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EXPOSIÇÃO CRÔNICA AO MALATION INIBE ATIVIDADE DA ACHE E ALTERA NÍVEIS DE GLICEMIA EM RATOS

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Academic year: 2020

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(1)EXPOSIÇÃO CRÔNICA AO MALATION INIBE ATIVIDADE DA ACHE E ALTERA NÍVEIS DE GLICEMIA EM RATOS. Anne Suély Pinto Savall 1 Eduarda Monteiro Fidélis 2 Allyson Ardais Boneberg 3 Lara Pedroso Fontoura 4 Simone Pinton 5 Daniel Henrique Roos 6. Resumo: A utilização de organofosforados (OFs) ocorre de forma bastante usual para o melhoramento agrícola devido aos seus efeitos no combate de pragas que prejudicam a produção de alimentos.Alguns estudos demonstram que a exposição aguda a estes compostos tem como característica a inibição da acetilcolinesterase (AChE),e aumento nos níveis de glicose no sangue. O Malation é um composto que pertence à classe dos OFs, altamente tóxico e com pouca especificidade, o que significa que afeta uma grande variedade de organismos. A 2-(5-Cloro-2-oxoindole-3-ilideno)-oxima (5-Cl-isatina-3-oxima) é uma oxima pertencente à classe das isatinas, a qual foi recentemente sintetizada e por esta razão não existem dados na literatura sobre seus usos ou aplicações. Desta forma, este estudo propõe analisar os efeitos da 5-Cl-isatina-3-oxima no metabolismo da glicose na atividade da AChE frente à intoxicação pela exposição aguda pelo OFs malation em ratos. os animais foram divididos em quatro grupos (Controle, Oxima, Malation, Malation+oxima), a administração oral da 5-Cloro-isatina-3-oxima via oral (gavage) foi realizada imediatamente após a injeção intraperitoneal do malation (250mg/kg, i.p), depois de doze horas os animais foram eutanasiados, sendo o córtex e hipocampo dissecados e o sangue retirado por punção cardíaca. Os ensaios realizados foram atividade AChE e os níveis de glicose mensurados pelo plasma. Os dados apresentaram que que o malation inibiu a atividade da AChE no córtex pré-frontal quando comparado ao grupo controle e a 5-Cloro-isatina-3-oxima reverteu a inibição na atividade da AChE induzida pela exposição ao malation, este efeito não foi constatado no hipocampo. Assim como, os dados apontam que a glicemia dos animais tratados com malation foram aumentadas comparadas ao grupo controle, os animais tratados com aapenas com a oxima não tiveram seus níveis glicêmicos alterados, contudo, a oxima foi capaz de diminuir os níveis de glicose plasmática aumentados pelo malation. O trabalho demonstrou que que a exposição aguda ao malation induz um aumento significativo nos níveis de glicose plasmática e inibi a atividade da AChE no córtex de ratos, demonstrando sua toxicidade o tratamento com a 5-Cloro-isatina-3-oxima foi capaz de reverter a inibição da atividade da enzima AChE e conseguinte impede o aumento da glicemia induzido pelo malation. Este estudo traz dados que reforçam o efeito benéfico do uso das oximas contra a intoxicação por OFs e serve como base para futuros experimentos no qual pretendemos investigar melhor o mecanismo de ação da 5-Cloro-isatina-3-oxima.. Palavras-chave: Malation; Oxima; Glicemia, Acetilcolinesterase;.

(2) Modalidade de Participação: Pesquisador. EXPOSIÇÃO CRÔNICA AO MALATION INIBE ATIVIDADE DA ACHE E ALTERA NÍVEIS DE GLICEMIA EM RATOS 1 Aluno de pós-graduação. annesavall@gmail.com. Autor principal 2 Aluno de pós-graduação. eduardamonfil.aqua@gmail.com. Co-autor 3 Aluno de graduação. allysonab87@gmail.com. Co-autor 4 Outro. larapedrosof@gmail.com. Co-autor 5 Docente. simonepinton@unipampa.edu.br. Co-orientador 6 Docente. danielroos@unipampa.edu.br. Co-orientador. Anais do 9º SALÃO INTERNACIONAL DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO - SIEPE.

