como ionoforos a través de la membrana microbiana (9).
Tioninas: Tienen un peso molecular de 5 KDa, generalmente son básicas ricas en
cisteínas y fueron aisladas de cereales. Se encuentran generalmente en hojas y su principal característica es su actividad antifúngica y antibacteriana similar a las defensinas puesto que conducen a la permeabilización de las membranas celulares (11).
en bacterias Gram positivas. Una vez el péptido atraviesa la pared celular e ingresa a la membrana citoplasmática interactúa con los grupos cargados negativamente del interior. En esta etapa el péptido asume una conformación anfipática donde el extremo hidrófilo interactúa con la cabeza fosfolipídica mientras que el extremo hidrobófico se inserta en el centro de la bicapa. Estas interacciones pueden causar daños estructurales a la membrana y ser resultado de varios mecanismos tales como: Las moléculas peptídicas se acumulan en la superficie afectando la membrana de manera similar a un detergente y formación de poros (12).
Puesto que los microorganismos patógenos están creando resistencia contra los antimicrobianos tradicionales obtenidos de manera sintética, el uso de plantas como fuente de nuevas moléculas biológicamente activas está siendo investigado en los últimos años, principalmente proteínas. La información disponible hasta la fecha demuestra que los diferentes antimicrobianos de origen vegetal pueden reducir efectivamente o inhibir el microorganismo patógeno, por lo tanto tienen un potencial para convertirse en una buena alternativa a los antibióticos sintéticos (13).
3.2 Microorganismos: En los últimos 7 años han sido reportados algunos
estudios en los cuales se observa un incremento en la tasa de resistencia a antimicrobianos por parte de algunos microorganismos patógenos (14). Esta resistencia puede ser generada por la transferencia de información genética mediante plásmidos, transposones, genes y en el caso de Escherichia coli la alteración en la regulación del locus mar (15).
3.2.1 Escherichia coli: Es una bacteria de forma bacilar Gram negativa perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, es facultativa por lo tanto tiene la capacidad de crecer y colonizar diferentes reservorios, ya sea libre en el ambiente o en el tracto gastrointestinal de mamíferos y aves. En su respiración anaerobia compuestos como citrato, NO3, y NO2 reemplazan al oxigeno como aceptor final de electrones. Es un microorganismo mesofílico el cual se replica en un amplio rango de temperaturas 7-45°C siendo el óptimo 37°C, crece a un pH entre 4-10 y un AW de 0,95; es decir la cantidad de agua libre en el alimento. Al ingerir alimentos contaminados con E. Coli puede generar diarrea crónica, síndrome de disentería, diarrea con sangre, entre otros (14).
como 0,83. Se encuentra principalmente en la piel de humanos y animales (14). Este microorganismo produce exfoliatina tipo A y B que causan dermatitis exfoliativa estafilococica, Toxina TSS 1 y enterotoxina estafilocócica A-C que causan el síndrome de shock tóxico (16).
3.2.3 Listeria monocytogenes: Es un bacilo Gram positivo no esporulado motil a 22 °C, catalasa positiva y oxidasa negativa, es capaz de hidrolizar la esculina y genera
ᵦ
-hemolisis. Su temperatura óptima de crecimiento es 30 a 37°C, pero puede crecer de -0,4 hasta 45°C. El rango óptimo de pH para el crecimiento es de 6 a 8, aunque se ha reportado que crece entre pH de 4,4 y 9,6. Es capaz de sobrevivir en AW 0,91. Este es un microorganismo altamente patógeno puesto que su consumo en alimentos contaminados causa listeriosis tanto a niños como adultos, pero principalmente en mujeres embarazadas debido a que provoca abortos (14).3.2.4 Fusarium oxysporum: Es un hongo filamentoso saprófito, con alta especificidad, capaz de crecer y sobrevivir por largos periodos de tiempo en materia orgánica, suelos y en la rizosfera de las plantas. Este microorganismo penetra las raíces e induce la pudrición de la raíz o traqueomicosis cuando invaden el sistema vascular de la planta, lo cual genera grandes pérdidas económicas en cultivos de tomate, tabaco, cebada, entre otros (17).
