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Evaluación de la Estabilidad del Jugo de Uva (Vitis rotundifolia) Fortificado con Extractos Fenólicoas, ácido Ascórbico y Procesado por Alta Presión Hidrostática-Edición Única

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Academic year: 2017

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Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey

Campus Monterrey

Monterrey, Nuevo León a

Lic. Arturo Azuara Flores:

Director de Asesoría Legal del Sistema

Por medio de la presente hago constar que soy autor y titular de la obra

Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey (EL INSTITUTO) para que efectúe la divulgación, publicación, comunicación pública, distribución y reproducción, así como la digitalización de la misma, con fines académicos o propios al objeto de EL INSTITUTO.

El Instituto se compromete a respetar en todo momento mi autoría y a otorgarme el crédito correspondiente en todas las actividades mencionadas anteriormente de la obra.

De la misma manera, desligo de toda la responsabilidad a EL INSTITUTO por cualquier violación a los derechos de autor y propiedad intelecutal que cometa el suscrito frente a terceros.

Nombre y Firma AUTOR (A)

de 200

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Evaluación de la Estabilidad del Jugo de Uva (Vitis rotundifolia)

Fortificado con Extractos Fenólicoas, ácido Ascórbico y

Procesado por Alta Presión Hidrostática-Edición Única

Title Evaluación de la Estabilidad del Jugo de Uva (Vitis

rotundifolia) Fortificado con Extractos Fenólicoas, ácido Ascórbico y Procesado por Alta Presión Hidrostática-Edición Única

Authors Armando del Follo Martínez

Affiliation ITESM-Campus Monterrey

Issue Date 2003-06-01

Item type Tesis

Rights Open Access

Downloaded 19-Jan-2017 10:43:57

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INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY CAMPUS MONTERREY

DIVISIÓN DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA PROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERÍA

TECNOLÓGICO

DE MONTERREY®

"EVALUACIÓN DE LA ESTABILIDAD DEL JUGO DE UVA (Vitis rotundifolia)

FORTIFICADO CON EXTRACTOS FENÓLICOS, ÁCIDO ASCÓRBICO Y PROCESADO POR ALTA PRESIÓN HIDROSTÁTICA"

TESIS

PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE:

MAESTRO EN CIENCIAS

CON ESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGÍA

POR:

ARMANDO DEL FOLLÓ MARTÍNEZ

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INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY

CAMPUS MONTERREY

DIVISIÓN DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA

PROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERÍA

Los miembros del comité de tesis recomendamos que el presente proyecto de tesis presentado por el Ing. Armando del Folio Martínez sea aceptado como requisito parcial para obtener el grado académico de Maestro en Ciencias con especialidad en:

BIOTECNOLOGÍA

Comité de Tesis:

Carmen Hernández Brenes, Ph. D. Asesor

Sinodal Sergio O. Serna Saldívar, Ph. D.Sinodal

Cecilia Rojas de Gante, Ph. D. Sinodal

Federico Viramontes Brown, Ph. D. Director del Programa de Graduados en Ingeniería

JUNIO 2003 Marco Antonio Rito Palomares, Ph. D.

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RESUMEN

En la actualidad el consumo de alimentos que conserven sus propiedades nutracéuticas durante y después del procesado ha tenido un gran impulso. Esto ha estimulado al área científica a desarrollar nuevas tecnologías de procesado y nuevas estrategias de estabilización de fitonutrientes. De especial atención para la industria de alimentos es el desarrollo de pigmentos naturales estables al procesado por tecnologías emergentes y con aplicaciones potenciales en ciertos procesos convencionales. La conservación del color en un alimento tiene mucha importancia ya que es la primera característica que se observa por parte de los consumidores y tiene gran impacto en la percepción del sabor y la calidad global del producto. De interés particular para esta tesis es un grupo de compuestos fenólicos llamados antocianinas, que se encuentran principalmente en frutas y vegetales. Estos compuestos están siendo estudiados por diversos grupos de investigación, ya que han demostrado tener propiedades multifuncionales y nutracéuticas. A pesar de las ventajas potenciales para la salud de los consumidores, la aplicación de éstos pigmentos como colorantes naturales, en muchos casos se ve limitada por su alto costo y su baja estabilidad a algunos procesados. La nueva tecnología que se utilizó en este proyecto es la aplicación de una alta presión hidrostática (HHP). A pesar de los múltiples reportes positivos existentes en la literatura sobre las ventajas de esta nueva tecnología, su principal limitación es la actividad residual de enzimas oxidorreductasas. Dicha actividad residual, en combinación con el daño y ruptura que sufren los tejidos a causa de las altas presiones tiene el potencial de causar cambios no deseables en el sabor, color y calidad nutrimental del alimento durante su vida útil. La estrategia de estabilización que se utilizó en este proyecto se basa en la propiedad de interacción en solución acuosa de las antocianinas con otras moléculas, denominadas copigmentos. Esta reacción se lleva a cabo mediante la interacción por fuerzas intermoleculares. Además del potencial de estabilización, la reacción de copigmentación provoca cambios espectrales en el pigmento que resultan en incrementos en su poder de coloración.

Este proyecto tuvo como objetivo evaluar la estabilidad de las antocianinas presentes en el jugo de uva muscadina copigmentadas con extractos fenólicos, fortificado con ácido ascórbico y procesados por alta presión hidrostática.

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uva muscadina y que la composición química individual de cada uno de los extractos así como los tipos de sustituyentes tienen una marcada influencia sobre la copigmentación intermolecular. Esta influencia es más evidente en los cambios colorimétricos y espectrales; siendo en general mayores para el extracto de tomillo.

El segundo estudio tuvo la finalidad de evaluar bajo diferentes condiciones de procesado por HHP la estabilidad de las antocianinas presentes en el jugo de uva muscadina fortificado con ácido ascórbico y copigmentadas con extractos fenólicos de romero y tomillo. Se concluyó que la copigmentación no sólo sirvió para proteger a los fitonutrientes bajo condiciones altamente oxidativas después del procesado por HHP, además de incrementar el color y la capacidad antioxidante. Las pérdidas más grandes de fitonutrientes se observaron en los jugos procesados a 400 MPa, debido a una alta actividad de polifenoloxidasa (PPO) resultado de la activación enzimática bajo esas condiciones. En general, la fortificación con ácido ascórbico ofreció una protección inicial antioxidante desminuyendo las pérdidas por degradación de las antocianinas y la capacidad antioxidante, las cuales se vieron aumentadas con la adición de los copigmentos. El almacenamiento de los jugos copigmentados presentó pérdidas considerables en el contenido de fitoquímicos. La copigmentación sirvió parcialmente para lograr una mayor retención, sin embargo no logró disminuir de manera contrastante las pérdidas de antocianinas y de ácido ascórbico. A pesar de las pérdidas obtenidas, visualmente la copigmentación logró aumentar y enmascarar parcialmente las pérdidas de color por efectos del tratamiento y el almacenado de los jugos.

El tercer estudio se llevó a cabo con el objetivo de caracterizar, evaluar y determinar la actividad de la enzima PPO en jugo de uva muscadina extraído bajo diferentes condiciones de prensado en caliente. Así como la optimización de dicha etapa de extracción para determinar las condiciones de proceso necesarias para obtener una actividad enzimática específica, minimizando el oscurecimiento enzimático y térmico del producto en etapas preliminares al procesado por HHP. El estudio permitió generar modelos matemáticos eficientes para la caracterización de la actividad enzimática de PPO y el oscurecimiento de los sistemas. Así mismo permitió la identificación de diversas zonas de interés en donde la actividad enzimática fue máxima, así como las zonas donde se presentó una inactivación casi total de la enzima. De la misma forma se identificaron regiones en donde el oscurecimiento fue mínimo así como las regiones donde fue máximo.

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DEDICATORIA

Con profundo cariño y sincero agradecimiento a mis padres por todo su esfuerzo y sacrificio que todos estos años representó y que se ven culminados con esta tesis y a

quienes debo todo lo que soy.

A mi hermana Lulú.

A mis abuelas y tías.

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AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Carmen Hernández por el trabajo realizado en la dirección y revisión de esta tesis, así como ser una buena

amiga en estos años de estancia en la maestría.

Al Dr. Rito, Serna y a la Dra. Rojas por los consejos y enseñanzas que me dejaron durante la maestría.

Al Dr. Talcott y a David del Pozo por el apoyo brindado durante mi estancia en Florida para la realización de esta

tesis.

A mis compañeros de la maestría.

