ASPECTOS ECOLÓGICOS DE MICROALGAS CON POTENCIALES BIOTECNOLÓGICOS

UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA FACULTAD DE CIENCIAS

POSTGRADO EN ECOLOGÍA

ASPECTOS ECOLÓGICOS DE MICROALGAS CON POTENCIALES BIOTECNOLÓGICOS

Tesis Doctoral presentada ante la ilustre Universidad Central de Venezuela por el Lic. Rubén Erasmo Torres Parra, para optar al título de Doctor en Ciencias, mención Ecología.

Tutores: Dra. Evelyn Zoppi de Roa y Dr. Diego Rodríguez

Caracas – Venezuela 15 de octubre de 2012

Resumen

Las poblaciones naturales suelen estar bajo presión ambiental constante, y sus tamaños poblacionales están limitados por la disponibilidad de recursos. En el caso de la ecuación logística, el parámetro que define la magnitud de la población en equilibrio es la capacidad de carga (K), mientras que la dinámica de retorno al mismo, luego de una perturbación, depende de la tasa de crecimiento per cápita (r). Las comunidades están caracterizadas por atributos estructurales como diversidad y relaciones interespecíficas. Las cianobacterias son los organismos fotosintéticos más antiguos del planeta; se encuentran a mitad de camino entre las bacterias y las algas eucariotas, pues su organización es procariótica pero su aparato fotosintético es similar al de las algas. Arthrospira y Spirulina son dos géneros de cianobacterias filamentosas que han colonizado diversos ambientes y algunas especies son extremófilas y de distribución muy restringida. Estas especies son propias de ambientes alcalinos (lagos de soda) y han experimentado pocas presiones ambientales, entre ellas competencia y depredación escasas. Poseen un gran valor alimenticio para animales y humanos, como lo demuestran numerosas investigaciones. Del mismo modo, existen microalgas eucariotas que poseen gran potencial para la biotecnología alimentaria y petrolera (bioenergética), esta última con la finalidad de generar combustibles alternativos (biodiesel), con valores ecológicos y económicos para generar energía eléctrica y tracción para vehículos. Esta investigación se enfocó en el estudio de las dinámicas poblacionales de A. platensis (especie en revisión) y muestreos de comunidades fitoplanctónicas con interés en especies autóctonas de gran valor biotecnológico. Se diseñaron experimentos para optimizar medios de cultivos para A. platensis a escala pequeña en sistemas controlados (Cámara de Crecimiento) y escalas mayores en sistemas no controlados (Ficotrón). Se obtuvieron medios de cultivo idóneos para el crecimiento de A. platensis en condiciones controladas (medio 1 = medio Parra (2005)) y naturales (tratamiento 36: medio central), con miras a su aprovechamiento biotecnológico a gran escala. La dinámica de crecimiento poblacional de A. platensis evidencia densodependencia logística, con una estructura de tallas que varía a medida que la población crece desde etapas tempranas hasta la capacidad de carga. Se encontraron representantes de varios géneros y especies de cianobacterias (Arthrospira spp., Spirulina subsalsa, Lyngbya spp., Oscillatoria spp. y Anabaena spp.) y microalgas eucarióticas (Scenedesmus spp., Isochrysis galbana, Chlorella sp., Chaetoceros sp., Nitzschia valens, Dunaliella salina, D. primolecta y D. viridis) de gran interés biotecnológico en diferentes lugares de la geografía variada del país, lo que conduce a la idea de que Venezuela cuenta con un gran potencial en su diversidad para la biotecnología de microalgas.

Las algas son vegetales que crecen en agua, tanto dulce como salada. En el océano constituyen el principal componente del plancton marino. Tuvieron

mucho que ver con el origen de la vida en el ámbito marino; fueron los primeros organismos en realizar la fotosíntesis clorofílica. Van desde los

microscópicos organismos unicelulares (como las espirulinas) hasta las gigantescas kelp (el ser vivo más largo del planeta).

Fuente: Almacén Natural

CONTENIDO

Resumen ... 2

Índice de figuras ... 5

Índice de tablas ... 8

1. Introducción ... 11

1.1 Una breve reseña histórica ... 11

1.2 Evolución y ecología de las microalgas ... 11

1.3 Aspectos biogeográficos ... 14

1.4 Importancia biotecnológica de las microalgas ... 15

2. Antecedentes en Venezuela ... 19

3. Justificación ... 20

4. Hipótesis ... 21

5. Objetivos ... 22

6. Metodología ... 23

6.1 Ecología de poblaciones de especies cultivadas ... 23

6.2 Ecología de comunidades fitoplanctónicas ... 36

7. Resultados ... 54

7.1 Cultivos ... 54

7.2 Ensayos con poblaciones cultivadas de Arthrospira platensis ... 62

7.3 Comunidades fitoplanctónicas ... 83

8. Discusión ... 113

8.1 Cultivos ... 113

8.2 Ensayos con poblaciones de Arthrospira platensis ... 114

8.3 Comunidades fitoplanctónicas ... 120

9. Conclusiones ... 124

10. Bibliografía ... 125

11. Enlaces ... 132

Apéndice 1 ... 134

Apéndice 2 ... 139

Apéndice 3 ... 144

Apéndice 4 ... 148

Índice de figuras

Figura 1. Esquema ilustrado donde se muestra el escalamiento de microalgas de medio líquido a medio sólido con el empleo de la técnica del asa de estaño. ... 26 Figura 2. Esquema donde se muestra el escalamiento de poblaciones de microalgas a fiolas de diferentes volúmenes hasta alcanzar los cultivadores a gran escala. ... 27 Figura 3. Imágenes donde se muestran las diferentes etapas de escalamiento del cultivo en medio líquido en el sistema integrado LOA-Ficotrón: (a) cultivos a escala pequeña en condiciones controladas (Cámara de Crecimiento, LOA - IZET); (b), (c) y (d) cultivos a cielo abierto en el Ficotrón, IDEA, en botellones de 5 L, tanques circulares de 500 L y cultivadores tipo carrusel de 2000 L, respectivamente. ... 28 Figura 4. Esquema para la preparación de cada medio (tratamiento) del diseño factorial fraccionado 2^6-1. ... 30 Figura 5. Esquema de la disposición espacial de los tanques cilíndricos en el Ficotrón para la ejecución del diseño de bloques completos aleatorizados. ... 31 Figura 6. Ubicación de los sitios de muestreo (el mapa se encuentra en www.guiageo- americas.com/mapas/venezuela.htm). ... 36 Figura 7. (a) Mapa de Venezuela donde se destaca a la península de Paria en un recuadro, (b) ubicación del área de estudio y (c) vista panorámica del humedal

“Palmares III” desde una carretera que lo bordea al norte, la vegetación herbácea cubre la totalidad de su superficie y forma bandas monoespecíficas, evidenciadas por las tonalidades distintas del color verde, que cubren toda su superficie sin formar espejos de agua (tomado de Torres y Zoppi de Roa 2010)... 38 Figura 8. Pluviodiagrama con precipitaciones medias de 47 años (1953-2000) del sur de la península de Paria (datos tomados de la Dirección de Meteorología del MARN 2000). ... 39 Figura 9. Vista satelital del área de estudio (humedal herbáceo de El Clavo). La línea blanca dibujada en el centro de la imagen señala el transecto levantado en la salida de campo (fuente: http://earth.google.com/). ... 40 Figura 10. Tomas fotográficas parciales de las dos zonas de vegetación emergente estudiadas: (a) vista de la amplia zona central de Hymenachne amplexicaulis, en primer plano la zona de Heliconia marginata que bordea todo el litoral sur; (b) zona de H. marginata (fotos: Carlos Lugo). ... 41 Figura 11. Ubicación geográfica del área de estudio al sur de Monagas (Orinoco bajo), con detalle de la localización en el mapa y fotografía panorámica de Macapaima, uno de los cuerpos de agua visitados (foto: Rubén Torres). ... 43 Figura 12. Imagen correspondiente a un sector de la orilla de la fosa El Caracol, (Municipio Aragua, Edo. Anzoátegui, 2009), donde se pueden apreciar los desechos petroleros que conforma parte del fondo de la misma (Foto: Olaf Ilzins, IDEA). ... 44 Figura 13. Ubicación de la laguna de Boca Chica (círculo azul) en la península de Macanao, isla de Margarita, estado Nueva Esparta (mapa:

http://www.disfrutevenezuela.com/Municipio-Peninsula-de-Macanao-Mapa.html)... 45 Figura 14. Marcha analítica simplificada para la determinación de nitrógeno en muestras de agua con el método Kjeldahl (1883) (continúa en la página siguiente). .. 49 Figura 15. Marcha analítica simplificada para la determinación del fósforo por el método colorimétrico de Murphy – Riley (1962). Las dos imágenes inferiores fueron tomadas de una presentación digital del curso de Ecología de Humedales, Postgrado en Ecología, IZET, 2009. ... 50

Figura 16. Algunas imágenes tomadas bajo microscopio invertido de las poblaciones de las diferentes cepas de Arthrospira spp. en la Cámara de Crecimiento (LOA-IZET).