3.2.5 Colletotrichum sp.: Es un hongo fitopatógeno que ataca hojas, frutas y flores. Causa antracnosis que afecta diversos cultivos en todo el mundo tales como fresa, judías arbustivas y guayaba (18). Esta enfermedad genera grandes pérdidas económicas anuales y se caracteriza por generar lesiones hundidas de color naranja en los frutos jóvenes, que por lo general se marchitan y mueren, y permanecen en el árbol. Las hojas infectadas muestran lesiones acuosas, amarillamiento, marchitez y una posterior necrosis marginal (19).
3.2.6 Botrytis sp.: Este hongo fitopatógeno conocido como el moho gris, produce una gama de toxinas, compuestos de bajo peso molecular como el acido oxálico y enzimas que degradan la pared celular del hospedero, causando pérdidas en más de 200 cultivos en todo el mundo. Este microorganismo genera podredumbre blanda y ataca a flores, tallos, hojas y frutos (20).
algunas especies son arbustos como en este caso, sus hojas son principalmente alternas, simples o compuestas, su fruto es un aquenio piloso (21).
3.4 Precipitación de proteínas: La solubilidad de una proteína es el resultado de
interacciones polares y apolares con el solvente, interacciones iónicas con sales e interacciones de repulsión electrostática entre moléculas con la misma carga. A continuación se presentan los métodos de precipitación de proteínas empleados en la investigación (22).
3.4.1 TCA/acetona: las proteínas pueden ser precipitadas por la adición de solventes orgánicos miscibles en agua tales como etanol y acetona. Este mecanismo se basa en la disminución del poder hidrofílico del agua por la adición de altas concentraciones del solvente orgánico (acetona). El efecto en las proteínas solubles en agua y proteínas citoplasmáticas es una disminución en la solubilidad generando una agregación y precipitación proteica por el desplazamiento del agua alrededor de la proteína lo cual promueve interacciones electrostáticas interproteína. Este tipo de precipitaciones se lleva a cabo generalmente a temperaturas por debajo de 0°C puesto que la adición del solvente a la mezcla genera calor. Se reporta que para obtener la mayor cantidad de proteína precipitada se usa del 20 al 50% acetona en la solución. No obstante, la adición de ácido tricloroacético además de contribuir a la precipitación por denaturalización de la proteína remueve sales interferentes así como algunos contaminantes no dializables (22).
3.4.3 Sulfato de amonio: El sulfato de amonio deshidrata el microambiente de la molécula de la proteína. En solución un gran número de moléculas de agua son enlazadas al ion sulfato, reduciendo la cantidad de agua disponible para interactuar con la molécula de la proteína. La solubilidad del sulfato de amonio es constante entre 0 y 30°C, pH neutros entre 6 y 7,5 (22).
3.5 Electroforesis SDS-PAGE 12%: La electroforesis es una técnica de
separación de moléculas en una mezcla a través de un campo eléctrico. Estas moléculas migran a una velocidad que está determinada por su relación carga-masa. Esta electroforesis se realiza bajo condiciones denaturantes puesto que el SDS, un detergente aniónico, rompe los enlaces que mantienen la conformación nativa de la proteína y brinda carga negativa (24).
3.6 Electroforesis Tricina-SDS-PAGE: Es comúnmente usado para separar
proteínas con pesos moleculares entre 1 y 100 KDa y específicamente para obtener una mejor resolución y separación de proteínas con pesos moleculares menores a 30 KDa. En este sistema electroforético se emplean concentraciones de acrilamida menores a los otros sistemas, lo cual facilita la electrotransferencia, que es crucial para proteínas hidrobóficas (25).
3.7 Cromatografía de Intercambio Iónico: Es un tipo de cromatografía liquida,
4. OBJETIVO GENERAL
Establecer el perfil electroforético y evaluar la actividad antimicrobiana del extracto proteico acuoso a partir de semillas y hojas de Conyza trihecatactis frente a las cepas de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Fusarium oxysporum, Botrytis sp y Colletotrichum sp.