(10)

TABla DE CONTENIDO

RESUMEN I

DEDICATORIA III

[image:10.615.94.518.296.693.2]

AGRADECIMIENTOS IV

TABLA DE CONTENIDO V

LISTA DE TABLAS IX

LISTA DE FIGURAS XI

LISTA DE ABREVIATURAS XIII

CAPÍTULO I: REVISIÓN DE LITERATURA 1 Alta Presión Hidrostática 1

(11)

Metales y Bisulfitos 20 Enzimas 21 Fenómeno de Copigmentación 23 Copigmentación por Autoasociación 23 Copigmentación Intramolecular 23 Copigmentación Intermolecular 24 Factores que Afectan la Copigmentación Intermolecular 25 Composición Química de Plantas con Potencial Estabilizador de las Antocianinas 26 Uva (Vitis spp.) 27 Composición Fenólica de las Especias 27 CAPÍTULO II: CARACTERIZACIÓN DE LA COPIGMENTACIÓN INTERMOLECULAR DE LAS ANTOCIANINAS DEL JUGO DE

UVA (VITIS ROTUNDIFOLIA) CON EXTRACTOS FENOLICOS DE ROMERO (ROSMARINUS OFFICINALIS L.) Y TOMILLO

(THYMUS VULGARIS L.) 29

(12)

Conclusiones 45

CAPÍTULO III: EFECTO ESTABILIZADOR DE LAS ANTOCIANINAS EN JUGO DE UVA

(ViTIS ROTUND1FOLIA)

COPIGMENTADOS CON EXTRACTOS FENÓLICOS Y PROCESADO POR ALTA PRESIÓN HIDROSTÁTICA 46

Introducción 46 Materiales y Métodos 48 Materiales 48 Extracción y Purificación de Copigmentos 48 Extracción del Jugo de Uva 48 Copigmentación 48 Sistemas Modelo de Jugo de Uva Sometidos a Alta Presión Hidrostática 48 Mediciones Fisicoquímicas 49 Medición Polarográfica de la Polifenoloxidasa 49 Cuantificación de Ácido Ascórbico por HPLC 49 Cuantificación de Antocianinas por HPLC 50 Medición de la Capacidad Antioxidante 50 Análisis Estadístico 51 Resultados y Discusión 52 Efecto de Tratamiento Causado por la Adición de Extractos Fenólicos 52 Efecto de Tratamiento Causado por el Tipo Procesado 58 Efecto de Tratamiento Causado por la Adición del Ácido Ascórbico 63 Efecto del Tipo de Extracto y Procesado sobre el Contenido de Ácido Ascórbico 67 Efecto del Almacenamiento sobre el Contenido de Fitonutrientes 69 Conclusiones 72

CAPÍTULO IV: CARACTERIZACIÓN DE LA POLIFENOLOXIDASA Y OPTIMIZACIÓN DE LA EXTRACCIÓN EN CALIENTE

DEL JUGO DE UVA (VlTIS ROTUNDIFOLIA) 73

(13)

Análisis Estadístico 76 Resultados y Discusión 77 Efecto del Prensado en Caliente sobre la Actividad Enzimática de la Polifenoloxidasa 77 Efecto del Prensado en Caliente sobre el Oscurecimiento 80 Optimización del Prensado en Caliente 82 Conclusiones 84

CONCLUSIONES GENERALES Y RECOMENDACIONES 85

LITERATURA CITADA 86

ANEXO 99

(14)

LISTA DE TABLAS

Tabla 1.1. Contenido de antocianinas totales en algunas frutas y vegetales 16

Tabla 1.2. Características estructurales y espectrales de las antocianinas dependiendo de los sustituyentes que contengan 18

Tabla 2.1. Caracterización de la composición fenólica de los exactos acuosos concentrados de romero (Rosmarinus officinalis L) y tomillo (Thymus vulgaris L.) 36

Tabla 2.2. Efecto de la adición de los extractos fenólicos de romero (Rosmarinus officinalis L.) y tomillo (Thymus vulgaris L.) sobre los valores de color instrumental del jugo de uva muscadina (Vitis rotundifolia) 39

Tabla 2.3. Efecto de la adición de los extractos fenólicos de romero (Rosmarinus officinalis L.) y tomillo (Thymus vulgaris L.) sobre las propiedades espectrales del jugo de uva muscadina (Vitis rotundifolia) 40

Tabla 2.4. Efecto de la adición de los extractos fenólicos de romero (Rosmarinus officinalis L.) y tomillo (Thymus vulgaris L.) sobre las mediciones de antocianinas, fenólicos totales y sobre otros parámetros de calidad del color del jugo de uva muscadina (Vitis rotundifolia) 42

Tabla 3.1. Efecto de la adición de los extractos de romero (Rosmarinus officinalis L.) y tomillo (Thymus vulgaris L.) y la fortificación con ácido ascórbico, sobre el contenido de antocianinas del jugo de uva muscadina (Vitis rotundifolia) procesado por alta presión hidrostática 53

Tabla 3.2. Efectos globales de los tratamientos de copigmentación, procesados por alta presión hidrostática y fortificados con ácido ascórbico, sobre el contenido de antocianinas del jugo de uva muscadina (Vitis rotundifolia) 54

Tabla 3.3. Efectos de los tratamientos individuales y globales causados por la adición de los extractos de romero (Rosmarinus officinalis L.) y tomillo (Thymus vulgaris L.) y la fortificación con ácido ascórbico, sobre la capacidad de absorber radicales libres de oxígeno (ORAC) del jugo de uva muscadina (Vitis rotundifolia) procesado por alta presión hidrostática 55

(15)

Tabla 3.5. Efectos de tratamientos individuales y globales de la adición de los extractos de romero (Rosmarinus officinalis L.) y tomillo (Thymus vulgaris L), sobre el contenido de ácido ascórbico en el del jugo de uva muscadina (Vitis rotundifolia) procesado por alta presión hidrostática 67

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1.1. Estructura química general de diversos compuestos fenólicos 12

Figura 1.2. Estructura química general de flavonoides y antocianinas 12

Figura 1.3. Estructura general de las chalconas 14

Figura 1.4. Estructura general de las flavonas 14

Figura 1.5. Estructura general de los flavonoles 14

Figura 1.6. Estructura general de las flavanonas 15

Figura 1.7. Estructura general de los isoflavonoides 15

Figura 1.8. Ácido gálico como unidad monomérica formadora de taninos 15

Figura 1.9. Representación esquemática del fenómeno de copigmentación 25

Figura 3.1. Interacción que describe el efecto del tipo de procesado y el tipo de copigmento, sobre el contenido de antocianinas monoméricas totales del jugo de uva muscadina (Vitis rotundifolia) 59

Figura 3.2. Interacción que describe el efecto del procesado y el tipo de copigmento, sobre la capacidad de absorber radicales libres de oxígeno (ORAC) del jugo de uva muscadina (Vitis rotundifolia) 61

Figura 3.3. Interacción que describe el efecto del procesado y tipo de copigmento, en la actividad enzimática de polifenoloxidasa (PPO) del jugo de uva muscadina (Vitis rotundifolia) 62

Figura 3.4. Interacción que describe el efecto de la adición de ácido ascórbico y el tipo de procesado, en el contenido de las antocianinas monoméricas totales del jugo de uva muscadina (Vitis rotundifolia) 64

Figura 3.5. Interacción que describe el efecto de la adición de ácido ascórbico y el tipo de copigmento, sobre la capacidad de absorber radicales libres de oxígeno (ORAC) del jugo de uva muscadina (Vitis rotundifolia) 65

Figura 3.6. Interacción que describe el efecto de la adición de ácido ascórbico y el tipo de copigmento, sobre la actividad enzimática de polifenoloxidasa (PPO) del jugo de uva muscadina (Vitis rotundifolia) 66

Figura 3.7. Interacción que describe el efecto del procesado y el tipo de copigmento, en el contenido total de ácido ascórbico del jugo de uva muscadina (Vitis rotundifolia) 68

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Figura 4.2. Consumo de oxígeno en presencia de catequina del jugo de uva muscadina (Vitis rotundifolia), extraído bajo diferentes condiciones de prensado en caliente 78

Figura 4.3. Actividad enzimática residual de polifenoloxidasa (PPO) del jugo de uva muscadina (Vitis rotundifolia) bajo diferentes condiciones de prensado en caliente 79

Figura 4.4. Superficie de respuesta para el oscurecimiento a 420 nm presentado por acción enzimática residual de polifenoloxidasa (PPO) y tratamiento térmico, aplicado en jugo de uva muscadina (Vitis rotundifolia) bajo diferentes condiciones de prensado en caliente 81

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LISTA DE ABREVIATURAS

%v/v: %AP: %AP: o. °C: 3,5­gluc: A:

A420nm H2O:

A420nmSO2:

A700:

AA:

AAPH:

AAx vis-max:

ACx vis­max:

ADN: AMT:

ARx vis-max:

AX vis-max H2O:

Ax vis-max SO2:

AX vis­max: C.V.: CA: cm: CM: Co: CP: cv: DC: DEAE: DOPA: E.C.:

E. coli:

ECN: EUA: FD: FDA: FR: g/mol:

g:

h:

H2O2:

HCI: HHP:

HLPC:

Porciento volumen sobre volumen Porcentaje de antocianinas poliméricas Porciento peso sobre volumen

Grado(s)

Grados centígrados

Antocianinas 3,5­diglucósidos Absorbencia

Absorbancia a 420 nm de las muestras tratadas con agua Absorbancia a 420 nm de las muestras tratadas con bisulfitos Absorbancia a 700 nm a pH 1 y pH 4.5

