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(1)

ESTIMACION DE LA FRECUENCIA DE LAS HEMOGLOBINOPATIAS PRESENTES EN NIÑOS DE UNO A DIEZ AÑOS DE EDAD DE AMBOS

SEXOS QUE CONSULTAN A LOS HOSPITALES: PEDIATRICO Y GENERAL DE BARRANQUILLA.

Jaime de Jesús Ayala Oviedo. M. D.

TRABAJO DE TESIS

Presentado como requisito parcial para optar al título de Maestría en Biología

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

PROGRAMA DE POSGRADO MAESTRIA EN BIOLOGIA ENFASIS EN BIOQUÍMICA

BOGOTÁ, D. C., COLOMBIA

Noviembre de 2002

(2)

ESTIMACION DE LA FRECUENCIA DE LAS HEMOGLOBINOPATIAS PRESENTES EN NIÑOS DE UNO A DIEZ AÑOS DE EDAD DE AMBOS

SEXOS QUE CONSULTAN A LOS HOSPITALES: PEDIATRICO Y GENERAL DE BARRANQUILLA.

JAIME DE JESÚS AYALA OVIEDO. M. D.

APROBADO

______________________________

Carlos Corredor Pereira, Ph. D Director

___________________________ ______________________

Dra. Harlem Povea, M. D. M. Sc. Dr. Leonardo Lareo, M. Sc.

________________________

Dr. Luis Fajardo, M. D. M. Sc.

_______________________ __________________________

Dra. Angela Umaña, M. Phil Dr. Luis Alejandro Barrera, Ph. D.

Decana Académica Director

Facultad de Ciencias Programa de Posgrado

(3)

A Sandra Cristina, Jaime Andrés, Gabriel José y a mis Padres, por ser fuentes inagotables de estímulos.

(4)

AGRADECIMIENTOS

El autor expresa sus agradecimientos a:

Al Dr. Carlos corredor, director del trabajo de investigación por su confianza, apoyo y por enseñarme su amplia visión de la Bioquímica.

A Maria del Pilar Bernal, Codirectora, por entregarme toda su experiencia sin ninguna contraprestación.

A Clara Lopez de Mesa, por su invaluable colaboración en el estudio estadístico de los resultados.

Al grupo de Genética del Instituto de Salud de Colombia, por su apoyo, invaluable compañía y amistad.

A los Pacientes, con su concurso y colaboración fue posible este trabajo.

A la UNIVERSIDAD DEL NORTE DE BARRANQUILLA, Por su soporte económico Y confianza que depositaron en mí.

Al INSTITUO NACIONAL DE SALUD, Por su apoyo en materiales y soporte ideológico para el desarrollo de la investigación

(5)

NOTA DE ADVERTENCIA

Reglamento de la Pontificia Universidad Javeriana. Artículo 23 de la Resolución N.13 de julio de 1946: “La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por los alumnos en sus trabajos de tesis.”

(6)

CONTENIDO

PAGINA

RESUMEN

INTRODUCCIÓN 15

1. MARCO TEORICO 22

1.1 GENETICA 22

1.2 ONTOGENESIS DE LAS HEMOGLOBINAS EN EL HOMBRE 23

1.3 ALTERACIONES DE LA HEMOGLOBINA 25

1.4 PROPIEDADES DE LA HEMOGLOBINA 26

1.5 DETECCIONES DE VARIANTES DE HEMOGLOBINA 27 1.6 EFECTO DE LAS ALTERACIONES DE LA HEMOGLOBINA 29 1.7 CLASIFICACION CLINICA DE LAS HEMOGLOBINOPATIAS 31 1.7.1 Síndromes falciformes o drepanocíticos 32

1.7.1.1 Hemoglobina S 32

1.7.1.2 Cambios en el glóbulo rojo con hemoglobina S 34 1.7.1.3 Presencia de hemoglobina fetal en la vida adulta 36

1.7.1.4 Hemoglobina A2 37

1.7.1.5 Hemoglobina C 38

(7)

pg

1.7.1.6 Hemoglobina D 38

1.7.2 Hemoglobinas inestables 39

1.7.3 Hemoglobinas con anormalidad en la afinidad por el oxígeno 39

1.7.3.1 Alta afinidad por el oxígeno 39

1.7.3.2 Baja afinidad por el oxígeno 40

1.7.4 Hemoglobina M. Cianosis Familiar 41

1.7.5 Síndromes talasémicos 43

1.7.5.1 α – talasemias 44

1.7.5.2 β - talasemias 45

1.8 Estudios realizados en los países caribeños 47

1.9 Estudios realizados en Colombia 51

2. OBJETIVOS 53

3. MATERIALES Y METODOS 54

3.1 Selección de la muestra poblacional 54

3.2 Individuos a analizar 55

3.3 Calculo de la muestra 55

3.4 Métodos 55

3.4.1 Extracción y manejo de la muestra 55 3.4.2 Hematocrito e índices eritrocitários 56

pg

(8)

3.4.3 Inducción de drepanocitos o falciformía 57

3.4.4 Prueba de estabilidad al isopropanol 58

3.4.5 Preparación del bemolizado 59

3.4.6 Electroforesis en acetato de celulosa 59 3.4.7 Cuantificación de hemoglobina A2 61

3.4.8 Isoelectroenfoque en gel de agarosa 63

3.5 Reactivos 64

3.5.1 Metabisulfito de sodio al 2% 64

3.5.2 Solución salina isotónica 64

3.5.3 Buffer TEB pH 8,6 65

3.5.4 Ponceau S 65

3.5.5 Acido acético al 5% 65

3.5. 6 Ciclohexanona 66

3.5.7 Buffer de isopropanol 66

3.5.8 Buffer Tris pH 7,4 66

3.5.9 Gel de agarosa al 1% 2 mm. 66

3.5.10 Solución para electrodos 67

3.5.11. Solución fijadora 67

3.5.12 Solución colorante o-toluidina 67

pg

(9)

3.6 Métodos estadísticos 68

4. RESULTADOS 70

4.1 Edad y sexo 70

4.2 Distribución de grupos sanguíneos 71

4.3 Electroforesis en acetato de celulosa e isoelectroenfoque en azarosa 73 4.4 Cuadro hemático e índices eritrocitarios 75

4.5 Comparación de los valores percentilares de los índices eritrocitarios del grupo de niños sin variante hemoglobínica (Normales) y los niños con variantes

( Anormales) 77

4.6 Falciformía y estabilidad al isopropanol 78 4.7 Comparación de falciformía y estabilidad con hemoglobinopatías 79

4.8 Antecedentes clínicos 80

4.9 Comparación de antecedentes clínicos con hemoglobinopatías 81 4.10 Comparación entre el motivo de consulta con hemoglobinopatías 82