4.1 OBJETIVOS ESPECIFICOS
Seleccionar el método que permita la mejor extracción de proteínas del extracto acuoso a partir de las hojas y semillas de Conyza trihecatactis.
Definir la concentración de sulfato de amonio que permita una mayor precipitación de proteínas en el extracto acuoso.
Obtener el perfil electroforético de la fracción proteica acuosa de las semillas y hojas de la planta.
5. METODOLOGIA:
Para cumplir con los objetivos planteados se realizaron los siguientes procedimientos y actividades.
5.1 Recolección del material vegetal:
La planta Conyza trihecatactis fue recolectada vía al Páramo de Sumapaz en el Departamento de Cundinamarca e identificada en el herbario de la Pontificia Universidad Javeriana. Se realizó la selección, clasificación del material vegetal (hojas y semillas) y se almacenaron a -20°C hasta su uso.
5.2 Microorganismos:
Los microorganismos empleados en la investigación fueron obtenidos del cepario de la Pontificia Universidad Javeriana. Las cepas son: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes a partir de las cuales se realizó un Banco de cepas bacteriano con una concentración de 10 8 UFC/ml y se almacenó a -20°C. Las cepas de hongos son: Fusarium oxysporum, Botrytis sp. y Colletotrichum sp., los cuales fueron repicados en agar PDA suplementado con cloranfenicol al 0,02% con frecuencia para conservar su viabilidad y pureza.
Se evaluaron las características morfológicas de los microorganismos para confirmar su pureza y género, adicionalmente se realizó un microcultivo de los hongos con el fin de observar estructuras microscópicas sensibles al montaje de la técnica azul de lactofenol y así confirmar el microorganismo.
5.3 Extracción de Proteínas:
Con el fin de establecer un protocolo que permita la mayor recuperación de proteínas del extracto acuoso de hojas de C. trihecatactis se evaluaron diferentes buffers de extracción.
saturado al 70% con sulfato de amonio (0,41g de sulfato de amonio) y almacenado a 4°C toda la noche. Una vez precipitadas las proteínas se centrifugó nuevamente a 10000 g por 10 minutos a 4°C. El sobrenádate fue descartado y el precipitado resuspendido en 100 µl de la solución de extracción correspondiente, se dializaron las muestras y se realizó electroforesis SDS-PAGE 12% para evaluar la presencia de proteínas y cuantificación con BCA (28).
5.4 Precipitación de proteínas:
Para obtener la mejor resolución de bandas en el gel de electroforesis SDS-PAGE 12% y la mayor precipitación de proteínas del extracto acuoso fueron evaluados tres protocolos diferentes: TCA-acetona, Fenol-Tris y Sulfato de amonio. Para este ultimo método, fueron ensayados 4 porcentajes diferentes de saturación (30, 50, 70 y 90%).
5.4.1 Protocolo TCA/acetona: A 1 g de material vegetal (hojas y semillas) macerado con nitrógeno líquido se añadieron 0,0025g de polivinilpolipirrolidona (PVPP), a partir del cual fueron tomados 0,2 g del macerado, distribuidos en dos tubos eppendorf (0,1g en cada tubo) y lavados tres veces con 1ml de acetona fría, centrifugando a 10000 g por 3 minutos a 4°C. Se adicionó 1 ml de buffer de extracción (1,5% PVPP, 0,1M Buffer fosfato, 10mM KCl y 2 mM EDTA, pH 7,5) y se dejó extrayendo por 2 horas a 4°C. Pasado este tiempo la muestra fue centrifugada a 12000 g por 20 minutos a 4°C, el sobrenadante se transfiere a un nuevo tubo con la solución de precipitación que consiste en 10% de TCA (ácido tricloroacético), 0,07% de
ᵦ