Ácido ascórbico

2,2'­Azobis(2­amidinopropano)

Absorbancia en la longitud de onda máxima de las antocianinas sin copigmentar Absorbancia en la longitud de onda máxima de las antocianinas copigmentadas Ácido desoxirribonucleico

Antocianinas monoméricas totales en miligramos/litro

Absorbancia de los copigmentos en la longitud de onda máxima de las antocianinas copigmentadas

Absorbancia a la longitud de onda máxima de las muestras tratadas con agua Absorbancia a la longitud de onda máxima de las muestras tratadas con bisulfitos Absorbancia a la longitud de onda máxima

Capital variable California Centímetro(s) Carboximetil Company Color polimérico Cultivar

Densidad de color Dietilaminoetanol 3,4­Dihidroxifenilalanina Enzyme Commission

Escherichia coli

Ecuación

Estados Unidos de América Factor de dilución

Food and Drugs Administration Fluorescencia relativa

Gramo por mol Gramo(s) Hora(s)

Peróxido de hidrógeno Ácido clorhídrico

(19)

ID: Inc.: Int.: L*: L: LOX: M:

m3: MA: MB: mg/kg: mg/L: min: mL: mM: MO: MPa: N: NC: nm:

nmoIO2/mL H2O:

NY: OH: ORAC: PE: PME: POD: ppm: PPO: Pue: rpm: RSM: S.A.:

S. cerevisiae:

UHT: VA: A%Abs: max: uL: uM: um:

índice de degradación Incorporated International Lightness Litro(s) Lipooxigenasa Molar Metro(s) cúbico(s) Massachussets Manitoba

Miligramo(s) por kilogramo(s) Miligramos por litro

Minuto(s) Mililitro(s) Milimolar Missouri Megapascales Normal Noth Carolina Nanómetro(s)

Nanomoles de oxígeno por mililitro de agua New York

Ohio

Capacidad de absorber radicales libres de oxígeno Pectinaesterasa

Pectinametilesterasa Peroxidasa

Partes por millón Polifenoloxidasa Puebla

Revoluciones por minuto

Metodología de respuesta de superficies Sociedad anónima

Saccharomyces cerevisiae

Ultrapasteurízado Virginia

Cambio porcentual en absorbancia de las antocianinas copigmentadas Longitud de onda máxima

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CAPÍTULO I

REVISIÓN DE LITERATURA

ALTA PRESIÓN HIDROSTÁTICA

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El uso de la HHP ofrece varias ventajas sobre otras tecnologías ya que evita la deformación de los alimentos, debido a que la presión se transmite uniforme e instantáneamente, es decir, no hay gradientes. A diferencia de lo que ocurre con los procesos térmicos, el tratamiento con HHP es independiente del volumen y de la forma de la muestra, con lo que se reduce el tiempo requerido para procesar grandes cantidades de alimento (Cheftel 1995; Pothakamury y otros 1995). Así mismo, no se altera significativamente el sabor ni se produce pardeamiento no enzimático, pues las altas presiones no favorecen la reacción de Maillard (Hayashi 1989). Sin embargo, la HHP produce cambios en las propiedades funcionales en los alimentos lo que puede resultar positivo en algunos casos como en el huevo, que al ser sometido a altas presiones no presenta el sabor y olor sulfuroso característico provocado por el calentamiento; debido a que el tratamiento térmico produce la formación de lisinoalanina, promotora de estas características. Además, la lisinoalanina limita la asimilación de aminoácidos en el cuerpo humano (Hayashi 1989). También el uso de la HHP, podría disminuir el uso de aditivos necesarios para controlar cambios de calidad que no tienen lugar con esta tecnología (Zhao y otros 1998). Con respecto a las desventajas de dicha tecnología podemos mencionar el alto costo del equipo debido a que como tecnología emergente, en principio es más cara que las tradicionales; pero se espera que en los próximos años se desarrollen equipos más baratos (Meyer y otros 2000). Así mismo, la desconfianza por parte del consumidor a decidirse comprar un producto que se sale de los esquemas tradicionales podría presentarse, por ser algo novedoso y desconocido. A pesar de ello, en Japón, Estados Unidos y algunos países europeos los productos presurizados se consumen cada vez más. Además de las desventajas en costo y aceptación, existen nuevos problemas tecnológicos en diversos productos como la actividad enzimática residual y pérdida potencial de nutrientes lo que abre un área de investigación y desarrollo tecnológico nueva y necesaria para la aplicación comercial de la tecnología.

DESARROLLO HISTÓRICO DE LA ALTA PRESIÓN HIDROSTÁTICA

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contribuciones de otros científicos como Crossland y otros (1971), quienes investigaron la producción industrial de polietileno de alta densidad y realizaron el corte de este material aplicando altas presiones. Además los trabajos de Crossland (1983a, 1983b) en el diseño de equipos de generación de altas presiones y recopilación de una revisión bibliográfica de las aplicaciones industriales de la alta presión. No es hasta principios de 1982 cuando realmente se empieza a investigar en Estados Unidos de forma exhaustiva el impacto de la alta presión hidrostática sobre las propiedades de los alimentos (Hoover y otros 1989; Hoover 1993); en 1986 se iniciaron líneas de investigación similares en Japón, lo que trajo como resultado la creación de la Sociedad Japonesa de Alta Presión y el lanzamiento al mercado de los primeros alimentos presurizados (Galazka y Ledward 1998). Japón es el país pionero en cuanto a la producción y comercialización de este tipo de alimentos. Estos primeros alimentos incluyeron procesados de tipo ácidos, como zumos y derivados de frutas (Ledward y otros 1995). El primer tipo de productos alimenticios presurizados fueron las mermeladas de fresa, frambuesa, kiwi y manzana y se lanzaron al mercado por la compañía japonesa Meidi­Ya Food Co. (Kinki, Osaka, Japón); hoy en día se comercializan mucho más productos en Japón. En los Estados Unidos, compañías como Avomex (Keller, Texas, EUA.) y Minute Maid (Houston, Texas, EUA.) tienen disponibles en el mercado productos como guacamole, salsas y jugos de diversas frutas, respectivamente. En Europa, países como Francia y España han lanzado al mercado diversos productos entre ellos jugos de diversas frutas, carnes, y embutidos. En México el Grupo Jumex en meses recientes ha lanzado ya al mercado uno de los primeros productos procesados con esta tecnología, siendo el jugo de naranja el primero de una lista la cual, en años próximos se incrementará a otras frutas y vegetales.

SISTEMAS, MÉTODOS Y EQUIPOS DISPONIBLES PARA EL PROCESADO POR ALTA PRESIÓN HIDROSTÁTICA

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frío y templados, con tiempos de tratamiento de 5 a 20 minutos y las presiones aplicadas no suelen ser inferiores a 400 MPa y no superan los 900 MPa (Pothakamury y otros 1995).

Por otra parte la alta presión se puede producir por distintos métodos: compresión directa, compresión indirecta o por calentamiento del medio presurizante. Para lograr la compresión directa se emplea un pistón para presurizar; y la alta presión es generada por la presurización del medio a través del extremo del pistón de diámetro pequeño. Este método permite compresiones muy rápidas, pero limitaciones del sellado entre el pistón y la superficie interna de la cámara lo que restringe su uso a laboratorios o a plantas piloto. En el método de compresión indirecta, se usa un intensificador de alta presión para bombear el medio presurizante desde un depósito hacia la cámara de presurización y así se alcanza la presión deseada, siendo éste el método más empleado a escala industrial. En cuanto al tercer método, se basa en la propiedad de expansión del medio presurizante cuando se le aplica una alta temperatura, produciéndose una elevación de la presión. El efecto se logra cuando se combina alta presión con alta temperatura. Este método requiere un control muy preciso de la temperatura dentro del volumen interno total de la cámara de presurización (Téllez y otros 2001).

(24)

International (Washington, Columbia, EDA.), al presente es una de las compañías líderes en el desarrollo de equipos de alta presión y ha desarrollado los primeros equipos continuos del mercado. El método de funcionamiento de este sistema continuo es mediante el uso de un dispositivo llamado aislador el cual en su interior tiene una cámara que separa al alimento del líquido presurizante que puede ser agua o algún aceite o mezcla como en el proceso por lotes. En este proceso el alimento es bombeado de forma secuencia! en cada aislador, presurizado y mantenido así por un período corto de tiempo y finalmente bombeado hacia el exterior, en donde se almacena por un tiempo determinado en algún tanque. La elección de materiales para el envasado de alimentos en este tipo de proceso es ilimitada ya que el llenado es realizado en condiciones de asepsia o esterilidad después de llevar a cabo el proceso de presurización.