... 56 Figura 17. Algunos cultivos de microalgas de interés biotecnológico presentes en la Cámara de Crecimiento (LOA, IZET). ... 59 Figura 18. Curvas de crecimiento poblacional de Arthrospira platensis en (a) fiolas y (b) cilindros. La densidad poblacional está expresada en términos de absorbancia a 680 nm. ... 63 Figura 19. Producción de biomasa seca en fiolas y cilindros de 2 L para cada medio mineral. La biomasa está expresada en gramos por dos litros. Intervalos de confianza:

media desviación estándar. ... 64 Figura 20. Valores comparativos de pH mostrados por los diferentes medios de cultivo en fiolas. En la figura se señala con un óvalo rojo el lapso de disminución de pH del medio – – y la contaminación del mismo por la cianobacteria Microcystis aeruginosa.64 Figura 21. Valores comparativos de conductividad (S/cm) mostrados por los diferentes medios de cultivo en fiolas. ... 65 Figura 22. Curva de calibración A₆₈₀ vs. Peso seco (mg). Las variables tienen una relación lineal (R² = 0,9935). ... 65 Figura 23. Crecimiento poblacional de Arthrospira platensis en cuatro medios de cultivo. En la fase de crecimiento rápido A680 y el tiempo presentaron correlaciones lineales fuertes, como se evidencia en los valores del coeficiente de determinación (R²). ... 67 Figura 24. Crecimiento poblacional de Arthrospira platensis en cuatro medios de cultivo (filamentos por litro) en la Cámara de Crecimiento. IC: media desviación estándar. ... 67 Figura 25. Curvas de crecimiento poblacional de Arthrospira platensis obtenidas en un ensayo factorial fraccionado 2^6-1 con combinaciones aleatorias de niveles mínimos y centrales de cinco macronutrientes (tratamientos). La densidad poblacional fue medida indirectamente con la absorbancia a una longitud de onda de 680 nm, correspondiente al rojo dentro del espectro visible, pico de absorción de la clorofila a. ... 69 Figura 26. Diagrama de columnas mostrando en orden creciente los tiempos de duplicación (t_g) de los diferentes tratamientos del ensayo multifactorial. ... 76 Figura 27. Biomasa seca (g/L) cosechada en los diferentes tratamientos del ensayo factorial 2^6-1.Los valores se ordenan en forma creciente. ... 78 Figura 28. Diagramas circulares que muestran las variaciones porcentuales en grupos de filamentos de diferentes tallas en una población de Arthrospira platensis, a lo largo de un periodo de incubación que duró 30 días. La cepa se cultivó en el medio optimizado en el ensayo factorial fraccionado 2^6-1 (tratamiento 36). ... 79 Figura 29. Dinámicas de crecimiento poblacional de los tres componentes de tallas de filamentos de Arthrospira platensis: (a) filamentos con 2 células, (b) filamentos con cuatro células y (c) filamentos con más de cuatro células. La letra “Y” en la ordenada es la densidad (filamentos/L) y en la abscisa el tiempo está dividido en intervalos de tres días. Salida: PAST. ... 80 Figura 30. Dinámicas de crecimiento poblacional de Arthrospira platensis a partir de tres extracciones de volúmenes en fase de saturación. De izquierda a derecha se muestran las curvas de crecimiento a partir de 25%, 50% y 75% de extracción. IC:

media desviación estándar. ... 81

Figura 31. Absorbancias medias (λ = 680 nm) de los cultivos en fase de crecimiento rápido, para tres profundidades, izquierda a derecha: 15 cm (barras azules), 25 cm (barras rojas) y 35 cm (barras amarillas). IC: media desviación estándar. ... 82 Figura 32. Biomasa seca total (g/L) en los tres bloques. ... 82 Figura 33. Biplot de los dos primeros componentes principales del ACP para las variables (especies) y casos (parches de vegetación) escogidas para caracterizar el ecosistema del humedal Palmares III en noviembre de 2008. Los dos primeros componentes principales acumularon 89,965% de la inercia total del sistema. Salida:

MVSP 3.0. ... 88 Figura 34. Dendrograma del Análisis de Agrupamiento o “Cluster Analysis” derivado del conjunto de especies fitoplanctónicas y zooplanctónicas más importantes colectadas en el ACP. Salida: MVSP 3.0. ... 89 Figura 35. Algunas especies de microalgas representantes del fitoplancton del humedal de El Clavo, Barlovento, Edo. Miranda: (a) Lyngbya lutea (Cyanobacteria), 400x; (b) Pinnularia sp. (Bacillariophyta), 400x; (c) Asterococcus limneticus (Chlorophyta), (d) Micrasterias sol (Chlorophyta), 250x; (e) Closterium ehrenbergii (Chlorophyta); 250x; (f) Spirogyra ternata (Chlorophyta), 250x. Fotos: Rubén Torres, cámara digital PAX-CAM acoplada a microscopio invertido y a computador (programa PAX-IT!). ... 95 Figura 36. Variaciones temporales de (a) conductividad eléctrica y (b) oxígeno disuelto a medida que la lámina de agua disminuyó en el parche de Heliconia marginata (enero – febrero 2009). ... 96 Figura 37. Concentraciones de nitrógeno (N) en las muestras de agua colectadas en la zona de Heliconia marginata en la primera salida de campo al humedal de El Clavo (05/01/2009). ... 97 Figura 38. Curva de calibración para la obtención de fósforo total en agua de las muestras tomadas en la zona de Heliconia marginata en la primera salida de campo al humedal de El Clavo (05/01/2009). ... 98 Figura 39. Biplot de los dos primeros componentes principales del ACP para los ambientes lagunares del Orinoco bajo, sur de Monagas. Los dos primeros componentes principales retuvieron 95,4% de la inercia total del sistema multidimensional original. Salida: MVSP 3.0. ... 104 Figura 40. Imágenes que muestran la composición de especies fitoplanctónicas de una charca fangosa, específicamente proveniente del borde exterior de un área de pozos petroleros en el norte del Edo. Bolívar, 2009. ... 106 Figura 41. Composiciones porcentuales de las divisiones de organismos procariotas y eucariotas integrantes de la comunidad del fitoplancton en las regiones estudiadas en el país a lo largo del estudio. ... 112