-mercaptoetanol en 2 ml de acetona fría, posteriormente la muestra es sonicada por 30 minutos y se deja precipitar toda la noche a -20°C (29, 30). Nuevamente se centrifuga a 12000 g por 20 minutos a 4 °C, el sobrenadante es descartado y el precipitado se lava tres veces con 400 µL de acetona fría centrifugando a 10000 g por 5 minutos a 4°C entre cada lavado. Finalmente el remanente de acetona se deja secar y el pellet es resuspendido en 70 µL de buffer fosfato 0,1M pH 7,5. A partir de este volumen se realiza la electroforesis SDS-PAGE 12% y cuantificación por BCA.ᵦ
-mercaptoetanol y 4mM de pefabloc, ajustado a un pH 8.0. Se agita la muestra por 5 minutos en hielo y son adicionados 0,2 ml de buffer Tris saturado con fenol, agitando 10 minutos a temperatura ambiente y centrifugando a 10000 g durante 10 minutos a 4°C. Se recupera la fase fenólica, es decir la fase superior, y se añaden 0,2 ml de buffer de extracción, es agitado por 3 minutos y nuevamente se centrifugado a 10000 g por 10 minutos a 4°C. Se recupera la fase fenólica y se adicionan 4 volúmenes de la solución de precipitación que contiene acetato de amonio 0,1M en metanol puro frío. Las proteínas son precipitadas toda la noche a -20°C. Finalmente centrifugar a 10000 g por 10 minutos a 4°C y realizar tres lavados con 30 µL de solución de precipitación y otro lavado con 30 µL de acetona fría, centrifugando a las mismas condiciones (23). Posteriormente se resuspendió en 70 µL de buffer Fosfato 0,1 M pH 7,5, se realizo electroforesis SDS-PAGE 12% y cuantificación de las proteínas del extracto crudo por BCA.5.4.3 Sulfato de amonio: a partir de 1 g de material macerado con nitrógeno líquido se tomaron 0,2 g y fueron distribuidos en dos tubos eppendorf con 0,1 g cada uno. Se realizaron 3 lavados con 1 ml de acetona fría centrifugando entre cada lavado a 10000 g por 3 minutos a 4°C. Posteriormente se dejó evaporar los residuos de acetona impregnados en el material vegetal en cámara de vacío a temperatura ambiente toda la noche. Se añadió 1 ml de la solución de extracción que contiene 1,5% PVPP, 10mM KCl y 2 mM EDTA en Buffer fosfato 0,1 M pH 7,5, extrayendo r a 4°C por 2 horas. Pasado este tiempo las muestras fueron centrifugadas a 10000 g por 10 minutos a 4°C, se separó el sobrenadante del material vegetal precipitado y el extracto acuoso fue saturado con sulfato de amonio al 30, 50, 70 y 90% (31, 32, 33). Se almacenó a 4°C toda la noche. Nuevamente se centrifugó a 10000 g por 10 minutos a 4°C. El sobrenádate es descartado y el precipitado fue resuspendido en 100 µL de buffer fosfato 0,1M pH 7,5. Posteriormente se dializó la muestra en 500 ml de buffer fosfato y filtrada (tamaño del poro 0,45 µm). Se realizó cuantificación con BCA y electroforesis SDS-PAGE 12% al extracto con mayor concentración de proteína, tanto para hojas como para semillas.
5.5 Cromatografía de intercambio iónico:
se recolectaron 60 fracciones, las cuales fueron cuantificadas por el método de BCA. Adicionalmente se evaluó actividad antibacteriana en microdilución a las fracciones que presentaron mayor concentración.
5.6 Electroforesis:
Se realizó electroforesis SDS-PAGE 12% (35) según el método de Laemmli (36) a los extractos obtenidos con diferentes buffers de extracción (numeral 3.1) y a los extractos obtenidos en los métodos de precipitación evaluados (numeral 4.1, 4.2, y 4.3). Se uso un voltaje de 120 voltios, se tiñeron con azul de Commassie y plata (37). Por otra parte se realizó electroforesis Tricina-SDS-PAGE con el extracto crudo obtenido por el método del sulfato a partir de los 20 g de hojas y semillas. Se realizó de acuerdo al protocolo establecido por Schagger, 2006, con algunas modificaciones (25). A este gel también se le realizó doble tinción (Azul de Commassie y plata) (37).
