PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS MAESTRIA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
SECUENCIACIÓN DE LA REGIÓN CONTROL DEL ADN MITOCONDRIAL A PARTIR DE FRAGMENTOS OSEOS PREHISPANICOS
HALLADOS EN EL SECTOR DE CANDELARIA LA NUEVA
EN BOGOTÁ
MYRIAM CRISTINA SÁNCHEZ COLLAZOS
Bogotá D.C., julio de 2007
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS MAESTRIA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
SECUENCIACIÓN DE LA REGIÓN CONTROL DEL ADN MITOCONDRIAL A PARTIR DE FRAGMENTOS OSEOS PREHISPANICOS
HALLADOS EN EL SECTOR DE CANDELARIA LA NUEVA
EN BOGOTÁ
MYRIAM CRISTINA SÁNCHEZ COLLAZOS
Tesis presentada como requisito parcial para optar por el titulo de Magíster en Ciencias Biológicas con énfasis en Genética Humana
Bogotá D.C., julio de 2007
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS MAESTRIA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
SECUENCIACIÓN DE LA REGIÓN CONTROL DEL ADN MITOCONDRIAL A PARTIR DE FRAGMENTOS OSEOS PREHISPANICOS
HALLADOS EN EL SECTOR DE CANDELARIA LA NUEVA
EN BOGOTÁ
MYRIAM CRISTINA SÁNCHEZ COLLAZOS
Director
Dr. IGNACIO BRICEÑO BALCAZAR, MD. PhD Profesor Titular del Instituto de Genética Humana Facultad de Medicina Pontificia Universidad Javeriana
Codirector
Dr. ALBERTO GÓMEZ G., PhD
Profesor Asociado del Instituto de Genética Humana Facultad de Medicina Pontificia Universidad Javeriana
Bogotá D.C., julio de 2007
NOTA DE ADVERTENCIA
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el
anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de julio de 1996.
SECUENCIACIÓN DE LA REGIÓN CONTROL DEL ADN MITOCONDRIAL A PARTIR DE FRAGMENTOS OSEOS PREHISPANICOS
HALLADOS EN EL SECTOR DE CANDELARIA LA NUEVA
EN BOGOTÁ
MYRIAM CRISTINA SÁNCHEZ COLLAZOS
APROBADO
IGNACIO BRICEÑO BALCAZAR, MD. PhD Director
MARTHA BERMUDEZ, PhD Jurado
ROCIO LIZARAZO, MSc Jurado
CARL H. LANGEBAEK, PhD Jurado
SECUENCIACIÓN DE LA REGIÓN CONTROL DEL ADN MITOCONDRIAL A PARTIR DE FRAGMENTOS OSEOS PREHISPANICOS
HALLADOS EN EL SECTOR DE CANDELARIA LA NUEVA
EN BOGOTÁ
MYRIAM CRISTINA SÁNCHEZ COLLAZOS
APROBADO POR
ANGELA UMAÑA M., Phil Decana Académica Facultad de Ciencias
CARLOS CORREDOR P., PhD Director de Postgrado
Facultad de Ciencias
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Ignacio Briceño Balcazar Al Dr. James Troy Valencia A la Dra. Patricia Jiménez Borrego
Al Dr. Freddy Rodríguez Saza A mis compañeras del Laboratorio
A la Fiscalía General de la Nación Al instituto de Genética de la PUJ Al Grupo de Genética de la FGN
A mi país, Colombia A nuestros antepasados Muiscas A mi trabajo en Identificación Humana
DEDICADO A
Mi adorada mamita, de quien no solo herede su mitocondria, sino también su amor por las verdaderas cosas importantes en la vida…
Mi precioso papito, que admiro por su tenacidad, su empeño y decisión de seguir adelante
junto a todos los que lo amamos…
Mi bello abuelo, al cual toda una generación le debemos el existir, por ser madre y padre al mismo tiempo sin renunciar…
Mi querido novio, que es mi mejor amigo, mi apoyo, mi compañía y el amor
que necesito en los momentos de mi vida…
Los amerindios, por superar miles de adversidades
llegando hasta estas tierras, para enriquecernos con sus genes…
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
RESUMEN ___________________________________________________1 ABSTRAC ____________________________________________________2 1 INTRODUCCIÓN ___________________________________________3 2 JUSTIFICACIÓN ___________________________________________7 3 OBJETIVOS_______________________________________________9 3.1 Objetivo General ________________________________________9 3.2 Objetivos Específicos ____________________________________9 4 MARCO TEÓRICO ________________________________________10 4.1 Las Mitocondrias_______________________________________10 4.1.1 El ADN Mitocondrial (ADNmt) _________________________12 4.1.2 Herencia Materna __________________________________15 4.1.3 Poliplasmia _______________________________________17 4.1.4 Segregación Mitótica ________________________________18 4.1.5 Alto Nivel de Mutación _______________________________19 4.1.6 Heteroplásmia _____________________________________21 4.2 Secuenciación del ADN Mitocondrial _______________________24 4.3 Haplogrupos __________________________________________26 4.3.1 Haplogrupos del ADN Mitocondrial _____________________31 4.4 ADN Antiguo __________________________________________36 4.4.1 Tipo de Muestras Antiguas ___________________________39 4.4.2 Inconvenientes del Análisis de ADN Antiguo______________43 4.5 Degradación del ADN ___________________________________44 4.5.1 Daños Moleculares en el ADN_________________________45 4.5.2 Factores que causan daños moleculares en el ADN________46 4.6 Cantidad y Calidad del ADN en los Restos Antiguos ___________47 4.7 Contaminación de las Muestras ___________________________48 4.8 Sustancias Inhibidoras __________________________________50 4.8.1 Inhibición de la PCR ________________________________52 4.8.2 Estrategias para Superar los Inhibidores ________________52 4.8.3 La Naturaleza de la Inhibición _________________________55 4.9 Condiciones de Conservación ____________________________55 4.10 Técnicas Usadas para Analizar ADN Antiguo ________________56
4.11 Primeros Pobladores de América __________________________61 4.11.1 Hacia Sur América__________________________________64 4.11.2 Los muiscas_______________________________________65 5 MATERIALES Y MÉTODOS _________________________________70 5.1 Muestras _____________________________________________70 5.2 Muestreo _____________________________________________71 5.3 Métodos _____________________________________________71 5.4 Preparación Previa al Desarrollo de los Protocolos ____________74 5.5 Fijación Fotográfica_____________________________________75 5.6 Extracción de ADN Mitocondrial ___________________________75 5.6.1 Extracción de ADN a Partir de Restos Óseos _____________76 5.6.2 Extracción de ADN a partir de Sangre___________________80 5.7 Purificación con Kit DNA IQ™ System (Promega) _____________82 5.8 Amplificación de ADN Mitocondrial_________________________83 5.9 Purificación del producto de amplificación PCR _______________87 5.10 Secuenciación de ADN Mitocondrial________________________88 5.11 Purificación del Producto de Secuenciación__________________90 5.12 Electroforesis Capilar de ADN Mitocondrial __________________92 5.13 Análisis de Datos ______________________________________93 6 RESULTADOS __________________________________________100 6.1 Primera Etapa ________________________________________100 6.2 Segunda Etapa _______________________________________104 6.3 Evolución del Haplogrupo A en América ___________________115 7 DISCUSIÓN _____________________________________________121 8 CONCLUSIONES ________________________________________132 9 BIBLIOGRAFÍA __________________________________________134 9.1 Recursos Electrónicos _________________________________148 10 ANEXOS _____________________________________________149 10.1 Maceración y digestión _________________________________149 10.2 Extracción ___________________________________________150 10.3 Reextracciòn con Kit Corpogen __________________________150
ÍNDICE DE TABLAS
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Tabla No. 1 Tamaño de las regiones no codificantes del ADNmt_________14 Tabla No. 2 Tipo de Variabilidad que presentan algunos Polimorfismos
de secuenciación del ADNmt. (Wakeley, 1993; Meyer et al.
1999) ____________________________________________30 Tabla No. 3 Mutaciones características de los haplogrupos fundadores
amerindios del ADNmt (HVI) por RFLPs (Torroni et al.
1993b; Brown et al.1998) _____________________________34 Tabla No. 4 Haplogrupos fundadores amerindios y mutaciones
asociadas en la región hipervariable HVI (Torroni et al.