(3) EXPOSIÇÃO CRÔNICA AO MALATION INIBE ATIVIDADE DA AChE E ALTERA NÍVEIS DE GLICEMIA EM RATOS 1. INTRODUÇÃO A utilização de organofosforados (OFs) ocorre de forma bastante usual para o melhoramento agrícola devido aos seus efeitos no combate de pragas que prejudicam a produção de alimentos, com isso quantidades residuais de pesticidas OFs foram detectados no solo, corpos d'água, vegetais, grãos e outros produtos alimentares. (John et al., 2001; Galloway and Handy, 2003) Alguns estudos demonstram que a exposição aguda a estes compostos tem como característica a inibição da acetilcolinesterase (AChE) que resulta em diversos sintomas neurotóxicos e neuropsiquiátricos podendo levar a morte. (Apilux et al., 2015; Zhang et al. 2017; Terry Jr., 2012) Além disso, há relatos que demonstram que a exposição aos OFs aumenta os níveis de glicose no sangue, estes estudos sugerem que o acúmulo de acetilcolina pode ser responsável pelo efeito hiperglicêmico. (Velmurugan et al., 2012; Ramu & Korner, 1975) O Malation [S-1,2 (bis-etoxicarbonil) etil-O, O-fosfododitioato de dimetilo] é um composto que pertence à classe dos OFs, altamente tóxico e com pouca especificidade, o que significa que afeta uma grande variedade de organismos (Rebechi et al., 2014; Colovic et al., 2013). O malation, quando absorvido ou ingerido é metabolizado resultandona formação do malaxon, que é um metabólito substancialmente mais tóxico (Verma et al., 2013). O tratamento clínico padrão para a intoxicação por OFs envolve a administração de atropina (antagonista dos receptores muscarínicos) e de fármacos que auxiliam na reativação da AChE como a oxima obidoxima (Shih et al., 2007; Vos et al., 2002; Colovic et al., 2013; Krishnan et al., 2016). No entanto, tanto os resultados experimentais quanto os achados clínicos demonstraram uma eficácia controversa das oximas contra intoxicações por OFs (Antonijevic et al., 2016). A 2-(5-Cloro-2-oxoindole-3-ilideno)-oxima (5-Cl-isatina-3-oxima) é uma oxima pertencente à classe das isatinas, a qual foi recentemente sintetizada e por esta razão não existem dados na literatura sobre seus usos ou aplicações. Desta forma, este estudo propõe analisar os efeitos da 5-Cl-isatina-3-oxima no metabolismo da glicose na atividade da AChE frente à intoxicação pela exposição aguda pelo OFs malation em ratos. 2. METODOLOGIA 2.1. Reagentes Malathion 500 CE (5,0%) (Biocarb Indústria Química LTDA, Curitiba, PR, Brasil) foi obtido no comércio local na cidade de Uruguaiana/RS. A 5-Cloro-isatina-3oxima foi sintetizada com uma mistura equimolar de 5-cloroisatina e cloridrato de hidroxilamina em etanol em meio ácido, sob refluxo por 5 horas a 135°C e posteriormente purificado (dados não publicados) A síntese da foi realizada por um Grupo de Pesquisa colaborador vinculado a Universidade Federal do Rio Grande..

(4) 2.2. Animais Este protocolo foi realizado utilizando ratos Wistar machos (250-300 g) com cerca de 3 meses de idade. Os animais foram mantidos a 22 °C-25 °C com acesso livre à água e ração, sob um ciclo claro/escuro de 12 horas com luzes acesas às 7:00 da manhã. Os animais foram obtidos da Universidade Federal de Santa Maria, no Brasil, todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento dos animais e reduzir o número de animais utilizados nas experiências. Este protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) sob nº 024/2016 pela Universidade Federal do Pampa. 2.3. Tratamento. A administração oral da 5-Cloro-isatina-3-oxima via oral (gavage) foi realizada imediatamente após a injeção intraperitoneal do malation (250mg/kg, i.p) nos ratos. Os animais foram divididos nos seguintes grupos: - I: Grupo Controle: recebeu óleo-canola via oral e salina 0,9% i.p. -II: Grupo Oxima: recebeu a 5-Cloro-isatina-3-oxima (50mg/kg, via oral) e salina 0,9% i.p. -III: Grupo Malation: recebeu óleo-canola via oral e malation (250mg/kg, i.p). -IV: Grupo Malation e Oxima: recebeu a 5-Cloro-isatina-3-oxima (50mg/kg, via oral) e malation (250mg/kg, i.p). Doze horas após a administração das drogas, os animais foram eutanasiados, o córtex e o hipocampo dissecados e o sangue coletado por punção cardíaca. O ensaio da AChE foi realizado de acordo com o método descrito por Ellman e colaboradores (1961). Os níveis plasmáticos de glicose foram determinados por ensaio colorimétrico usando kit comercial. (Gold Analisa Diagnóstica Ltda). Os resultados foram expressos como média ± S.E.M. A análise estatística dos dados foi realizada através de análise de variância de duas vias (ANOVA), seguida pelo teste de Tukey quando necessário. Os valores de p < 0.05 foram considerados significativos. 3. RESULTADOS e DISCUSSÃO 3.1. Atividade da Acetilcolinesterase (AChE) A Figura 1 apresenta o efeito do malation e/ou 5-Cloro-isatina-3-oxima na atividade da AChE. A análise de variança de duas vias da atividade da AChE no córtex pré-frontal demonstrou um efeito significativo da oxima (fig. 1A). Estas comparações revelaram que o malation inibiu a atividade da AChE no córtex préfrontal quando comparado ao grupo controle e a 5-Cloro-isatina-3-oxima reverteu a inibição na atividade da AChE induzida pela exposição ao malation, este efeito não foi constatado no hipocampo (Fig. 1B). As oximas são uma classe de compostos com habilidade de reativar a AChE, capaz de aumentar sua dissociação com os OFs o (Antonijevic e Stojilikovic, 2007; Masson e Nachon, 2017)..