5.7 Actividad antimicrobiana:
5.7.1 Actividad antibacteriana: La actividad antibacteriana del extracto proteico acuoso de hojas y semillas de C. trihecatactis se evaluó por el método de difusión en agar, para el cual se sirvieron 17 ml de agar TSA y agar TSA suplementado con 0,6% de extracto de levadura, se dejó gelificar y se adicionaron 7 ml de agar TSA fundido con S.aureus y E.coli y agar TSA suplementado con 0,6% de extracto de levadura con L.monocytogenes respectivamente. Se homogenizó y se adicionaron 50 µl del extracto proteico, buffer fosfato como control negativo y cloranfenicol (1mg/ml) (antibacteriano de amplio espectro) como control positivo a los pozos previamente realizados una vez solidificado el agar. Se incubaron a 37°C durante 4 días, todos los ensayos se realizaron por triplicado (37).
Para corroborar el resultado obtenido por este método se realizó el ensayo en microdilución. Se tomaron 50 µl de la suspensión bacteriana, 50 µl del extracto crudo o de las fracciones y 100 µl de caldo BHI y se añadieron en un pozo. Este ensayo se realizó por triplicado y se establecieron cinco controles: caldo BHI, bacteria y cloranfenicol (1mg/ml); caldo BHI y extracto crudo de hojas; caldo BHI y extracto crudo de semillas; caldo BHI y buffer fosfato; Caldo BHI y bacteria. Posterior a la siembra se incubó a 37°C por 24 horas. Pasado este tiempo se adicionaron 20 µl de TTC (cloruro de trifenil tetrazolium) 20mg/ml (38), se agitó y se incubó a 37°C por 1 hora.
6. RESULTADOS Y DISCUSION:
6.1 Recolección y selección del material vegetal:
Se seleccionaron plantas pertenecientes al género C. trihecatactis con las siguientes características: arbusto de 150 cm de altura aproximadamente, numerosas hojas simples y alternas, lígulas blanquecinas y aquenios pilosos. (6) (ver Anexo 9.1). Adicionalmente fueron identificadas en el herbario de la Pontificia Universidad Javeriana donde se encuentra registrada bajo el número 27543.
6.2 Microorganismos:
Se evaluaron las características macroscópicas y microscópicas de los microorganismos empleados en la investigación mediante la coloración de Gram para bacterias y tinción con azul de lactofenol para hongos.
6.2.1 Escherichia coli: Este microorganismo se observó como un bacilo Gram negativo corto no esporulado de crecimiento rápido con colonias grandes de color blanco y bordes irregulares. Su temperatura óptima es de 37°C, es capaz de fermentar la glucosa a piruvato, el cual es metabolizado hasta ácidos orgánicos como láctico, acético y fórmico, por lo tanto hay una disminución del pH del medio (38) (ver anexo 9.2 Figura 1).
6.2.2 Staphylococcus aureus: Se observaron cocos Gram positivos agrupados en diplococos, tétrada y estafilococos (racimos). Sus colonias son cremosas blancas pequeñas y con bordes regulares (16) (ver anexo 9.2 Figura 2).
6.2.3 Listeria monocytogenes: Es una bacteria en forma de bacilo Gram positiva, no esporuladas, es motil a 22°C, sus colonias son blancas muy pequeñas con bordes regulares y es considerado un microorganismo altamente peligroso en mujeres en estado de embarazo que estén en el segundo o tercer trimestre de gestación puesto que provoca abortos (39) (ver anexo 9.2 Figura3).
6.2.5 Colletotrichum sp: Las colonias son de color café verdoso claro en el anverso, café oscuro en el reverso, son de textura algodonosa y no producen pigmento difusible al medio. Al realizar la tinción con azul de lactofenol se observaron conidios ovalados, alargados, hialinos y septados, hifas delgadas hialinas y septadas (41) (ver anexo 9.2 Figura 5).