1993a; Forster et al. 1996). Las posiciones corresponden a la secuencia de referencia de Anderson (Anderson et al.
1981). ____________________________________________34 Tabla No. 5 Principales factores que influyen en la degradación del ADN
(Rodríguez, 2003) __________________________________44 Tabla No. 6 Características y codificación de las tumbas analizadas de
Candelaria La Nueva. (Cifuentes y Moreno, 1987) _________72 Tabla No. 7 Identificación y tipo de muestras analizadas _______________75 Tabla No. 8 Color y cantidad del pulverizado obtenido a partir de las
muestras. _________________________________________77 Tabla No. 9 Reactivos usados en la reacción de Amplificación de
ADNmt ___________________________________________84 Tabla No. 10 Dye terminators y sus colores en el electroferograma ______89 Tabla No. 11 Reactivos usados en la reacción de Secuenciación ________90 Tabla No. 12 Secuencia de Primers usados en Amplificación ___________95 Tabla No. 13 Muestras procesadas en la primera etapa del análisis _____100 Tabla No. 14 Resultados de la primera amplificación para ADNmt ______100 Tabla No. 15 Resultados del primer proceso de secuenciación de
ADNmt __________________________________________101 Tabla No. 16 Muestras procesadas en la segunda etapa del análisis. ____105 Tabla No. 17 Resultados del proceso de extracción orgánica __________105 Tabla No. 18 Resultados de la segunda amplificación de ADNmt _______106
Tabla No. 19 Resultados de la tercera amplificación de ADNmt ________107 Tabla No. 20 Resultados del segundo proceso de secuenciación de
ADNmt __________________________________________108 Tabla No. 21 Polimorfismos encontrados en la secuenciación de la
región HVI del ADNmt en las muestras del estudio que presentaron resultados. Posición de las bases en la secuencia HVI del ADNmt, SA: Secuencia de Anderson, 1MP al 20MP: muestras analizadas, HA2: Polimorfismos característicos del Haplotipo A2, CS: Polimorfismos encontrados en la analista Cristina Sánchez _____________110 Tabla No. 22 Polimorfismos encontrados en la secuenciación de la
región HVII del ADNmt en las muestras del estudio que presentaron resultados. Posición de las bases en la secuencia HVI del ADNmt, SA: Secuencia de Anderson, 1MP al 20MP: muestras analizadas, HA2: Polimorfismos característicos del Haplotipo A2, CS: Polimorfismos encontrados en la analista Cristina Sánchez _____________111 Tabla No. 23 Polimorfismos característicos del Haplotipo A2 __________112 Tabla No. 24 Porcentaje de coincidencias entre las muestras
analizadas y el Haplotipo A2._________________________114 Tabla No. 25 Polimorfismos de secuenciación hallados en el haplogrupo
A. ______________________________________________116 Tabla No. 26 Posibles fuentes de los polimorfismos presentados por el
haplogrupo A._____________________________________119
ÍNDICE DE FIGURAS
Pág.
Figura No. 1 La Mitocondria _____________________________________10 Figura No. 2 Genoma Mitocondrial ________________________________12 Figura No. 3 Mapa del ADNmt ___________________________________13 Figura No. 4 Esquema de la Región Control y Localización de las
Regiones Hipervariables HVI y HVII. ____________________15 Figura No. 5 Forma de herencia de la mitocondria materna y su ADN_____16 Figura No. 6 Linaje materno del ADNmt ____________________________17 Figura No. 7 Representación de la poliplasmia del ADNmt _____________18 Figura No. 8 Imagen del proceso de secuenciación de ADNmt __________24 Figura No. 9 Migraciones de los haplogrupos de ADNmt en el Mundo ____27 Figura No. 10 Haplogrupos de ADNmt _____________________________31 Figura No. 11 Distribución de los tres grupos lingüísticos Americanos y
sus haplogrupos basado en la teoría tri-migracional de Greenberg et al. 1986. Fuente:
(http://proyectosadnhispanos.bravehost.com/NAlanguageg rps.gif) ___________________________________________35 Figura No. 12 Fuentes de ADN antiguo ____________________________36 Figura No. 13 Resto óseo en proceso______________________________40 Figura No. 14 Ruta de Bering ____________________________________61 Figura No. 15 Ubicación geográfica de la población de estudio: hallazgo
arqueológico Candelaria La Nueva en Bogotá, perteneciente a los muiscas del grupo lingüístico chibcha.
(Modificado de Melton et al. 2007)______________________67 Figura No. 16 Tipos de sitios arqueológicos Sabana de Bogotá por
ICANH ___________________________________________68 Figura No. 17 Ubicación y tipo del rescate arqueológico Candelaria La
Nueva, en el barrio Candelaria La Nueva en la zona de Ciudad Bolívar, al sur oriente de la ciudad de Bogotá, paralelo a la avenida ciudad de villavicencio. _____________69 Figura No. 18 Esquema de las regiones hipervariables HVI y HVII
Amplificadas. ______________________________________85
Figura No. 19 Esquema de la región control Amplificada _______________85 Figura No. 20 Estrategia de Amplificación __________________________94 Figura No. 21 Fotografía digital y polaroid del corrido electroforético de
gel de agarosa al 2% con las muestras de la Amplificación 1, para las regiones HVI y HVII de 400 pb del ADNmt. Se observa la banda que corresponde al tamaño de las regiones amplificadas del ADNmt. _____________________103 Figura No. 22 Fotografía digital y polaroid del corrido electroforético del
gel de agarosa al 2% con la Amplificación 1, débilmente positiva de la muestra 20MP para las regiones HVI y HVII, con un tamaño de 400 pb y se verifica la no amplificación del control negativo. ________________________________104 Figura No. 23 Fotografía polaroid del corrido electroforético en gel de
Agarosa al 2% de la extracción orgánica de las muestras.
Se observa degradación y presencia de posibles inhibidores acompañantes de las muestras. _____________106 Figura No. 24 Fotografía polaroid del corrido electroforético en gel de
Agarosa al 2% de la Amplificación 2, donde solo amplificaron los controles y no se obtuvo resultados en las muestras. ________________________________________107 Figura No. 25 Fotografía polaroid del corrido electroforético en gel de
Agarosa al 2% de la Amplificación 3, con las muestras que amplificaron para las regiones HVI y HVII de 400 pb del ADNmt.__________________________________________108 Figura No. 26 Haplogrupo A en América __________________________115
ÍNDICE DE ANEXOS
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Anexo No. 1. Método de Extracción de ADN en Restos Óseos Antiguos, Estandarizado en el Instituto de Genética de la Pontificia Universidad Javeriana. ______________________149
RESUMEN
Los estudios genéticos en restos pre-hispánicos de amerindios son escasos. Análisis previos en restos arqueológicos “muiscas” hallados en el rescate arqueológico “Candelaria La Nueva” en Bogotá, Colombia mostraron el haplogrupo A en todas las muestras. El presente proyecto pretende establecer la estructura genética mitocondrial de la región control.
Once individuos dentro de las variables de inclusión fueron analizados.
Criterios de autenticidad fueron implementados durante los procedimientos de laboratorio con el fin de validar el estudio.
Siete de ellos fueron exitosamente amplificados y secuenciados para la región HV1 y HV2. Todos correspondieron al haplogrupo A, cinco de ellos mostraron el haplotipo A2 y uno de ellos mostró la transición G→A en la posición 16213.
Los resultados obtenidos en el análisis de los restos óseos arcaicos soportan previos reportes estableciendo la presencia del “haplogrupo A”, incluyendo el polimorfismo 16111 encontrado en el haplotipo A2 característico de los nativos americanos. Adicionalmente la transición 16213 hallada en un individuo, es actualmente reportada en los habitantes de la región de Bogotá. Estos resultados soportan la afiliación genética chibcha de este grupo. Siendo necesario realizar nuevos estudios para establecer la estructura genética de estas poblaciones extintas.
ABSTRAC
Genetic studies in Amerindian pre-hispanics remains are scarce.
Previous RFLP studies in archaeological “muiscas” remains from a rescue performed in “Candelaria La Nueva”, a region from Bogotá Colombia, showed haplogroup A in all the samples. The present project was performed in order to establish the genetic mitochondrial structure in the control region.