Índice de tablas

Tabla 1. Especies de microalgas con potencialidades para generación de biocombustibles. Contenido de aceites en base seca (tomada de Albarracín 2007). .. 17 Tabla 2. Composición química del medio Spirulina (Schlösser 1994). ... 23 Tabla 3. Diseño factorial 2² para ensayos de laboratorio. El experimento se simplificó a cuatro medios de cultivo sin replicación. ... 28 Tabla 4. Resumen del diseño factorial fraccionado 2^6-1 (salida del programa Design Expert)*. ... 29 Tabla 5. Medios de cultivos preparados en laboratorio para crecimiento de poblaciones de microalgas y modalidades de preparación y recipientes. ... 54 Tabla 6. Concentraciones milimolares (mM) de los macronutrientes totales (representados como elementos, a excepción del carbono que se representa en las formas de los aniones carbonato y bicarbonato) y relaciones milimolares sodio/potasio en los cuatro medios minerales comparados en el diseño factorial 2². En rojo se destacan las concentraciones milimolares de Na⁺ y K⁺, y en azul las de Cl^-, anión directamente involucrado con el Na⁺. ... 62 Tabla 7. Concentraciones milimolares totales de los macronutrientes que integran cada uno de los medios de cultivo preparados. En rojo se destaca la relación 4:1 de K y Na en el medio 1. ... 66 Tabla 8. Tasa de crecimiento per cápita de Arthrospira platensis en la fase de crecimiento rápido, biomasa seca producida en cada medio de cultivo y pH inicial y final. ... 68 Tabla 9. Tasas de crecimiento per cápita y capacidades de carga en cultivos de Arthrospira platensis para el ensayo factorial fraccionado 2^6-1. En rojo se destacan los medios con valores mayores para uno o ambos parámetros poblacionales obtenidos de forma experimental. ... 74 Tabla 10. Análisis de varianza para el diseño factorial fraccionado 2^6-1 (salida del programa Design Expert). Los números destacados en rojo son valores de p<0,05. .. 77 Tabla 11. Resumen del Análisis de Varianza (salida de MICROSOFT EXCEL). ... 83 Tabla 12. Composición de especies y abundancia (células/litro) de los taxa fitoplanctónicos presentes en las zonas de vegetación en noviembre de 2008. Bm (Brachiaria mutica), EcBmSe (ecotono B. mutica - Sesbania exasperata), Se (S.

exasperata), EcSeCa (ecotono S. exasperata - Cyperus articulatus), Ca (C.

articulatus), EcCaTd (ecotono C. articulatus-Typha dominguensis), Td (T.

dominguensis) y EcTdSe (ecotono T. dominguensis - S. exasperata)... 84 Tabla 13. Algunos índices de diversidad empleados para caracterizar la comunidad fitoplanctónica de Palmares III en sus diferentes parches de vegetación monoespecífica y ecotonos (noviembre 2008). Salida: PAST. ... 86 Tabla 14. Distancias Jaccard entre los parches de vegetación acuática del humedal Palmares III, noviembre de 2008, definidas a partir a las abundancias de las especies fitoplanctónicas. Los valores están acotados entre 0 y 1, los destacados en rojo indican similitudes altas y en azul se señala a la pareja de vegetaciones con menor similitud.

Salida: PAST. ... 87 Tabla 15. Variables fisicoquímicas y concentraciones de cationes y aniones del agua, determinados en las zonas de vegetaciones monoespecíficas estudiadas en el humedal de Palmares en noviembre de 2008. ... 89

Tabla 16. Composición de especies y abundancias (células/litro) de los taxa fitoplanctónicos presentes en las zonas de vegetación para agosto de 2009. EcBm1Ca y EcCaBm2 (ecotonos B. mutica - C. articulatus); EcBm2Td (ecotono B. mutica - T.

dominguensis). ... 90 Tabla 17. Algunos índices de diversidad empleados para caracterizar la comunidad fitoplanctónica de Palmares III en sus diferentes parches de vegetación monoespecífica y ecotonos (agosto 2009). Salida: PAST. ... 91 Tabla 18. Distancias Jaccard entre los parches de vegetación acuática del humedal Palmares III, agosto de 2009, definidas a partir a las abundancias de las especies fitoplanctónicas. Los valores están acotados entre 0 y 1, los destacados en rojo indican similitudes altas y en azul se señala a la pareja de vegetaciones con menor similitud.

Salida: PAST. ... 91 Tabla 19. Variables ambientales medidas en agosto de 2009... 92 Tabla 20. Grupos (Taxa) fitoplanctónicos identificados en los diferentes ambientes de vegetación en El Clavo, Barlovento, Edo. Miranda (enero de 2009). ... 92 Tabla 21. Algunos índices de diversidad empleados para caracterizar la comunidad fitoplanctónica del humedal de El Clavo (enero 2009). Salida: PAST... 94 Tabla 22. Índice de similitud de Jaccard para las tres zonas estudiadas en el Clavo, Edo. Miranda (enero de 2009). El análisis se hizo en PAST. ... 94 Tabla 23. Valores medios  desviaciones estándares de las variables fisicoquímicas tomadas en la zona de Heliconia marginata del humedal herbáceo de El Clavo, Edo.

Miranda en enero - febrero de 2009. ... 96 Tabla 24. Lista de especies y abundancia (cel./L) del fitoplancton en aguas libres de las lagunas estudiadas en el bajo Orinoco, sur de Monagas. ... 99 Tabla 25. Algunos índices de diversidad empleados para caracterizar la comunidad fitoplanctónica de lagunas de inundación del bajo Orinoco (sur de Edo. Monagas), para enero de 2010. Salida: PAST. ... 102 Tabla 26. Índice de similitud de Jaccard para las lagunas estudiadas en el bajo Orinoco, sur del Edo. Monagas (enero de 2010). En rojo se resaltan los valores más altos. Salida: PAST. ... 103 Tabla 27. Composición y abundancia (células por litro) de la comunidad fitoplanctónica de tres ambientes de los módulos inundables de Mantecal (noviembre 2010). ... 104 Tabla 28. Algunos índices de diversidad empleados para caracterizar la comunidad fitoplanctónica entres ambientes de los módulos inundables de Mantecal (Edo. Apure), en noviembre de 2010. Salida: PAST. ... 105 Tabla 29. Índice de similitud de Jaccard para comparación de los tres ambientes estudiados en Mantecal (Edo. Apure). Salida: PAST. ... 106

Secado al sol de biomasa de Arthrospira platensis, India

1. Introducción

1.1 Una breve reseña histórica

Las referencias más antiguas del consumo de microalgas por el hombre datan del Antiguo Testamento, puesto que el maná que permitió la supervivencia del pueblo de Israel es un liquen del desierto (simbiosis de hongo y alga) (García-Blairsy 2008).

Spolaore y col. (2006) mencionan que el primer uso de las microalgas por los seres humanos se remonta a 2000 años atrás en China; para entonces, los chinos utilizaban Nostoc sp. para sobrevivir durante la hambruna. No obstante, no se conoce con precisión cuándo el humano empezó a emplear las microalgas (Sánchez y col. 2003).

El uso corriente de estos recursos tiene tres precedentes: tradición, desarrollo científico y tecnológico, y la denominada “tendencia verde” (Henrikson 1994). En la América de la conquista europea, Bernal Díaz del Castillo, miembro de las tropas de Hernán Cortés, reportó en 1521 que una pasta azulada (la hoy conocida Arthrospira maxima) era cosechada del lago Texcoco, secada y vendida para consumo humano en un mercado de Tenochtitlán (hoy Ciudad de México). Los aztecas dieron a este alimento el nombre de tecuitlalt, el cual en su lengua literalmente significa

“excrementos de las piedras” e indiscutiblemente formó parte de su cultura alimentaria, social, económica y política (Ciferri 1983, Sánchez y col. 2003).

Se sabe entonces que el empleo alimentario de microalgas por la humanidad no es reciente. Hoy día, algunas culturas de la zona del lago Chad en África subsahariana, como la etnia kanembu, conservan las mismas prácticas de cosecha artesanal de A.

platensis (identificación en revisión) legadas desde tiempo inmemorial. Esta cianobacteria filamentosa constituye la base de la dieta diaria de esa tribu, la que extraen del lago y secan al sol para preparar una galleta denominada dihé; este hábito alimentario peculiar le ha brindado a los kanembu mejor estado de salud que tribus vecinas que no consumen el dihé (Ciferri 1983). Cuando los científicos descubrieron la rapidez con la que las poblaciones de estos microorganismos crecen, con un rendimiento 20 veces mayor que la soja o soya (Glycine max) por unidad de superficie, los describieron como el alimento del futuro (Henrikson 1994).