EFECTO DE LA ALTA PRESIÓN HIDROSTÁTICA SOBRE LOS MICROORGANISMOS

La extensión del efecto de la HHP sobre la inactivación microbiana depende de variables de proceso, tales como presión, tiempo y temperatura de la exposición, además de la composición del alimento y tipo de microorganismo involucrados. La HHP produce cambios de tipo morfológico en las células vegetativas tales como la compresión del gas en las vacuolas, el alargamiento de las células y la formación de filamentos (Zobell y Cobet 1970). También se ha reportado la separación de la membrana celular de la pared celular, la contracción de la pared celular con la formación de poros, modificaciones del citoesqueleto, modificaciones de los núcleos y de los organelos intracelulares, coagulación de la proteína citoplasmática y la liberación de constituyentes intracelulares (Cheftel 1995). También el procesado por HHP provoca modificaciones bioquímicas y genéticas al inactivar las enzimas involucradas en la replicación y transcripción del ADN (Smelt 1998). Se piensa que la inactivación de los microorganismos por la HHP puede ser debida a un incremento en la permeabilidad de la membrana, la inhibición de las reacciones productoras de energía y la desnaturalización de las enzimas necesarias para el desarrollo y reproducción de la célula (Pothakamury y otros 1995). Varios sistemas enzimáticos de los microorganismos son inhibidos o inactivados por la presión, como se ha observado en varias deshidrogenasas de Eco//, carboxipeptidasas en las levaduras y la ATPasa localizada en la capa de fosfolípidos, involucrada en el proceso de transporte activo a través de la membrana. Este fenómeno explica parcialmente la ausencia del desarrollo microbiano con los tratamientos con las presiones antes mencionadas (Pothakamury y otros 1995).

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microorganismos Gram negativos son los más sensibles a la HHP; les siguen las levaduras y los hongos, los Gram positivos y por últimos las esporas; los virus son muy resistentes a la HHP, aunque depende del tipo de virus (Smelt 1998). La mayoría de los autores coinciden en que las esporas bacterianas son las formas de vida más resistentes a la presurización (Farkas y Hoover 2000). Presiones de 400 a 600 MPa inactivan las células vegetativas, mientras que para inactivar las esporas se necesitan presiones mayores. Ya en la primera mitad del siglo XX se comprobó que la inactivación de ciertas esporas requiere de presiones de 1200 MPa. Otros autores reportan una presión de 1000 MPa, aunque en algunos casos se requieren valores de hasta 1500 MPa a temperatura ambiente, lo que ha limitado el uso de HHP en productos de baja acidez (Smelt 1998).

FACTORES INTRÍNSECOS DEL ALIMENTO QUE AFECTAN LA INACTIVACIÓN DE CÉLULAS VEGETATIVAS POR ALTA

PRESIÓN HIDROSTÁTICA

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aumentar la temperatura y el tiempo de presurización. En un estudio de inactivación de Candida parapsilosis y Candida tropicalis, realizado por Knorr (1995), se observó que se requieren niveles de presiones más altas o combinaciones de presión y temperatura cuando los alimentos son ricos en azúcar. Las soluciones salinas también favorecen la resistencia a la alta presión hidrostática. Soluciones de NaCI de 2 a 4 M ejercen un marcado efecto protector sobre la inactivación de Eco// y S. cerevisiae en soluciones buffer pH 7 sometidas a presiones de 100 a 400 MPa (Kowaslski y otros 1992).

EFECTO DE LA ALTA PRESIÓN SOBRE LAS PROTEÍNAS Y ENZIMAS

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de los grupos cargados, aumentan la carga total. Lo anterior da como resultado que los grupos que tiene carga opuesta tengan más energía para combinarse, cosa que no pasaría bajo condiciones normales de presión. Por lo que los enlaces iónicos son formados disminuyendo la solubilidad de la molécula proteica provocando por una disminución del número de grupos hidrofílicos libres, dando como resultado que la proteína precipite (Tewari y otros 1999). Esta desnaturalización parcial de las proteínas es un fenómeno complejo que es principalmente debido al rompimiento de puentes intramoleculares salinos o interacciones hidrofóbicas débiles, que tienden a incrementar el área accesible para el solvente. A parte de esto también se ven involucrados otros factores como el tipo de proteína, concentración, pH, fuerza iónica, temperatura, etc. (Galazka y Ledward 1998). La estructura cuaternaria de muchas proteínas es a menudo estabilizada por interacciones hidrofóbicas, lo cual hace a estas proteínas muy sensibles a cambios de presión. Presiones por debajo de los 150 MPa favorecen la disociación de las proteínas oligoméricas, y este fenómeno es acompañado por un cambio negativo de volumen en el orden 0.2 a 0.5%. Sin embargo, muchas estructuras cuaternarias muestran un comportamiento más complejo como la disociación seguida por una agregación de subunidades o precipitación después de un tratamiento por alta presión. Otras estructuras pueden ser simplemente insensibles a tratamientos de presión de este tipo (Galazka y Ledward 1998). Estudios bioquímicos indican que la disociación de los oligómeros en subunidades ocurre a presiones por arriba de los 100 a 200 MPa, supuestamente como resultado del debilitamiento de las interacciones hidrofóbicas. A estas presiones, estructuras monoméricas también son parcialmente desenrolladas y desnaturalizadas. Generalmente, a altas presiones (por arriba de los 200 MPa), muchas proteínas tienen a desenrollarse, y la reasociación de las subunidades de oligómeros disociados puede ocurrir. La renaturalización de los oligómeros después de la presurización puede ser muy lenta y llevar varios días (Galazka y Ledward 1998), por lo que es importante evaluar los alimentos a través del tiempo durante su almacenamiento.

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intermoleculares y cambios conformacionales en el sitio activo de la enzima. Se ha observado que algunas enzimas se inactivan con las altas presiones, mientras que otras se activan o aumentan su actividad. Por ejemplo, las deshidrogenasas de Eco// se inactivan completamente cuando se someten a presiones de 100 MPa durante 15 minutos a 27°C, mientras que la actividad de la aspartasa de esta misma bacteria se incrementó cuando la presión se elevó a 680 MPa (Téllez y otros 2001). Hendrickx y otros (1998) agrupan en dos los efectos de la HHP sobre las enzimas: presiones relativamente bajas, del orden de 100 MPa que activan algunas enzimas y presiones mucho más altas, que provocan inactivación enzimática.

Probablemente sean las polifenoloxidasas (PPO) las enzimas que más se han estudiado bajo condiciones de altas presiones. Al igual que se ha reportado para otras proteínas los principales cambios tienen lugar sobre la conformación de la enzima. La matriz alimentaria también influye en la resistencia y estabilidad a la presurización (Hendrickx y otros 1998). Los efectos de activación que se han reportado en la literatura, pueden ser atribuidos a la configuración reversible y/o a los cambios de conformación de la enzima y/o a las moléculas del sustrato que lo hacen más disponible (Téllez y otros 2001). Estudios realizados por Gómez y Ledward (1996) tanto en tirosinasa comercial de champiñón como en tirosinasas extraídas de champiñones y papa mostraron un oscurecimiento después de la presurización. Dichos autores reportaron que la actividad de la PPO comercial disminuye de forma constante con la presión y tiempo en un buffer de fosfato a pH 6.5, y observaron una inactivación completa pero reversible a 800 MPa por 5 minutos. Los extractos de PPO purificada de papas y champiñones siguieron un comportamiento diferente al observado para la enzima comercial. La actividad de la PPO en las papas se perdió de manera gradual con relación al incremento en la presión, sin embargo, después de 10 minutos a 800 MPa, se observó un 40% de actividad residual. Para el caso de los champiñones, la actividad aumentó después de un tratamiento de 400 MPa por 10 minutos e incluso a presiones de 800 MPa por 10 minutos, se observó un 60% de actividad residual. Dicho estudio comparativo indicó que la fuente enzimática PPO y composición química de cada alimento afectan la estabilidad de la enzima al someterse a presiones hidrostáticas altas, y que el tratamiento por HHP en algunos casos no es suficiente para lograr la completa inactivación de PPO. La combinación de este proceso con otras alternativas podría ser una opción viable, entre ellas el uso de inhibidores enzimáticos y/o la aplicación de tratamientos térmicos leves antes o durante el procesado por HHP.

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tratado por HHP, no fueron significativamente diferentes a los obtenidos para el guacamole no presurizado. Se observó oscurecimiento enzimático del guacamole durante el almacenamiento después de la presurización, el cual fue atribuido a la actividad residual de la PPO. Otros estudios sobre estabilidad enzimática fueron realizados por Seyderhelm y Knorr (1992) sobre la pectinaesterasa (PE), enzima presente en jugo de cítricos y que puede causar la pérdida de la nubosidad o turbidez en los jugos. Los autores mostraron que esta enzima es barorresistente incluso a presiones de 900 MPa y que esta resistencia se incrementaba con el aumento de sólidos solubles. El uso de métodos combinados de presión con temperatura parece ser la estrategia a seguir para el control la actividad enzimática. Rovere y otros (1996) estudiaron el efecto y la inactivación de la pectinametilesterasa (PME), peroxidasa (POD) y PPO combinando presiones de hasta 100 MPa con temperaturas de 20 a 88°C. Sus estudios indicaron que todas las enzimas pueden ser inactivadas usando 100 MPa a 50 ó 60°C.