Eleven individuals fulfilling the inclusion criteria were analyzed.
Authenticity criteria were implemented during the laboratory procedures in order to validate the study.
Seven of them were successfully amplified and sequenced for HV1 and HV2 region. All correspond to haplogroup A, five of them showed the A2 haplotype One of them showed a transition G→A in position 16213.
The results obtained in the analysis of the archaic bones supports previous reports establishing the presence of “haplogroup A”, including the 16111 polymorphism found in haplotype A2 characteristic of Native Americans. Additionally the 16213 transition found in one individual. has been reported in present day inhabitants of the Bogota region. This result supports the genetic chibcha affiliation of the group. Further studies need to be performed to establish the genetic structure of these extinct populations.
1 INTRODUCCIÓN
Las mitocondrias actualmente son protagonistas de numerosos estudios de interés científico en muchos campos, que van desde la medicina clínica donde se investiga un gran número de enfermedades metabólicas relacionadas con el genoma mitocondrial. así como en la bioquímica metabólica donde las mitocondrias, tienen el papel principal en el metabolismo celular y los procesos bioenergéticos que de estos se desprenden; además en muchos aspectos relacionados con nuevas investigaciones sobre cáncer, enfermedades neurodegenerativas y el envejecimiento. Así mismo, la utilidad del ADN mitocondrial como un marcador genético confiable en antropología molecular para el estudio de la evolución humana, los flujos migratorios y la posibilidad de analizar fósiles arcaicos o restos humanos antiguos en avanzado estado de degradación, es de suma importancia para dilucidar interrogantes aun no resueltos en estos aspectos y que también se extienden al campo de la genética forense donde se ha comprobado su gran valor como marcador en la identificación de personas o el esclarecimiento de relaciones de parentesco; sin duda estos hechos le dan a la mitocondria un estatus incuestionable.
Los avances genéticos, especialmente aplicados en el campo forense, donde se deben analizar muestras traza de la escena de un crimen o muestras en avanzado estado de degradación, han evolucionado enormemente con el uso de técnicas de biología molecular que han permitido abordar este tipo de muestras paralelamente con el análisis de muestras con ADN antiguo, que presentan características similares en cuanto al proceso de degradación al que han estado expuestas y la limitación en calidad y
Actualmente, el análisis de ADN antiguo es un nuevo campo científico basado en la recuperación de material genético de restos antiguos, donde se combina la fascinación del estudio del pasado con la potencialidad del ADN para establecer genealogías, que aportan información muy valiosa sobre la estructura genética de las poblaciones antiguas como de las poblaciones modernas. Al mismo tiempo, presenta numerosas dificultades técnicas debido a la degradación del material genético, convirtiéndolo en un campo de estudio tecnológicamente difícil y a veces complejo.
Los primeros pobladores de América, encontraron un continente rico en recursos, con amplias sabanas donde rápidamente siguieron rutas migratorias hacia el sur, pasando a través de centroamérica y llegando hasta Colombia, donde algunos se establecieron y pasaron de grupos errantes a cultivadores.
A partir de evidencias de restos humanos encontradas en el sector conocido como Candelaria La Nueva, ubicado hacia el sur oriente de la sabana de Bogotá, se realizó el análisis de secuenciación de ADN mitocondrial de una muestra de 11 fragmentos óseos, los cuales se encontraron muy frágiles y degradados, lo que hizo que el estudio de estas muestras, (que en su mayoría eran fragmentos de costilla) fuera muy difícil lograr una secuencia clara de ADN mitocondrial y conseguirlo fuera un reto.
El análisis de estas muestras se realizó en el Laboratorio de la Sección de Genética de la Fiscalía General de la Nación; donde se procesan muestras forenses, en su mayoría restos óseos en alto estado de degradación, tanto para ADN nuclear como ADN Mitocondrial.
La secuencia de ADN mitocondrial da indicios del linaje materno al que pertenecen estas muestras arcaicas; encontrando una reducida diversidad de ADN mitocondrial, siendo esto comparable a lo hallado en Suramérica.
En definitiva, la identificación genética de restos óseos humanos de distinta antigüedad es una herramienta utilizada por muy diversos campos científicos entre los que cabe destacar la biología evolutiva, la ecología, la antropología, la arqueología, la paleontología o la genética forense.
En el estudio de restos antiguos, el análisis de ADN nuclear se encuentra muy restringido, ya que la posibilidad de obtención de resultados es mínima como consecuencia de la degradación del ADN, casi todos los estudios se basan en el ADN mitocondrial.
Ahora mismo, con esta técnica, se están estudiando poblaciones humanas desaparecidas. Conocer el ADN antiguo ayuda a reconstruir el árbol de la vida y a conocernos a nosotros mismos.
Los estudios de ADN de restos humanos de interés arqueológico y/o forense, son de los más difíciles dentro de la identificación y cada caso debe ser considerado separadamente.
El análisis del ADN mitocondrial de individuos prehistóricos aborda la problemática del poblamiento Colombiano desde el ADN antiguo, además de abordar técnicas de análisis de secuenciación del ADNmt en especímenes con ADN antiguo.
Las restricciones encontradas en el análisis genético de las poblaciones extintas, se basan en las pocas evidencias que se han podido descubrir en la actualidad y se limitan a los restos esqueléticos hallados en situaciones especiales, haciendo que las teorías o inferencias puedan tener una mayor consistencia con respecto a las pruebas analizadas y evidencias demostrables con ayuda de las técnicas de análisis de ADN.
2 JUSTIFICACIÓN
Los estudios de Secuenciación de ADNmt de las poblaciones indígenas prehistóricas en Colombia son pocos (Monsalve et al. 1996; Keyeux et al.
2000) y aunque actualmente la posibilidad de analizar por este medio grupos indígenas ya extintos es mucho mayor por el mejoramiento continuo de las técnicas y reactivos utilizados para muestras antiguas, existe una gran cantidad de rescates arqueológicos que se deben estudiar, hasta lograr tener una base de datos de los polimorfismos de secuencia de ADNmt encontrados en los diferentes grupos indígenas que habitaron y que aun se encuentran en territorio Colombiano.
Contar con esta información es un gran avance a nivel multidisciplinario que aportará mucha información y dilucidara teorías contradictorias, evitando planteamientos erróneos sobre el poblamiento en Colombia y su actual estructura genética.
Debido a que la información contenida en la secuencia de ADN mitocondrial es heredada a partir de la vía materna exclusivamente, se puede establecer un vínculo de parentesco entre individuos maternalmente relacionados (Giles et al. 1980). El análisis de la secuencia permite diferenciar un individuo de otro de distinto linaje materno (Higuchi et al.
1988).
Esta característica, sumada a que cada célula contiene una gran cantidad de mitocondrias y por ello el genoma mitocondrial se halla mucho más representado que el contenido en el núcleo celular, hace que este
ampliamente degradado o escaso, como los restos prehistóricos de nuestra historia.
A partir del análisis de la secuencia de ADNmt, han sido caracterizados restos arqueológicos de varios miles de años de antigüedad, en los que fue factible obtener ADN mitocondrial relativamente bien conservado (Pääbo, 1990).
La identificación metodológica del ADN antiguo con el ADN mitocondrial, se debe a que hay varios miles de genomas mitocondriales (hasta 10.000 o más) por cada célula, mientras que el ADN nuclear, únicamente tiene dos copias de cada cromosoma.
Las mitocondrias se heredan por línea materna; debido al hecho de que cuando los espermatozoides penetran en el óvulo, sus mitocondrias (ADNmt paterno) son degradadas por las enzimas del ovulo. Es decir, el ADN mitocondrial que está en nuestras células proviene de nuestra madre (y no de nuestro padre), y de nuestra abuela materna, bisabuela materna, etc. Esto significa que, desde un punto de vista evolutivo, es más fácil de interpretar que un marcador nuclear, debido a la ausencia de recombinación (entrecruzamientos de fragmentos de material genético que se produce entre los cromosomas del núcleo), haciendo que se herede de manera idéntica a todos sus descendientes por linaje materno.
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo General
Establecer la estructura genética mediante la secuenciación del ADN mitocondrial de la población prehispánica del hallazgo arqueológico de Candelaria La Nueva en Bogotá, Colombia.