4.11 Estudio familiar 83

5. DISCUSIÓN 85

6. CONCLUSIONES 99

7. RECOMENDACIONES 100

8. BIBLIOGRAFÍA 101

LISTA DE TABLAS

PAGINA

(10)

Tabla 1 Frecuencia(%) de Hb S y Hb C en población negra/negroide de

países del Caribe. 49

Tabla 2 Resultados de estudios realizados en diferentes poblaciones de

Colombia. 51

Tabla 3 Distribución porcentual por sexo y edad de 400 niños de uno a diez años de edad de la ciudad de Barranquilla que consultan a los hospitales: Pediátrico y General de Barranquilla. 70 Tabla 4 Grupos sanguíneos de niños de Barranquílla y de dos poblaciones

Estadounidenses 72

Tabla 5 Comparación de dos métodos diagnósticos Electroforesis vs Isoelectroenfoque utilizados para la detección de variantes Hemoglobínicas en 400 niños de uno a diez años de edad de la ciudad de Baranquílla que consultan a los hospitales:

Pediátrico y General. 75

Tabla 6 Valores percentilares de cuadro hemáticos de los 400 niños

De uno a diez años de edad de la ciudad de Barranquilla. 76 Tabla 7 Comparación de valores internacionales de referencia con

Los valores obtenidos en los 400 niños de Barranquilla. 76 Tabla 8 Comparación de valores percentilares de índices eritrocitarios

entre niños de la ciudad de Barranquílla que presentan en el IEF normal y los niños que presentaron hemoglobinopatías. 77 Tabla 9 Comparación de los hallazgos de hemoglobinopatías en relación Con índices eritrocitarios bajos en niños de uno a diez años de edad de la ciudad de Barranquilla. 78 Tabla 10 Resultados de las pruebas de falciformía y de estabilidad al

Isopropanol en 400 niños de ambos sexos de uno a diez años de Edad de la ciudad de Barranquílla. 78 Tabla 11 Comparación de los resultados de falciformía y prueba de

Estabilidad con las hemoglobinopatías identificadas en los

400 niños de la ciudad de Barranquílla 79 Tabla 12 Distribución porcentual de los niños con antecedentes clínicos

De 400 niños de uno a diez años de edad de la ciudad de

Barrranquílla 80

Tabla 13 Distribución de frecuencias de niños con antecedentes clínicos

(11)

Vs diagnósticos según resultados de hemoglobinopatías en niños 81

Tabla 14 Distribución de frecuencias de niños por motivo de consulta Vs diagnóstico según resultados de hemoglobinopatías en niños De uno a diez años de edad de la ciudad de Barranquilla 82

(12)

LISTA DE FIGURAS

PAGINA

Figura 1 Distribución porcentual de niños según sexo 71

Figura 2 Distribución porcentual de niños por grupos de edad 71

Figura 3 Distribución porcentual de niños según clasificación por grupos

Sanguíneos 72

Figura 4 Resultado de una de la EAC realizadas a un grupo de diez niños 73

Figura 5 Resultado de un IEF realizado a un grupo de diez niños 74

Figura 6 Distribución porcentual de niños según antecedentes clínicos 81

Figura 7 Esquema familiar 1 83

Figura 8 Esquema familiar 2 84

Figura 9 Esquema familiar 3 84

(13)

ABREVIATURAS

Hb : HEMOGLOBINA F : FETAL

A : ADULTA S : FALCIFORME

RGR : RECUENTO DE GLOBULOS ROJOS HCTO : HEMATOCRITO

HCM : HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MEDIA VCM : VOLUMEN CORPUSCULAR MEDIO

CMHC : CONCENTRACIÓN MEDIA DE HEMOGLOBINA CORPUSCULAR

RP : RECUENTO DE PLAQUETAS

EAC : ELEACTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA IF : ISOELECTROENFOQUE

(14)

RESUMEN

Las hemoglobinopatías son las enfermedades genéticas más frecuentes en todo el mundo. La organización Mundial de la salud (1982) calculó que alrededor del 5% de la población mundial es portadora de genes de trastornos clínicamente importantes de la hemoglobina y cada año nacen 300.000 homocigotos gravemente afectados.

Estudios previos realizados en varias regiones de Colombia por Restrepo encontraron una frecuencia de 7,6% de estas enfermedades. El objetivo del presente trabajo fue el de estimar la frecuencia de hemoglobinopatías en niños de ambos sexos de uno a diez años de edad que consultan por cualquier motivo a los Hospitales: Pediátrico y General de Barranquilla. Se estudiaron 400 niños previo consentimiento informado de sus padres a los que se les realizó una historia clínica dirigida hacia la detección de las hemoglobinopatías. Además, se les practicaron los siguientes exámenes de laboratorio: falciformía y estabilidad al isopropanol, hemograma completo, cuantificación de Hb A2 y Hb Fetal, electroforesis en acetato de celulosa e isoelectroenfoque en gel de agarosa. Después de estudiar todos los resultados de las anteriores pruebas se lograron identificar un total de 22 (5,5%) niños con hemoglobinas alteradas, de los cuales 17 (4,2%)niños presentaron Hb AS, un niño (0,2%)con Hb AC, un niño (0,2%) con Hb AD, 2 niños(0,5%) portadores de alfa--talasemia y un niño(0.2%) portador de beta- talasemia. Los resultados obtenidos permiten concluir que las hemoglobinopatías representan un problema de salud pública en estas poblaciones del Caribe Colombiano.

Palabras claves: Hemoglobinopatias, electroforesis en acetato de celulosa, Isoelectroefoque en gel de agarosa

(15)

INTRODUCCION

La hemoglobina es una proteína globular, presente en las células rojas sanguíneas de los vertebrados comprometida en el transporte de oxígeno a los tejidos. Es un tetrámero, con peso molecular de 68.000 d. constituido por cuatro cadenas polipeptídicas, llamadas globinas, unidas entre sí mediante enlaces no covalentes, cada cadena de globina contiene un anillo de ferroporfirina o hemo, que es el sitio de unión para el oxígeno (1)

Las cadenas de globina son del tipo alfa (α) o beta (β). Las cadenas globínicas α constan de 141 aminoácidos y las β constan de 146 aminoácidos cada una. Los genes que codifican las globinas α están localizados en bloque, en una región de 35 Kb del cromosoma 16, en el que se encuentran 3 genes, que se expresan como globínas: zeta (Ζ) alfa1 1) y alfa 2 2). (2)

Los genes que codifican para las cadenas β también se localizan en bloque en una región de 70 Kb del cromosoma 11, donde se encuentran 5 genes, que se expresan como globinas: epsilon (ε), gama1 (γ1), gama (γ2), delta (δ) y beta (β). (2)

En los eritrocitos se hallan normalmente tres tipos de hemoglobinas:A, A2 y F. En los adultos normales, al menos el 96% de la hemoglobina es hemoglobina A, que consta