1.2 Evolución y ecología de las microalgas

Dentro del vasto grupo de seres vivos considerados bajo la denominación de microalgas, éstas incluyen en su definición más amplia a las cianobacterias (anteriormente cianofitas o cianofíceas y conocidas comúnmente como algas verde-

azules). Estos seres constituyen el grupo de organismos fotosintéticos más antiguos del planeta y se puede decir que se encuentran a mitad de camino entre las bacterias y las algas, porque su organización es procariótica pero su aparato fotosintético es similar al de las algas (Prosperi 2000).

La Tierra tiene una edad aproximada de 4.600.000.000 de años y se ha podido comprobar que 1.000.000.000 de años después de su formación ya había actividad orgánica en la corteza terrestre. Los sedimentos no metamorfoseados más antiguos de hace 3.500.000.000 de años muestran las primeras bacterias y los estromatolitos, las más antiguas comunidades coloniales de las que se tenga conocimiento, constituidas principalmente por algas verdes-azules filamentosas semejantes a las Oscillatoriales (Orden al que pertenecen los géneros Oscillatoria, Lyngbya, Spirulina y Arthrospira, entre otros), colonias que se asentaron en las costas de los mares primitivos. Hoy sólo quedan estromatolitos vivos en la costa sur de Australia, las Bahamas y algunas otras costas e islas remotas y prístinas (Woese 1987).

Hace unos 2.000.000.000 de años las cianobacterias produjeron suficiente oxígeno para modificar sustancialmente la atmósfera terrestre. Muchos anaerobios obligados (aquellos que no viven en presencia de oxígeno) fueron dañados por el oxígeno y algunos desarrollaron modos de neutralizarlo, o se restringieron a vivir en áreas donde este gas no penetra. Por selección natural algunos organismos aerobios se adaptaron a vivir desarrollando una vía respiratoria que utilizaba el oxígeno para extraer más energía de los alimentos y transformarla en ATP, prosperaron y radiaron en múltiples formas de vida. La respiración aerobia se incorpora así al proceso anaerobio ya existente de la glucólisis (Woese 1987, Mercado 1999).

Las cianobacterias y las microalgas eucarióticas al ser productoras que utilizan la luz solar como fuente de energía contienen clorofila y otros pigmentos accesorios que les otorgan una gran eficiencia fotosintética. Por el proceso de fotosíntesis que regula el contenido de oxígeno y dióxido de carbono en la atmósfera, las microalgas contribuyen notablemente a aliviar el efecto invernadero y se constituyen en protagonistas de la producción inicial de materia viva en ecosistemas acuáticos (Mercado 1999).

La ecología de microalgas está determinada por un sinnúmero de factores ambientales bióticos y abióticos que regulan sus poblaciones y determinan la amplitud de su dispersión y la capacidad de invadir nuevos hábitats. Posiblemente el factor más importante en la determinación de la abundancia del fitoplancton, comunidad acuática errante constituida por microalgas, sea la disponibilidad de nutrientes. Las poblaciones

fitoplanctónicas aumentan sus números aceleradamente en la época de crecimiento (surgencias, afloramientos, estación de mezcla en la zona limnética de los lagos, etc.), por lo que ciertos nutrientes pueden hacerse limitados (Paulson 2005).

Otro factor primario a tomar en cuenta, principalmente en lo que respecta a la distribución espacial del fitoplancton, es la luz, fenómeno físico que restringe a las poblaciones de microalgas a parches en la zona iluminada (eufótica) de los cuerpos de agua, único lugar donde pueden hacer la fotosíntesis. Si bien, las diferentes especies de microalgas pueden entablar competencias intra e interespecíficas fuertes por la luz, las comunidades fitoplanctónicas mantienen una riqueza elevada con tamaños poblacionales moderados, fenómeno que ha sido denominado por Hutchinson (1961) la paradoja del plancton.

De lo anterior se desprende la idea de que las poblaciones naturales suelen estar siempre bajo presión ambiental constante, y sus tamaños poblacionales están limitados por la disponibilidad de recursos. Aun cuando matemáticamente el crecimiento poblacional es exponencial a densidades bajas, progresivamente se hace densodependiente a medida que el tiempo avanza y la densidad crece. El modelo logístico, el modelo densodependiente más conocido, explica el crecimiento de las poblaciones durante lapsos más prolongados. Gráficamente se observa un periodo inicial de latencia y adecuación (crecimiento lento), seguido de un incremento exponencial (crecimiento rápido) para luego culminar en un plateau donde se alcanza la capacidad de carga del ambiente, K (May 1976).

Las microalgas pueden ser organismos con un gran impacto negativo en la ecología de los ambientes húmedos del planeta. Muchas especies de cianobacterias son problemáticas en lagos y embalses usados para abastecimiento de agua para consumo humano, donde crecen muy bien y frecuentemente producen florecimientos o

“blooms”, fenómenos en los que muchas especies se pueden acumular en las espumas superficiales con densidades poblacionales sumamente altas. Estos afloramientos son inducidos por enriquecimientos con macronutrientes como el fósforo y el nitrógeno, principalmente derivados de actividades antrópicas (aguas ricas en fertilizantes provenientes de zonas agropecuarias, vertidos industriales, aguas domésticas, etc.); están acompañados de la producción de malos olores y sabores en el agua, así como de neuro y hepatotoxinas mortales para animales domésticos y seres humanos que la consumen (Carmichael 1994). En el mar ocurren las denominadas mareas rojas, compuestas principalmente por dinoflagelados altamente tóxicos, que producen una mortandad masiva de peces; también se dan las mareas

blancas o “blooms” en época de surgencia, congregaciones constituidas por diatomeas que originan el efecto opuesto a las mareas rojas, pues desencadenan una gran producción secundaria del zooplancton y de los siguientes peldaños de la cadena alimentaria marina. Estas zonas de surgencia son de gran importancia en la economía pesquera de muchas naciones del mundo.

1.3 Aspectos biogeográficos

En el contexto evolutivo y ecológico, Spirulina y Arthrospira son dos de los géneros de cianobacterias más interesantes de este grupo antiguo, debido a la historia natural y evolución singulares de algunas de sus especies en ambientes extremos y sumamente restringidos, muchos de ellos agrestes e inhóspitos para casi cualquier otra forma de vida, donde han tenido muy poca competencia y depredación. No obstante el carácter extremófilo de ciertas especies de Spirulina y Arthrospira, estos géneros son ubicuos, pues se encuentran representantes en ambientes marinos costeros, estuarinos, humedales dulceacuícolas, lagos, etc., lo que también sugiere una idea del éxito colonizador de estas cianobacterias filamentosas (Ciferri 1983).

Las microalgas extremófilas, como Arthrospira platensis, han evolucionado en sitios que eran vastos en el precámbrico, y de los que ahora sólo quedan unos pocos sitios aislados como relictos de esos mares antiguos por procesos continuos de evaporación y desertificación. Estos procesos hoy día aún prosiguen y se intensifican con el proceso de calentamiento global, como es el caso del lago Chad (África Subsahariana), cuya superficie ha retrocedido en forma notable en el curso de menos de un siglo. Dicho lago constituye uno de los últimos hábitats naturales de microorganismos antiguos como A. platensis (Ciferri 1983).

De acuerdo al concepto de especie morfológica, la mayoría de las especies de algas de agua dulce son cosmopolitas. Esto implica que las especies poseen mecanismos muy eficientes para la dispersión o sus caracteres morfológicos han permanecido

“estáticos” en un tiempo evolutivo amplio. No obstante, hoy día muchos ficólogos prestan atención a variaciones intraespecíficas en aspectos fisiológicos y bioquímicos.

Por otro lado, observaciones cuidadosas de poblaciones naturales pueden revelar aislamiento reproductivo dentro de una morfoespecie o entre taxa intraespecíficos (Ichimura 1996).