3.2 Objetivos Específicos
¾ Estandarizar la metodología de extracción de ADN usada en la identificación de restos óseos forenses para su aplicación en los restos óseos prehispánicos.
¾ Determinar los polimorfismos de la región hipervariable HVI, mediante secuenciación de ADN mitocondrial de los fragmentos óseos prehispánicos.
¾ Determinar los polimorfismos de la región hipervariable HVII, mediante secuenciación de ADN mitocondrial de los fragmentos óseos prehispánicos.
¾ Establecer el haplogrupo y los haplotipos de ADNmt al que pertenecen los fragmentos óseos prehispánicos.
¾ Realizar estudios filogenéticos utilizando los polimorfismos de ADN mitocondrial encontrados en la secuenciación con otras muestras de grupos indígenas caracterizados.
4 MARCO TEÓRICO
4.1 Las Mitocondrias
Figura No. 1 La Mitocondria
Fuente:(http://www.juntadeandalucia.es/averroes/recursos_informaticos/conc urso1998/accesit6/mitocond.html)
Son organelos que se encuentran en el citoplasma de las células eucariotas, de forma ovalada, tienen una membrana externa y una interna muy plegada donde se engloba una matriz fluida (Figura 1), donde las moléculas orgánicas producto de la degradación de los alimentos se oxidan por reacciones químicas en cadena; así mismo los electrones producidos en este proceso pasan por una serie de complejos enzimáticos respiratorios de la membrana interna donde se produce la fosforilación del Adenosin Difosfato (ADP) en Adenosin Trifosfato (ATP). (Klug y Cummings, 1999; Álvarez, 2001).
La función principal de la mitocondria, es la producción de energía celular en forma de ATP, como resultado de la fosforilación oxidativa.
Además, esta provista de su propia maquinaria necesaria para replicar, transcribir y traducir la información genética que contiene.
Su origen, hasta el momento es explicado por medio de la teoría endosimbiótica, según la cual se postula que el origen del ácido desoxirribonucleico (ADN) extranuclear contenido por la mitocondria es exógeno y se deriva evolutivamente de un microorganismo de vida libre;
posiblemente cuando el ancestro de los organismos eucarióticos fagocitó un procariote, como una bacteria, que luego fue retenida en una relación endosimbiótica favorable para los dos organismos (Gray et al. 1999).
Así las mitocondrias obtienen su propio material genético, pese a esto no son totalmente autosuficientes debido a que gran parte de las proteínas funcionales y estructurales están codificadas por genes del ADN nuclear (Anderson et al. 1981; Álvarez, 2001).
Por lo tanto, el sistema respiratorio celular requiere la complementación del genoma nuclear y el genoma mitocondrial. La mayoría de las proteínas mitocondriales son codificadas en genes del ADN nuclear, incluyendo gran parte de las subunidades que hacen parte de los complejos de la cadena respiratoria, las ADN y RNA polimerasas y las proteínas ribosomales. En contraste el ADN mitocondrial (ADNmt) codifica solamente algunas subunidades esenciales de la cadena respiratoria, así como sus RNA ribosomales y de transferencia. En resumen, un complejo control genético es proporcionado por productos de genes nucleares que coordinan la preservación del ADN mitocondrial y su expresión para suplir las necesidades energéticas de la célula (Anderson et al. 1981).
Las mitocondrias son heredadas por línea materna, la madre las transmite en su oocito a la descendencia. Las pocas mitocondrias contenidas en la porción media del espermatozoide no penetran el óvulo o posiblemente
4.1.1 El ADN Mitocondrial (ADNmt)
Figura No. 2 Genoma Mitocondrial
Fuente:(http://images.clinicaltools.com/images/gene/mitochondrialADN2.jpg)
El genoma mitocondrial humano (Figura 2), es una molécula de ADN circular de doble cadena con una longitud de 16569 pares de bases (pb) que fue completamente secuenciado en 1981 por Anderson. (Anderson et al.
1981). El ADNmt, esta distribuido en dos regiones: una región codificante que contiene los genes involucrados en los procesos de producción de energía de la célula y una región no codificante, donde se acumulan las mutaciones y es llamada región control.
La región codificante contiene información para 37 genes: dos ácidos ribonucleicos ribosomales (rRNA), que forman los ribosomas mitocondriales necesarios para la traducción, 22 de transferencia (tRNA), que pueden leer todo el código genético y 13 proteínas que forman parte de cuatro de los cinco complejos multienzimáticos del sistema de fosforilación oxidativa, (Figura 3), etapa final de la producción del ATP (Shadel and Clayton, 1997;
Klug y Cummings, 1999).
Los péptidos corresponden a siete subunidades del dinucleótido de nicotinamida (ND1, 2, 3, 4, 4L, 5, 6) y adenina reducida (NADH): ubiquinona óxidoreductasa; una subunidad de la ubiquinol citocromo c óxidoreductasa (cyt b); tres subunidades de la citocromo c oxidasa (COI, II, III) y dos subunidades de la ATP sintetasa.
Figura No. 3 Mapa del ADNmt
Fuente: (http://www.snv.jussieu.fr/vie/documents/adnancient/04adnmt.gif)
Las cadenas complementarias y antiparalelas del ADNmt tienen una distribución asimétrica de guaninas: G y citosinas: C, lo que produce una cadena pesada Heavy H mas rica en bases púricas adenina: A y G, conformada así: 4096 A, 2171 C, 5180 G, 5122 T y un peso molecular de 5168.726 daltons; además de presentar un coeficiente de sedimentación mayor de gradientes alcalinos de cloruro de cesio y una cadena ligera L (Light) con mas pirimidinas C y timina: T; conformada así: 5122 A, 5180 C, 2171 G, 4096 T y un peso molecular de 5060.609 daltons.
La región control (Figura 4) es la responsable de la regulación de la molécula de ADNmt, tiene 1122 pares de bases de longitud, contiene los promotores de la transcripción de ambas cadenas y el origen de replicación de la cadena pesada H, y debido a las estructuras visibles bajo microscopia electrónica durante la replicación también es conocida como asa de desplazamiento o (D-Loop). (Vigilant et al. 1991; Hasegawa et al. 1993;
Isenberg and Moore, 1999; Álvarez, 2001).
Tabla No. 1 Tamaño de las regiones no codificantes del ADNmt REGIONES ADNMT PARES DE BASES Región Control (16024-576) 1122 pb
HVI (16024-16365) 342 pb HVII (73-340) 267 pb
Dentro de la región control se encuentran dos regiones del ADNmt, con un alto grado de polimorfismo en las poblaciones humanas. (Tabla 1) Esas dos regiones son llamadas la región hipervariable 1 (HVI), que tiene aproximadamente unas 342 pares de bases de longitud y abarca desde la posición 16024 hasta la 16365, y la región hipervariable 2 (HVII), con una longitud aproximada de 267 pares de bases y va desde la posición 73 hasta la 340. (Figura 4) (Isenberg and Moore, 1999; Álvarez, 2001).
HVI+HVII Región Control
15971 579
HVI Región Hipervariable 1 0 HVII Región Hipervariable 2
16024 16365 73 340 Figura No. 4 Esquema de la Región Control y Localización de las Regiones Hipervariables HVI y HVII.
Esta región es la más importante en cuanto a su aplicación en el estudio de filiaciones en poblaciones (Merriwether et al. 1991), por ser una región altamente variable y con una longitud que permite ser analizada por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y por análisis de secuenciación. Es una región no codificante situada entre los genes que codifican para el ARN de transferencia prolina y el ARN de transferencia fenilalanina. (Figura 3 y 4).
4.1.2 Herencia Materna
El ADNmt se hereda por vía materna con un patrón vertical no mendeliano. La madre trasmite su genoma mitocondrial a todos sus hijos, pero solamente las hijas lo pasarán a sus descendientes y así sucesivamente (Figura 5).
Figura No. 5 Forma de herencia de la mitocondria materna y su ADN Fuente:
(http://www.snv.jussieu.fr/vie/documents/adnancient/03transmissionmt.gif)
Esto se debe al elevado número de moléculas de ADNmt que existe en los óvulos (entre 100000 y 200000 copias) en comparación con unos pocos cientos que hay en los espermatozoides. Además, las mitocondrias que se encuentran en el cuello y cola del espermatozoide, que puedan entrar en el óvulo fecundado se eliminan por un proceso enzimático activo (Giles et al.
