en Biología Molecular (4 julio 2013)
EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN
CON ÁCIDOS GRASOS SOBRE EL PESO Y LA MICROBIOTA INTESTINAL DE
RATONES OBESOS
Jorge R. Mujico
1, Gyselle C. Baccan
2, Alina Gheorghe
1, Ligia E. Díaz
1& Ascensión Marcos
11
Grupo de Inmunonutrición
(http://www.inmunonutricion-csic.com) Departamento de Metabolismo y Nutrición
Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN-CSIC)
Madrid, Spain
2
Instituto de Ciencias de la
Salud
Universidad Federal de Bahía
Salvador, Brasil
• Prevalencia mundial del sobrepeso y la obesidad
• Obesidad: trastornos metabólicos y
cardiovasculares, tales como diabetes tipo 2, aterosclerosis, hipertensión e infartos
• Nuevas sustancias que podrían ser utilizadas para controlar el peso corporal y mejorar la salud de los pacientes obesos
Introducción
• Estudios en modelos experimentales y humanos:
• La composición de la microbiota intestinal de las personas obesas es diferente respecto de las delgadas
• Los cambios en la dieta o la pérdida de peso pueden conducir a alteraciones de la microbiota intestinal (Ley et al., 2006; Santacruz et al., 2009; Delzenne et al., 2011; Jumpertz et al., 2011)
• La microbiota intestinal desempeña un papel importante en la regulación del almacenamiento y metabolismo de las grasas (Bäckhed et al., 2004; Cani and Delzenne, 2009)
Introducción
La composición de la microbiota puede dar lugar a una respuesta inmune saludable o predisponer a la enfermedad:
Alteraciones en el desarrollo normal de la microbiota podrían
afectar al desarrollo inmunológico y potencialmente predisponer a los individuos a desarrollar diversas enfermedades inflamatorias
Introducción
Introducción
El consumo de una dieta alta en
grasas (DAG) está asociado a una inflamación crónica y sistémica "de bajo grado", que puede alterar la
composición de la microbiota
intestinal y ésta, a su vez, afectar al proceso de desarrollo de la obesidad
Hipótesis de partida
El objetivo del presente estudio ha sido investigar la capacidad de ciertos ácidos grasos para modular tanto el peso corporal como la microbiota intestinal en un modelo in vivo de obesidad inducida por DAG
Objectivo
S1: Compuesto derivado del ácido oleico (1.500 mg/kg/día)
S2: Combinación de ácidos grasos omega-3
(ácidos eicosapentaenoico y docosahexaenoico,
3.000 mg/kg/día)
Ochenta ratonas hembra ICR (CD-1 ® ) de 8 semanas de edad fueron alimentadas con:
• Dieta Control (DC, )
• DAG no suplementada (DAG, )
• DAG suplementada con S1 (DAG-S1, )
• DAG suplementada con S2 (DAG-S2, )
Tres jaulas por cada grupo experimental (jaula A, n 8; jaulas B y C, n 6)
Materiales & Métodos
Composición de las dietas
Dieta Control (DC)
% (p/p)
Carbohidratos Proteínas Grasa Saturada Grasa Mono-insaturada Grasa Poli-insaturada Fibra Soluble Fibra Insoluble
50
Dieta Alta en Grasas (DAG)
50
Análisis de la microbiota fecal
Los DNAs fueron extraídos de las muestras de heces (jaulas B y C) utilizando las
QIAamp ® DNA Stool Mini Kit (Qiagen)
Las concentraciones fueron determinadas mediante fluorimetría (Fluorescent DNA Quantification Kit, Bio-Rad)
La cuantificación de los distintos grupos de bacterias se realizó mediante PCR
cuantitativa y SYBR Green I (Agilent)
Cebadores o primers
Para la PCR cuantitativa en tiempo-real se utilizaron los siguientes primers* (específicos de distintos grupos de bacterias):
Ensayo PCR Secuencia (5'–3') Tamaño
amplicón (pb) Reference Bacterias totales
F: 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'R: 5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'
200 Fierer 2005 Filo Firmicutes
F: 5'-GGAGYATGTGGTTTAATTCGAAGCA-3'R: 5'-AGCTGACGACAACCATGCAC-3'
126 Guo 2008 Cluster Clostridial XIVa
F: 5'-GCGGTRCGGCAAGTCTGA-3'R: 5'-CCTCCGACACTCTAGTMCGAC-3'
81 Ramírez- Farias 2009 Grupo Lactobacillus
F: 5'-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3'R: 5'-CACCGCTACACATGGAG-3'
341 Rinttila 2004 Orden Enterobacteriales
F: 5'-ATGGCTGTCGTCAGCTCGT-3'R: 5'-CCTACTTCTTTTGCAACCCACTC-3'
177 Castillo 2006 Filo Bacteroidetes
F: 5'-GGARCATGTGGTTTAATTCGATGAT-3'R: 5'-AGCTGACGACAACCATGCAG-3'