6.2.6 Botrytis sp: se observaron colonias blancas tanto en el anverso como en el reverso, textura algodonosa con abundante micelio aéreo, sin producción de pigmento difusible al medio. En cuanto a las características microscópicas se observaron hifas demateaceas gruesas y septadas, algunas hialinas por ser hifas más jóvenes, conidios redondos hialinos originados en los ápices y conidióforos con ramificaciones (42) (ver anexo 9.2 Figura 5).
6.3 Extracción de proteínas:
[image:26.612.81.531.500.615.2]Para recuperar la mayor cantidad de proteína del extracto acuoso se evaluaron cuatro porcentajes de saturación con sulfato de amonio (30, 50, 70 y 90%) tanto para hojas como para semillas. De acuerdo con la información de la Tabla 1 en la que se observan los resultados arrojados de la cuantificación de proteínas a diferentes porcentajes de saturación de sulfato de amonio, se obtuvo una mayor concentración de proteína con el 70% de saturación para semillas y para hojas. Tabla 1: comparación en la concentración de diferentes porcentajes de saturación con sulfato de amonio del extracto acuoso tanto de hojas como de semillas.
30% 50% 70% 90%
Hojas 377+/-40
µg/ml 747+/-7 µg/ml 1689+/-7 µg/ml 517+/-7 µg/ml
Semillas 1598+/-57
µg/ml 1656+/-118 µg/ml 1965 +/-10 µg/ml 1103+/-40 µg/ml
superiores de 0,1M (29), por lo tanto se empleó buffer fosfato para la extracción. Según un estudio realizado con proteínas globulares obtenidas de las semillas de la soya, al evaluar Tris-HCl en la extracción a pH 7,5 no se obtuvo un buen resultado, sin embargo a pH más básicos se recupero la mayor cantidad de proteína (27), por lo tanto el pH es otro factor determinante en la extracción y recuperación de proteínas.
El buffer fosfato es ampliamente utilizado por su compatibilidad con cromatografía de intercambio iónico, inhibe una gran cantidad de enzimas que pueden afectar la estabilidad de la proteína y por su bajo costo. Así mismo al observar el perfil electroforético en el cual se comparan los tres buffers de extracción (Figura 1) se aprecia una mayor resolución de las bandas en el carril correspondiente al buffer fosfato, razón por la cual se empleó el buffer fosfato en la extracción de las proteínas. En cuanto al buffer HEPES ((4-(2-hidroxietil) acido-1-piperazinaetanosulfonico)) a pesar de estar catalogado como un buffer libre de efectos secundarios y efectivo en la extracción de proteínas no se obtuvo una resolución de buena calidad del perfil electroforético y además fue el buffer que presentó la concentración más baja de proteínas al cuantificarlo con BCA (45). Tabla 2: Comparación en la concentración de proteínas extraídas con los tres Buffers evaluados.
Buffer de Extracción Concentración (µg/ml)
Tris-HCl 1807+/- 11
Fosfato 1786 +/- 7
[image:27.612.81.382.419.544.2]Figura 1: SDS-PAGE 12%. Perfil electroforético del extracto crudo acuoso de hojas extraído con los tres buffers evaluados. P: patrón de peso molecular; H: Buffer HEPES; T: Buffer Tris-HCl; F: Buffer Fosfato.
6.4 Precipitación de proteínas:
[image:28.612.98.455.72.352.2]Tabla 3: Concentración de proteínas obtenidas en el extracto crudo de Hojas y semillas de C. trihecatactis por el método de precipitación TCA/acetona, Fenol-Tris y Sulfato de Amonio al 70% de saturación.
TCA/Acetona (µg/ml)
Fenol-Tris (µg/ml) Sulfato de Amonio (70%)(µg/ml)
Hojas 1498+/-232 1153+/-57 3171+/-285
Semillas 1587+/-428 4085+/-299 2995+/-281
A continuación se presentan los geles obtenidos en los diferentes protocolos evaluados tanto para hojas como para semillas.
[image:29.612.82.535.149.252.2] [image:29.612.122.486.302.654.2]Figura 3: Perfil electroforético del extracto crudo de semillas precipitado con TCA/acetona. P: patrón de peso molecular; S: extracto crudo de semillas.