(16)

de dos cadenas α y dos cadenas β (α2β2). La hemoglobina A2, representa entre un 2,5 a 3% y está formada por dos cadenas α y dos cadenas δ (α2δ2). La hemoglobina fetal (Hb F), consta de dos cadena α y dos cadenas γ (α2γ2). Esta hemoglobina predomina durante la vida fetal, pero disminuye durante el primer año de vida postnatal. En adultos normales, menos del 1% de la hemoglobina es Hb F. Las hemoglobinas embrionarias tienen poca importancia en el laboratorio clínico, ya que no están presentes durante la vida postnatal.(2)

Desde que Ingram identificó la alteración estructural de la hemoglobina S, alrededor de 600 variantes adicionales han surgido por un número de mecanismos genéticos diferentes y en los que varios efectos clínicos han sido descritos. Las variables o variantes de hemoglobinas que tienen repercusión clínica se les denomina desórdenes de la hemoglobina o hemoglobinopatías en general. En aquellos desórdenes en donde el glóbulo rojo toma forma de hoz o falciforme, se les denomina anemia de células falciformes o drepanocíticas. (2).

Las hemoglobinopatías constituyen un grupo de enfermedades caracterizadas por defectos en la estructura de la hemoglobina. Esto sucede porque las cadenas polipeptídicas de la globina se sintetizan a partir de aminoácidos mediante control genético, al igual que otras proteínas del organismo, por lo que es de esperar que haya errores ocasionales en su formación. Por fortuna estos errores son infrecuentes y no todos ellos producen una hemoglobina funcionalmente defectuosa. (2).

Estas enfermedades se heredan en forma autosómica recesiva y se caracterizan por

(17)

presentar manifestaciones clínicas solo los individuos homocigotos para el gen mutante. Tanto los hombres como las mujeres presentan la misma probabilidad de padecer la enfermedad. A los individuos que solo presentan un alelo mutante, se les denomina heterocigotos o portadores y generalmente son asintomáticos. (3).

Los desordenes de la síntesis de hemoglobina se han dividido en dos grandes grupos:

A. Síntesis de globina estructuralmente anormal (hemoglobinopatías): anemia de células falciformes o drepanocitosis, hemoglobinas inestables.

B. Síntesis deficiente o nula de globina: Síndromes talasémicos. (4).

Atendiendo a sí estos desórdenes producen glóbulo rojo en forma de hoz o falciformía con repercusiones clínicas se clasifican en: Síndromes falciformes o drepanocíticos y síndromes talasémicos. (4)

Las hemoglobinopatías son enfermedades hereditarias, que prevalecen en el África, Asia, Europa y las Américas, principalmente en el Caribe, debido a la inmigración negra, en donde estos genes se mezclaron en diferentes extensiones, creándose en el Caribe diferentes poblaciones híbridas.(5)

La importancia de las hemoglobinopatías en el ámbito de la salud pública ha suscitado un acelerado desarrollo de tecnologías para su análisis en el laboratorio, particularmente en el desarrollo de procedimientos diagnósticos rápidos y precisos.(6)

(18)

Estos avances han ayudado a dilucidar patrones electroforéticos convencionales que otrora confundían el diagnóstico clínico, así como a clasificar perfiles hereditarios complejos y a investigar diversas poblaciones humanas desplazadas a nuevos continentes.(7)).

Los estudios antropológicos han demostrado que los genes responsables de las drepanocitosis provienen de los países africanos, principalmente de la costa occidental de África. Estos países presentan un promedio del 20-25 % de personas afectadas por Hb S y los genes talasémicos provienen principalmente de los países Europeos, de raza caucásica, con una penetración al Caribe con la colonización Española y mediante el mercado de esclavos de raza negra. (7)

La contribución Africana ha sido predominante desde los inicios del siglo XVI, mediante la migración forzada de aproximadamente 20 millones de esclavos provenientes de las diferentes regiones de África a los países caribeños y que se fueron mezclando con los nativos en diferente grado. (8)

Los trastornos de las hemoglobinas humanas, o hemoglobinopatías, ocupan una importante posición en la genética médica por varias razones. Son las enfermedades genéticas más habituales en todo el mundo y generan una sustancial morbilidad. La Organización Mundial de la Salud (1982) calculó que alrededor del 5% de la población mundial es portadora de genes de trastornos clínicamente importantes de la hemoglobina, y que cada año nacen alrededor de 300.000 homocigotos

(19)

gravemente afectados. (7)

La OMS ha sugerido acciones que se deben realizar; entre ellas, la detección temprana de heterocigotos en comunidades o grupos étnicos con prevalencia alta de enfermedades genéticas recesivas, programa que podría ser parte del control prenatal, con asesoramiento de pareja y diagnóstico en los recién nacidos; a través de la detección de los casos índice, se realiza el estudio familiar y se toman acciones encaminadas a la prevención y el manejo adecuado de los casos. El asesoramiento genético consiste en brindar a la pareja toda la información disponible y necesaria sobre los riesgos detectados de manera que puedan tomar decisiones reproductivas de manera informada y autónoma. (9)

Los programas de tamizaje, orientan a la prevención de estas enfermedades, y el diagnóstico prenatal trajo una marcada reducción en el nacimiento de niños afectados en Grecia, Chipre e Italia. La extensión de estos programas a otras áreas del mundo no ha sido posible en el diagnóstico prenatal recientemente se ha obtenido del análisis directo del DNA fetal de la vellosidad coriónica, esta prueba está asociada con un leve aumento del riesgo de perdida fetal y con un porcentaje de error menor del 1 %. (10)

En los estudios realizados en el Caribe, las hemoglobinas S y C son las más encontradas en poblaciones híbridas; en cambio, las poblaciones aborígenes no muestran ningún polimorfismo en el loci de la hemoglobina, así como tampoco se han encontrado polimorfismo para la enzima G6PDH, y genes talasémicos.(5)

(20)

Lo primero que llama la atención con estos estudios poblacionales es que en la mayoría de los países caribeños no existe una distribución homogénea de las variantes hemoglobínicas ni siquiera entre la Hb S y Hb C, posiblemente debido a los diferentes factores étnicos que han entrado a formar parte de la población de los distintos países y, aún dentro de ellos, en diferentes regiones. Es decir, que estos resultados reflejan la estructura antropológica de los diferentes grupos. (5)

El hecho que los portadores de cualquier desorden de la hemoglobina no presenten síntomas clínicos, pero que potencialmente sean capaces de tener hijos enfermos, hace que los estudios poblacionales sean de mucha importancia, y podamos realizar mapas epidemiológicos de estas áreas. En Cuba existe un programa Nacional de Educación y prevención de hemoglobinopatías. En Colombia no existe un programa nacional para la detección de portadores y enfermos de hemoglobinopatías y tampoco hay estadísticas de morbi - mortalidad que informen cual es la prevalencia de estas patologías en el país. (11)