1980; Marchington et al. 1997; Zeviani et al. 2001; Alvarez et al. 2001).
Figura No. 6 Linaje materno del ADNmt Fuente:
(http://www.clc.cl/Area_Academica/Revista_Medica_Enero_2006/foto03.jpg) La secuencia de ADNmt de un individuo, proviene de un genoma haploide por heredarse de forma uniparenteral por vía materna, sin sufrir recombinación con el ADNmt paterno (Figura 6), denominándose así un haplotipo. De tal forma que los hermanos, hijos de la misma madre y todos los individuos relacionados por línea materna tendrán el mismo haplotipo, excepto cuando se presente una mutación; permitiendo así seguir linajes genéticos por línea materna (Lorente, 1997; Alvarez, 2001).
4.1.3 Poliplasmia
El ADNmt es poliploide; (alto numero de copias en cada célula) está presente en grandes cantidades en todas las células, un oocito maduro tiene miles de mitocondrias y más de 100000 copias de ADNmt (Figura 7), mientras que los espermatozoides tienen solo cientos; en una célula somática cada mitocondria contiene entre 2 y 10 moléculas de ADNmt, presentando de 200 a 1700 o mas copias por célula dependiendo del tipo de tejido (Wallace, 1995; Manfredi et al. 1997; Malyarchuk et al. 2004; Alvarez et
Figura No. 7 Representación de la poliplasmia del ADNmt Fuente:
(http://www.mda.org/publications/images/q9-5_Cell%20wmitochondrion.jpg)
4.1.4 Segregación Mitótica
Una línea celular puede variar durante la división celular, debido a que las mitocondrias se distribuyen al azar entre las células hijas, por lo que si en una célula coexisten dos poblaciones de ADNmt, una normal y otra mutada (heteroplásmia), a lo largo de las divisiones se podrán originar tres genotipos diferentes: homoplásmico para el ADN mitocondrial normal. Homoplásmico para el ADN mutado y heteroplásmico. Por tanto, el fenotipo de una célula con Heteroplásmia dependerá del porcentaje de ADN mutado que contenga este tejido (Cann and Wilson, 1983; Brown et al. 1998; Hagelberg, 2003).
4.1.5 Alto Nivel de Mutación
El ADNmt presenta una tasa de mutación de 5 a 10 veces mayor que la del ADN nuclear debida a múltiples factores, que van desde la producción continua de radicales de oxígeno, como consecuencia de la oxidación final de los compuestos carbonados, produciendo radicales libres que pueden dañar a un ADNmt que no está protegido por proteínas histonas, que si envuelven y protegen el ADN nuclear.
El ADN mitocondrial presenta una alta tasa de mutación (Wallace et al. 1999; Ingman et al. 2000; Alvarez, 2001; Foster, 2004) debida a factores tales como:
¾ A diferencia del ADN nuclear, el ADNmt no tiene proteínas protectoras, no posee histonas, que la hace una molécula más sensible a las mutaciones.
¾ En el proceso de replicación del ADNmt, hay baja fidelidad de la polimerasa, presentando mecanismos ineficientes de reparación y baja actividad correctora si se compara con la polimerasa del ADN nuclear.
¾ El ADNmt se encuentra asociado físicamente con el interior de la membrana mitocondrial, donde existe alta concentración de mutágenos (radicales superóxido, peróxido e hidroxilo) resultantes de las funciones metabólicas realizadas por la mitocondria, siendo el ADNmt muy sensible al daño oxidativo de estos radicales libres liberados en la zona.
Estos factores hacen que en el ADNmt se presente una alta tasa de sustitución y evolucione de 5 a 10 veces más rápido que el ADN nuclear
En la actualidad, no se ha definido una tasa de mutación real en el ADNmt; se han estimado según análisis filogenéticos tasas que van de 1,66×10–4 a 2,06×10–6, llegando a 4,04×10–6 (Stoncking, 1994; Vigilant et al.
1991; Horai et al. 1995) o de 0,3% por millón de años (Brown et al. 1979), alcanzando un 8,4% por millón de años en la región Control del ADNmt (Greenberg et al. 1983), mientras que en estudios de tasa de sustitución intergeneracional de la región control del ADNmt se ha encontrado una tasa de 1 en cada 33 generaciones, siendo 20 veces mayor que el obtenido en análisis evolutivos (Parsons et al. 1997), indicando así una rápida segregación en las secuencias de la región control entre generaciones, pudiendo ser homoplásmico con o sin un intermediario heteroplásmico.
La teoría propuesta para explicar la sustitución intergeneracional es el planteamiento de la existencia de un cuello de botella (Vilkki et al. 1990;
Howell, 1992; Poulton, 1995) donde se propone que los genomas mitocondriales se reducen a un número mínimo durante algunos estados de la oogénesis y un subgrupo de la población de ADNmt es trasmitido a través de un cuello de botella, obteniendo una población fundadora que luego se replica en unas 100.000 copias de ADNmt en un óvulo maduro. La población fundadora como una submuestra, puede diferir significativamente en la proporción de variantes desde el conjunto original de ADNmt, produciendo una segregación diferencial entre meiosis (Holland and Parsons, 1999).
La alta tasa de sustitución del ADNmt hace que con relativa frecuencia se encuentren una o más diferencias en la secuencia del ADNmt en la rama materna de una familia e incluso en familiares muy cercanos (Parsons et al.
1997).
Por lo tanto, la variación de secuencias entre individuos de una misma especie es grande, se estima que dos genomas humanos pueden diferir de unos 9,5 a 66 nucleótidos, (Cann and Wilson, 1983; Zeviani et al. 1998) y entre dos individuos caucásicos no relacionados existe un promedio de 8 diferencias en la secuencia de ADNmt, (Alvarez, 2001) y en un mismo individuo se puede generar heterogeneidad a lo largo de la vida en el ADNmt.
Según las características moleculares y genéticas de la mutación en el ADNmt, si ocurre dentro de la región codificante puede producir un grupo de desordenes y síndromes clínicos, por una escala de reordenamiento y por mutaciones puntuales del ADNmt. El reordenamiento incluye deleciones o duplicaciones parciales, siendo ambos tipos de mutaciones heteroplásmicas.
En muchas enfermedades la homoplasmia no se mantiene quizás porque el 100% del ADNmt mutante puede ser letal. (Poulton, 1995)
Las mitocondrias se deterioran con la edad por la acumulación de mutaciones. (Michikawa et al. 1999) Por lo que se ha llegado a proponer que la disminución en la capacidad respiratoria de los tejidos en el envejecimiento sea debida a una acumulación de este daño mitocondrial. (Trifunovic et al.
2004)
4.1.6 Heteroplásmia
Es el estado en el que un individuo formado por billones de células, que contienen miles de copias de ADNmt (que pueden mutar), presenta más de un genotipo de ADNmt. Así mismo, cuando una mutación surge en una de las moléculas de ADNmt, crea una mezcla intracelular de moléculas mutantes y normales (Howell et al. 2000; Wilson et al. 1997; Tully et al.
Esta coexistencia de dos o más tipos de ADNmt puede ocurrir en una sola mitocondria, célula, tejido o individuo. (Lareau et al. 1998; Howell et al.
2000; Álvarez, 2001)
Cuando una célula heteroplásmica se divide, la herencia mitocondrial en las células hijas es una cuestión de azar. Como resultado de esto después de varios ciclos de división celular, la proporción de ADNmt mutante y normal en una célula puede cambiar hacia el mutante puro o hacia el normal puro (homoplásmia) en un proceso conocido como segregación replicativa. Este proceso puede desarrollarse durante la replicación de la célula somática o durante la proliferación de las células germinales femeninas. (Wilson et al. 1997; Calloway et al. 2000; Alvarez, 2001).
Existen diversos estudios acerca de la tasa de heteroplásmia y recientemente se ha encontrado que es un fenómeno frecuente en las células somáticas; mientras en las células germinales se han realizado estudios de heteroplásmia en gemelos encontrando que la heteroplásmia en los oocitos ocurre con una relativa frecuencia, debido a la alta tasa de mutación del ADNmt (Wilson et al. 1997; Tully et al. 2000). La Heteroplásmia puede presentarse en dos formas:
Heteroplásmia de Secuencia
Es cuando en una determinada posición de la secuencia del ADNmt hay más de una base, por ejemplo la existencia de C/T al mismo tiempo.