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NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES

El interés del consumidor por optimizar su dieta para mantener una buena salud, y extender los años y calidad de vida, ha causado un incremento en el segmento de mercado de los alimentos naturales y en los últimos años ha resultado la revolución tecnocientífica de los alimentos funcionales o alimentos diseñados. La base de estos componentes es eminentemente de on'gen vegetal, aunque como excepción también están incluidos los suplementos prebióticos y probióticos. Los alimentos funcionales, y los suplementos nutrimentales que proveen un posible beneficio fisiológico en el control o la prevención de enfermedades, representan una oportunidad para el desarrollo de nuevos productos. La comprensión científica sobre como actúan en el organismo estos componentes no nutricionales o fitoquímicos apenas está en sus inicios; no sólo se están identificando y encontrando un gran número de compuestos, sino que también se está logrando establecer el mecanismo acción de algunos de ellos. Aunque los fitoquímicos no contribuyen con energía o material estructural al organismo, pueden cumplir importantes funciones en la prevención y tratamiento de enfermedades. Se estima que actualmente el mercado de alimentos funcionales y productos nutracéuticos es de 47.6 billones de dólares, siendo Estados Unidos el mercado más grande con 18.25 billones, seguido de Europa y Japón con 15.4 billones y 11.8 billones respectivamente. El mercado americano creció un 8.5% en el 2001, y se espera que una tendencia similar de crecimiento del 7.5% para el 2005 (Sloan 2002). El consumo de flavonoides y de compuestos fenólicos en general presentes en el jugo de uva han mostrado efectos benéficos a la salud humana y han recibido mucha atención como nutracéuticos. Rusznayák y Szent­Gyórgyi (1939) observaron que una mezcla de dos flavononas disminuyó la permeabilidad y fragilidad capilar en humanos y propuso llamarlas vitamina P. El término vitamina P en la actualidad ha sido abandonado debido a que los flavonoides no han encajado en la definición de vitaminas. Sin embargo, en años recientes numerosos estudios han demostrado que los flavonoides y otros compuestos fenólicos presentes en uvas y sus derivados, poseen efectos anticarcinogénicos, antiinflamatorios, antihepatóxicos, antibacteriales, antialergénicos, antitrombóticos y antioxidantes (Mazza 1998).

COMPUESTOS FENÓLICOS

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clasificaron estos compuestos en quince grandes grupos, sin embargo por conveniencia Walter (1975) los clasificó en dos grupos:

> Grupo I: Los ácidos fenólicos y cumarinas (Figura 1.1), son compuestos que tienen estructuras Ce­Ci y C6­C3, dentro de los cuales podemos encontrar ácidos benzoicos, ácidos cinámicos, escopoletina, etc. Ambos tipos de ácidos fenólicos también se pueden encontrar de forma conjugada o esterificada. Las cumarinas por lo general se encuentran en plantas medicinales.

OR,

Ácidos Fenólicos

CH=CH­COOH

[image:31.612.116.510.234.356.2]

Ácidos Cinámicos Cumarinas

Figura 1.1. Estructura química general de diversos compuestos fenólicos.

[image:31.612.236.355.463.550.2]

> Grupo II: Está formado por flavonoides y antocianinas (Figura 1.2) los cuales, son compuestos con estructura Ce­Ca­Ce, dentro de los cuales podemos encontrar antocianidinas, flavonoles, flavones, chalconas, etc.

Figura 1.2. Estructura química general de flavonoides y antocianinas.

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FLAVONOIDES

Son compuestos fenólicos que abundan en la naturaleza, poseen una estructura química muy parecida a la de las antocianinas, y normalmente se encuentran en diversos frutos junto con ellas ya que ambos grupos de compuestos siguen la misma ruta biosintética. Estos compuestos se encuentran en todos los órganos de las plantas pero usualmente se concentran en las hojas y flores. Los flavonoides presentan todos los matices de solubilidad, desde totalmente solubles en agua hasta insolubles; son generalmente amarillos, y a pesar de que existe un número muy grande de ellos, no contribuyen de manera importante al color de los alimentos. Sin embargo, son responsables en gran medida de la astringencia de diversos productos como el té (Badui 1999). Los flavonoides generalmente se encuentran como glucósidos formados por una aglucona, que en muchos casos deriva de la 2­fenilbenzopirona; entre las principales agluconas se encuentra el flavonol, flavona, isoflavona, flavanona, chalconas, etc. Los azúcares sustituyentes más importantes son la glucosa, ramnosa, galactosa, arabinosa y xilosa, y en ocasiones también se encuentran la apiosa y rutinosa; éstos se unen a la aglucona por medio de los carbonos 7,5 y 4', principalmente (Jackman y Smith 1996). Por otra parte la clasificación de los flavonoides se realiza tomando varios aspectos como el tipo de sustitución que tenga en su anillo C, de su estado ya sea oxidado o en su forma heterocíclica y de la posición que tenga el anillo B. En este subgrupo se encuentran las flavonas, flavonoles, flavanonas, isoflavonoides y antocianinas. Este último grupo de compuestos se discutirá posteriormente por ser de gran importancia en este proyecto, el resto del subgrupo se tratará en términos generales es este escrito como flavonoides. A continuación se mencionan algunos datos relevantes de cada uno de estos subgrupos y sus estructuras químicas generales.

> Chalconas: Son isómeros de las flavanonas por apertura del núcleo central (Figura 1.3). Cabe mencionar el glucósido de la floretina: florizina, ampliamente distribuido en la corteza de los frutos de varias Rosáceas. Produce la "diabetes de la floretina" que se caracteriza por un aumento de la glucosuria, causada por interferencia en la reabsorción de la glucosa por los túbulos renales.

[image:32.612.231.361.569.634.2]

o

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> Flavonas: Son compuestos (Figura 1.4) responsables de los colores amarillos de las flores de muchas plantas. Este tipo de compuestos producen colores más permanentes, pero algo más pálidos de aquellos que son producidos por los flavonoles. Dentro de las flavonas podemos citar la apigenina y luteolina.

Figura 1.4. Estructura general de las flavonas.

> Flavonoles: Son compuestos (Figura 1.5) responsables de dar una coloración amarilla en las hojas de muchas plantas, tienden a desaparecer bajo la acción de luz intensa. Los más comunes son la quercetina, mirecetina, fisetina. Dada su capacidad de capturar radicales libres y de crear complejos con iones metálicos, tienen una actividad antioxidante muy alta; sin embargo, el hecho de que sean poco liposolubles los hace poco adecuados para aplicaciones comerciales. Presentan una gran similitud con la estructura de las antocianidinas y antocianinas, la diferencia radica en que los flavonoides tienen un grupo cetona en el carbono 4 en el anillo C.

Figura 1.5. Estructura general de los flavonoles.

[image:33.612.240.374.446.522.2]
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[image:34.612.240.372.78.157.2]

Figura 1.6. Estructura general de las flavanonas.

[image:34.612.232.359.311.371.2]

> Isoflavonoides: Son compuestos (Figura 1.7) distribuidos en pocas familias (alrededor de 20), principalmente en las leguminosas. Estructuralmente se les puede dividir en varias clases: isoflavonas, isoflavonoles, etc. Por su parte, las isoflavonas tienen actividad estrogénica, es decir, imitación de hormonas femeninas, sobre todo la genisteína, la daidzeína y la gliciteína, que se encuentran como glucósidos en la soya, alfalfa, etc.

Figura 1.7. Estructura general de los isoflavonoides.

> Taninos: Son compuestos (Figura 1.8) incoloros o con tonalidades de amarillo, que de acuerdo con su estructura y reactividad con agentes hidrolíticos los han clasificado en hidrolizables y no hidrolizables o condensados. Los hidrolizables, son sustancias que a su vez se clasifican en galotaninos y elagitaninos; éste último puede estar en forma de glucósido o esterificarse consigo mismo. Los taninos no hidrolizables son generalmente dímeros de la catequina o de antocianidinas. Ambos presentan propiedades reductoras y actúan como antioxidantes protegiendo a los vinos tintos y son los responsables de la astringencia de muchos frutos inmaduros como la va, manzana, pera, etc.