Se puede demostrar que los patrones de distribución de organismos sobre la superficie del planeta no son aleatorios. Esta no aleatoriedad requiere explicaciones en términos de procesos y reconstrucciones de eventos geológicos y biológicos en la

historia de la vida en la Tierra. Los procesos implican la formación de patrones biogeográficos a partir de procesos abióticos muy lentos y a gran escala que incluyen los movimientos tectónicos de placas, cambios en los niveles de los mares y océanos y cambios climáticos, entre otros aspectos geológicos. Estos procesos han operado casi en concierto, pues el clima puede ser afectado por los movimientos de los continentes y los cambios en la circulación oceánica; los movimientos tectónicos pueden alterar las corrientes oceánicas; el clima ha podido influir en la eustasia¹ de la periodicidad interglaciar. A un nivel más local, las erupciones volcánicas, desertificaciones, cataclismos terrestres, huracanes, etc. también han contribuido a la creación de patrones de distribución en diferentes hábitats (Myers y Giller 1991).

La determinación de patrones de distribución parte de un análisis biogeográfico. Tales patrones son dóciles a análisis sin supuestos específicos de procesos subyacentes o pueden ser usados para probar hipótesis sobre procesos. La biogeografía histórica y ecológica indirectamente ha usado patrones observados de distribución de organismos para probar hipótesis, con miras a explicar procesos tales como la vicariancia (separación de grupos por barreras geográficas), dispersión, interacciones de especies y eventos de perturbación (Myers y Giller 1991).

1.4 Importancia biotecnológica de las microalgas

Pocas personas, fuera del ámbito científico, conocen qué son las llamadas cianobacterias, a pesar de que estos organismos son responsables tanto de beneficios como de problemas en asuntos humanos (Prosperi 2000). Tampoco se conoce a la mayor parte de las microalgas eucariotas, aún las bien sabidas propiedades abrasivas de las tierras de diatomeas; o las especies que producen las perjudiciales mareas rojas; o todavía sus “primas mayores”, las macroalgas, tan apreciadas en la gastronomía japonesa y europea, así como en las industrias de geles como el agar y carragenina, esta última para espesar jaleas y gelatinas. Son también invaluables los aportes de las microalgas a la industria de los colorantes por la gran diversidad de pigmentos que producen. Clorofitas del género Dunaliella acumulan elevados contenidos de carotenoides, varias veces más que la zanahoria en base seca, por un proceso denominado carotenogénesis, que las hacen fuente primaria de provitamina A para humanos (Guevara y col. 2005).

1 El término eustasia se emplea para designar los hundimientos y posteriores ascensos de la corteza terrestre en aquellas zonas en que existieron grandes glaciares continentales durante el Pleistoceno. Con la formación de los grandes glaciares, el relieve se fue hundiendo por el peso del propio hielo y al finalizar el período glacial y desaparecer esos glaciares, el relieve previamente hundido tiende a "rebotar" hacia arriba debido a que se queda liberado de dicho peso (http://es.wikipedia.org/wiki/Eustasia).

A pesar del empleo milenario de las microalgas como alimento humano, la biotecnología de estos microorganismos en realidad sólo comenzó a desarrollarse a mediados del siglo pasado. Hoy en día, existen numerosas aplicaciones comerciales de las microalgas. Por ejemplo, (i) las microalgas pueden ser utilizadas para mejorar el valor nutritivo de los alimentos y la alimentación animal debido a su composición química, (ii) desempeñan un papel crucial en la acuicultura y (iii) pueden ser incorporadas a los cosméticos. Además, se cultivan como fuentes muy valiosas de diversas moléculas. Respecto a esto último, por ejemplo, los ácidos grasos poliinsaturados de los aceites se añaden a las fórmulas infantiles y complementos nutricionales y los pigmentos son importantes como tintes naturales. Isótopos bioquímicos estables ayudan en la determinación estructural y los estudios metabólicos. La investigación futura deberá centrarse en la mejora de los sistemas de producción y la modificación genética de las cepas. Las microalgas constituyen de esta manera una alternativa económica cada vez más diversificada y competitiva (Spolaore y col. 2006).

Entre los beneficios que la humanidad obtiene de las cianobacterias, por citar uno de múltiples ejemplos, se encuentra su utilización como biofertilizantes en agricultura, gracias a su capacidad de fijar nitrógeno atmosférico (N2) y producir compuestos orgánicos ricos en nitrógeno que contribuyen a incrementar los rendimientos de las cosechas de arroz (Prosperi 2000). El empleo de algunas especies de los géneros Spirulina y Arthrospira para la alimentación humana está ampliamente comprobado por un sin fin de investigaciones científicas, las que coinciden en su inocuidad (no son tóxicas), gran palatabilidad (más de 90% comestible) y sus importantes cantidades de proteínas (65-70% en base seca), vitaminas y otros nutrientes (Ciferri 1983, Henrikson 1994, Mani y col. 2000, Pervushkin y col. 2001, Sachdeva y col. 2004).

Está ampliamente comprobado el beneficio alimentario de Spirulina y Arthrospira en animales de granjas pecuarias (aves de corral, porcinos, etc.) y acuícolas (peces, camarones, etc.), y consumo humano (Martínez-Palacios y col. 1996, Soler y col.

2000, Nandeesh y col. 2001, Jaime-Ceballos y col. 2004). Las tecnologías empleadas para cultivar masivamente microalgas y obtener productos alimenticios, farmacéuticos y cosméticos de su biomasa son limpias en su totalidad; las granjas a cielo abierto tienen un gran valor ecológico como trampas vivientes de gases de efecto invernadero y purificación de biogás (Conde y col. 1993), así como recuperación de cuerpos de agua contaminados (Ayala y Vargas 1987, Sim y Goh 1988, Cañizares y col. 1993).

Existen diversas especies de microalgas que metabolizan hidrocarburos, los bioacumulan en sus vacuolas y producen aceites, a partir de los cuales se pueden producir biocombustibles (biodiesel). La clorofita Botryococcus braunii se caracteriza por su capacidad de producir hidrocarburos insaturados de cadena larga, llegando a contenidos que van de 15 a 75% de su peso seco. Además, esta microalga produce polisacáridos extracelulares que inducen la formación de colonias, el tamaño de las mismas depende de la hidrodinámica de estrés en el biorreactor. Su gran potencial como fuente renovable de combustibles de base o de productos químicos ha sido demostrado por diferentes grupos de investigación (Casadevall y col. 1985, Banerjee y col. 2003).

Otras especies de microalgas con gran potencial en biotecnología petrolera, debido a sus gran contenido de lípidos, son Schizochytrium sp., Nannochloropsis sp., Nitzschia sp., Isochrysis sp. y Tetraselmis suecica, entre otras (Tabla 1).

Tabla 1. Especies de microalgas con potencialidades para generación de biocombustibles.

Contenido de aceites en base seca (tomada de Albarracín 2007).

Especie Contenido de aceite (% de peso seco)

Botryococcus braunii

25 – 75

Chlorella sp.

28 – 32

Crypthecodinium cohnii

20

Cylindrotheca sp.

16 – 37

Dunaliella primolecta

23

Isochrysis sp.

25 – 33

Monallanthus salina

20

Nannochloris sp.

20 – 35

Nannochloropsis sp.

31 – 68

Neochloris oleoabundans

35 – 54

Nitzschia sp.

45 – 47

Phaeodactylum tricornutum

20 – 30

Schizochytrium sp.

50 – 77

Tretraselmis suecica

15 – 23

Por su parte, la diatomea marina Chaetoceros muelleri puede tener potencial para su explotación como un precursor renovable de los combustibles líquidos o como fuente de lípidos, esto sobre la base de su alta tasa de crecimiento, la tolerancia a una amplia gama de temperaturas y conductancias específicas, y una gran cantidad de lípidos intracelulares (Mcginnis y col. 1997).

El fitoplancton ha sido ampliamente estudiado en sus dinámicas poblacionales y comunitarias. Los estudios teóricos a partir de observaciones empíricas y de campo han crecido notablemente debido a la importancia de muchas especies de microalgas en la alimentación, farmacia, medicina, control de calidad de aguas, etc. Un aspecto aún incipiente es el estudio biogeográfico de microalgas en sus ambientes nativos.

Este trabajo trata de dos temas: (1) estudio de las dinámicas poblacionales en especies cultivadas y (2) muestreo y caracterización de hábitats y aspectos comunitarios de especies autóctonas de gran valor en la biotecnología alimentaria y petrolera.