Colombia como parte integrante del Caribe, tiene una población estimada en 43.000.000 habitantes, con una distribución racial aproximada de 15% blancos de origen caucásico, 15% negros de origen Africano, 5% indígenas y el 65% son mestizos o mulatos resultantes de la mezcla de las razas anteriormente mencionadas. (8,12)

En los estudios realizados en diferentes grupos de población Colombiana, las

(21)

frecuencias en los desordenes de la hemoglobina fluctúan entre 0.6 y 21,2 %, siendo de todos ellos el más común el rasgo AS, lo que indica que el espectro de prevalencia es amplio y depende de factores raciales, geográficos y ambientales. Las poblaciones estudiadas son de los departamentos del Antioquia, Boyacá, Cauca, Cundinamarca, Chocó y San Andrés y Providencia. (13,14)

Barranquilla, es una ciudad localizada en la costa norte sobre el caribe colombiano, con una población aproximada de 990.547 habitantes que se caracterizan por su alto grado de mestizaje, de estos el 20% son menores de 10 años de edad. Esta población no cuenta con un estudio acerca de las principales desordenes de la hemoglobina. Por tal motivo, nuestro estudio tiene como finalidad analizar muestras sanguíneas de niños entre 1 y 10 años de edad, que consulten por algún motivo a los dos principales sitios de atención en salud en Barranquilla como son: el Hospital Pediátrico y el hospital General que cubren las consultas del 40 % de los niños de la población y así poder establecer un diagnóstico de la incidencia de estas enfermedades y con esto poder sugerir programas de atención a la comunidad.(12)

(22)

1. MARCO TEORICO

1.1 GENETICA

La síntesis de cada una de las subunidades de la hemoglobina ( α,β ,γ, ε, ζ ) se regula por genes distintos. Las subunidades épsilon y ζ se encuentran solo en la hemoglobina embrionaria. Los individuos normales heredan dos genes para la cadena β (uno de cada progenitor), cuatro genes para la cadena α y cuatro genes para la cadena γ. Los genes para las cadenas épsilon, gamma, delta y beta ocupan locis adyacentes en el cromosoma 11. Los genes α y ζ se localizan en el cromosoma 16. La herencia de las hemoglobinas anormales sigue la genética mendeliana clásica.(2)

Los polipéptidos de globina α y β son productos de genes específicos en cromosomas separados. Así una mutación en la hemoglobina envuelve una anormalidad estructural de una subunidad de globina en particular.(2)

Las variantes de la hemoglobina son heredadas de portadores codominantes. Un individuo hereda un gene de la cadena beta de cada padre, si ambos padres son heterocigotos para la hemoglobina S en la cadena beta ( portador de Hb S o AS), hay un 50 % de probabilidad que un hijo de la pareja sea AS, un 25 % AA y un 25 % tenga el genotipo SS. (2)

(23)

Si un individuo AS se une a otro AC, hay un 25 % de probabilidad que un hijo sea doble heterocigoto (SC); en este los glóbulos rojos tendrán un 50% de Hb S y un 50% DE Hb C, pero no tiene Hb A.(2)

1.2 ONTOGENESIS DE LAS HEMOGLOBINAS EN EL HOMBRE

En las distintas etapas del desarrollo embrionario desde el embrión hasta llegar a la edad adulta, se sintetizan en un orden fijado y rigurosamente determinado, diferentes hemoglobinas constituidas por dos pares de cadenas polipeptídicas como se puede apreciar en la siguiente tabla que muestra la composición de las distintas moléculas correspondientes a los estadios embrionarios, fetal y adulto. El patrón de aparición y desaparición de las distintas cadenas globínicas se esquematiza en la figura , en la cual se ponen en evidencia los cambios que ocurren en la ontogenia. El primero, del fenotipo embrionario al fenotipo fetal, ocurre en las etapas tempranas de la diferenciación; el segundo, del fetal al del adulto, y tiene lugar en el período perinatal.(5)

La eritropoyesis comienza en el saco vitelino durante la etapa embrionaria, se desplaza al hígado y al bazo durante el período fetal, y finalmente a la medula ósea en la vida adulta.(5)

Las células que se originan en el saco vitelino contienen predominantemente Hb Gover I, Hb Gover II y Hb Pórtland en proporciones 42, 24 y 21 %. Estas

(24)

hemoglobinas están presentes en células nucleadas relativamente grandes, llamadas megaloblastos, que se encuentran en circulación hasta alcanzada las seis semanas de gestación, cuando el saco vitelino cesa su actividad eritropoyética que se transfiere al hígado. Aparecen en la circulación células macrocíticas anucleadas más pequeñas, la cantidad de cadenas ς disminuyen y aumentan las cadenas α, por lo que aumenta la Hb Gover II y las cadenas γ.

Las Hb Fetal es producida en el hígado hasta las 32 semanas de gestación donde comienza su reducción y se aumenta la síntesis de la Hb A.(5)

En los recién nacidos los niveles relativos son muy variables, y la Hb F presenta valores entre 60 -80%, que se deben en gran medida a la presencia de células sintetizadas en los meses anteriores al nacimiento ( la vida media de los eritrocitos fetales es de aproximadamente 90 días). En la figura se pude observar que después del nacimiento el porcentaje de Hb F se mantiene constante por un período de aproximadamente 20 a 40 días, durante los cuales la hemoglobina total presenta una caída rápida durante unos tres meses, seguidos por un período de disminución más lenta, hasta llegar a los niveles del adulto, aproximadamente al año de vida.

Este modelo implica que el cambio de Hb F a Hb A no se debe a una disminución paulatina, sino a un cambio brusco que produce la inactivación del gene γ y la activación del gen β. (5)

(25)

En cada estadio las hemoglobinas responden a una particular situación en la cual llevan a cabo su función y, en efecto, se ha demostrado que las propiedades fisiológicas de las distintas hemoglobinas son diferentes. La afinidad por el oxígeno de las hemoglobinas embrionarias y de la Hb F es mayor que la de la Hb A, de manera que ambas son capaces de saturarse en condiciones de baja tensión de oxígeno. Esta diferencia tiene un importante significado fisiológico, porque permite la respiración del embrión y del feto.(5)

1.3 ALTERACIONES DE LA HEMOGLOBINA

La primera observación sobre una alteración de la hemoglobina data de principios del siglo XX cuando en 1910, Herrick observó en los eritrocitos de un individuo negro con anemia grave células en forma de hoz (células drepanocíticas o falciforme). Sin embargo, fue hasta la introducción de técnicas electroforéticas, en 1949, cuando Pauling, Itano, Singer y Wells demostraron, en los individuos portadores de drepanocitos, una hemoglobina de movilidad electroforética diferente a lo normal y la denominaron Hb S. En ese mismo año, Neel probó que los pacientes con anemia grave y eritrocitos en forma de hoz eran homocigotos para un gen productor de una anormalidad similar aunque clínicamente menos grave en ambos padres homocigotos obligados, quedando con esto demostrado el patrón hereditario de la anemia drepanocítica: autosómica recesiva para la enfermedad. (15)