COOH

[image:34.612.258.331.568.640.2]
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ANTOCIANINAS

Importancia de las Antocianinas

Actualmente existe un gran interés en el desarrollo de colorantes de origen natural para la industria de alimentos con el fin de reemplazar a los colorantes sintéticos (Francis 1989). El papel que tienen las antocianinas como colorantes naturales las convierte en compuestos muy importantes debido a que imparten los tonos rojos y azules de muchas frutas y vegetales (Mazza y Miniati 1993), y dan un color atractivo a jugos, vinos, conservas, etc. Las antocianinas comprenden el grupo más grande de pigmentos solubles en agua en el reino vegetal y son encontrados en mayor cantidad en frutas y hortalizas (Timberiake y Bridle 1982). Estos pigmentos también son responsables de una gran variedad de colores en los pétalos de las flores que pueden ir desde salmón, rosa, violeta y azul oscuro dependiendo al pH en el que se encuentren (Jackman y Smith 1996). A pH ácido tienen tonalidades de rojo y a pH básico tonalidades de azul. Son compuestos hidrofílicos y generalmente están presentes en las vacuolas de la célula vegetal, aunque también están presentes en hojas, raíces y en semillas (Cooper­Driver 2001). La mayor fuente de antocianinas son las familias Vitaceae (uvas) y Rosaceae (cerezas, pasas, fresas, manzanas, etc.). Otras familias que contiene antocianinas son Encaceae (arándano agrio), Solanaceae (papa, zarzamoras) y Cruciferae (rábano y col) (Timberiake y Bridle 1982). El contenido de las antocianinas varía tanto en las frutas como en los vegetales dependiendo de la especie (Tabla 1.1), así como de los diferentes estados de maduración y factores ambientales como la luz, temperatura, agua, etc. (Mazza y Miniati 1993). Actualmente los pigmentos comerciales de antocianinas se extraen de fuentes vegetales como uvas, fresas y frambuesas (Jackman y Smith 1996), e inclusive de vegetales como la col morada, el rábano y la zanahoria morada entre otros (Dougall y otros 1998).

Tabla 1.1. Contenido de antocianinas totales en algunas frutas y vegetales.

Fuente Manzana

Mora Col morada

Uva Fresa Arándano Rábano rojo Frambuesa negra

Contenido de Antocianina (mg/IOOg)

10 25­495

25 6­600

15­35 60­200

11­60 300­400

Referencia Mazza y Miniati (1998) Mazza y Miniati (1998)

Timberiake (1998) Mazza y Miniati (1998)

Timberiake (1998) Timberiake (1998) Giusti y otros (1998)

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Estructura Química de las Antocianinas

Las antocianinas como parte del grupo de los compuestos fenólicos poseen la característica estructura Ce­Cs­Cs en su esqueleto (Jackman y Smith 1996). Estos compuestos, al igual que los flavonoides y las betalaínas, son pigmentos hidrosolubles con características de glucósidos; están constituidos por una molécula de antocianidina, que es una aglucona, a la que se le une un azúcar por medio de un enlace p­ glucosídico. La estructura química básica de estas agluconas es el ion flavilio que consta de dos grupos aromáticos: un benzopirilio (A) y un anillo fenólico (B); por su posición trivalente del oxígeno, el flavilio normalmente funciona como un catión. Los azúcares que comúnmente se encuentran asociados son glucosa y ramnosa, seguidos de galactosa, xilosa, arabinosa y, ocasionalmente, gentiobiosa, rutinosa, soforosa; todos ellos se unen a la antocianidina principalmente por medio del hidroxilo de la posición 3, y en segundo término, de la 5 o de la 7. Cuando en una misma molécula se encuentran dos azúcares, éstos generalmente se localizan en los hidroxilos 3 y 5, produciendo una estructura que generalmente es más estable que un pigmento que contiene únicamente un monosacárido (Jackman y Smith 1996). Los azúcares unidos a las antocianinas en algunas ocasiones pueden estar acilados con ácidos aromáticos tales como el p­cumárico, ferúlico, sinápico, gálico o p­hidroxibenzoico, y/o con ácidos alifáticos como el malónico, acético, málico, succínico u oxálico. Estos sustituyentes acilo generalmente están unidos al azúcar del carbono 3, esterificados al hidroxilo 6 o con menor frecuencia al hidroxilo 4 del azúcar. Algunas ocasiones se han reportado antocianinas con dos o más grupos acilo. El color de antocianinas poliaciladas generalmente muestra una mayor estabilidad en comparación con los pigmentos monoacilados. Indicando que en éstos pigmentos un mínimo de dos constituyentes acilo son necesarios para una mejor estabilización del color en medio ligeramente ácido u alcalino. Basándose en estas observaciones, el número y tipo de radicales acilo presentes en las antocianinas les confieren estabilidad lo que se traduce en un mayor valor comercial del pigmento. El tipo de sustituyeme, también se ha reportado como un factor estabilizante, las antocianinas aciladas con el ácido p­cumárico son menos estables que cuando son aciladas con el ácido cafeico (Jackman y Smith 1996).

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color se ve fuertemente afectado después de algún tiempo (Badui 1999). El color de estos pigmentos está determinado por el número de grupos hidroxilos, la naturaleza y número de azúcares unidos a la molécula así como de su posición, la naturaleza y número de los grupos alifáticos o aromáticos que están unidos al azúcar y el ambiente fisicoquímico en el cual se encuentra el compuesto (Mazza y Brouillard 1990). En la Tabla 1.2 se muestran las características estructurales y espectrales de las diferentes antocianidinas dependiendo del tipo de sustitución que presentan.

Tabla 1.2. Características estructurales y espectrales de las antocianinas dependiendo de los sustituyentes que contengan.

OH

Aglucona

Pelargonidina Cianídina Delfinidína Peonidina Petunidina Malvidina

Sustituyentes

R1 R2

H H

OH H

OH OH

OMe H

OMe OH

OMe OMe

Espectro visible (nm) 494 (naranja) 506 (naranja­rojo) 508 (azulado­rojo) 506 (naranja­rojo) 508 (azulado­ rojo)

510 (azulado­rojo)

Factores que Afectan la Estabilidad de las Antocianinas

[image:37.614.146.445.257.496.2]
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otros componentes alimenticios (ácido ascórbico, metales, azúcares, copigmentos, etc.) también son importantes (Jackman y Smith 1996).

pH

Los cambios estructurales de las antocianinas como efecto del pH son un factor muy importante para el color y la estabilidad de estos pigmentos. Las soluciones de antocianinas que generan colores de rojo intenso son las que tiene un pH por debajo de 3. Con el incremento de pH estas antocianinas puede que pierdan o que se vuelvan incoloras antes de que adquieran tonalidades púrpuras o azul oscuro a pH mayores de 6 (Jackman y Smith 1996). Debido a una deficiencia electrónica del núcleo flavilio, estos pigmentos funcionan como verdaderos indicadores de pH; es decir, su color depende de las condiciones de acidez o alcalinidad del sistema en que se encuentran.

Temperatura

Como cualquier otra reacción química la estabilidad de las antocianinas y la velocidad de degradación están marcadamente influenciadas por la temperatura. En general las características estructurales (metoxilaciones, glicosilaciones, acilaciones, etc.) que incrementan la estabilidad a cambios de pH, también confieren estabilidad térmica. La estabilidad de las antocianinas es prácticamente independiente del pH en condiciones anaerobicas; la concentración de pigmentos poliméricos (productos de degradación de las antocianinas) incrementan con el aumento de la temperatura y el tiempo de almacenamiento, contribuyendo de esta forma al pardeamiento de jugos y vinos. Varios autores han recomendado el uso de altas temperaturas y tiempos de proceso cortos para alcanzar maximizar la retención del pigmento en alimentos procesados (Jackman y Smith 1996).

Peróxido de Hidrógeno, Oxígeno y Ácido Ascórbico

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concentraciones (9.31 a 27.92) y temperaturas (10 a 30°C) causan la degradación de las antocianinas siguiendo una cinética de primer orden. Sus estudios mostraron que, las antocianinas de cereza resistieron mejor la degradación del peróxido, seguidas por las de granada y fresa.

Además de los factores antes mencionados, se ha demostrado que la presencia de las antocianinas y el ácido ascórbico son mutuamente destructivos en la presencia de oxígeno, lo que causa una pérdida o decremento en el color, en las propiedades funcionales y en la calidad nutrimental de los alimentos (Calvi y Francis 1978; Poei­Langston y Wrolstad 1981). Los mecanismos que se han propuesto para ésta mutua degradación incluyen condensación directa entre las antocianinas y el ácido ascórbico y/o la formación de radicales libres que inducen la oxidación de cada uno de ellos (García­Viguera y otros 1999). La mayor pérdida de color ocurre bajo condiciones más favorables para la oxidación del ácido ascórbico, es decir, altas concentraciones del ácido y oxígeno. Estas reacciones adversas pueden limitar la fortificación con ácido ascórbico en alimentos ricos o adicionados con antocianinas. Varios estudios utilizando sistemas modelos con antocianinas y ácido ascórbico han demostrado destrucción bajo condiciones tanto aeróbicas como anaeróbicas, por lo que la exclusión del oxígeno durante el pasteurizado no sería suficiente para prevenir la degradación de las antocianinas en jugos (Jackman y Smith 1996). Estudios con antocianinas y ácido ascórbico han sido ambiguos desde que Kaack y Austed (1998) reportaron un efecto protector en las antocianinas en presencia de ácido ascórbico, mientras que el ascórbico sólo fue responsable de una perdida en el contenido de antocianinas en jugo de uva concord (Calvi y Francis 1978).