2. Antecedentes en Venezuela

En Venezuela se han hecho numerosos trabajos taxonómicos y ecológicos de microalgas. Diversas especies fitoplanctónicas de importancia biotecnológica son nativas de Venezuela; las clorofitas Botryococcus braunii y Chlorella vulgaris y cianobacterias del género Spirulina han sido reportadas para el embalse de Guri (González de Infante y Riehl 1992). Anteriormente, B. braunii también se encontró en la laguna de San Javier del Valle, Edo. Mérida (Yacubson 1974). En aguas salobres y estuarinas, como el sistema del lago de Maracaibo (norte del lago) se ha reportado la cianobacteria Spirulina subsalsa y otras cianobacterias eurihalinas (Rodríguez 2001).

En diversos sistemas marinos costeros y lagunas hipersalinas del país se han colectado diferentes especies de clorofitas del género Dunaliella (Guevara y col.

2005), así como prasinofitas del género Tetraselmis (Romero y col. 2002), entre otras especies.

Por otra parte, algunas investigaciones se han orientado a ensayos de cultivos de microalgas en condiciones controladas con fines biotecnológicos. Algunos análisis han permitido la determinación de las composiciones nutricionales y producciones de metabolitos de diferentes especies de microalgas: Anabaena sp. (Morales y col. 2002), Chlorella sp. (Mora y col. 2004) y Dunaliella salina (Guevara y col. 2005). Otros ensayos han conducido a la cuantificación de efectos inmunomoduladores de Spirulina subsalsa (Cheng-Ng y col. 2005). Parra (2005) aisló y purificó c-ficocianina y aloficocianina de Arthrospira platensis, dos pigmentos de gran interés en la industria de los colorantes y marcadores moleculares. Naranjo y col. (2010) hicieron una revisión del uso de A. platensis como biofactoría de metabolitos secundarios de interés farmacológico, con énfasis en el ácido pipecólico.

La Asociación Civil Gente de Ciencias (2007), organización científica y social venezolana constituida por profesionales del área de las ciencias naturales, con experiencia en el cultivo de microalgas (cultivos en laboratorio y campo; optimización de medios de cultivo, fotobiorreactores y obtención de productos de microalgas), con énfasis en Arthrospira platensis desde el año 2000. Las investigaciones se concentraron en la aplicación de la biotecnología de microalgas en temas como la nutrición animal y humana. Recientemente con Botryococcus braunii, Nannochloropsis sp., Tetraselmis chuii e Isochrysis galbana, entre otras especies, se ha explorado la factibilidad de producir biocombustibles a partir de aceites sintetizados o acumulados en sus compartimentos intracelulares.

3. Justificación

Este trabajo está enmarcado en el estudio ecológico, taxonómico y biogeográfico de especies de microalgas eucarióticas y cianobacterias autóctonas con potencialidades para su cultivo masivo en Venezuela y empleo en la acuicultura, biotecnología alimentaria, generación de biocombustibles (biodiesel), biorremediación, producción de energías limpias y trampas de gases de efecto invernadero. También se incorporan especies cultivadas en Venezuela desde hace varios años, como Arthrospira platensis y A. maxima de conocido perfil nutricional, médico y biorremediador, por lo que tienen gran demanda mundial; más de 70 países las cultivan comercialmente (Henrikson 1994).

Las especies de los géneros Spirulina y Arthrospira han sido incorporadas con éxito notable en programas sociales y alimentarios dentro de países del cuarto mundo con altas tasas de desnutrición, como el África Ecuatorial. Conviene entonces incorporar el estudio ecológico de estas cianobacterias para conocer sus tasas de crecimiento óptimas y otros parámetros poblacionales con miras a cultivarlas a gran escala en el país y aprovechar su biomasa con la firme intención de establecer programas nutricionales similares en Venezuela y Latinoamérica, a sabiendas de los niveles preocupantes de desnutrición que imperan en los países de esta región.

El estudio de los organismos en su ambiente natural brinda la oportunidad de conocer las especies con las que cuenta Venezuela y adquirir un conocimiento integral de sus ambientes naturales. Esta propuesta lleva implícito un propósito productivo de emular las condiciones naturales para lograr sus cultivos en sistemas controlados, y una finalidad de conservación a partir del conocimiento de los ambientes para manejo sustentable de ecosistemas o su protección como santuarios de vida. En síntesis, la meta de esta investigación es brindar puntos de partida a partir de un estudio ecológico integral a expectativas y necesidades creadas en el país por la búsqueda de fuentes alternativas de alimentos, medicinas, pigmentos y energías limpias, así como perspectivas para la recuperación de ecosistemas acuáticos contaminados. Esta propuesta está enmarcada en el Plan Nacional Simón Bolívar como nuevo modelo sociopolítico para el país.

4. Hipótesis

1. Las poblaciones de Arthrospira platensis cultivadas en el laboratorio presentan densodependencia, y un crecimiento poblacional que puede ser descrito con modelos matemáticos.

2. La geografía y ecología variadas del país permiten esperar una gran diversidad de especies de microalgas distribuidas en forma discontinua y gradientes, algunas de ellas con gran potencial biotecnológico.

5. Objetivos

1. Establecer la dinámica de crecimiento poblacional de Arthrospira platensis con optimización de medios de cultivo para fines productivos.

2. Caracterizar hábitats y comunidades fitoplanctónicas con especies de interés biotecnológico en el país.

Del objetivo 1 se desprenden los objetivos específicos:

a. Caracterizar el crecimiento poblacional de A. platensis en condiciones controladas y naturales.

b. Determinar los parámetros poblacionales.

c. Realizar análisis de perturbación en el modelo dinámico.

Del objetivo 2 derivan los objetivos específicos:

a. Identificar especies de microalgas de muestras colectadas en el campo.

b. Determinar riqueza, abundancia e índices de diversidad.

c. Establecer relaciones entre ambientes, variables físicas y químicas y la composición de especies encontradas.

6. Metodología

El plan general de trabajo se dividió en dos niveles de organización: poblacional y comunitario.

6.1 Ecología de poblaciones de especies cultivadas

Los estudios poblacionales se condujeron por aproximaciones experimentales y con base en la teoría ecológica. Los mismos se centraron en cultivos de la cianobacteria Arthrospira platensis (cepa Lefevre 1963/M-132-1, República Checa). La especie se ha cultivado en el Laboratorio de Optimización Agrícola (LOA-IZET) por más de ocho años. Arthrospira maxima (cepa cubana), es una especie congénere obtenida para el cepario del laboratorio en tiempo más reciente. El cepario también cuenta con otras especies de valor biotecnológico provenientes de otros ceparios del país y del extranjero, así como colecciones de campo: Chaetoceros sp. (Bacillariophyta), Botryococcus braunii (Chlorophyta), Chlamydomonas sp. (Chlorophyta), Chlorella vulgaris (Chlorophyta), Dunaliella salina (Chlorophyta), D. viridis (Chlorophyta), D.

primolecta (Chlorophyta), Haematococcus pluvialis (Chlorophyta), Scenedesmus sp.

(Chlorophyta), Spirulina subsalsa (Cyanobacteria), Isochrysis galbana (Haptophyta), Nannochloropsis sp. (Ochrophyta), Tetraselmis sp. (Prasinophyta), Porphyridium cruentum (Rhodophyta) y Rhodosorus marinus (Rhodophyta).

Medios de cultivo. Se procedió a la preparación de un medio de cultivo estándar para cianobacterias filamentosas alcalófilas de los géneros Spirulina y Arthrospira denominado medio Spirulina o SAG (Schlösser 1994), que es una modificación del medio Aiba y Ogawa (1977). Parra (2005), incorporó algunos cambios a este medio nutritivo. La composición del medio Spirulina se presenta en la Tabla 2.

Tabla 2. Composición química del medio Spirulina (Schlösser 1994).