Como se observa en las figuras 2 y 3, el perfil electroforético de las proteínas de hojas y semillas no presentan una buena resolución a comparación de los geles obtenidos por el método del sulfato de amonio, así mismo la concentración de proteína cuantificada es baja. No obstante, el protocolo de precipitación con TCA/Acetona es uno de los más usados en proteomica por su capacidad de remover y eliminar compuestos interferentes tales como lípidos, carbohidratos, ácidos nucleícos, fenoles, pigmentos y sales e inhibe enzimas proteolíticas que pueden afectar la estabilidad de la proteína. No obstante, existen algunas teorías las cuales afirman que las fuerzas intermoleculares del TCA toman el H2O de la proteína insolubilizándola y precipitándola, y que dicha precipitación no depende únicamente del pH (45).
[image:30.612.113.503.66.358.2]realizar actividad antimicrobiana, ya que alteran la estructura nativa de la proteína y por consiguiente se pierde su actividad biológica.
Figura 6: Perfil electroforético del extracto crudo de hojas obtenido por el método de precipitación con Sulfato de Amonio. P: patrón de peso molecular; S: extracto crudo de semillas
En otras investigación recomiendan emplear dos porcentajes de saturación con sulfato de amonio diferentes, tal es el caso de Ogras, T. et al. (2005), quienes para precipitar las proteínas del extracto acuoso de semillas de Robinia pseudoacasia emplearon concentraciones al 30 y 70% de sulfato de amonio, obteniendo un alto rendimiento de proteína (47).
6.5 Cromatografía de Intercambio iónico: esta técnica de separación se basa
estén débilmente o fuertemente unidas van a ser separadas o retiradas de la columna al pasar un buffer con diferentes concentraciones de NaCl. Como se observa en la grafica 1 del anexo 10,3 se obtuvieron tres picos, con un total de 60 fracciones, de los cuales presentan mayor absorbancia las proteínas que se adhieren débilmente a la columna, es decir hay más cantidad de proteínas con grupos aromáticos en este pico (ver anexo 9.3).
[image:34.612.92.475.181.615.2]6.6 Electroforesis Tricina-SDS-PAGE:
Como se observa en la figura 7, se obtuvieron péptidos con pesos moleculares entre 8 y 10 KDa en el extracto de hojas, este sistema de electroforesis Tricina-SDS-PAGE es específico para proteínas de bajo peso molecular y ha sido empleado en diferentes estudios. Uno de ellos fue la evaluación de un péptido antifúngico de 5.9 KDa aproximadamente aislado de las semillas de la col en China (49).
6.7 Actividad antimicrobiana:
Tal y como se observa en las figuras 1, 2, 3 del anexo 9.4 se evidenció crecimiento de las bacterias alrededor de los pozos, por lo tanto los extractos y la fracciones evaluadas no presentan actividad. Este resultado también fue observado en el ensayo realizado con hongos en el cual únicamente se aprecia una restricción en el crecimiento del hongo en el pozo del control positivo (figura 1, 2, 3) (Ver anexo 9. 4.2).
No obstante se quiso corroborar el resultado obtenido en el ensayo contra bacterias empleando la técnica microdilución mas TTC (2,3,5-trifeniltetrazolium cloruro), (figura 4) (ver anexo 9.4) en la cual se obtuvieron resultados satisfactorios con el extracto de hojas frente a E. coli y L. monocytogenes, por lo tanto se estableció que el método en microdilución tiene mayor sensibilidad que por difusión en agar. Para este tipo de actividad se emplea el método Kirby Bauer en el cual se usa papel de filtro impregnado con el extracto, sin embargo este método demuestra ser menos sensible que el método por difusión en pozos (31).
Por otra parte el objetivo de usar el reactivo TTC es poder estimar la viabilidad celular, el cual fue adaptado por Steponkus y Lanphear en 1967 y se basa principalmente en la reducción del TTC, por la actividad mitocondrial de las células vivas, a trifenilformazan, un compuesto rojo e insoluble en agua (51).