(Álvarez, 2001).
Heteroplásmia de Longitud
Que se establece como la variación en el número de bases que existen en un fragmento homopolimérico, por ejemplo es muy conocido el número de C´s en el fragmento de poliC en HVII. De esta manera en un mismo individuo pueden coexistir poblaciones de ADNmt las cuales difieren en el número de citosinas dentro de dichos fragmentos (Álvarez, 2001).
En algunas zonas de la región control, existen tractos o zonas de policitosinas, que parecen ser los lugares que con mayor frecuencia presentan las heteroplásmias, como en las posiciones 16189 en la región HVI y de la posición 303 a la 315 de la región HVII donde se forman regiones ininterrumpidas de citosinas, que son replicadas con baja fidelidad por el sistema de la ADN polimerasa mitocondrial (Bendall et al. 1995).
Debido a la gran cantidad de moléculas de ADNmt podemos encontrar la Heteroplásmia a nivel de trazas, pero solo ocasionalmente a niveles detectables que sean significativos para las pruebas de identificación en individuos a todo nivel (Holland and Parsons, 1999).
.
Uno de los ejemplos más conocidos de diferencia en la secuencia de ADNmt intergeneracional es el estudio de los restos del Zar Nicolás II, (Gill et al. 1994; Ivanov et al. 1996) se encontró que las secuencias de ADNmt analizadas de los restos del presunto Zar inicialmente comparadas con familiares vivos por línea materna no coincidían en la posición 16169 donde se observaba una mezcla de C y T, (heteroplásmia) en la muestra del Zar, esté hallazgo hizo necesario el análisis de las secuencias de Georgij
Las variaciones de secuencia existentes entre diferentes individuos han resultado muy útiles para estudios en poblaciones, antropológicos, etnológicos y forenses; siendo la base de la hipótesis de que el hombre desciende de una mujer que vivió en África hace unos 250000 años conocida como la Eva mitocondrial. (Cann et al. 1987; Ayala, 1995)
4.2 Secuenciación del ADN Mitocondrial
La primera secuencia completa de ADNmt se realizó en Inglaterra en 1981, y se conoce como Cambridge Reference Sequence (CRS) o secuencia de Anderson, que se publico en Abril de 1981 en Nature, por la cual las variaciones de secuenciación de ADNmt se dan con referencia a esta secuencia (Anderson et al. 1981).
Figura No. 8 Imagen del proceso de secuenciación de ADNmt Fuente:
(CD-ROM Operator Training V1.0 ABI PRISM ® 310 Genetic Analyzer AB ©) La mayoría de la secuencia se obtuvo a partir de mujeres caucásicas, sin embargo en algunos fragmentos se uso ADNmt bovino y de las células HeLa (Herrnstadt et al. 2002; Holland and Parsons, 1999; Jin et al. 2006).
En 1999 se realizó una resecuenciación de la CRS, donde se encontraron 11 errores, incluyendo 1 de la secuencia HeLa y 2 de la secuencia bovina y también 7 polimorfismos privados, de los cuales dos se encuentran en la región HVII: en la posición 263A se encontró 263G y en la posición 311-315CCCCC se encontró 311-315CCCCCC (Andrews et al.
1999).
La secuenciación es una de las formas mas utilizada de estudio para el ADNmt (Figura 8), que hace posible el abordaje de especímenes antiguos que presentan avanzado estado de degradación y permite obtener información para el análisis de filiación en poblaciones, en este caso prehispánicas, determinando así el orden exacto de las pares de bases en un segmento de ADNmt en las regiones hipervariables HVI y II, que presentan una tasa de mutación mayor que en el resto del ADNmt. La mayor parte de los estudios se refieren a la región HVI, que de acuerdo a la secuencia de Anderson, comprende las bases entre las posiciones 16051 a 16365.
Adicionalmente, se ha establecido que determinadas mutaciones o polimorfismos encontrados en estas regiones del ADNmt se relacionan a los haplogrupos descritos por RFLPs (Torroni et al. 1993a y 1993b).
La secuenciación es el método de elección cuando queremos poner de manifiesto que tipo de mutación está presente en el ADNmt que se está analizando (Budowle et al. 1999; AB ©, 2000). En los últimos años, la posibilidad de estudiar restos de poblaciones extintas se ha ampliado considerablemente, incluyendo restos de gran antigüedad como es el caso del material genético de Neandertales (30.000 a 90.000 años antes del presente) (Krings et al. 1997; Ovchinikov et al. 2001).
4.3 Haplogrupos
El hecho de que no se produzca recombinación en el ADNmt permite el seguimiento de los haplogrupos, refiriéndose a genes que están muy cercanos y pasan en bloque a sus descendientes sin que haya recombinación entre genes paternos y maternos.
En el caso del ADNmt, todos los genes y regiones entre éstos, como la Región Control, pasan también en bloque, por lo que cuando aparece una mutación, todos los descendientes de esa misma línea materna la tendrán.
La variabilidad se producirá por acumulación de mutaciones, así a la mutación inicial se agregarán otras. Sin embargo, al ser escasas las mutaciones en la región codificante del ADNmt, se ha determinado que todas las poblaciones que existen en el mundo actualmente se representan en aproximadamente 15 haplogrupos distintos (Figura 9), siendo el resto, variaciones dentro de esos haplogrupos, lo cual puede ser denominado, a nivel individual como haplotipo.
Entonces un haplogrupo del ADNmt, esta formado por los polimorfismos (los polimorfismos son las diferentes secuencias genéticas posibles que puede tener un loci determinado) que aparecieron hace miles de años atrás.
Los haplotipos son los subgrupos de los haplogrupos, y los polimorfismos que los establecen son mucho mas recientes. La mayoría de los polimorfismos que determinan a los haplogrupos son específicos de continente. Un haplogrupo esta codificado con una letra (Ej.; U) mientras que su haplotipo esta codificado con un numero (Ej.; U6).
Figura No. 9 Migraciones de los haplogrupos de ADNmt en el Mundo Fuente:
(http://img.search.com/thumb/3/37/Map-of-human-migrations.jpg/340px-Map- of-human-migrations.jpg)
A cada mutación en la región codificante, que determina el haplogrupo, usando el análisis de enzimas de restricción según Anderson y colaboradores en 1981, le corresponden otras mutaciones en las regiones hipervariables HVI y HVII determinadas con secuenciación del ADNmt. Dado que la zona hipervariable o Región Control, muta con mayor velocidad, pueden existir casos de mutaciones reversas (es decir, en forma opuesta a la primera mutación), por lo cual no siempre se encuentra el total de las mutaciones asociadas al haplogrupo en esta región.
El método de RFLPs (un RFLP es un polimorfismo de fragmentos largos de restricción que esta formado por frecuencias de corte encontradas en una cadena de ADN por las enzimas de restricción), la técnica consiste en amplificar por PCR una pequeña región del ADNmt y digerirla con una enzima de restricción específica que corta al reconocer una determinada secuencia de bases; luego, se analiza si existe o no la mutación por pérdida, observando un fragmento único o por ganancia, obteniendo dos fragmentos de un sitio de restricción o corte reconocido por la enzima. En el haplogrupo B, la técnica se aplica sin necesidad de digerir con enzimas, ya que este se determina por la pérdida de un segmento de 9 pares de bases por lo cual se observa directamente el largo de los fragmentos.
Esta técnica fue utilizada para identificar las mutaciones que llevaron a definir posteriormente los principales haplogrupos fundadores de los indígenas americanos, denominados A, B, C, y D (Tabla 3) (Cann, 1994, Monsalve et al. 1996; Lalueza, 1996; Moraga, 2000). Actualmente, se discute la cantidad de haplogrupos fundadores, pero se acepta que al menos el 90%
y en América del Sur, el 100% de los indígenas actuales pertenece a uno de los cuatro haplogrupos. (Torroni et al. 1992).
Los estudios que analizan el ADNmt por variación de sitios de restricción han revelado que la gran mayoría de los ADNmt europeos, asiáticos, africanos y americanos están definidos por uno o más linajes específicos de cada continente, demostrando que existe una correlación entre la variación del ADNmt con el origen étnico y geográfico de un individuo (Starikovskaya et al. 1998; Keyeux et al. 2002; www.genemory.edu).