Componentes Solución Stock

(mL) Masa (g)

Concentración en el medio

final

pH

Solución I 500 (2X) – – Alcalino

(>9)

NaHCO

– 13,61 1,62×10

M –

Na

CO

– 4,03 3,80×10

M –

K

HPO

* – 0,50 2,87×10

M –

Solución II 500 (2X) – – Neutro

(7)

NaNO

* – 5,00 2,94×10

M –

K

SO

– 2,00 5,74×10

M –

NaCl – 2,00 1,71×10

M –

Tabla 2. Continuación.

Componentes Solución Stock

(mL) Masa (g)

Concentración en el medio

final (1X)

pH

MgSO

.7H

O – 0,40 8,11×10

M –

CaCl

.2H

O – 0,02 2,72×10

M –

FeSO

.7H

O – 0,02 3,60×10

M –

Na

EDTA.2H

O – 0,16 2,15×10

M –

Traza metálica 1000 (1000X) – – Neutro

(7)

Na

EDTA.2H

O – 0,80 2,15×10

M –

FeSO

.7H

O – 0,70 2,52×10

M –

ZnSO

.7H

O – 0,001 3,48×10

M –

MnSO

.7H

O – 0,002 8,97×10

M –

H

BO

– 0,01 1,62×10

M –

Co(NO3)2.6 H2O

– 0,001 3,44×10

M –

Na2MoO4.2 H2O

– 0,001 4,13×10

M –

CuSO

.5H

O – 0,00005 2,00×10

M –

*

Spirulina subsalsa fue cultivada en medio Spirulina combinado con agua de mar (50:50), debido al origen estuarino de la cepa (Morales, com. pers.). El resto de las especies de microalgas del cepario se cultivaron en diferentes medios probados y estandarizados como óptimos para sus crecimientos poblacionales: medio F/2 (Guillard 1975), para microalgas marinas como Nannochloropsis sp., Tetraselmis sp. e I. galbana; medio Algal (Fábregas y col. 1985), el cual fue empleado tanto para microalgas de agua dulce como Chlamydomonas sp., C. vulgaris y Scenedesmus sp., como para diatomeas marinas (Chaetoceros sp.), con adición de silicatos, rodofitas (P.

cruentum y R. marinus) y Tetraselmis sp., con adición de agua de mar, y clorofitas de ambientes hipersalinos (Dunaliella spp.), con la incorporación de solución saturada de cloruro de sodio (NaCl); medio Chu-13 (Chu 1942) modificado por Dayananda (2007) para B. braunii; Haematococcus pluvialis fue cultivada en medio Bristol (Bold 1949).

Para especies del género Dunaliella también se probó el medio de Serpa y Calderón (2006). Las composiciones de estos medios se presentan en el Apéndice 1.

La preparación de los medios se efectuó conforme los siguientes pasos generales:

1. Se preparó una solución madre 1000X (solución concentrada) de micronutrientes (oligoelementos o traza metálica), según lo establecido en cada medio de cultivo.

Para ello, las sustancias requeridas como sales inorgánicas cristalizadas grado analítico se pesaron en una balanza analítica digital AND (d = 1 mg).

2. Las sustancias constituyentes de la solución de macronutrientes, sales inorgánicas cristalizadas grado analítico (salvo bicarbonato y carbonato de sodio, sales que debido a sus altos requerimientos para el medio Spirulina se obtuvieron de sacos de 25 ó 50 kg de agroquímicos grado técnico), también se pesaron en una balanza analítica digital AND (d = 1 mg). Las sales de bicarbonato y carbonato de sodio se pesaron en una balanza digital de 10 kg (d = 1 g).

3. Cada sal se disolvió en forma independiente con agitación magnética y calor, luego se mezclaron todos los componentes de la solución madre y se enrasó al volumen final, generalmente de un (1) litro, en un balón aforado o en un cilindro graduado de 1 L. Algunas sales, como el sulfato ferroso heptahidratado (sal utilizada generalmente como fuente de hierro para todos los medios), tuvieron que ser disueltas con un quelante (EDTA disódico o citrato trisódico dihidratado). No se añadieron vitaminas ni carbohidratos a ninguna solución de medio nutritivo.

4. La solución madre de micronutrientes se esterilizó en un autoclave analógico vertical KALSTEIN durante 45 min hasta una temperatura tope de 119ºC (temperatura óptima = 121ºC), y una presión de 10 PSI (presión óptima = 15 PSI).

Antes de autoclavar cualquier solución y material (pipetas Pasteur, fiolas, botellas vacías, etc.), una cinta de papel autoadhesivo indicador (o testigo) se colocó a cada recipiente.

5. A la solución de macronutrientes se añadió la alícuota correspondiente de solución madre de micronutrientes estéril, para de este modo obtener el medio de cultivo íntegro. Para trasvasar soluciones se tomó la previsión de destapar el envase frente a la llama azul de un mechero FISHER.

6. Finalmente, la solución de medio de cultivo se autoclavó para luego enfriar y proteger con papel envolvente.

Inóculo. Se obtuvieron cultivos monoalgales y monoclonales (poblaciones surgidas de un filamento) de A. platensis (cepa Lefevre), por la virtud de estas cianobacterias de reproducirse asexualmente por particiones de filamentos o tricomas en sitios críticos que necrosan y se escinden formando hormogonios (filamentos reproductivos), sitios denominados necridia o necridios. Esto garantizó uniformidad genética en las poblaciones de estos microorganismos.

Para la obtención de cultivos monoclonales se cumplió la pauta siguiente:

1. De una cepa se aisló un filamento en una cápsula de Petri con solución buffer alcalina (bicarbonato-carbonato de sodio, 4:1) bajo un estereoscopio (lupa).

2. Cada filamento se colocó en un tubo de ensayo con medio Spirulina esterilizado y se colocó en cámara de crecimiento (T = 27ºC) con iluminación permanente. El periodo de incubación fue de 15 días, tiempo en el cual el filamento inicial pudo clonarse en varios filamentos vía escisión en necridios.

3. Los cultivos monoclonales se escalaron a fiolas de 250 mL y se mantuvieron sin agitación en la cámara de crecimiento. En estos recipientes se mantuvieron para ser empleados en medios sólidos y completar proceso de purificación de la cepa.

Para la siguiente etapa de purificación del cultivo monoalgal y monoclonal, con la finalidad de controlar contaminación de bacterias y hongos, se emplearon los siguientes pasos:

1. Se prepararon medios sólidos con disolución en caliente de agar no purificado en medio Spirulina (1,5 g de agar por cada 100 mL de medio), de esta manera se elaboró un medio de agar alcalino.

2. Las soluciones con agar se autoclavaron en cápsulas de Petri, para hacer placas y en tubos de ensayo inclinados para obtener cuñas. Una vez obtenidos los medios sólidos estériles, se procedió a encender la llama azul en un mechero FISHER y limpiar el mesón con etanol absoluto. Este procedimiento se hizo con el fin de tener las mayores condiciones de asepsia posibles.

3. Bajo estas condiciones de asepsia y llama azul, una vez que las soluciones esterilizadas se enfriaron, se procedió a la siembra de las cepas vivas. Los medios solidificados en placas y tubos fueron sembrados por medio de un asa metálica pasada por llama azul y enfriada en algún punto del medio sólido, teniendo cuidado de no inocular posteriormente en esa zona (figura 1).

Figura 1. Esquema ilustrado donde se muestra el escalamiento de microalgas de medio líquido a medio sólido con el empleo de la técnica del asa de estaño.

4. Finalmente las cepas en las soluciones nutritivas solidificadas se ubicaron en el cepario o cámara fría bajo luz fría (tubos fluorescentes day-light) a una temperatura media de 23ºC.

Luego de la obtención de cepas limpias, monoclonales y monoalgales, se procedió al escalamiento a fiolas de 250 mL, y de éstas a fiolas de mayores volúmenes en forma sistemática hasta llegar a los cultivos en fiolas de 2 L con agitación y sin fotoperiodo (luz por 24 h diarias). Para ello se procedió del modo siguiente:

1. Soluciones líquidas esterilizadas se trasvasaron a fiolas de 250 mL cubiertas con tapones de algodón y gasa. Todo este material previamente se autoclavó. Los medios líquidos nuevos se inocularon con pequeños volúmenes de cepas provenientes de cuñas y placas del cepario en cámara fría.