En 1950, Harris probó que la deformidad del eritrocito se debe a la polimerización de la Hb S en fibras alongadas. Las pruebas de la anormalidad estructural fueron encontradas por Ingram en 1956 y 1959, quien demostró que la Hb S difería de la

(26)

Hb A, en la sustitución del aminoácido valina por el ácido glutámico en la posición 6 de la cadena β. Esta fué la primera demostración en el humano, de que una mutación en un gen estructural origina un cambio en la secuencia de aminoácidos en la proteína correspondiente y que esta proteína anormal da lugar a una patología característica, en este caso, anemia hemolítica; por tanto, la Hb S está considerada como el primer ejemplo de enfermedad molecular. (16 )

1. 4 PROPIEDADES DE LA HEMOGLOBINA

En 1949 Linus Pauling y sus colaboradores examinaron las propiedades físico- químicas de la hemoglobina en individuos normales y de pacientes con rasgo falciforme o con anemia falciforme. Su objetivo principal fue investigar las diferencias de estas hemoglobinas mediante electroforesis. Encontraron que el pH isoélectrico (pI) de la hemoglobina de las células falciforme es mayor que el encontrado para la hemoglobina normal, tanto en la forma oxigenada como en la desoxigenada. (14)

Descripción del pH isoeléctrico

NORMAL ANEMIA FALCIFORME DIFERENCIA OXIHEMOGLOBINA 6,87 7,09 0,22 DESOXIHEMOGLOBINA 6,68 6,91 0,23

Estas observaciones sugirieron que existe una diferencia en el número o la clase de grupos ionizables en las dos hemoglobinas. Se llegó a la conclusión de que la hemoglobina falciforme tiene por lo menos entre dos y cuatro cargas positivas netas

(27)

más que la hemoglobina normal. (15)

El ARNm para la cadena α esta compuesto por 625 a 650 nucleótidos de los cuales 423 son necesarios para codificar los 141 aminoácidos que componen la cadena y el ARNm de la cadena β tiene un largo de 675 a 770 nucleótidos de los cuales 438 son necesarios para codificar los 146 aminoácidos que componen la cadena polipeptídica.

Por consiguiente de las 2750 bases nitrogenadas en los genes α y β pueden sufrir una sustitución teórica y se puede calcular que aproximadamente 700 bases de estas (25%) debidas a la degeneración del código genético no originan cambios finalmente en la secuencia de las cadenas peptídicas. 50 bases (2%) provocan una terminación prematura y 2000 bases originan un cambio de aminoácido. En este último grupo solo la tercera parte de las mutaciones da lugar a un cambio de carga eléctrica, de manera que pueden producirse por mutación puntiforme aproximadamente 600 variantes las que se pueden identificar por medio de técnicas electroforéticas. Las otras son sustituciones eléctricamente neutras que se detectan solo cuando conllevan a una anormalidad funcional con efectos clínicos. (16)

1.5 DETECCION DE VARIANTES DE HEMOGLOBINA

El diagnóstico de las alteraciones de la hemoglobina y en particular de las hemoglobinopatías, se realiza por:

(28)

A. Examen clínico: Se busca la presencia de anemia hemolítica, palidez, ictericia, esplenomegalia y deformaciones óseas.

B. Examen hematológico: Análisis de la biometría hemática, en particular de las cifras de Hb, Volumen corpuscular medio y hemoglobina corpuscular media, presencia de reticulocitos, normoblastos y de formas anormales eritrocitarias o de cuerpos de inclusión en un frotis sanguíneo.

C. Electroforésis e isolectroenfoque de hemoglobina: Presencia de hemoglobina con movilidad anormal

D. Cuantificación de hemoglobinas F y A2. Valores elevados son indicativos de algún tipo de talasemia.

E. Estudios moleculares: Se realizan principalmente para analizar los genes que se encuentran en bloques, con la técnica del southern blot y por amplificación génica con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).(29)

La mayoría de las variantes de hemoglobina fueron detectadas por estudio electroforético. Usualmente este estudio se realiza en acetato de celulosa pH 8,3 a 8,8. De las 200 variantes que no estaban asociadas a manifestaciones clínicas, el 95% tienen una sustitución de un aminoácido que envuelve un cambio de carga identificándose en un examen de rutina al separar Hb A. (16)

(29)

Algunos laboratorios primero realizan una electroforesis con urea 6M seguida de otra en agar citrato a pH (6 a 6.5) obteniendo así la identificación de una gran cantidad de variantes. Rosa y colaboradores han mostrado lo útil que es el isoelectroenfoque en gel de policrilamida en la separación de variantes de hemoglobina. La cromatografía de alta presión también es utilizada para algunas variantes que se escapan de la detección por estos métodos electroforéticos.(17)

Recientemente, técnicas inmunológicas han sido desarrolladas para la identificación de variantes. Garver y colaboradores han preparado 40 anticuerpos monoespecíficos para ese mismo número de variantes. Recientes avances en la cromatografía líquida de alta presión y espectrofotometría de masas han facilitado la identificación de estructuras anormales. (17)

1.6 EFECTO DE LAS ALTERACIONES DE LA HEMOGLOBINA

La mayoría de las variantes no están asociadas a manifestaciones clínicas. Solo el 30% de las variantes descubiertas hasta ahora las presentan. Muchas fueron descubiertas accidentalmente o por estudios poblacionales. Un individuo de cada 800 presenta una variante que puede ser detectada por electroforesis. Las más comúnmente encontradas de las variantes son la S, E, o C. (9)

El conocimiento de la función que tienen las distintas partes de la molécula de hemoglobina en el mecanismo de transporte del oxígeno y el análisis del efecto que tienen ciertas mutaciones sobre ese mecanismo, permiten demostrar que las

(30)

alteraciones en la función dependen en gran medida de la posición y del tipo de mutación. Por ejemplo, aproximadamente de 151 sustituciones de un aminoácido en la región externa de la molécula, solo 48 producen una hemoglobina funcionalmente anormal, mientras que de 182, en los cuales la mutación ocurre en una región de contacto con el grupo hemo o en el interior de la subunidad, 172 conlleva a la síntesis de una hemoglobina funcionalmente anormal. (17)

Por otra parte, la importancia del tipo de mutación se puede analizar observando el efecto de diferentes sustituciones en el mismo sitio aminoacídico. Por ejemplo, la sustitución de la histidina 92 de la cadena beta por glutamina o prolina, (Hb Istambul y Hb St. Etienne), produce anemia hemolítica; la sustitución del mismo aminoácido por tirosina, ( Hb HydePark), produce cianosis y la sustitución por ácido aspártico (Hb Algeld Garden), no tiene ningún efecto. (18)