Luz

Las antocianinas en general son inestables cuando son expuestas a luz ultravioleta o visible, o cuando son expuestas a fuentes de radiación. Las antocianinas que tienen un grupo hidroxilo como sustituyente en el carbono 5', son más susceptibles a la degradación fotoquímica en comparación con las que no presentan este tipo sustituyente. La luz causa un incremento en las velocidades a las cuales las antocianinas se degradan por acción térmica, debido a la formación del catión flavilio. La fotoxidación de antocianinas produce los mismos productos que la degradación térmica, donde la posición del carbono 4 sirve como un intermediario, el cual puede sufrir una hidrólisis en el carbono 2 y consecuentemente un rompimiento en el anillo para producir una chalcona (Jackman y Smith 1996).

Metales y Bisulfitos

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azules. Esta capacidad de formar tales complejos está relacionada con el arreglo estructural o­dihidroxi en el anillo B, por lo que los glucósidos de la cianidina, delfinidina y petunidina tienen la capacidad de formar dichos complejos; los glucósidos de la mavildina, petunidina y pelargonidina no pueden porque tienen metoxilaciones (malvidina y petunidina) y un átomo de hidrógeno (pelargonidina) en su lugar (Boulton 2001). Esta formación de complejos o quelatos es resultado de un apilamiento ordenado de los iones metálicos por medio de interacciones hidrofóbicas con el núcleo aromático de las antocianinas (Goto y Kondo 1991). Estudios realizados por Dangles y otros (1994) y Elhabiri y otros (1997) mostraron que soluciones de antocianinas formaron complejos de color azul en presencia de aluminio con un color máximo a un pH de 4.5.

El anhídrido sulfuroso y los sulfitos que se usan en la conservación de los frutos y en la industria de los vinos tienen un efecto decolorante sobre estos pigmentos debido a que se producen formas sulfónicas en las posiciones 2 y 4 que son incoloras. Estas reacciones son reversibles, sin embargo, es necesario acidificar el medio a pH 1 o mediante un tratamiento térmico para revertir la reacción y restaurar el color rojo de las antocianinas; se necesitan muy pequeñas cantidades de estos compuestos para llevar a cabo esta decoloración (Jackman y Smith 1996).

Enzimas

Un cierto número de enzimas que se encuentran en el tejido vegetal, han sido relacionadas con la degradación de las antocianinas y su correspondiente pérdida de color. Estas enzimas han sido llamadas en términos generales como antocianinasas; pero debido a sus actividades se han dividido en dos grupos. Las glucosidasas, las cuales hidrolizan el enlace glucosídico de las antocianinas liberando así el azúcar y la aglucona; la inestabilidad de ésta última da como resultado una degradación casi espontánea formando compuestos incoloros como las chalconas. También por tener estructuras fenólicas las antocianinas son atacadas por la polifenoloxidasa. Así mismo, la peroxidasa también degrada rápidamente a las antocianinas (Jackman y Smith 1996). Los mecanismos propuestos para el oscurecimiento enzimático causado por PPO han sido resumidos por Kader y otros (1997). En general, los compuestos polifenólicos y la PPO se ponen en contacto debido a descompatamelización del tejido celular que tiene lugar durante el manejo o procesado de los productos (Kader y otros 1999) resultando en el oscurecimiento enzimático.

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que se presenta por acción de la PPO es también dependiente del tipo de sustitución que tengan las antocianinas en el anillo B así como del tipo de glucosilación que posea la molécula (Jackman y Smith 1996).

FENÓMENO DE COPIGMENTACIÓN

Este fenómeno es debido a una asociación molecular entre las antocianinas y otros compuestos por lo general incoloros en solución, denominados cofactores e inclusive con los mismos pigmentos entre sí. Estas asociaciones causan que los pigmentos exhiban una coloración mucho mayor sin que ésta se deba a incrementos en la concentración del pigmento. La copigmentación ha sido estudiada en diversas plantas y frutas y es un fenómeno ampliamente distribuido en la naturaleza. Los cambios espectrales que se producen debido a dicho fenómeno de copigmentación son un incremento en la intensidad del color o un cambio hipercrómico (incremento en la absorbencia máxima) y un cambio batocrómico (incremento en la longitud de onda de absorbancia máxima del pigmento) (Ansen y otros 1971).

Copigmentación por Autoasociación

La autoasociación (Figura 1.9) ocurre cuando la intensidad de color de las antocianinas se incrementa más de la linealidad con un aumento en la concentración del pigmento (Mazza y Miniati 1993). Ansen y otros (1971) reportaron este fenómeno de autoasociación en soluciones de cianídina­3,5­diglucósido 5 mM, las cuales presentaron cambios en el color del doble de lo esperado a pH de 3.16,4.12 y 5.10. Estos resultados pueden ser comparados al efecto que puede tener soluciones equimolares de cianidina­3,5­ diglucósido 5 mM y quercetina que da como resultado incrementos de color del triple de lo esperado bajo las mismas condiciones de pH. A diferencia de la copigmentación, la autoasociación es caracterizada por un cambio hipercrómico, es decir, un aumento en la absorbancia a la longitud de onda máxima con cambios mínimos en los valores de las longitudes de onda máximos (Hoshino y otros 1980). Los cromóforos de la antocianina pueden interactuar fuertemente con otras moléculas de pigmento; la estabilidad del color rojo del ion flavilio resulta de la reducción en la constante de hidratación con un incremento en la autoasociación, previniendo el ataque nucleofílico de las moléculas de agua. Este fenómeno ocurre cuando hay altas concentraciones de iones flavilios y bases neutras quinoidales, con al menos dos cromóforos de antocianinas apilados de forma vertical en sentido contrario a las manecillas del reloj (Hoshino 1992).

Copigmentación Intramolecular

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tiene que atraer o juntar moléculas separadas cuando se encuentran en solución. Sin embargo, la inclusión de grupos adiós se lleva a cabo en la naturaleza por acción enzimática de las aciltransferasas las cuales, unen los ácidos orgánicos a los glucósidos de las antocianinas por medio de una unión adiada. El aumento en el color por efecto de la copigmentación intramolecular es difícil de llevar a cabo a nivel comercial debido a la necesidad de purificar este tipo de enzimas a gran escala, pero ocurre de forma eficiente en las vacuolas de las células de las ciertas plantas que se pueden seleccionar como fuentes de pigmentos adiados (Ansen y otros 1971; Brouillard 1983). Los residuos de azúcares unidos a las antocianinas pueden encontrarse adiados con ácidos aromáticos como p­cumárico, cafeico, felúrico, gálico o por ácidos p­hidroxibenzoicos, y/o por ácidos alifáticos como malónico, acético, málico, succínico, etc. También se han reportado antocianinas que tienen dos o más grupos acilos, como la cianodelfinidina, rubrocinearina, tematinas y lobelinas, etc. (Jackman y Smith 1996). La copigmentación intramolecular (Figura 1.9) es responsable del mejoramiento en la estabilidad del color de moléculas poliaciladas bajo condiciones ligeramente acidas o en soluciones neutras, por lo que tienen un gran interés para industria de colorantes naturales con aplicaciones en alimentos. La configuración planar de los residuos aromáticos de los grupos acilos se apilan con las cargas positivas del núcleo flavilio, previniendo la adición de nucleófilos, especialmente del agua, en la posición C­2 y C­4 de las antocianinas disminuyendo así la formación de pseudobases (Goto y Kondo 1991). Este fenómeno no previene en su totalidad la formación da las pseudobases, pero si permite la existencia de compuestos coloreados por más tiempo en un rango mayor de pH. La interacción intramolecular es mejor en las antocianinas que tienen una configuración de cadena linear grande que les permita una mayor flexibilidad para el doblamiento del anillo planar de los ácidos aromáticos sobre el anillo planar del flavilio, permitiendo de esta forma la existencia de un complejo intramolecular por la formación de interacciones hidrofóbicas de enlaces TI­TT entre las dos partes de la molécula (Figueiredo y otrosí 996). Entre los factores que están involucrados en este proceso de apilamiento están, la posición en la cual está unido el grupo acilo en el azúcar, la longitud y estructura del grupo acilo, la estructura del azúcar, etc. Generalmente las antocianinas monoaciladas no presentan ésta alta estabilidad en su base quinoidal neutra o ionizada porque sólo un lado del anillo pirilio puede ser protonado con el ataque nucleofílico del agua (Brouillard 1983).

Copipmentación Intermolecular

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diglucósido. La copigmentación fue estudiada en años posteriores por Robinson y Robinson (1931), quienes clasificaron casi 30 diferentes cofactores por su capacidad de dar un cambio de coloración azul a soluciones en medio ácido que contenían malvidina­3­glucósido. Las moléculas que actúan como copigmentos incluyen una gran variedad de compuestos como los flavonoides, polifenoles, alcaloides, aminoácidos y en algunos casos las propias antocianinas. Sin embargo de estas sustancias, sólo unas pocas han sido investigadas a detalle. Los flavonoides y polifenoles incoloros son frecuentemente encontrados en asociación con las antocianinas en las vacuolas de las plantas superiores (McCIure 1979). Autores como Goto y otros (1979) propusieron que la copig mentación en un medio acuoso es causada por un apilamiento hidrofóbico entre el núcleo aromático de las antocianinas y el copigmento, que posteriormente puede ser estabilizada por medio de azúcares. Este mecanismo proporciona una buena protección para las antocianinas contra el ataque nucleofílico del agua lo que provoca posteriormente su respectiva pérdida de color (Brouillard 1982).