El análisis del ADNmt se ha convertido en una herramienta muy importante para el estudio de la estructura y la historia de las poblaciones humanas (Stone and Stoneking, 1993, 1998 y 1999).
La mayoría de los análisis filogenéticos del ADNmt se han basado en la variación de secuencias en el primer segmento hipervariable de la región control (HVI) que presenta más variación en el ADNmt.
Los polimorfismos del ADNmt son actualmente una de las mejores herramientas genéticas para rastrear geográficamente poblaciones y valorar la evolución temporal dentro de los haplogrupos del ADNmt.
Muchos haplotipos dentro de un haplogrupo pueden tener un número de nucleótidos diferentes de la secuencia fundadora, con más mutaciones acumuladas a través del tiempo o algunas veces se pueden reducir.
Teniendo en cuenta que no todos los nucleótidos en el genoma mitocondrial mutan con la misma frecuencia, siendo algunas mutaciones más frecuentes que otras.
Se han realizado estudios sobre la mutabilidad de cada nucleótido dentro de la región hipervariable, (Wakeley, 1993; Hasegawa et al. 1993;
Meyer et al. 1999) mostrando resultados que pueden ayudar a hipotetizar los probables orígenes de la mutación y/o Haplotipo; además en muchos haplotipos dentro de un haplogrupo pueden verse con mayor frecuencia algunas mutaciones, (Tabla 2) las cuales pueden o no almacenar información de los orígenes geográficos o del tiempo en que ocurrió el cambio en la secuencia de ADNmt.
Tabla No. 2 Tipo de Variabilidad que presentan algunos Polimorfismos de secuenciación del ADNmt. (Wakeley, 1993; Meyer et al. 1999)
Las mutaciones consideradas como típicas de un haplogrupo determinado, se presentan en la mayoría de los individuos de ese haplogrupo. Esto es, aquellos individuos con haplogrupo A, tendrán las mutaciones en las posiciones 16111 (en Subhaplogrupo o Haplotipo A2), 16223. 16290, etc., mientras que los que tienen haplogrupo C tendrán aquéllas en 16223, 16298, 16325, y 16327 (Tabla 4). Sin embargo, hay otras mutaciones, raras, que se agregan a las típicas del haplogrupo y que se han observado en uno o pocos individuos, definiendo haplotipos particulares.
En todos los casos se trata de transiciones, que son las mutaciones más frecuentes. Se indica la posición basados en la secuencia de Anderson o CRS y la base que resulta luego de la transición: A: adenina, C: citosina, G:
guanina, T: timina (Anderson et al. 1981).
Moderada Variabilidad Mediana Variabilidad Alta Variabilidad
16093 16163 16051
16111 16172 16126
16148 16187 16129
16166 16230 16189
16183 16293 16223
16219 16309 16278
16256 16294
16261 16311
16274 16362
16292 16319 16320 16343 16355
4.3.1 Haplogrupos del ADN Mitocondrial
Figura No. 10 Haplogrupos de ADNmt
Fuente: (http://www.worldfamilies.net/migration_map_wfn.gif)
Los primeros humanos vivieron hace aproximadamente 150.000 años en África. Poco después, una primera expansión de humanos modernos pobló África y dejo su marca genética en el ADNmt con el haplogrupo L1, encontrado particularmente en los pueblos khoisanidos de la actualidad. Esta expansión aparentemente no abandono el continente africano, debido probablemente al clima de la edad del Hielo y a la presencia del hombre de Neandertal en Eurasia. Decenas de miles de años después, una expansión africana oriental de 60-80.000 años atrás, repobló África creando los haplotipos L2 y L3, que finalmente llevo a la migración fuera de África de al menos un haplotipo de ADNmt, especialmente el subtipo L3. (Figura 9 y 10)
Haplogrupos Africanos del ADN Mitocondrial
L1 representa el 29% de todo el ADNmt africano, mientras que L2 agrupa el 34%. El 37% restante pertenece al haplogrupo L3, un grupo heterogéneo de 4 linajes. Uno de esos linajes, definido por la perdida del sitio Ddel en la posicion 10394, representa solo un porcentaje muy pequeño del ADNmt africano, pero parece ser el progenitor de alrededor de la mitad de todo el ADNmt europeo, asiático, y amerindio. (Figura 9 y 10)
Haplogrupos Europeos del ADN Mitocondrial
El ADNmt europeo y Caucasoide puede ser subdividido en dos grupos de acuerdo a la presencia (25%) o ausencia (75%) del sitio Ddel en la posición 10394. Alrededor del 99% del ADNmt puede ser clasificado en 9 haplogrupos del ADNmt (Figura 9 y 10), llamados H, I, J, K, T, U, V, W y X (Torroni et al. 1996), y estos pueden ser agrupados dentro de cuatro grupos de haplogrupos del ADNmt: HV, UK, TJ y WIX (Richards et al. 1998)
Haplogrupos Asiáticos del ADN Mitocondrial
En Asia, el 77% de todo el ADNmt se agrupa dentro del superhaplogrupo M, definido por una ganancia en el sitio Ddel en la base 10394 y en una ganancia en el sitio Alul en la base 10397 (Ballinger et. al.
1992; Torroni et al. 1993a y 1993b; Wallace, 1995; Kong et al. 2003). El haplogrupo M esta subdividido en pequeños subhaplogrupos llamados C, D, G y E. La mayoría del ADNmt asiático restante con un 23% esta agrupado en los haplogrupos A, B y F (Torroni et al. 1994). (Figura 9 y 10)
Haplogrupos Americanos del ADN Mitocondrial
El Haplogrupo A fue el primero en ser identificado con RFLPs, en el ADNmt de indígenas americanos (Wallace et al. 1985). En 1990 se analizaron secuencias de tres grupos indígenas amerindios: en sur América los ticuna, en centro América los mayas (Gonzalez-Oliver et al. 2001) y en Norte América los pima, identificando cuatro ADNmt fundadores en cada población (Shurr et al. 1990; Horai et al. 1993; Lorenz and Smith, 1996;
Bandelt et al. 2003)
A los cuatro tipos de ADNmt encontrados en América, se les llamo haplogrupos A, B, C, y D (Figura 9, 10 y 11) en el estudio publicado en 1992 (Torroni et al. 1992). Donde se estudiaron 167 indígenas americanos, incluyendo 87 amerindios y 80 na-dené que se agruparon en los cuatro haplogrupos por RFLPs.
Además, evidencias arqueológicas sugieren que los individuos fundadores de la actual población americana, migraron a norte América desde siberia y el oriente de rusia (Torroni et al. 1993a y 1993b). Por lo tanto a partir de estas poblaciones se obtienen los haplogrupos A, C, y D encontrados en América, (donde A representa el 15,3% del total) encontrando que el haplogrupo A de siberia contiene las mutaciones características 16290C y 16319A. (Bailliet et al. 1994)
Esencialmente todo el ADNmt amerindio cae dentro de los haplogrupos A, B, C y D (Torroni and Wallace, 1995). El haplogrupo X tiene una baja frecuencia cercana al 3% siendo característico de las poblaciones del norte de América y al parecer proveniente de la zona norte de Europa. (Brown et
Tabla No. 3 Mutaciones características de los haplogrupos fundadores amerindios del ADNmt (HVI) por RFLPs (Torroni et al. 1993b; Brown et al.1998)
Tabla No. 4 Haplogrupos fundadores amerindios y mutaciones asociadas en la región hipervariable HVI (Torroni et al. 1993a; Forster et al. 1996). Las posiciones corresponden a la secuencia de referencia de Anderson (Anderson et al. 1981).