Es evidente, entonces, que las mutaciones que afectan los residuos en la región de contacto α1 - β1 no altera el efecto de cooperación, mientras que las mutaciones en el área de contacto α1 - β2 tiene una elevada probabilidad de producir alteraciones en la afinidad por el oxígeno. Igualmente alteraciones en las regiones cercanas donde se une el hierro con el oxígeno, influyen sobre la afinidad por este. (18)

1.7 CLASIFICACION CLINICA DE LAS HEMOGLOBINOPATIAS

Las variantes o desordenes de la hemoglobina se han agrupado de acuerdo a su

(31)

importancia clínica en:

I. Síndromes falciformes:

A. Portadores de células falciformes B. Enfermedad de células falciformes 1. SS

2. SC 3. SD 4. SO

5. S/β- Talasemia

II. Hemoglobinas inestables (aproximadamente 90 variantes)

III. Hemoglobinas con anormalidad en la afinidad por el oxígeno

A. Alta afinidad. Eritrocitosis familiar (aproximadamente 40 variantes) B. Baja afinidad. Cianosis familiar

IV. Hemoglobinas M. Cianosis familiar (6 variantes)

V. Síndromes talasémicos A. α- talasemia

B. β - talasemia (4)

1.7.1 SINDROMES FALCIFORMES O DREPANOCITICOS

(32)

Estos síndromes se caracterizan por presentar un glóbulo rojo en forma de hoz o depranocítico, ante una tensión baja de oxígeno. Esta forma característica del glóbulo rojo se presenta en todas las variantes hemoglobínicas que se polimerizan, precipitando en su interior y deformándolo, como por ejemplo: Hb SS, SC, S- β talasemias, etc.(2)

1.7.1.1 HEMOGLOBINA S

La Hemoglobina S es el resultado de una mutación puntual de una base nitrogenada en el DNA: la base cambiada es A en vez de T. Esto trae como consecuencia que el aminoácido de la posición 6 de la cadena β, el ácido glutámico, sea sustituido por valina.

Los genes falciformes producen una entidad clínica, solo si son heredados en los estados homocigotos como en la anemia falciforme (SS) y en los doble heterocigotos (SC, SD, SO; S / β talasemia. En estos casos el número de glóbulos rojos afectados es tan alto que en muchos casos es incompatible con la vida. (2) Las manifestaciones clínicas de la anemia falciforme clásica han sido bien definidas desde hace mucho tiempo y se han caracterizado por un conjunto de signos y síntomas propios de una anemia hemolítica crónica grave, con incremento en la susceptibilidad a infecciones, retraso en el crecimiento y desarrollo, crisis de dolor por oclusión vascular, cuadro toráxico agudo, síndrome de secuestro esplénico, daño tisular, trastornos en el sistema nervioso central, crisis aplásicas hemolíticas y

(33)

asplenia funcional. (13)

La falta de maduración en la enfermedad de células falciformes se refleja en una baja tasa en el desarrollo del esqueleto y una menarquia tardía. La osteomelítis y lesiones óseas fueron encontradas en un 10% de los casos de Hb SS en Jamaica (Serjeant, 1970). Un 13% de los afectados perecen en los primeros 2 años de vida comparado con un 1% de los que presentan hemoglobina normal, y la principal causa es falla esplénica y respiratoria secundaria a una infección pneumocóccica. (18)

Para el diagnóstico del portador de hemoglobina S (AS) generalmente se realizan las siguientes pruebas de laboratorio: electroforesis de hemoglobina, en donde aparecen dos bandas; una de Hb S y una banda de Hb A; cuantificación de hemoglobinas F, la cual es inferior al 1% y cuantificación de Hb A2, siendo inferior al 4%, siclemia y prueba de solubilidad al isopropanol, positivas. El portador de Hb S es esencialmente asintomático, solo se ha demostrado con certeza la hipostenuria, la hematuria (4%), la infección urinaria en la mujer embarazada y la bacteriurea asintomática en la mujer. En 204 portadores AS estudiados en Cuba, la hemoglobina, las constantes corpusculares, los reticulocitos, la Hb F y la Hb A2 fueron normales.(5)

1.7.1.2 CAMBIOS EN EL GLOBULO ROJO CON HEMOGLOBINA S

La polimerización de la Hb S en estado desoxigenado para formar un gel extremadamente viscoso es el evento fisiopatológico primario en la enfermedad conocida como hemoglobinopatía S; la gelificación distorsiona el glóbulo rojo y

(34)

disminuye su flexibilidad. Estas células rígidas pueden obstruir los pequeños capilares en la circulación y ocasionar una oxigenación deficiente de los tejidos. La hipoxia tisular causada por la vasoclusión en la microcirculación constituye la principal causa de morbilidad y mortalidad de esta enfermedad. (17)

El proceso de polimerización de la desoxihemglobina S envuelve tres fases:

nucleación, crecimiento y alineamiento. Este proceso depende de la concentración de desoxihemoglobina S, temperatura, pH y la presencia de Hb A o Hb F las cuales inhiben la gelación. (17)

La estructura del polímero se ha estudiado detalladamente y se ha determinado que la unidad está formada por un filamento compuesto por anillos de 14 moléculas de Hb S superpuestos formando una estructura helicoidal. También se puede describir como 7 dobles hélices de moléculas superpuestas y enrolladas entre sí. (17)

En cada molécula solamente uno de los residuos de valina en la posición 6 de la cadena β está involucrado en el contacto intramolecular con su vecina de la doble hélice. Además de este contacto, existen muchos otros entre las moléculas del polímero, tanto con los tetrámeros adyacentes en el mismo anillo, como con los que están situados a lo largo del eje vertical. Aunque el contacto de la valina β - 6 es el más importante para la formación del polímero, los contactos entre otras partes de las moléculas también se hacen necesarios para su estabilidad. (17)

(35)

Repetidos ciclos de desoxigenación - reoxigenación dan una pista sobre los cambios que sufre el glóbulo rojo al deformarse y los daños que sufre la membrana como son: la entrada de sodio y salida de potasio y un marcado incremento del calcio intracelular. Estos cambios causan un aumento en la perdida de agua, resultando una deshidratación del glóbulo rojo con un incremento de la concentración de hemoglobina intracelular, lo cual aumenta la polimerización intracelular de Hb S.