Intermolecular Intramolecular Autoasociación

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Antodaninas Copigmentos Grupos adío Azúcares

Figura 1.9. Representación esquemática de la copigmentación.

Factores que afectan la copigmentación intermolecular

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por la relación molar pigmento/copigmento. Esta razón difiere para las diversas especies de antocianinas y tipos de copigmentos presentes en la solución (Davies y Mazza 1993). Así mismo el aumento en la concentración sólo del copigmento en las diferentes soluciones de antocianinas resultó en un aumento en la absorbencia y también en un cambio batocrómico (Mazza y Brouillard 1990). En soluciones acuosas la mayoría de las antocianinas se comportan como indicadores de pH como se mencionó en secciones anteriores. Los estudios realizados por Mazza y Brouillard (1990) mostraron que cuando un copigmento se adiciona a una solución de antocianinas, las propiedades espectrales de la solución son modificadas. En su estudio encontraron que la adición de ácido clorogénico a una solución de cianidina en un rango de pH de 2.7 a 5.7 causa un incremento en la absorbencia máxima del pigmento. El valor de pH que presentó el mayor incremento de color fue de 3.6, y es consistente con reportes anteriores para otros sistemas de copigmentación. También observaron que al aumentar la temperatura de diferentes soluciones de malvidina y cianidina copigmentadas con ácido clorogénico, el grado de copigmentación disminuye, lo que afecta tanto a la intensidad de color como a la longitud de onda máxima. Es importante mencionar que cuando diferentes soluciones copigmentadas en el rango de 30 a 80°C se enfriaron a 20°C, la absorbancia y la longitud de onda máxima regresaron a sus valores originales, resultados que indican la estabilidad térmica de la antodanina y del ácido clorogénico. El tipo de solvente utilizado también afecta el grado de copigmentación, se ha observado que los solventes orgánicos como metano! o etanol, alteran las asociaciones físicas que se dan durante el fenómeno de copigmentación. Somers y Evans (1979) demostraron que existe una pérdida significativa de color cuando se añaden solventes no polares al vino, aunque la concentración de antocianas se mantuviera constante. Esto puede ser explicado por un debilitamiento de las interacciones hidrofóbicas en el apilamiento que se da entre el pigmento y el copigmento debido al solvente utilizado.

COMPOSICIÓN QUÍMICA DE PLANTAS CON POTENCIAL ESTABILIZADOR DE LAS ANTOCIANINAS

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algunos datos relevantes sobre la composición química del grupo de plantas seleccionadas para este proyecto.

Uva (Vitis spp.)

De todos los principios activos descubiertos en la vid, indudablemente los compuestos polifenólicos han despertado el mayor interés desde el punto de vista de la investigación farmacológica en relación con sus propiedades protectoras del sistema cardiovascular (Castleman 1998). Por otra parte teniendo en cuenta la gran variedad de subespecies de uvas, los compuestos activos pueden variar sobre todo en la fórmula cuantitativa más que en la cualitativa. Los compuestos responsables del color de las uvas se encuentran básicamente es los hollejos de las mismas, siendo las antocianinas y taninos los más importantes. Los flavonoides también se han aislado e identificado de los frutos y hojas e incluyen primordialmente catequina, epicatequina, quercetina y sus glucósidos quercetina e isoquercetina (éstos últimos son responsables de la coloración amarillenta de las uvas blancas cuando son vistas a contraluz), kanferol, rutina y luteolina. Los taninos condensados, proantocianidinas, antocianidinas o leucoantocianidinas, son todos términos que encuadran a los derivados de los oligómeros o polímeros de la catequina y epicatequina. Abundan en las semillas y hollejos principalmente, aunque también pueden encontrarse en las hojas y raíces. Las antocianidinas brindan el color rosado y rojo­oscuro de las uvas, destacándose la malvidina­3­glucósido (Castleman 1998).

Composición Fenólica de las Especias

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apreciado en gastronomía (Castleman 1998). Al igual que otras especias mencionadas, la mayor proporción de los principios activos del tomillo se encuentran en el aceite esencial. Los flavonoides presentes son derivados de la apigenina y luteolina; ácidos fenólicos como el cafeico y rosmarínico (Zheng y Wang 2001). La acción farmacológica reportada, incluye propiedades tonificantes, expectorantes, antisépticas y antifúngicas. En estudios clínicos se ha reportado que también posee propiedades como inhibidor de la agregación plaquetaria inducida por el colágeno, ácido araquidónico y trombina (Okazaki y otros 2002).

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CAPÍTULO II

CARACTERIZACIÓN DE LA COPIGMENTACIÓN INTERMOLECULAR DE LAS ANTOCIANINAS DEL

JUGO DE UVA

(Vms ROTUNDIFOLIÁ)

CON EXTRACTOS FENÓLICOS DE ROMERO

(ROSMARINUS

OFFICINALIS L) Y TOMILLO (THYMUS VULGARIS L)

INTRODUCCIÓN

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en la naturaleza principalmente en las vacuolas de las plantas superiores, frutas y vegetales (McCIure 1979), y durante la maduración de vinos. En general consiste en la asociación entre las moléculas de antocianinas y otros compuestos fenólicos como los flavonoides, lo que provoca un incremento en la longitud de onda máxima de las antocianinas así como en la intensidad de color.

Las uvas muscadinas son la variedad de uva predominante en el sur de los Estados Unidos teniendo un amplio mercado en la industria de jugos, vinos, etc. Así mismo, la composición fitoquímica de las uvas muscadinas es comparable a las de la V. vintfera y V. labrusca, todas ellas contienen concentraciones considerables de compuestos fenólicos neutros y ácidos que actúan como antioxidantes. Sin embargo, las uvas muscadinas poseen además antocianinas 3,5­diglucósidos en una forma no adiada, que las hace únicas entre otras especies de uvas (Lamikanra 1998; Talcott y Lee 2002). Las fuentes de copigmentos seleccionadas para el presente estudio incluyen el romero (Rosmarinas officinalis L.) y tomillo (Thymus vulgarís L.) por ser especias que tienen un alto contenido de compuestos fenólicos principalmente de ácidos fenólicos y flavonoides como ácido rosmarínico, ácido cafeico, luteolina, kanferol, quercetina, etc. (Nobuyuki y otros 1994; Lenoble y otros 1999; Zheng y Wang 2001). Los copigmentos que son más efectivos son los incoloros y/o los que tienen una estructura planar 71­71, que al asociarse con las antocianinas aumentan y estabilizan al cromóforo, por ejemplo las flavonas y flavonoles como la luteolina, narigina, apigenina, etc. Un doble enlace en la posición 2 y 3 del anillo C es por lo general necesario en los flavonoides para que puedan ejercer un efecto de copigmentación (Jackman y Smith 1996). Goto y otros (1979) propusieron que la copigmentación en un medio acuoso se debe a un apilamiento entre el núcleo aromático de las antocianinas y el copígmento. Las antocianinas presentan una mejor copigmentación en relación directa con la presencia de glucósidos, metilaciones y grupos acilos en la molécula de antocianina (Mazza y Brouillard 1990; Jackman y Smith 1996). Este mecanismo proporciona una buena protección para las antocianinas contra los factores desestabilizantes antes mencionados, previniendo de esta forma su pérdida de color e incluso su degradación (Brouillard 1982).

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MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIALES

La extracción de compuestos fenólicos del romero (Rosmarinus officinalis L.) se realizó utilizando hojas deshidratadas (Carabobo S.A. de C. V, Puebla, Pue., México). El extracto fenólico de tomillo (Thymus vulgarís L.) se aisló de hojas deshidratadas obtenidas a granel en un supermercado de la zona. Los estándares de ácido gálico, cafeico, quercetina y reactivo de Folin­Ciocalteau se obtuvieron de Sigma­Aldrich Co. (St. Louis, MO., EUA.). Los reactivos y solventes utilizados en los protocolos de purificación y copigmentación se obtuvieron de Fermont­Productos Químicos Monterrey S.A. de C.V. (Monterrey, NL, México), Fisher Scientific Int. (Winnipeg, MB., Canadá) y Merck Co. (Darmstadt, Alemania). Las columnas cromatográficas de purificación con capacidad de 20 mL y 5 g de adsorbente C­18 Sep­Pak® se obtuvieron de Waters Co. (Milford, MA., EUA.).

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE COPIGMENTOS

Figure

TABLA DE CONTENIDO
Figura 1.2. Estructura química general de flavonoides y antocianinas.
Figura 1.3. Estructura general de las chalconas.
Figura 1.5. Estructura general de los flavonoles.
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Referencias

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