(5) Figura 1. Efeitos da 5-Cloro-isatina-3-oxima e/ou malation no córtex pré-frontal (A) e hipocampo (B) na atividade da AChE. Os dados foram reportados como significantes ± S.E.M. (N=9-11/grupo). *p<0.05 comparado com o grupo CONTROLE. 3.2. Níveis de Glicose A figura 2 apresenta o efeito do malation e/ou 5-Cloro-isatina-3-oxima nos níveis de glicose no sangue dos animais. Os dados encontrados apontam que a glicemia dos animais tratados com malation foram aumentadas comparadas ao grupo controle, os animais tratados com a apenas com a oxima não tiveram seus níveis glicêmicos alterados, contudo, a oxima foi capaz de diminuir os níveis de glicose plasmática aumentados pelo malation. . O aumento da glicêmia no gripo malation é reportado como sinal de toxicidade causado por OPs, alguns estudos reportaram que o aumento da glicemia esta relacionado com o acúmulo de acetilcolina, a qualaumentaria estes níveis consideravelmente. (Rezg et al., 2006; Coult, et al. 1979) Além disso, estudos utilizando a atropina sugerem que o efeito periférico domonocrotofós (outro OF) pode desempenhar um papel predominante na obtenção de hiperglicemia com inibição central da AChE. (APURVA, et al., 2012). Figura 2. Efeitos da 5-Cloro-isatina-3-oxima e/ou malation no sangue sob os níveis de glicose plasmática. Dados foram reportados como média ± S.E.M. (N=9-11/gupo). *p<0.05 comparado com o grupo CONTROLE..