Finalmente, las células deformadas aún después de una adecuada reoxigenación permanecen así, por lo que es irreversible el proceso. (17)

Los cambios de deshidratación y el incremento de la concentración intracelular de hemoglobina causan un aumento de la viscosidad en el interior de la célula capaz de deformar y permitir la agrupación al pasar por la microvasculatura, trayendo como consecuencia vaso-oclusión. (17)

Hay evidencia ahora, que otros cambios ocurren en la membrana del glóbulo rojo:

oxidación de fosfolípidos, traslocación de fosfolípidos, oxidación de grupos sulfhidrilos de proteínas y formación de enlaces disulfuros intramoleculares. Un grupo anormal de glicoforinas con incremento en la adhesión celular al endotelio y a otras membranas biológicas, explicaría el tiempo de tránsito por los capilares, que puede variar de un paciente a otro. (17)

1.7.1.3 PRESENCIA DE HEMOGLOBINA FETAL (F) EN LA VIDA ADULTA.

La hemoglobina F se encuentra en pequeñas cantidades, variables entre 0,3% -

(36)

1,2% en todos los individuos normales, y no está distribuida uniformemente en los glóbulos rojos, sino que se encuentra localizada en una subpoblación celular que representa el 0,5- 7,0 % de los eritrocitos circulantes. Estas células se denominan células F, y su número se relaciona con el porcentaje de Hb F. Estudios de seguimiento realizados en individuos normales han demostrado que el número de células F y por lo tanto el porcentaje de Hb F se mantiene constante en el tiempo.(25)

Sin embargo, existen varias condiciones adquiridas o congénitas en las cuales la Hb F está elevada por la persistencia de su síntesis o por la reactivación de la expresión de los genes en la vida adulta. Las condiciones familiares incluyen diversos tipos de persistencia hereditaria de la hemoglobina fetal, beta-talasemia y anemia de células falciformes. Los desordenes hematológicos adquiridos asociados con niveles altos de Hb F incluyen leucemias, anemia megaloblástica anemia aplásica, anemia sideroblástica y hemoglobinuria paroxística nocturna. También se han encontrado niveles elevados en el embarazo y en tumores con metástasis en medula ósea.(25)

1.7.1.4 HEMOGLOBINA A2

La Hemoglobina A2 se encuentra presente en los individuos normales en un porcentaje variable, de 1,8 – 3,0 %. La activación del gen tiene lugar poco antes del nacimiento, de manera que los niveles de Hb A2 en recién nacidos son bajos, alrededor de un 0,5%, y alcanza valores normales del adulto aproximadamente a los seis meses de vida. A pesar de sus bajos niveles en sujetos normales, y por su

(37)

escasa importancia fisiológica, la Hb A2 ha sido muy estudiada. En parte, para obtener datos sobre el mecanismo de expresión de los genes globínicos y en parte porque niveles elevados de esta hemoglobina son patognomónicos de la β- talasemia heterocigótica y su determinación es la base del diagnóstico de ese trastorno, por lo que se han desarrollado muchas técnicas simples y confiables de cuantificación de HB A2. (27 )

Aumentos de Hb A2 se han observado además en la anemia perniciosa, en presencia de algunas hemoglobinopatías inestables, y después de un transplante de medula ósea. Por el contrario, niveles disminuidos se encuentran en la alfa –talasemia, la anemia aplástica y en el deficit de hierro.(27)

1.7.1.5 HEMOGLOBINA C

La hemoglobina C se produce por una mutación puntual similar a la que ocurre en la Hb S: el ácido Glutámico de la posición 6 de la cadena β es sustituido por Lisina. Fué la segunda variante identificada por electroforesis; es encontrada; exclusivamente en raza negra. Cerca del 25% de los habitantes del oeste africano y entre el 2 y 3% de individuos americanos de raza negra están afectados por la Hb C. Su presencia en individuos de raza blanca es infrecuente, aunque puede presentar una incidencia focal en determinadas zonas geográficas del litoral mediterráneo al igual en España se encuentra localizada en Andalucía y Extremadura. En su forma heterocigoto (Hb AC) es totalmente asintomático tanto clínica como hematológico. En su forma

(38)

homocigota( Hb CC) se caracteriza por una ligera anemia hemolítica de carácter crónico y esplenomegalia y un ligero aumento de la Hb F. El diagnóstico se realiza por las alteraciones del hemograma, la formación de cristales intraeritrocitarios y la electroforesis de hemoglobina. Su movilidad electroforética, al igual que la Hb S es más lenta que la Hb A, situándose aproximadamente en el lugar de la Hb A2. (29)

1.7.1.6 HEMOGLOBINA D

La hemoglobina D se origina por una mutación en la cadena β, el ácido glutámico en la posición 121 es sustituido por glutamina. Esta variante co-migra en la misma zona electroforética que la hemoglobina S, pero la siclemia y la solubilidad en alcohol son negativas. Tanto los homocigotos como los heterocigotos presentan valores de hemoglobina normales y no hay evidencia de hemólisis. (2)

1.7.2 HEMOGLOBINAS INESTABLES

Las hemoglobinas inestables son las variantes caracterizadas por una alteración estructural que causa una disminución de la estabilidad de la molécula, por lo cual estas hemoglobinas pueden precipitar en los hematíes formando cuerpos de inclusión, conocidos como cuerpos de Heinz. Las causas más comunes de la inestabilidad son los cambios estructurales de unión con el grupo hemo o en la región de contacto entre las subunidades y las alteraciones conformacionales producidas por la inserción de una prolina en regiones de α-hélice.La presencia de una hemoglobina inestable se confirma por medio de pruebas de estabilidad al

(39)

isopropanol. Las características clínicas y hematológicas más relevantes de esos síndromes son: anemia hemolítica de severidad variable, la excreción de dipirroles por la orina y las frecuentes crisis hemolíticas asociadas a ingestión de drogas y a infecciones.(31)

1.7.3 HEMOGLOBINAS CON ANORMALIDAD EN LA AFINIDAD POR EL OXIGENO

1.7.3.1 ALTA AFINIDAD POR EL OXIGENO

Las alteraciones pueden ocurrir tanto en la cadena α como en la cadena β: las variantes de la cadena α están presentes siempre en cantidad menor que las variantes de la cadena β y por lo tanto producen en general una menor alteración de la afinidad por el oxígeno en los heterocigotos y una eritrocitosis más reducida. La eritrocitosis es una característica típica de estos trastornos y se produce por un mecanismo que induce la síntesis de eritropoyetina en condiciones de hipoxia tisular, producto de la insuficiente liberación de oxígeno. La presencia de una variante hemoglobínica con alta afinidad por el oxígeno se puede sospechar en todos los casos de eritrocitosis que no tengan otros diagnósticos. Estas variantes se transmiten de acuerdo con un patrón autosómico dominante, lo cual determina que el estudio familiar es muy importante. En muchos casos la hemoglobina anormal en la afinidad por el oxígeno presenta una movilidad electroforética diferente a la Hb A a pH 8,6 y por lo tanto se puede lograr un diagnóstico, sin embargo otras variantes no se separan de la Hb A de manera que el resultado de la electroforesis es normal.(31)