Haplogrupos Mutación Enzima A 663 (ganancia) Hae III
B Deleción 9 pb NA
C 13259 (pérdida) Hinc II D 5176 (pérdida) Alu I X 1715 (pérdida) Dde I
Haplogrupo Mutación/Posición 16111T 16223T 16290T 16319A 16362C A
16519C 16189C
B 16217C
16223T 16298C 16325C
C 16327T
16223T 16325T D
16362C
Figura No. 11 Distribución de los tres grupos lingüísticos Americanos y sus
4.4 ADN Antiguo
Figura No. 12 Fuentes de ADN antiguo Fuente:
(http://www.ucm.es/info/genforen/queesadnantiguo_archivos/fuenteadn.jpg) La sofisticación y evolución de las técnicas de biología molecular ha hecho posible el análisis del material genético a partir de restos antiguos, disciplina conocida como análisis del ADN antiguo. Donde la posibilidad de estudiar poblaciones antiguas mediante estas técnicas abre nuevas posibilidades al conocimiento de los orígenes de las poblaciones actuales.
Ya sea nuclear o mitocondrial se conoce como ADN antiguo, a el ADN obtenido de los restos de organismos muertos, o de restos humanos del período histórico (últimos 30.000 años), así como también del período prehistórico (hace unos 40.000 años). (Poinar y Poinar, 1995)
Otros autores lo han caracterizado como aquel que ha sufrido procesos autolíticos o cualquier clase de fijación en material inerte. (Monsalve, 1996;
Kolman and Tuross, 2000)
El estudio del ADN antiguo, nos ayuda a obtener información sobre las interrelaciones de los grupos estudiados, como de los fenómenos dinámicos del aporte genético femenino entre las poblaciones con una perspectiva cronológica de la información obtenida. Permitiendo la comprensión de determinadas transformaciones en aquellas sociedades sobre las que no existe un registro escrito o de las cuales las evidencias presentes son muy pocas y confusas.
Al investigar esto podremos determinar si una población mortuoria exhibe características demográficas y fisiológicas, reflejo de aquellas que presentaban las poblaciones vivas en su momento (O’Shea, 1984).
Indiscutiblemente la ventaja que presenta el ADN antiguo, es la de investigar directamente los especímenes del pasado (Figura 12); sin embargo estos suelen ser casos aislados pertenecientes a diversas cronologías más que a verdaderas poblaciones biológicas. No obstante, y pese a sus limitaciones, el ADN antiguo ha demostrado ser una herramienta útil en la reconstrucción de árboles filogenéticos, en los casos en los que los análisis a partir de poblaciones actuales requieren confirmación, o se hace relación con la población antigua de la zona y cuando se trata de grupos ya extinguidos. Al mismo tiempo, presenta numerosas dificultades técnicas debido a la degradación del material genético de los especímenes, que lo convierte en un campo de estudio tecnológicamente difícil y complejo.
El ADN antiguo es actualmente uno de los mejores rastros preservados del pasado biológico humano, aunque degradado, y pese a los múltiples factores que influyen en su destrucción, algunas veces es posible obtener ADN a partir de restos fósiles, inclusive de rastros dejados en artefactos relacionados directamente con el individuo o especímenes de museo. (Poinar y Poinar, 1995; Vigilant et al. 1991; Thorton, 1989; Wallace and Torroni, 1992; Cattaneo et al. 1995; Herrmann and Hummel, 1994; Martinez-Jarreta et al. 1995)
El primer estudio de ADN antiguo fue el que recuperó, en 1984, un fragmento de ADN de un ejemplar naturalizado de quagga, una especie de cebra sudafricana extinguida a finales del siglo XIX. Posteriormente, se ha ido recuperando ADN de otras especies desaparecidas en los últimos centenares o miles de años, como los mamuts, los osos de las cavernas, los tigres con dientes de sable o los moas. En el campo de la evolución humana, la aportación más espectacular fue la primera recuperación, en 1997, de ADN de una especie humana extinguida, los neandertales, que demostró que éstos no pudieron ser los antepasados directos del hombre moderno.
El hecho de que en algunos casos seamos capaces de recuperar material genético de hace unos miles o cientos de años de antigüedad, no debe engañarnos sobre la estabilidad química del ADN. En realidad, se trata de una molécula frágil sometida a reacciones químicas que la degradan muy rápidamente. A la muerte de un individuo, las enzimas contenidas en diversos compartimentos celulares se liberan y atacan al propio material genético; las enzimas de microorganismos que intervienen en la descomposición también actúan sobre la molécula.
Finalmente, los factores climáticos externos como el calor, el pH y la humedad acaban determinando, en la mayoría de los casos, la total destrucción del material genético. Aunque los restos orgánicos llegan a desaparecer en muestras de una cierta antigüedad, fragmentos de cadenas de ADN quedan unidos a la matriz de hidroxiapatita del esmalte dentario y del tejido óseo, pudiendo ser liberadas y concentradas posteriormente mediante una extracción específica en el laboratorio.
4.4.1 Tipo de Muestras Antiguas
Las muestras que mejor resisten los fenómenos de destrucción cadavérica y por tanto las que mantienen su estructura celular más intacta son por un lado los restos óseos y por otro las piezas dentales, fundamentalmente debido a su estructura histológica que proporciona un aislamiento a sus componentes celulares mayor que en los tejidos blandos (Lindahi, 1993; Merriwether et al. 1994).
En el caso del tejido óseo, éste se compone fundamentalmente de una matriz orgánica calcificada impregnada de sales minerales, con una alta concentración de fibras de colágeno que representa aproximadamente un 95% del peso de la matriz orgánica del hueso. En cuanto a las sales minerales, éstas se encuentran en forma de fosfato cálcico y de cristales de hidroxiapatita. Esta matriz está recorrida por un sistema de cavidades (osteoplastos) que comunican entre sí y que encierran las células óseas (osteocitos) y por los canalículos óseos, una característica interesante es que en los espacios extracelulares apenas hay líquido intersticial con lo que la cantidad de agua en el tejido óseo es muy baja. Las células que componen el tejido óseo son los osteoblastos, que al rodearse de la matriz y madurar se
Todos estos factores explicarían también la razón por la cual la recuperación de ADN es mayor a partir de dientes y diáfisis de huesos largos (tejido óseo compacto) que a partir de tejido óseo esponjoso, donde la protección del ADN seria mucho menor.
Esquelitización de los restos óseos
Figura No. 13 Resto óseo en proceso
Fuente: (www.szbk.u-szeged,dnabonesprocesament/2006_jpg05)
Es el estado en el cual se encuentran la mayoría de los especímenes prehistóricos, donde han desaparecido los tejidos blandos en su totalidad y solo se conservan los exoesqueletos, endoesqueletos y apéndices queratinosos como: uñas y pelos. En determinado tiempo, dependiendo de la estructura y composición del endoesqueleto, no se pierden sus componentes orgánicos debido a que en este tejido existe menor contenido de agua que en otros tejidos y en estructuras duras de tejidos como el óseo y dental, se pueden encontrar muestras potenciales de análisis por ADN (Martinez et al.
1992), especialmente de tipo mitocondrial que por sus características se conserva mas en estos tejidos, aunque presenten un avanzado estado de degradación innato, por la descompensación enzimática en condiciones normales de enterramiento.
Sin embargo, el paso del tiempo y proceso de degradación dinámico y progresivo sobre el resto óseo, produce una pérdida continua de su material orgánico y mineral tanto cuantitativo como cualitativo, provocando que en este se presenten estados de fragilidad altos y déficit de material para análisis genéticos.
Dentro de la cascada de procesos de degradación normal del resto óseo (Figura 13), uno de los más activos es la humedad, que es un factor de ayuda a la aparición y crecimiento de organismos y microorganismos como algas, mohos, hongos y bacterias, que hacen de este su alimento, alterando la consistencia, aspecto y color del resto óseo. También se encuentran alteraciones debidas a la flora acompañante del sitio de enterramiento, la acción de las plantas producen grandes fracturas cuando toman el resto como parte de su alimento en la tierra que al momento de desenterrarlos y evaluarlos se deben diferenciar de fracturas propias del espécimen ante mortem.
La permanecía de los restos enterrados con alta humedad terminarán por destruir el espécimen o estos se impregnarán de pigmentos vegetales, compuestos minerales y moléculas del medio que los rodea (posibles inhibidores de la PCR), a diferencia de los que quedan expuestos al aire y al sol, donde ocurren procesos diferentes como blanqueamiento y el endurecimiento del resto óseo mientras se descompone. Por lo tanto la dirección del tipo de degradación que afectara al resto óseo, dependerá de las condiciones en que ha permanecido el espécimen, como los elementos del terreno o el ambiente que los rodee.
La mayoría de las características encontradas en los restos óseos que