7. CONCLUSIONES:
• El buffer de extracción que permitió la mayor recuperación de proteínas acuosas tanto para hojas como para semillas fue el buffer Fosfato a una concentración de 0,1M pH 7,5 a partir de 0,1 g de material vegetal
• La mejor resolución del perfil electroforético se obtuvo con el protocolo de precipitación con sulfato de amonio tanto para hojas como para semillas.
• El extracto proteico acuoso de Hojas de C.trihecatactis tiene actividad antibacteriana frente a las cepas de Escherichia coli y Listeria monocytogenes de acuerdo al método en microdilución con TTC.
• No se evidencio actividad antifúngica de los extractos proteicos acuosos de hojas y semillas de C. trihecatactis.
• El pretratamiento realizado con acetona fría a los protocolos de obtención de proteína TCA/acetona, sulfato de amonio y Fenol-Tris fue efectivo puesto que se logró visualizar una mejor resolución del perfil electroforético de hojas y semillas de C. trihecatactis.
8. RECOMENDACIONES:
Para complementar la información acerca de la actividad antibacteriana del extracto proteico acuoso de las hojas de C. trihecatactis se recomienda hacer pruebas cuantitativas al ensayo de microdilución con TTC con el fin de evaluar el porcentaje de inhibición que tiene el extracto frente a las cepas bacterianas.
9. ANEXOS
9.1 Recolección y selección del material vegetal:
9.2 Microorganismos:
Figura 1: Microscopía con Tinción de Gram de Escherichia coli.
Figura 3: Microscopía con Tinción de Gram de Listeria monocytogenes
Figura 7: Características Macroscopicas y Microscopicas de Botrytis sp. (A) Anverso; (B) Reverso; (C) Microscopia y (D) Microcultivo.
9.3 Cromatografía de intercambio aniónico:
Grafica 1: Perfil cromatografico del Extracto crudo de Hojas de C.trihecatactis.
Tabla 1: Cuantificación de las fracciones del extracto crudo de hojas por BCA obtenidas por cromatografía de intercambio iónico
Fracción Concentración µg/ml
Fracción Concentración µg/ml
Fracción Concentración µg/ml
1 -48,143 21 -33,857 41 -21,714
2 -25,286 22 -28,857 42 -37,429
3 -3,143 23 -6,714 43 -23,143
4 -3,143 24 -31 44 -21
5 -24,571 25 -45,286 45 -10,286
6 -6,714 26 -35,286 46 -16,714
7 -18,143 27 -46 47 -6,714
8 -34,571 28 -48,857 48 -35,286
[image:41.612.86.552.176.429.2]9.4 Actividad antimicrobiana
9.4.1 Actividad antibacteriana
9.4.1.1 Ensayo difusión en agar
Figura 1: Prueba de actividad antimicrobiana frente a Escherichia coli por Difusión en agar. (A) Extracto proteico acuoso de hojas; (B) Extracto proteico acuoso de semillas E: Extracto crudo; (+): Control positivo cloranfenicol 0,02%; (-): Control negativo buffer fosfato; 32 y 53: Fracciones 32 y 53 del extracto crudo de hojas obtenidas por cromatografía de intercambio anionico.
10 -38,143 30 -31 50 -38,143
11 -28,857 31 -29,571 51 -35,286
12 -1,714 32 3,286 52 -32,429
13 -26 33 -48,857 53 11,143
14 -38,857 34 -46,714 54 -8,143
15 -51 35 -38,857 55 -24,571
16 -62,429 36 -38,143 56 -29,571
17 -50,286 37 -44,571 57 -31,714
18 -38,857 38 -36,714 58 -28,143
19 -27,429 39 -42,429 59 -29,571
9.4.1.2 Ensayo en microdilución:
[image:45.612.93.529.97.380.2]9.4.2 Actividad antifúngica:
Figura 1: Prueba de Actividad Antifungica frente a Fusarium oxysporum. (A) Anverso, (B) Reverso. (+): Control positivo Terbinafrina 2,5 mg/ml; (-): Control negativo buffer fosfato; S: Extracto Crudo de Semillas; H: Extracto Crudo de
[image:46.612.89.518.98.385.2]Hojas.
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