(6) 4. CONSIDERAÇÕES FINAIS Este trabalho demonstrou que a exposição aguda ao malation induz um aumento significativo nos níveis de glicose plasmática e inibi a atividade da AChE no córtex de ratos, demonstrando sua toxicidade. Alguns estudos apresentam que este aumento na glicemia está envolvido na inibição da AChE, o que foi constatado neste estudo com a diminuição da atividade no córtex pré-frontal dos animais tratados com o malation. Importantemente, o tratamento com a 5-Cloro-isatina-3-oxima foi capaz de reverter a inibição da atividade da enzima AChE e conseguintemente impede o aumento da glicemia induzido pelo malation. Este estudo traz dados que reforçam o efeito benéfico do uso das oximas contra a intoxicação por OFs e serve como base para futuros experimentos no qual pretendemos investigar melhor o mecanismo de ação da 5-Cloro-isatina-3-oxima. 5. REFERÊNCIAS APILUX, A.; ISARANKURA-NA-AYUDHYA, C.; TANTIMONGCOLWAT, T. Paperbased acetylcholinesterase inhibition assay combining a wet system for organophosphate and carbamate pesticide detection. EXCLI Journal. v.14, p.307319, 2015. APURVA, K., Joshi, R.; RAJINI, P.S. Organophosphorus Insecticides and Glucose Homeostasis, Insecticides - Pest Engineering. InTech, 2012. ANTONIKEVIC, B.; STOJILJKOVIC, M.P. Unequal Efficacy of Pyridinium Oximes in Acute Organophosphate Poisoning. Clin Med Res. v.5(1), p.71±82, 2007. ý2/29,& 0 % .567,& ' = /$=$5(9,&-PASTI, T.D.; BONDZIC, A.M.; VASIC, V.M. Acetylcholinesterase Inhibitors: Pharmacology and Toxicology. Curr Neuropharmacol. v.11(3), p.315-35, 2013. COULT, D. B.; HOWELLS, D. J., SMITH, A. P. Smith. yclic nucleotide concentrations in the brain of mice treated with the conversant bicyclic organophosphate 4isopropyl-2,6,7-trioxa-1-phosphabicyclo [2,2,2]. Biochem. Pharmac. v.28, p.193-196, 1979. ELLMAN, G.L.; COURTNEY, D.K.; ANDRES, V.; FEATHERSTONE, R.M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem. Pharmacol. v.7, p.88-95, 1961. GALLOWAY, T.; HANDY, R. Immunotoxicity of organophosphorous pesticides. Ecotoxicology v.12, p.345±363, 2003. JOHN, S., KALE, M.; RATHORE, N.; BHATNAGAR, D. Protective effect of Vitamin E in dimethoate and malathion induced oxidative stress in rat erythrocytes. J. Nutr. Biochem. V.12, p.500±504, 2001. KRISHNAN, J.K.; ARUN, P.; APPU, A.P.; VIJAYAKUMAR, N.; FIGUEIREDO, T.H.; BRAGA, M.F.; BASKOTA, S.; OLSEN, C.H.; FARKAS, N.; DAGATA, J.; FREY, W.H.; MOFFETT, J.R.; NAMBOODIRI, A.M. Intranasal delivery of obidoxime to the brain.

(7) prevents mortality and CNS damage Neurotoxicology. v.53, p.64-73, 2016.. from. organophosphate. poisoning.. KRISMAN, C. A method for the colorimetric estimation of glycogen with iodine. Anal Biochem. v. 19, p.7-23. MASSON, P.; NACHON, F. Cholinesterase reactivators and bioscavengers for preand post-exposure treatments of organophosphorus poisoning. J Neurochem. v. 142 (Suppl. 2), p.26-40, 2017 RAMU, A.; KORNER, M. EVIDENCE OF CENTRAL INFLUENCES ON BLOOD GLUCOSE LEVEL: MALATHION HYPERGLYCEMIA. European Journal of Pharmacology. v.32, p.120-123, 1975. REBECHI, D.; RICHARDI, V.S.; VICENTINI, M.; GUILOSKI, I.C.; ASSIS, H.C.S.; NAVARRO-SILVA, M.A. Low malathion concentrations influence metabolism in Chironumus sancticaroli (Diptera, Chironomidae) in acute and toxicity chronic tests. Revista Brasileira de Entomologia. v.58(3), p.296±301, 2014. SHIH, T.M.; Rowland, T.C.; McDONOUGH, J.H. Anticonvulsants for nerve agentinduced seizures: The influence of the therapeutic dose of atropine. J Pharmacol Exp Ther. v.320, p.154- 61, 2007. TERRY Jr., A.V. Functional consequences of repeated organophosphate exposure: Potential non-cholinergic mechanisms. Pharmacology & Therapeutics . v.134, p.355± 365, 2012. VERMA, A.; SHEORAN, M. Titanium dioxide mediated photocatalytic degradation of malathion in aqueous phase. Indian Journal of Chemical Technology. v.20, p.46-51, 2013. VELMURUGAN G.; BABU, D.D.V., RAMASAMY, S. Prolonged intake of monocrotophos induces cardiac oxidative stress and myocardial damage. Toxicology. v.307, p.103-108, 2012. VOS, E.M.; HENS, J.J.; LAU, H.S.; BOON, E.S.; BARTELINK, A.K. Poisoning with organophosphate compounds. Ned Tijdschr Geneeskd. v.146(1), p.34-7, 2002. ZHANG, J.; SONG, W.; SHAN, A. Effects of phoxim-induced hepatotoxicity on SD rats and the protection of vitamin E. Environ Sci Pollut Res. 2017.

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Figura 1. Efeitos da 5-Cloro-isatina-3-oxima e/ou malation no córtex pré-frontal (A) e  hipocampo (B) na atividade da AChE

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