126 Guo 2008 Bifidobacterium spp.
F: 5'-TCGCGTCYGGTGTGAAAG-3'R: 5'-RCCACATCCAGCRTCCAC-3'
243 Rinttila 2004
*Estos primers fueron comercialmente sintetizados por Isogen
La DAG indujo un aumento del
peso corporal, que disminuyó tras suplementar la dieta con S1
Resultados & Discusión (I)
0 60
7
0 Semanas
Peso Corporal (g)
DAG-S1 DC
DAG / DAG-S2
DC DAG DAG-S1 DAG-S2 0
3500
* * * *
Área Baj o Curv a
Resultados & Discusión (I)
DC DAG DAG-S1 DAG-S2
0 2 4 6
** *
**
P e s o Gra s a V is c e ra l (g)
Resultados & Discusión (II)
Ensayo PCR Pendiente Eficiencia PCR (%)
Coeficiente correlación
Bacterias totales -3,288 101,4 0,999 Filo Firmicutes -3,382 97,6 0,999 Cluster Clostridial XIVa -3,439 95,3 0,999 Grupo Lactobacillus -3,709 86,0 0,999 Orden Enterobacteriales -3,379 97,7 0,990 Filo Bacteroidetes -3,401 96,9 0,999 Bifidobacterium spp. -3,613 90,2 0,997
• Las curvas estándar tuvieron coeficientes de correlación entre 0,990-0,999
• Usando la fórmula E = [10
(-1/pendiente)- 1], las eficiencias para cada ensayo individual
estuvieron entre 86,0-101,4%
Resultados & Discusión (II)
Filo Firmicutes
DC DAG DAG-S1 DAG-S2 100
0
Unidades Relativas
Grupo Lactobacillus
DC DAG DAG-S1 DAG-S2 100
0
Unidades Relativas
Cluster Clostridial XIVa
DC DAG DAG-S1 DAG-S2 100
0
Unidades Relativas
Orden Enterobacteriales
DC DAG DAG-S1 DAG-S2
* *
100
0
Unidades Relativas
*
El análisis de
correlaciones (Test de Spearman) reveló que el peso corporal
correlacionaba
positivamente con el Filo Firmicutes
(P=0,0154) y el Cluster Clostridial XIVa
Resultados & Discusión (II)
Filo Firmicutes
0 80
0 Unidades Relativas 100
Peso Corporal (g)
Cluster Clostridial XIVa
0 80
0 Unidades Relativas 100
Peso Corporal (g)
La suplementación con S1 restauró la proporción de bacterias que habían disminuido con la DAG (por ejemplo, Bifidobacterium spp.)
Resultados & Discusión (III)
Bifidobacterium spp.
DC DAG DAG-S1 DAG-S2 100
0
Unidades Relativas
Filo Bacteroidetes
DC DAG DAG-S1 DAG-S2 100
0
Unidades Relativas
La suplementación con S1 restauró la proporción de bacterias que habían disminuido con la DAG (por ejemplo, Bifidobacterium spp.)
El análisis de correlaciones (Test de Spearman) reveló que el peso corporal correlacionaba negativamente con el Filo Bacteroidetes (P=0,0279)
Resultados & Discusión (III)
Bacteroidetes Phylum
0 80
0 Unidades Relativas 100
Peso Corporal (g)
