Efecto in vitro del aceite esencial de las hojas de Lippia alba “pampa orégano” frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus

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(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. UI M. IC A. ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. Q. TESIS II. BI. O. Efecto in vitro del aceite esencial de las hojas de Lippia alba “pampa. IA. Y. orégano” frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus. RM. AC. PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO DE:. DE. FA. BACHILLER EN FARMACIA Y BIOQUÍMICA. SEGURA ALAYO, Alex David. BI BL. IO. TE. CA. AUTOR (es): RODRIGUEZ LOPEZ, Joseph Jeremy. ASESOR: Dr. QUISPE DÍAZ, Iván Miguel. Co-ASESOR: Dra. LUJÁN VELÁSQUEZ, Manuela Natividad. TRUJILLO - PERÚ 2018. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA. A nuestro Dios, por ser nuestra luz en este largo camino, por permitirnos seguir adelante ante toda adversidad, por ser nuestro guía en todos nuestros. UI M. IC A. logros y cuidarnos en todo momento.. Q. A nuestros padres, por su apoyo incondicional, por. BI. O. darnos una carrera para nuestro futuro, por ser el. IA. Y. motivo que nos impulsa a llegar más lejos y lograr. FA. RM. AC. todas nuestras metas.. DE. A nuestros profesores, por haber compartido su. CA. experiencia, entregarnos sus conocimientos y apoyo. BI BL. IO. TE. durante nuestra formación profesional.. Los Autores. i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. AGRADECIMIENTO. A nuestro Dios por darnos salud. A nuestros profesores, que hoy pueden ver un reflejo de lo que han formado, permitiéndonos fortalecernos como estudiantes.. IC A. A nuestro asesor el Dr. Iván Miguel Quispe Díaz (Profesor Auxiliar de la Cátedra de. UI M. Farmacología de la Facultad de Farmacia y Bioquímica) y Co-Asesora la Dra. Manuela. Q. Natividad Luján Velásquez (Profesora de Microbiología y Parasitología de la Facultad de. BI. O. Ciencias Biológicas), docentes de la Universidad Nacional de Trujillo, por ser excelentes. IA. Y. profesores, por darnos la oportunidad de trabajar con ustedes y a la vez transmitir sus. AC. conocimientos hacia nosotros que han sido útiles en el desarrollo de esta tesis, por su. RM. apoyo desinteresado, paciencia, consejos y ayuda brindados. Gracias también a nuestra. FA. casa de estudios, la Universidad Nacional de Trujillo, en especial a nuestra Facultad de. BI BL. IO. TE. CA. DE. Farmacia y Bioquímica y a las instalaciones de la misma.. Los Autores. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRESENTACIÓN. Señores miembros del Jurado Dictaminador: Dado el cumplimiento a lo establecido por el reglamento de Grados y Títulos de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo; sometemos a. IC A. vuestra honorable consideración y elevado criterio el presente informe final de tesis II,. O. Q. UI M. titulado:. BI. “Efecto in vitro del aceite esencial de las hojas de Lippia alba “pampa orégano” frente a. RM. AC. IA. Y. Escherichia coli y Staphylococcus aureus”. FA. Es propicia la oportunidad para evidenciar el más sincero reconocimiento a nuestra. DE. facultad y toda su plana docente que con su capacidad, buena voluntad y enseñanzas. TE. CA. impartidas han contribuido a nuestra carrera profesional.. IO. Dejamos a vuestro criterio señores miembros del jurado dictaminador la calificación del. BI BL. presente trabajo de investigación científica.. Loa Autores. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRESIDENTE. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. Dra. Marilú Roxana Soto Vásquez. IC A. JURADO DICTAMINADOR. FA. JURADO. BI BL. IO. TE. CA. DE. Dr. Francisco Moisés Abanto Zamora. ASESOR Dr. Iván Miguel Quispe Díaz. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN. La investigación tuvo como objetivo determinar el efecto in vitro del aceite esencial de las hojas de Lippia alba frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus, para lo cual se extrajo el aceite esencial mediante el método de destilación por arrastre de vapor de agua. Para la determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) se utilizó el. IC A. método de macrodilución en caldo Brain Heart Infusion (BHI), posteriormente se agregó. UI M. las concentraciones del aceite esencial diluido en polisorbato 80 y se agregó la suspensión. O. Q. bacteriana incubándose a 37°C por 48 horas. Obteniendo la CMI del aceite esencial de. Y. BI. Lippia alba frente a Escherichia coli de 2.5 uL/mL, y la CMI del aceite esencial de Lippia. IA. alba frente a Staphylococcus aureus de 3 uL/mL. Posteriormente en la determinación de. RM. AC. la Concentración Mínima Bactericida (CMB) se utilizó el método de difusión de agar en. FA. placa, colocando en las placas petri agar Mueller-Hinton obteniéndose la CMB del aceite. DE. esencial de Lippia alba frente a Escherichia coli de 2.5 uL/mL, y la CMB del aceite. CA. esencial de Lippia alba frente a Staphylococcus aureus de 3 uL/mL. Concluyendo que. TE. el aceite esencial de las hojas de Lippia alba tiene efecto antibacteriano frente a. BI BL. IO. Escherichia coli y Staphylococcus aureus.. Palabras claves: Lippia alba, aceite esencial, Escherichia coli, Staphylococcus aureus.. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT. The objective of the research was to determine the In vitro effect of the essential oil of the leaves of Lippia alba versus Escherichia coli and Staphylococcus aureus, for which the essential oil was extracted by the method of steam distillation. For the determination of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC), the Brain Heart Infusion macrodilution. IC A. method (BHI) was used, after which the concentrations of the essential oil diluted in. UI M. polysorbate 80 were added and the bacterial suspension was added, being incubated at. O. Q. 37°C por 48 hours. Obtaining the MIC of the essential oil of Lippia alba versus. Y. BI. Escherichia coli of 2.5 uL/mL, and the MIC of the essential oil of Lippia alba versus. IA. Staphylococcus aureus of 3 uL/mL. Later in the determination of the Bactericidal. RM. AC. Minimum Concentration (CMB), the method of plate agar diffusion was used, placing in. FA. the petri plates Mueller-Hinton agar, obtaining the CMB of the essential oil of Lippia. DE. alba versus Escherichia coli of 2.5 uL/mL, and the CMB of the essential oil of Lippia. CA. alba versus Staphylococcus aureus of 3 uL/mL. Concluding that the essential oil of the. TE. leaves of Lippia alba has an antibacterial effect against Escherichia coli and. BI BL. IO. Staphylococcus aureus.. Key words: Lippia alba, essential oil, Escherichia coli, Staphylococcus aureus. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE. DEDICATORIA ................................................................................................... i AGRADECIMIENTO .......................................................................................... ii. IC A. PRESENTACIÓN ................................................................................................ iii. UI M. JURADO DICTAMINADOR .............................................................................. iv. BI. O. Q. RESUMEN ........................................................................................................... v. AC. IA. Y. ABSTRACT ......................................................................................................... vi. RM. INDICE ................................................................................................................. vii INTRODUCCIÓN .................................................................................... 1. II.. MATERIAL Y MÉTODO ........................................................................ 16. III.. RESULTADOS ........................................................................................ 23. IV.. DISCUSIÓN ............................................................................................. 25. V.. CONCLUSIONES .................................................................................... 28. VI.. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................... 29. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. I.. ANEXOS .............................................................................................................. 34. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN En la naturaleza existen dos clases de células, las procariotas y las eucariotas; las primeras son evolutivamente más antiguas, sólo se hallan como seres unicelulares y constituyen las bacterias. El resto de los organismos vivos unicelulares y pluricelulares está formado por células eucariotas1,2,3.. IC A. Las bacterias, que son las células más pequeñas, sólo se pueden visualizar con ayuda. UI M. de un microscopio. Las bacterias de menor tamaño miden sólo 0,1-0,2 µm de diámetro,. O. Q. mientras que las bacterias más grandes pueden alcanzar varias micras de longitud1,2,3,4.. Y. BI. Las bacterias pueden sobrevivir y, en algunos casos, crecer en entornos hostiles, en los. IA. que la presión osmótica en el exterior de la célula es tan baja que la mayor parte de las. RM. AC. células eucariotas se lisarían, con temperaturas extremas (tanto cálidas como frías), en. FA. ambientes secos y en presencia de fuentes de energía muy diluidas y diversas. Las. DE. bacterias han sufrido cambios en la estructura y función para adaptarse a estas. TE. CA. condiciones1,2,3,4.. IO. Las bacterias se clasifican en dos grupos en función de la estructura de su pared celular,. BI BL. las Gram positivas, sólo poseen peptidoglicano y las Gram negativas, tienen adosada por fuera del peptidoglicano una membrana rica en lipopolisacáridos. Algunas bacterias tienen una cápsula rodeando la pared; también pueden poseer flagelos, que facilitan su movilidad, y fimbrias (pili), que desarrollan varias funciones, fundamentalmente. de. adherencia.. En. las. bacterias,. además. del. ácido. desoxirribonucleico (DNA) cromosómico (nucleoide) puede existir DNA extra cromosómico formando plásmidos. Las bacterias suelen reproducirse mediante la división en dos células iguales; este proceso se conoce como fisión binaria1,2,3,4. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Algunas estructuras bacterianas, como el lipopolisacárido de la pared, el polisacárido capsular y las proteínas de los flagelos, son antigénicas, por lo que inducen la producción de anticuerpos cuando infectan al hombre1,2,3,4.. Los diferentes grupos bacterianos poseen diversas capacidades metabólicas siendo el grupo de interés en medicina el que posee un metabolismo heterótrofo; es decir, requiere sustratos orgánicos como fuente de energía y de carbono. Para el desarrollo. IC A. de su metabolismo algunas bacterias necesitan oxígeno (bacterias aerobias); para otras. UI M. el oxígeno resulta letal (bacterias anaerobias) y algunas pueden multiplicarse tanto en. BI. O. Q. presencia como en ausencia de oxígeno (bacterias facultativas) 1,2,4.. IA. Y. Del número de especies bacterianas existentes en la biosfera, sólo unas pocas. AC. colonizan las superficies cutáneomucosas del hombre, y un número aún más limitado. FA. RM. posee capacidad patógena, causando las enfermedades infecciosas2.. DE. Entre estas especies esta Escherichia coli, una especie del género Escherichia, que es. CA. un miembro de la familia Enterobacteriaceae, bacilos Gram negativos, anaeróbico. IO. TE. facultativo, no forma espora, fermentan la glucosa, reducen los nitratos, son catalasa-. BI BL. positivo y oxidasa-negativo. Escherichia coli son los más abundantes anaerobios facultativos en el ser humano del tracto gastrointestinal, donde la mayor parte de ellos son habitantes normales no patógenas. El género Escherichia poseen unos factores de virulencia especializados que se pueden clasificar en dos categorías generales: adhesinas y exotoxinas1,2,5.. Este microorganismo se asocia a múltiples enfermedades, que incluyen la gastroenteritis e infecciones extraintestinales, como las ITU (Infección del Tracto. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Urinario), meningitis y sepsis. Multitud de cepas son capaces de producir enfermedad y algunos serotipos se asocian a una mayor virulencia1.. También esta Staphylococcus aureus, un coco Gram positivo, caracterizado por presentar una disposición típica en forma de racimos de uvas, denominado así por sus colonias amarillas, siendo anaerobio facultativo y catalasa positivo. Crecen relativamente bien en condiciones de presión osmótica elevada y humedad reducida,. IC A. lo que explica en parte que puedan desarrollarse y sobrevivir en las secreciones nasales. Q. UI M. y en la piel1,5.. BI. O. La enfermedad la produce mediante la liberación de toxinas o a través de la invasión. IA. Y. directa y la destrucción del tejido. Entre las toxinas que produce figuran cinco toxinas. AC. citolíticas que dañan la membrana (alfa, beta, delta, gamma y leucocidina de Panton-. RM. Valentine [P-V]), dos toxinas exfoliativas (A y B), 18 enterotoxinas (A a R) y la toxina-. DE. FA. 1 del síndrome del shock tóxico (TSST-1) 1,5.. CA. Las manifestaciones clínicas de algunas enfermedades estafilocócicas se deben casi. IO. TE. exclusivamente a la actividad de la toxina (síndrome de la piel escaldada por. BI BL. estafilococos y síndrome del shock tóxico), mientras que otras afecciones son consecuencia de la proliferación de los microorganismos, la cual da lugar a la formación de abscesos y la destrucción tisular (infecciones cutáneas, endocarditis, neumonía, empiema, osteomielitis y artritis séptica). La producción de enfermedad en presencia de un cuerpo extraño (astilla, catéter, anastomosis, prótesis valvular o articular) requiere un número significativamente menor de estafilococos. En la actualidad se encuentra como el principal causante de las infecciones nosocomiales1.. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Los microorganismos enteropatógenos como Escherichia coli, son causantes de una gran parte de morbilidad y mortalidad en los países en vías de desarrollo como es el caso de nuestro país. Otros microorganismos como Enterococcus faecalis, son causante del 15% de las infecciones intrahospitalarias registradas por el Instituto Nacional de Salud (INS), Staphylococcus aureus es responsable del 50% y Pseudomona aeruginosa del 70% de dichas infecciones6.. IC A. En los últimos años las diversas enfermedades ocasionadas por agentes patógenos e. UI M. inadecuados comportamientos en los distintos estilos de vida del hombre moderno,. O. Q. creando muchos problemas de salud y la necesidad de buscar nuevas alternativas de. IA. Y. BI. tratamiento7.. AC. Es comparativamente fácil encontrar o desarrollar fármacos eficaces contra células. RM. procariontes y que no afecten las células eucariontes humanas. Estos dos tipos. FA. celulares presentan diferencias sustanciales en varios aspectos, como en la presencia o. DE. la ausencia de paredes celulares, en la estructura precisa de sus ribosomas y en los. TE. CA. detalles de su metabolismo. Asimismo, algunos fármacos tienen un espectro reducido. IO. de actividad microbiana como la penicilina G que afecta a las bacterias Gram positivas,. BI BL. pero con menor actividad sobre bacterias Gram negativas1,8.. Los antibióticos que actúan sobre una amplia variedad de bacterias Gram positivas y Gram negativas se denominan antibióticos de amplio espectro. Dado que no siempre se conoce de inmediato la identidad del patógeno, un fármaco de amplio espectro parece tener ventajas en el tratamiento de una enfermedad para ahorrar un tiempo valioso. La desventaja es que con estos fármacos se destruye gran parte de la microflora normal del huésped que normalmente suele competir con los patógenos o. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. con otros microbios y controlar su crecimiento. Los fármacos antimicrobianos son bactericidas (destruyen directamente a las bacterias) o bacteriostáticos (inhiben su crecimiento)1,8.. Habría que concebir las moléculas de antimicrobianos como ligandos cuyos receptores son las proteínas de los microorganismos. El término farmacóforo introducido por primera vez por Ehrlich, define la fracción química activa del fármaco que se une al. IC A. receptor microbiano. Las proteínas microbianas en las que actúa el antibiótico son. UI M. componentes esenciales de reacciones bioquímicas en los microorganismos, y la. O. Q. interferencia en sus vías fisiológicas termina por destruirlos. En la medida en que un. Y. BI. antimicrobiano actúe de manera específica en una proteína que no se expresa de forma. IA. extensa en otras bacterias, el fármaco tendrá un efecto relativamente selectivo como. RM. AC. antimicrobiano8.. FA. Los procesos bioquímicos que suelen inhibirse incluyen síntesis de las paredes y de. DE. las membranas; síntesis de las subunidades ribosómicas 30s y 50s, metabolismo de. TE. CA. ácidos nucleicos, función de topoisomerasas, proteasas e integrasas. La clasificación. IO. de un antibiótico se basa en: la clase y el espectro de microorganismos que destruye,. BI BL. la vía bioquímica que interfiere y la estructura química de su farmacóforo8.. Dentro de los inhibidores de la síntesis de la pared celular están los antibióticos blactámicos que catalizan enzimas específicas (transpeptidasas, transglucosilasas, carboxipeptidasas) que son miembros de una gran familia de serina proteasas. Estas enzimas reguladoras reciben también la denominación de proteínas fijadoras de penicilinas (PBP), porque son las dianas de los antibióticos b-lactámicos. Los cuales. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. se unen a PBP específicas de la pared celular bacteriana, activando autolisinas que degradan la pared celular, dando lugar a la muerte de la célula bacteriana1,8.. Entre los antibióticos b-lactámicos tenemos las penicilinas, muy eficaces con una toxicidad baja. También la combinación de penicilinas con inhibidores de las blactamasas (ácido clavulánico, sulbactam, tazobactam, otros), siendo eficaces en el tratamiento de algunas infecciones causadas por bacterias productoras de b-. UI M. IC A. lactamasa1,8.. Q. También las cefalosporinas son antibióticos b-lactámicos derivados del ácido 7-. BI. O. aminocefalosporánico siendo más estables a la hidrólisis por las b-lactamasas. Otras. AC. IA. Y. clases de antibióticos b-lactamicos son los carbapenems y los monobactams5,10.. RM. Dentro de los inhibidores de la síntesis de la pared celular también están los. FA. glucopéptidos como la vancomicina, los lipopéptidos como la daptomicina, los. DE. polipéptidos como la bacitracina, las polimixinas (polipéptidos cíclicos), la isoniazida,. TE. CA. la etionamida, el etambutol y la cicloserina1,5,8.. BI BL. IO. La segunda clase más importante de antibióticos es la inhibición de la síntesis de proteínas. Entre estos están los aminoglucósidos, estos antibióticos ejercen su acción al pasar a través de la membrana externa bacteriana (en bacterias Gram negativas), la pared celular y la membrana citoplasmática al citoplasma, en donde inhiben la síntesis de proteínas al unirse de modo irreversible a las proteínas ribosómicas 30S. Esta unión a los ribosomas tiene dos efectos: producción de proteínas aberrantes como consecuencia de una lectura errónea del ARN mensajero (ARNm) y la interrupción de la síntesis de proteínas al producir la liberación prematura del ribosoma del ARNm1,5,8.. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. También están los inhibidores de la síntesis de ácidos nucleicos como las quinolonas (ácido. nalidíxico,. ciprofloxacino,. el. levofloxacino,. el. moxifloxacino. y. fluoroquinolonas), la rifampicina, el metronidazol, las sulfamidas, la trimetoprima, la dapsona y el ácido p-aminosalicílico1,5,8.. Entre otros antibióticos esta la clofazimina, un antibiótico lipófilo que se une al DNA micobacteriano. la pirazinamida (la forma activa de este antibiótico es el ácido. UI M. IC A. pirazinoico, producido cuando se hidroliza en el hígado), otros1,5,8.. Q. Cuando se comenzaron a usar en seres humanos, los antimicrobianos se consideraron. BI. O. curas milagrosas. Sin embargo, poco después del descubrimiento de la penicilina se. IA. Y. advirtió que aparecía en forma rápida resistencia, lo que ponía fin al milagro. Esta. AC. situación grave persiste con cada antimicrobiano nuevo y amenaza con terminar con. RM. la época de los antimicrobianos. En la actualidad, cualquier clase importante de. DE. FA. antibióticos se acompaña de la aparición de resistencia notable1,5.. CA. Una especie sometida a presiones químicas o de otro tipo que amenazan con su. TE. extinción, suele desarrollar mecanismos para sobrevivir bajo tal tensión excesiva. Los. BI BL. IO. patógenos evolucionarán para presentar resistencia a la “guerra química” a la que están sometidos. Esta evolución se facilita con prácticas terapéuticas inadecuadas realizadas por el personal de atención de la salud, así como por el uso indiscriminado de antibióticos. Las prácticas clínicas que no incorporan las propiedades farmacológicas de los antimicrobianos aceleran el surgimiento y la evolución de la resistencia a fármacos1,5.. La resistencia a antimicrobianos puede surgir en una o más de las etapas de los procesos por los que el fármaco llega y se combina con el sitio en que actúa. De este 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. modo, la resistencia puede surgir a causa de: disminución de la penetración del antibiótico en el interior del patógeno, mayor expulsión del antibiótico desde la célula por la acción de bombas de extracción, liberación de enzimas del microbio que destruyen el antibiótico, alteración de proteínas microbianas que transforman los profármacos en sus fracciones eficaces, alteración de las proteínas en que actúa un fármaco y la creación de otras vías distintas a las inhibidas con el antibiótico1,5.. IC A. El primer mecanismo de resistencia se observa en bacterias Gram negativas. Estas. UI M. bacterias poseen una membrana externa que está por encima de la capa de. O. Q. peptidoglucano. La penetración de los antibióticos b-lactámicos en el interior de los. Y. BI. bacilos Gram negativos requiere el paso a través de unos poros en esta membrana. AC. IA. externa. Los cambios en las proteínas (porinas) que forman las paredes de los poros,. FA. la exclusión del antibiótico1,5.. RM. pueden alterar el tamaño del orificio del poro o la carga de estos canales y dar lugar a. DE. La resistencia puede adquirirse por modificación de la unión del antibiótico b-. TE. CA. lactámico a la PBP. Esta modificación puede estar mediada por una hiperproducción. IO. de PBP (fenómeno infrecuente), la adquisición de una nueva PBP, la modificación de. BI BL. una PBP existente por recombinación o una mutación puntual. Por último, las bacterias pueden producir b-lactamasas que inactivan los antibióticos b-lactámicos1,5.. En los aminoglucósidos el mecanismo de resistencia más común es la modificación enzimática que se lleva a cabo por la acción de fosfotransferasas, adeniltransferasas y acetiltransferasas en los grupos amino e hidroxilo del antibiótico1,5.. En las tetraciclinas los investigadores han identificado una variedad de genes en diferentes bacterias que controlan el eflujo activo fuera de la célula. La resistencia a 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. las tetraciclinas puede ser consecuencia también de la producción de proteínas similares a factores de elongación que protegen el ribosoma 30S. Cuando así sucede, el antibiótico puede aún unirse al ribosoma, pero no se desestructura la síntesis proteica1,5.. Se observa también resistencia al cloranfenicol en bacterias productoras de cloranfenicol acetiltransferasa de codificación plasmídica, que cataliza la acetilación. IC A. del grupo 3-hidroxi del cloranfenicol. El producto es incapaz de unirse a la subunidad. Q. UI M. 50S1,5.. BI. O. En los macrólidos lo más frecuente es que la resistencia se origine de la metilación del. IA. Y. ARNr 23S, impidiendo la unión por el antibiótico. Otros mecanismos de resistencia. AC. incluyen la inactivación de los macrólidos por enzimas (esterasas, fosforilasas,. FA. RM. glucosidasa) o mutaciones en el ARNr 23S y en las proteínas ribosómicas1,5.. DE. En las quinolonas la resistencia está mediada por mutaciones cromosómicas en los. CA. genes estructurales del DNA girasa y en la topoisomerasa de tipo IV. Otros. IO. TE. mecanismos incluyen una menor captación del fármaco causada por mutaciones en los. BI BL. genes reguladores de la permeabilidad bacteriana, y una hiperexpresión de bombas de eflujo que de modo activo eliminan el fármaco. Cada uno de estos mecanismos está principalmente mediado por el cromosoma1,5.. En los últimos años se han realizado investigaciones dirigidas a buscar nuevas terapias antimicrobianas como opciones alternas a los tratamientos con antibióticos conocidos, debido a la alta tasa de resistencia que presentan los patógenos microbianos en todo el mundo. Este importante problema de salud pública involucra a todos los países debido. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. a su impacto en la salud, como en el costo-beneficio que implica tratar estas patologías9.. Estudios realizados por la Organización Mundial de la Salud (OMS), Comunidad Andina de Naciones (CAN), entre otras organizaciones nacionales e internacionales, establecen que mediante la bioprospección y aprovechando los recursos naturales, se podrían diseñar alternativas de tratamiento. Uno de los organismos con los cuales se. UI M. IC A. está trabajando para obtener nuevos compuestos antimicrobianos son las plantas9.. Q. Desde tiempos remotos es sabido que las plantas han sido utilizadas para una amplia. BI. O. variedad de propósitos. Las plantas medicinales nos ofrecen recursos potencialmente. IA. Y. útiles en el tratamiento de enfermedades, representando una estrategia prometedora en. AC. muchas enfermedades. Recursos que serán utilizadas como materia prima para la. RM. utilización de extractos o para el aislamiento de sustancias naturales puras,. DE. FA. representando así una gran área en expansión10.. CA. Además, en la actualidad se reconoce la importancia de origen natural, por que poseen. IO. TE. innumerables características, con bajo costo y sus principios activos están. BI BL. biológicamente equilibrados evitando que se acumulen en el organismo, no presentando efectos secundarios o no advertidos10.. La medicina natural hoy es un campo terapéutico que constituye una vía para contrarrestar los efectos adversos de los productos farmacéuticos obtenidos mediante síntesis química. Su aplicabilidad en la terapéutica actual le permite ser considerada como una de las más importantes modalidades de la medicina complementaria10. Dentro de estas plantas medicinales está la familia verbenaceae, utilizadas. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. tradicionalmente para tratar múltiples enfermedades. Entre los estudios realizados tenemos:. El estudio desarrollado en la Universidad Nacional Jorge Basadre Grohmann de Tacna, donde el aceite esencial de Aloysia triphylla P. mostro actividad antibacteriana significativa frente a Escherichia coli y moderada frente a Staphylococcus aureus. Así, el estudio reveló la CMI (Concentración Mínima Inhibitoria) de Escherichia coli. IC A. siendo de 3,701 mg/mL mientras que para Staphylococcus aureus fue 15,167 mg/mL.. UI M. También se precisó la CMB (Concentración Mínima Bactericida) de Escherichia coli. O. Q. siendo de 4,186 mg/mL, mientras que para Staphylococcus aureus fue 16,259. IA. Y. BI. mg/mL11.. AC. El estudio desarrollado en la Universidad de los Andes de Venezuela, muestra que el. RM. aceite esencial de Aloysia triphylla reveló inhibición del desarrollo de todas las. FA. bacterias aisladas (Escherichia coli, Klebsiella ozaenae, Enterobacter aerogenes,. IO. TE. de 10-50 μg/mL12.. CA. DE. Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus y Enterococcus sp.), con valores de CMI. BI BL. El estudio desarrollado en la Universidad Sultan Moulay Slimane de Marruecos, afirma que los aceites esenciales de Aloysia citridora mostraron una actividad antimicrobiana significativa contra bacterias Gram negativas y Gram positivas con una CMI de 2.84 y 8.37 mg /mL frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus respectivamente13.. El estudio desarrollado en la Universidad pedagógica y tecnológica de Colombia, muestra que el extracto etanolico de las hojas secas de Lantana cámara, frente a Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Pseudomona aeruginosa exhibió mejor 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. actividad contra Staphylococcus aureus con un CMI de 12 mg/mL y CMB de 28 mg/mL14.. El estudio desarrollado en la Universidad del Quindío de Colombia, muestra que los extractos apolares de las hojas de Lippia origanoides H.B.K. mostraron actividad de inhibición del crecimiento de los microorganismos evaluados (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomona aeruginosa, otros), mientras que los extractos. UI M. IC A. polares no mostraron actividad frente a los mismos microorganismos15.. Q. El estudio desarrollado en la Universidad Juárez del Estado de Durango de Mexico,. BI. O. muestra que el extracto etanólico de Lippia graveolens tiene un fuerte poder. IA. Y. inhibitorio contra Staphylococcus aureus, además que en combinación con Propolis. RM. AC. sugiere un efecto sinergico16.. FA. Dentro de la misma familia de estas plantas se encuentra Lippia alba que es originaria. DE. de América del Sur (Brasil). Se encuentra en regiones tropicales, subtropicales y. CA. templadas. En el Perú, en los departamentos de Loreto; Amazonas; Huánuco; La. IO. TE. Libertad; Pasco; Ucayali y San Martín. Conocida también por otros nombres como:. BI BL. pampa orégano, cidra, cidraero, orégano, sideraca, sideraera, erva cidreira, salsa brava, salva, salvia17.. La Lippia alba, es una hierba arbustiva muy ramificada, de 1 a 2 m de altura, con olor aromático característico, de tallo rectilíneo y curvado, flexible y quebradizo, de color castaño claro con ramas nuevas pubescentes y las viejas glabras, hojas elípticas hasta redondeadas, enteras, simples, penninervadas, aserradas en el margen y ligeramente escabrosas en la superficie, opuestas, de color verde acenizada de 6 cm de largo y 2,5 cm de ancho. Inflorescencias en capítulo, axial, pedunculada, con bráctea. Flores 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. reunidas en la periferia de la inflorescencia, fuertemente zigomorfas, herma-froditas, corola lila y blanquecina con fondo amarillo. Fruto drupa o cápsula seca con exocarpo de color violeta oscuro. Raíz axial, fasciculada, con más o menos 25 cm de largo17.. El género Lippia de la familia Verbenaceae, comprende acerca de 200 especies distribuidas por las regiones tropicales, subtropicales y templadas de la América, África y Asia. Los aceites esenciales se encuentran en las estructuras celulares de la. IC A. epidermis, más específicamente de las glándulas secretoras especializadas conocidas. UI M. como tricomas glandulares. El aceite esencial de Lippia alba está compuesto. O. Q. principalmente por dos tipos de compuestos químicos, los terpenoides y los. IA. Y. BI. fenilpropanoides. Aunque existe un gran número de quimiotipos18.. AC. El aceite esencial de Lippia alba, está constituido por siete quimiotipos. Pertenecen al. RM. quimiotipo I los aceites que poseen citral, linalol, -cariofileno como sus principales. FA. componentes. Los aceites incluidos en el quimiotipo II tienen tagetenona como su. DE. principal constituyente. Aquellos que poseen limoneno en grandes cantidades y con. TE. CA. una cantidad variable de carvona o cetonas monoterpénicas en lugar de carvona están. IO. incluidos en quimiotipo III. Los quimiotipos restantes se caracterizan por presentar. BI BL. componentes principales específicos en su composición, tales como quimiotipo IV: mirceno, V: -terpineno, VI: canfora-1,8-cineol y VII: estragol18.. La planta de Lippia alba tiene diversos usos comerciales y tradicionales asociados a su acción terapéutica, empleándose como analgésico, antiinflamatorio, antipirético sedante, antidiarreico, antifúngico, en enfermedades intestinales y hepáticas, anticolesterolémico, larvicida, repelente, antimicrobiano, antiviral, antimalaria y molusquicida. Por lo que posee un elevado potencial terapéutico18.. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Conociendo la diversidad de plantas medicinales en nuestro país y conociendo las propiedades que tienen sus aceites esenciales. Planteamos esta investigación para ampliar nuestros conocimientos científicos en el valor que tiene Lippia alba con sus múltiples propiedades, en especial el efecto antimicrobiano. Actualmente en el Perú se ha incrementado el porcentaje de infecciones causada por Escherichia coli y Staphylococcus aureus constituyéndose un problema de Salud. IC A. Pública; por lo que se considera necesario la realización del presente trabajo de. UI M. investigación orientado a determinar el efecto in vitro del aceite esencial de las hojas. O. Q. de Lippia alba ”pampa orégano” frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus,. BI. con la finalidad de proporcionar una alternativa de solución a este problema con. IA. Y. recursos que estén al alcance de la población. Es por ello que se plantea el siguiente. RM. AC. problema:. FA. ¿Cuál es el efecto in vitro del aceite esencial de las hojas de Lippia alba “pampa. DE. orégano” frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus?. TE. CA. Plantemos la siguiente hipótesis:. BI BL. IO. El aceite esencial de las hojas de Lippia alba tiene efecto antibacteriano, medido por la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración Mínima Bactericida (CMB), sobre Escherichia coli y Staphylococcus aureus.. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Objetivos Objetivo general Determinar el efecto in vitro del aceite esencial de las hojas de Lippia alba pa pa oréga o frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus. Objetivos específicos  Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del aceite esencial de las. IC A. hojas de Lippia alba, por el método de macrodilución en caldo BHI frente a. UI M. Escherichia coli.. O. Q.  Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del aceite esencial de las. Y. BI. hojas de Lippia alba, por el método de macrodilución en caldo BHI frente a. AC. IA. Staphylococcus aureus.. RM.  Determinar la Concentración Mínima Bactericida (CMB) del aceite esencial de las. FA. hojas de Lippia alba, por el método de difusión de agar en placa frente a. DE. Escherichia coli.. CA.  Determinar la Concentración Mínima Bactericida (CMB) del aceite esencial de las. TE. hojas de Lippia alba, por el método de difusión de agar en placa frente a. BI BL. IO. Staphylococcus aureus.. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II. MATERIAL Y MÉTODO 2.1. Materiales 2.1.1. Material botánico Muestras de hojas de Lippia alba procedente del Jardín Botánico de Plantas Medicinales "Rosa Elena de los Ríos Martínez" de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo del distrito de Trujillo,. IC A. provincia de Trujillo, región La Libertad, recolectadas en la época de primavera,. UI M. identificada y depositada con el código N° 59148 en el Herbarium Truxillense. Q. de la Universidad Nacional de Trujillo (Anexo 1).. BI. O. 2.1.2. Material biológico. Y. Se utilizaron cepas de Escherichia coli (ATCC 25992) y Staphylococcus aureus. AC. IA. (ATCC 25923). Estas cepas fueron proporcionadas por el Laboratorio de. RM. referencia regional en salud pública, del distrito de Trujillo, provincia de. DE. 2.1.3. Medios de cultivo. FA. Trujillo, región La Libertad.. Agar Mueller-Hinton. -. Caldo Brain Heart Infusion (BHI). IO. TE. CA. -. BI BL. 2.1.4. Medicamento -. Ciprofloxacino 200mg/100mL (CIPROF-200). 2.1.5. Equipos -. Incubadora Microbiológica (PRECISION). -. Balanza triple brazo (OHAUS 700/800 series). -. Estufa de convección forzada (JSR). -. Congeladora (Coldex). -. Equipo de arrastre por vapor – extracción de aceites volátiles.. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.1.6. Solventes -. Solución salina fisiológica. -. Polisorbato 80 (Tween 80). 2.1.7. Material de vidrio -. El de uso común en el laboratorio.. 2.1.8. Reactivos Agua destilada. IC A. -. -. 7 frascos de 10 cc, color ámbar.. -. 500 g de algodón hidrofílico.. -. Caja de guantes estériles. -. Gradilla. -. Mascarillas. -. Mechero de alcohol. -. Cocina eléctrica. -. Papel filtro Whatman Nº 1. -. Papel Kraft. O. 6 Jeringas de 1 cc. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. -. Q. UI M. 2.1.9. Otros. -. Placas petri. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2. Método 2.2.1. Procedimiento Farmacobotánico 2.2.1.1. Recolección Se recolectó hojas de Lippia alba, procedente del Jardín Botánico de Plantas Medicinales "Rosa Elena de los Ríos Martínez" de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo del distrito de Trujillo,. UI M. IC A. provincia de Trujillo, región La Libertad, en la época de primavera.. Q. 2.2.1.2. Preparación de la muestra19. BI. O. a. Selección. IA. Y. La planta recolectada fue transportada al Laboratorio de Farmacognosia de la. AC. Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo,. RM. donde se eliminarán las sustancias extrañas presentes en la muestra.. FA. b. Lavado. DE. Luego de la separación de las sustancias extrañas, se procedió a lavar las hojas. TE. CA. frescas con agua destilada, seguido de una desinfección, se utilizó hipoclorito. IO. de sodio, a una concentración de 200 ppm.. BI BL. c. Secado. Se separó las hojas de los tallos de la planta, se colocó sobre papel kraft y se secó en estufa a 40 °C19.. 2.2.1.3. Obtención del aceite esencial de las hojas de Lippia alba El aceite esencial fue extraído a partir de las hojas frescas por el método de destilación de arrastre de vapor de agua. Se pesaron 100 g de hojas frescas y se colocaron en una pera de separación. En un balón a parte se colocó 1000 mL de 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. agua destilada y se calentó hasta punto de ebullición. Luego la muestra fue sometida a una corriente de vapor de agua sobrecalentada; de esta manera se arrastró la esencia que posteriormente por acción del refrigerante, fue condensada y se obtuvo dos fases, una de aceite esencial y otra del agua (hidrolato); posteriormente se separó el aceite esencial por decantación y se deshidrató las impurezas de agua en el aceite esencial con sulfato de sodio. IC A. anhidro, se filtró y se guardó en un frasco de vidrio color ámbar (para evitar la. Q. UI M. descomposición por la luz), bajo refrigeración a una temperatura de 4 oC20,21.. BI. O. 2.2.1.4. Preparación de las diferentes concentraciones del aceite esencial de las hojas. Y. de Lippia alba. AC. IA. Se tomó del aceite esencial puro (100%), volúmenes de 0.20 mL. 0.25 mL, 0.30. RM. mL, 0.35 mL, 0.40 mL y 0.45 mL, se colocaron en frascos color ámbar. FA. completando con polisorbato 80, para obtener las concentraciones de 20%, 25%,. CA. DE. 30%, 35%, 40% y 45% (v/v) respectivamente22.. IO. TE. 2.2.2. Procedimiento Microbiológico23,25,26. BI BL. 2.2.2.1. Distribución de los grupos de estudio Para determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI), del aceite esencial de las hojas de Lippia alba, se trabajó por triplicado mediante el método de macrodilución en caldo BHI, a la concentración de 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 uL/mL para Escherichia coli y Staphylococcus aureus, utilizando polisorbato 80 como blanco, y al ciprofloxacino como patrón. Para determinar la concentración mínima bactericida (CMB) del aceite esencial de las hojas de Lippia alba se trabajó por triplicado, mediante el método de agar. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. en placa, de los tres primeros tubos de la lectura del CMI, en los cuales no se observó crecimiento visible de la bacteria.. 2.2.2.2. Preparación de inóculos bacterianos23,25,26 a. Reactivación de las cepas Cada cepa bacteriana se sembró en tubos con agar Müller-Hinton inclinado, los. UI M. b. Estandarización del inóculo. IC A. cuales se incubaron a 37° C durante 24 horas.. O. Q. Se tomó una pequeña cantidad de colonias de cada cepa, para luego ser. BI. suspendidas en solución salina fisiológica estéril hasta alcanzar la turbidez. AC. IA. Y. equivalente al tubo N° 1 del Nefelómetro de Mac Farland (3 x 108 UFC/mL).. RM. 2.2.2.3. Actividad bacteriana por el método de difusión de Kirby Bauer. DE. FA. modificado27. CA. Se empleó la técnica de difusión en placa, según el método de Kirby Bauer, la. TE. cual fue modificada, sustituyéndose el disco de papel por pocillos en el medio. BI BL. IO. de cultivo agar Mueller-Hinton solidificado. Este método se fundamenta en la difusión de una muestra a través de una capa de agar solidificado, en una extensión tal que el crecimiento de microorganismos sensibles es inhibido en zonas alrededor del área que contiene una concentración conocida de la muestra en estudio.. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2.2.2.4. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)23,24,25,26 La concentración mínima inhibitoria es la menor concentración de antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento visible de la bacteria en el medio de cultivo, tras 18-24 horas de incubación. a. Método de macrodilución en caldo BHI Se utilizó tubos de ensayo, en los cuales se colocó 3 mL de caldo BHI, luego. IC A. se añadió 30 uL, de cada una de las concentraciones de las diluciones del. UI M. aceite esencial preparadas anteriormente, luego en cada tubo de ensayo se. O. Q. colocó 6 uL de la suspensión de la bacteria y se incubó a 37°C por 24 horas.. Y. BI. Se empleó como control positivo al ciprofloxacino, 30 uL a una concentración. AC. IA. de 2mg/mL y para el control negativo 30 uL de polisorbato 80. Se trabajó por. RM. triplicado.. FA. Después de 24 horas de incubadas a 37°C, los tubos de ensayo se examinaron. DE. visualmente. Se consideró la concentración mínima inhibitoria a la menor. CA. concentración de la dilución del aceite esencial a la cual el microorganismo. IO. TE. ensayo no presento desarrollo visible.. BI BL. 2.2.2.5. Determinación de la Concentración Mínima Bactericida (CMB)23,24,25,26 La concentración mínima bactericida es la menor concentración capaz de destruir o matar el 99.9% de bacterias del inoculo original, tras 18-24 horas de incubación. a. Método de difusión de agar en placa23,24,25,26 Se colocó en placas petri, 18 mL de Agar Mueller-Hinton. De la lectura del CMI, a partir del tubo que no se observó crecimiento bacteriano (inhibición del crecimiento), se contó 3 tubos. De cada tubo seleccionado se extrajo 1 mL 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. para realizar la técnica de siembra por incorporación en placas con agar Mueller-Hinton. Se trabajó por triplicado con cada cepa e incubo a 37°C por 24 horas. Luego se procedió con la lectura; se consideró la CMB a la menor concentración de aceite de hojas de Lippia alba que destruyó o mató al 99.9%. IC A. de bacterias.. UI M. 2.3. Análisis de datos23. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. Los datos fueron presentados en tablas haciendo uso del Excel 2016.. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. III. RESULTADOS. UI. M. IC. A. Tabla 1. Concentración mínima inhibitoria (CMI) del aceite esencial de Lippia alba frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus. Concentración mínima inhibitoria. Bacterianas. (μL/mL). BI. O. Q. Cepas. AC IA. Y. ̅± . . 𝐗 3 ± 0.00. TE CA. ̅ X = promedio. 2.5 ± 0.00. DE. Staphylococcus aureus. FA RM. Escherichia coli. D. E. = desviación estándar. BI B. LI O. Fuente: Investigadores. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla 2. Concentración mínima bactericida (CMB) del aceite esencial de Lippia alba frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus. Concentración mínima bactericida. Bacterianas. (μL/mL). UI. M. IC. A. Cepas. Q. ̅± . . 𝐗. O. 2.5 ± 0.00. Y. BI. Escherichia coli. 3 ± 0.00. ̅ = promedio X. BI B. LI O. TE CA. Fuente: Investigadores. DE. D. E. = desviación estándar. FA RM. AC IA. Staphylococcus aureus. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IV. DISCUSIÓN. Al comienzo del estudio se realizó el método de difusión de Kirby Bauer modificado para verificar que el aceite esencial de las hojas de Lippia alba tiene efecto sobre los microorganismos en estudio, comprobando que si tiene efecto. Después se realizaron varios ensayos para determinar las concentraciones de aceite esencial para realizar el estudio,. IC A. encontrando que el aceite esencial opacaba el caldo BHI, siendo necesario tomar como. UI M. referencia para la determinación del CMI el sedimento bacteriano.. Q. En la tabla N° 01 se observa los valores de la CMI del aceite esencial de las hojas de Lippia. BI. O. alba, siendo para Escherichia coli y Staphylococcus aureus, 2.5 μL/mL y 3 μL/mL. IA. Y. respectivamente. Dentro de esta familia, el aceite esencial de Lippia origanoides presento. AC. una CMI para Staphylococcus aureus de 1,25 μL/mL durante los 10 meses de estudio y para. RM. Escherichia coli variaron entre 0.15 μL/mL a 0.31 μL/mL, estos resultados indican que los. FA. componentes del aceite esencial varían dependiendo de la estación y asimismo varían sus. CA. DE. propiedades 27.. TE. En la determinación del CMB, tiene de destruir o matar el 99.9% de bacterias del inoculo. IO. original, 0.1% es la cantidad máxima de UFC que debían crecer en placa, siendo en nuestro. BI BL. trabajo 600 UFC. En las placas cultivadas a partir del CMI de Escherichia coli no hubo crecimiento bacteriano considerando la menor concentración como la CMB, pero en las placas cultivadas a partir del CMI de Staphylococcus aureus si hubo crecimiento bacteriano, siendo en todas las placas menor a 600 UFC (menor al 0.1% del inoculo original), considerando la menor concentración como la CMB. En la tabla N° 02 muestra los valores de la concentración mínima bactericida (CMB) del aceite esencial de las hojas de Lippia alba, siendo para Escherichia coli y Staphylococcus aureus, 2.5 μL/mL y 3 μL/mL respectivamente. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Dentro de esta familia, el aceite esencial de Lippia origanoides presento una CMB para Escherichia coli de 1.25 μL/mL y para Staphylococcus aureus fue de 2.5 μL/mL27. Mostrando que esta especie tiene un mejor efecto bactericida. La actividad antimicrobiana del aceite esencial depende principalmente de tres características; sus componentes químicos, su carácter hidrófobo, y el tipo de microorganismo al que debe atacar28.. IC A. La composición de los aceites esenciales varía de acuerdo a las diferentes partes de la planta. UI M. de las cuales se extrae, y puesto que sus componentes volátiles son los que presentan el. Q. efecto antimicrobiano, se ha demostrado que los principales componentes derivan de un. BI. O. grupo de terpenoides, sesquiterpenos y diterpenos, los cuales a su vez contienen diferentes. Y. grupos de hidrocarburos, ácidos, alcoholes, aldehídos, esteres, éteres y cetonas.. AC. IA. El aceite esencial de Lippia alba está caracterizado por un alto contenido de monoterpenos. RM. oxigenados y por un bajo contenido de hidrocarburos sesquiterpénicos y sesquiterpenos. FA. oxigenados.. DE. El efecto inhibidor de varios terpenoides en la absorción de oxígeno microbiano y la. CA. fosforilación oxidativa ha sido demostrado, siendo los compuestos fenólicos y los alcoholes. IO. TE. no fenólicos los que exhiben los efectos inhibidores más fuertes, seguidos de aldehídos y. BI BL. cetonas, estando así relacionada con el alto contenido de oxígeno que contienen los monoterpenos representados principalmente por aldehídos y alcoholes28. Según su carácter hidrófobo, tiene la capacidad de alterar y penetrar en la estructura lipídica de la pared celular perturbando estructuras celulares, lo que lleva a la desnaturalización de las proteínas y a la destrucción de la membrana celular, haciéndolas más permeables, lo que conduce a rupturas o fugas citoplasmáticas, lisis celular, interacciones con proteínas ATPasa y eventualmente la muerte del microorganismo29.. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Por otro lado, se ha observado en estudios que las bacterias Gram-negativas tienen mayor susceptibilidad a los aceites esenciales a diferencia de las Gram-positivas, estando relacionado con la membrana externa compuesta por lipopolisacáridos que poseen este tipo de bacterias29. Otros estudios suponen que el efecto antimicrobiano de los monoterpenos está influenciado por la carga superficial de la membrana celular microbiana30.. IC A. Los resultados obtenidos en esta tesis con otros estudios similares, puede diferir que muchos. UI M. factores varían entre los ensayos. Esto incluye diferencias en el crecimiento microbiano,. Q. exposición de los microorganismos al aceite esencial, la solubilidad del aceite, el uso y. BI. O. cantidad de emulsificante. Asimismo, la composición del aceite esencial de Lippia alba. Y. puede variar, teniendo en cuenta factores como el clima y las condiciones ambientales.. AC. IA. En las diferentes regiones, las mismas especies de plantas pueden exhibir diferente. RM. composición de aceite esencial, esto es justificado por el hecho de que los aceites esenciales. FA. son metabolitos secundarios cuya producción y acumulación depende de variables tales. DE. como el tipo de suelo (por ejemplo: tamaño de la partícula, pH y nutrientes), condiciones. CA. ambientales (temperatura, precipitación, humedad, duración de luz del día, niveles de luz),. IO. TE. disponibilidad del agua y exposición a herbívoros27.. BI BL. Estos y otros elementos se deben tener en cuenta en la concentración mínima inhibitoria y concentración mínima bactericida.. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. V. CONCLUSIONES.  La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del aceite esencial de las hojas de Lippia alba, por el método de macrodilución en caldo BHI frente a Escherichia coli fue 2.5 μL/mL.  La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del aceite esencial de las hojas de Lippia. IC A. alba, por el método de macrodilución en caldo BHI frente a Staphylococcus aureus. UI M. fue 3 μL/mL.. Q.  La Concentración Mínima Bactericida (CMB) del aceite esencial de las hojas de. BI. O. Lippia alba, por el método de difusión de agar en placa frente a Escherichia coli fue. Y. 2.5 μL/mL.. AC. IA.  La Concentración Mínima Bactericida (CMB) del aceite esencial de las hojas de. RM. Lippia alba, por el método de difusión de agar en placa frente a Staphylococcus. BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. aureus fue 3 μL/mL.. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 1. Murray P, Rosenthal K, Pfaller M. Microbiología Medica. Ed. ELSEVIER. 7° ed. España. 2014. Pág. 109, 165-174, 177, 179, 258, 260 2. Prats G. Microbiología Clínica. Ed. Medica Panamericana. 1° ed. España. 2005. Pág. 17 3. Romero R. Microbiología y parasitología humana. Ed. Medica Panamericana. 3° ed.. IC A. Mexico. 2007. Pag. 623-625. Q. O. de Antioquia. 2° ed. Medellín. 2008. Pag. 22-41. UI M. 4. Montoya H. Microbiología básica para el área de la salud y afines. Ed. Universidad. BI. 5. Tortora G, Funke B, Case C. Introducción a la Microbiología. Ed. Medica. IA. Y. Panamericana. 9° ed. Argentina. 2007. Pág. 12, 332, 583-595. AC. 6. Rios N, Davila R. Actividad antibacteriana in vitro de Geranium ayavacense sobre. RM. Escherichia coli, Enterococcus faecalis y Staphylococcus aureus, IMET-. FA. ESSALUD-2013 [tesis]. Universidad Nacional De La Amazonía Peruana; 2014.. DE. 7. Sanchez S, Curitima E. Actividad antibacteriana in vitro del extracto hidroalcoholico. CA. de hojas de Chenopodium ambrosioides (Paico) por el método de macrodilución en. IO. TE. caldo frente a Staphylococcus aureus y Escherichia coli, Iquitos – 2015 [Internet].. BI BL. [acceso en agosto del 2017]. Universidad Nacional De La Amazonía Peruana; 2016. Disponible. en:. http://repositorio.unapiquitos.edu.pe/bitstream/handle/UNAP/3864/Sergio_Tesis_T itulo_2016.pdf?sequence=1 8. Brunton L, Chabner B, Knollmann B. Goodman & Gilman. Las bases farmacológicas de la terapéutica. Ed. McGraw-Hill. 12° ed. Mexico. 2012. Pág. 1365 9. Rodriguez C, Zarate A, Sánchez L. Actividad antimicrobiana de cuatro variedades de plantas frente a patógenos de importancia clínica en Colombia. [Internet]. [acceso. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

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(42) BI BL. IO. TE. CA. DE. FA. RM. AC. IA. Y. BI. O. Q. UI M. IC A. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.