2. Las cepas cultivadas en medio líquido se colocaron en la cámara de crecimiento bajo luz fría y temperatura media de 27ºC, con agitación y luz continuas. La agitación en la cámara de crecimiento la proveyó un blower KAWAKE (¼ HP; 220 V), y se condujo a través de un sistema de tubos y mangueras hasta culminar en pipetas Pasteur esterilizadas sumergidas en las soluciones con inóculo.

3. Los dos pasos anteriores se repitieron para los escalamientos sucesivos hasta culminar en cultivos a escala mayor (figuras 2 y 3).

Figura 2. Esquema donde se muestra el escalamiento de poblaciones de microalgas a fiolas de diferentes volúmenes hasta alcanzar los cultivadores a gran escala.

Diseño de experimento. Los experimentos en laboratorio bajo condiciones controladas se ejecutaron a escala menor (fiolas de 2 L); estas pruebas se ejecutaron en la cámara de crecimiento del cepario del Laboratorio de Optimización Agrícola (LOA). Los ensayos en campo se llevaron a cabo a escala mayor y con monitoreo de las condiciones ambientales en la Planta Experimental “Ficotrón” ubicada en el Instituto de Estudios Avanzados (IDEA), Sartenejas, Edo. Miranda. Se ensayó en

botellones de 5 L, tanques cilíndricos de 500 L y cultivadores tipo carrusel (en inglés

“race-ways”) de 2000 L (figura 3).

Figura 3. Imágenes donde se muestran las diferentes etapas de escalamiento del cultivo en medio líquido en el sistema integrado LOA-Ficotrón: (a) cultivos a escala pequeña en condiciones controladas (Cámara de Crecimiento, LOA - IZET); (b), (c) y (d) cultivos a cielo abierto en el Ficotrón, IDEA, en botellones de 5 L, tanques circulares de 500 L y cultivadores tipo carrusel de 2000 L, respectivamente.

Cada diseño de experimento se definió por el número de factores o variables independientes a fijar y su número de niveles (Montgomery 2001). En todos los experimentos se consideraron variables dependientes: (1) la densidad poblacional (filamentos/L), por el método directo de conteo de filamentos, y (2) la absorbancia a longitud de onda (λ) = 680 nm, para el método indirecto.

Los ensayos de laboratorio se organizaron en diseños factoriales 2² (dos factores, sodio (Na) y potasio (K), con dos niveles, alta y baja concentración), para comparar cuatro medios de cultivo (modificaciones del medio Spirulina) empleados para A.

platensis. Se supone la existencia de repeticiones del experimento en cada una de las posibles combinaciones de los niveles del factor correspondiente (Montgomery 2001).

No obstante, los ensayos se replicaron en fiolas (bloques), para realizar la prueba estadística. Se hicieron ajustes matemáticos para modificar la relación Na⁺:K⁺, sin variar en forma notable las concentraciones de los demás iones. Con estas pruebas se determinó el medio de cultivo óptimo para el crecimiento poblacional en condiciones controladas, a partir de los dos cationes más importantes en el equilibrio electroquímico entre los compartimentos intra y extracelulares, y contraiones de las sales inorgánicas. Las interacciones entre factores se evaluaron con un ANOVA de dos vías (α = 0,05). La Tabla 3 muestra el resumen del ensayo factorial 2².

Tabla 3. Diseño factorial 2² para ensayos de laboratorio. El experimento se simplificó a cuatro medios de cultivo sin replicación.

K⁺ alto K⁺ bajo

Na⁺ alto + + + –

Na⁺ bajo – + – –

(a) (b) (c) (d)

En campo se continuó la investigación con diseños factoriales de mayor complejidad, a medida que se añadieron factores. El primer experimento de campo se llevó a cabo en botellones plásticos de 5 L y el diseño correspondió a un factorial fraccionado 2^6-1 de resolución VI, montado con el programa Design Expert versión 6, donde las variables independientes o factores fueron seis sales grado alimenticio a dos niveles, con cinco puntos centrales. El programa produjo 37 tratamientos, 5 centrales y el resto combinaciones aleatorias de los factores (Tabla 4). Las sales forman parte del medio Spirulina (Schlösser 1994), pero en lugar de la sustitución de Parra (2005) de KNO₃ por NaNO3, se empleó NH4NO3, esto debido a razones de costos. A esta escala de experimentación se emplearon sales grado alimenticio y no reactivo, el NH₄NO₃ resultó la fuente de nitrógeno disponible y muy empleada en producción de fertilizantes.

Tabla 4. Resumen del diseño factorial fraccionado 2^6-1 (salida del programa Design Expert)*.

Study Type: Factorial Runs: 37

Initial Design:

2 Level Factorial Blocks: No Blocks

Center

Points:

5

Design Model:

Reduced 3FI

Factor Name Units Type Low Actual

High Actual

Low Coded

High Coded

Mean Std.

Dev.

A NaHCO3 mg/L Numeric 6805 13610 -1 1 10207,5 3164,3 B Na2CO3 mg/L Numeric 2015 4030 -1 1 3022,5 937,0

C K2HPO4 mg/L Numeric 250 500 -1 1 375 116,2

D NaCl mg/L Numeric 500 1000 -1 1 750 232,5

E K2SO4 mg/L Numeric 500 1000 -1 1 750 232,5

F NH4NO3 mg/L Numeric 1176 2352 -1 1 1764 546,8

*Para más detalle sobre este ensayo, ver Apéndice 2.

Las variables respuestas o dependientes aleatorias fueron: absorbancia a 680 nm, número de filamentos por litro, y biomasa final (g/L). El medio óptimo para este experimento se escogió por una técnica matemática multivariada denominada superficie de respuesta (ver Apéndice 2 con salida del análisis en Design Expert, y Apéndice 3 que muestra un marco teórico breve que explica la técnica).

Para este ensayo de campo, los medios se prepararon según esquema de la figura 4.

Los pasos se enumeran a continuación:

1. Se prepararon soluciones stocks por triplicado con agua destilada y se preservaron en envases limpios. Los primeros ocho tratamientos se prepararon en dos soluciones de 500 ml cada una: Solución I (Stocks A, B y C) y Solución II (stocks I,

D, E, F y II). Las preparaciones se hicieron en grupos de ocho debido a la capacidad limitada del autoclave (16 botellas de vidrio de 1 L c/u).

2. Se autoclavaron las soluciones I y II de cada tratamiento.

3. Cada tratamiento se aforó a 4 L con agua filtrada.

4. Se tomó una muestra de 50 mL de cada tratamiento y se realizaron medidas de pH y conductividad como método de comprobación de calidad del medio.

Figura 4. Esquema para la preparación de cada medio (tratamiento) del diseño factorial fraccionado 2^6-1.

La siguiente escala de volumen en el estudio, la constituyeron tanques cilíndricos de 500 L. El diseño experimental empleado para evaluar el crecimiento poblacional de A.

platensis en este tipo de cultivadores fue un factorial 3² con bloques completos aleatorizados. Se estableció un sistema de 9 tanques cilíndricos de 500 litros de polietileno de alta densidad, con sistema de bombeo y aireación (blower KAWAKE ¼ HP; 220 V) bajo invernadero (Ficotrón). El sistema de bombeo está compuesto de dos bombas de pecera (cada bomba aproximadamente suministra 2 L•min^-1). Cada medio en tanque se inoculó con 10% de los volúmenes totales, dando como resultado una concentración promedio de 83 mg/L. Las pérdidas por evaporación se repusieron con agua filtrada. Cada 72 h se midió la absorbancia o densidad óptica (DO) en un espectrofotómetro SHIMADZU UV-160 a λ = 680 nm. Como medio de cultivo se empleó el optimizado en el diseño factorial fraccionado 2^6-1. La variable independiente aleatoria fue la profundidad (cm), debido a que este factor físico resulta determinante

Stock A

1/2L Sol. I de Trat.

X

1/2L Sol. II de Trat.

X

4L Trat.

X

Autoclavar I y II

Stock B Stock C Stock I Stock D Stock E Stock F Stock II