(40)

1.7.3.2 BAJA AFINIDAD POR EL OXIGENO

Las hemoglobinas caracterizadas por una reducción en la afinidad por el oxígeno son raras. Todas presentan, como es de esperarse, una saturación menor de la HbA a una determinada tensión de oxígeno en los tejidos. Debería producirse, por lo tanto, una anemia relativa, por un mecanismo opuesto al que se origina en las hemoglobinas con alta afinidad por el oxígeno, pues la elevada tendencia a liberar oxígeno a los tejidos baja la producción de eritropoyetina y se reduce la cantidad de hemoglobina sintetizada. La presencia de una hemoglobina de baja afinidad se puede sospechar en los pacientes con cianosis sin alteraciones cardíacas o pulmonares. Estas variantes se heredan con un patrón autonómico dominante, por lo que el estudio familiar es importante. La presencia de este síntoma en otros familiares es indicativo de una variante hemoglobínica. No obstante, muchas de estas hemoglobinas anormales no producen cianosis, de esta manera que como en los casos de variantes con alta afinidad por el oxígeno, la prueba crucial para el diagnóstico es la determinación de la curva de afinidad, que en estos casos se encuentra desplazada hacia la derecha.(31)

1.7.4 HEMOGLOBINA M. CIANOSIS FAMILIAR

La hemoglobina M o metahemoglobina, es el derivado de la hemoglobina en la que el hierro del hemo se encuentra en forma férrica (Fe+++) y no en la forma ferrosa normal (Fe++). En esta situación el hierro es incapaz de unirse reversiblemente con el oxígeno y por lo tanto de transportar el gas. La metahemoglobina es

(41)

funcionalmente inútil.

Pequeñas cantidades de metahemoglobina se producen continuamente en los glóbulos rojos de los individuos normales, pero la constante oxidación fisiológica del hierro está balanceada por su reducción, catalizada por sistemas enzimáticos que convierten el hierro férrico en ferroso, de manera que el porcentaje de metahemoglobina no supera el 0,5%.(30)

Las enfermedades que se originan por aumento de la metahemoglobina se conocen como metahemoglobinemias hereditarias y la mayoría de ellas se caracterizan por una cianosis variable.

Las metahemoglobinemias hereditarias se pueden producir por dos causas:

1. Disminución en la reconversión de la metahemoglobina en hemoglobina

2. Alteración de una cadena globínica que impide la presencia del hierro en la forma ferrosa.

En el primer caso se debe a una deficiencia hereditaria de la enzima responsable de la reducción de la metahemoglobina, la NADPH-dependiente metahemoglobina reductasa. También conocida como diaforasa, que se transmite como un gen autosómico recesivo. En estos casos se puede identificar fácilmente porque la metahemoglobina desaparece en presencia de sustancias reductoras como el ácido ascórbico o azul de metileno, que se utilizan para mantener bajos los niveles de metahemoglobina en estos pacientes.

(42)

En el segundo caso presentan una sustitución de un aminoácido en una posición ubicada en la cavidad donde está situado el grupo hemo, como es el caso de la HbM Milwaukee y la Hb Iwate. Se ha demostrado la presencia de enlaces de coordinación entre el átomo de hierro y los aminoácidos anormales, lo que impide la unión con el oxígeno y al mismo tiempo estabiliza la forma férrica.(5)

1.7.5 SINDROMES TALASEMICOS

El otro grupo de desordenes de la hemoglobina, conocidos como síndromes talasémicos, constituye un grupo de trastornos hereditarios extremadamente heterogéneos desde los puntos de vista clínico, hematológico y genético. Están caracterizados por alteraciones cuantitativas en la síntesis de las cadenas de globina, que producen anemias microcíticas e hipocrómicas de intensidad variable.

(19)

Las talasemias, en conjunto los trastornos monogénicos más frecuentes, en donde la mutación reduce el nivel de síntesis de las cadenas α ,β, γ ο δ (Weatherall y col., 1989).

En ausencia de una de las cadenas el tetrámero se forma con un solo tipo de cadena, el exceso de la misma cadena produce corpúsculos de hemoglobina anormales intraeritrocitarios deformando el glóbulo rojo y su membrana lo que

(43)

ocasiona su destrucción prematura. El daño en los glóbulos rojos de estos pacientes causa anemia microcítica, hipocrómica. (19)

Las α talasemias son las más prevalentes y se encuentran más ampliamente distribuidas. Existe una distribución característica de las talasemias en una franja a lo largo del viejo mundo: Mediterráneo, Oriente Medio y partes de África, India y Asia.

El nombre deriva del término Tallaza, mar, y significa que la enfermedad se descubrió por primera vez en personas de origen mediterráneo. (19)

1. 7 . 5. 1 α - TALASEMIAS

Este desorden está caracterizado por una reducida síntesis de las cadenas α;

normalmente cuatro genes son los responsables de la codificación para la síntesis de las cadenas α; la severidad del síndrome clínico muestra una gran variación, dependiendo del número de genes defectuosos. Se clasifican así: cuando se altera un solo gene; se le conoce como portador silencioso(- α / αα, heterocigoto para talasemia α- 2), no existen manifestaciones clínicas ni hematológicas; cuando dos genes se encuentran implicados, se le conoce como estado portador (- / αα o -α / -α, heterocigoto para talasemia α - 1 u homocigoto para talasemia α - 2, respectivamente) existen manifestaciones clínicas leves idénticas a las descritas para la β - talasemia menor, como es una discreta anemia; la alteración de tres genes (--/ -α, heterocigoto compuesto para talasemia α - 1 y α - 2 ) causa un estado hemolítico, que aunque está compensado, se traduce en un síndrome de anemia

(44)

hemolítica crónica conocido como enfermedad por Hb H; finalmente, cuando los cuatro genes se afectan, el cuadro clínico es más grave y se manifiesta desde la vida fetal, es incompatible con la vida y se conoce como hidropesía. (19)

En ausencia de cadenas α -globina con las cuales asociarse, las cadenas de los conjuntos de β - globina están libres para formar una hemoglobina homotetramérica.

La hemoglobina con una composición γ4 se conoce como Hb Bart, y el tetrámero β4

se denomina Hb H. Debido a que ninguna de estas hemoglobinas pueden liberar oxígeno a los tejidos en condiciones normales, resultan portadoras de oxígeno completamente ineficaces. Por lo tanto, los niños con α -talasemias graves y niveles altos de Hb Bart, presentan en sangre del cordón umbilical un 80% de Hb Bart`s (γ4), trazas de Hb H (β4) y hasta un 20% de Hb Pórtland( ε2γ2), lo cual indica que en presencia de grandes deleciones en las regiones de los genes alfa, los loci que normalmente se inactivan en la vida embrionaria, permanecen activos.(2). Estos pacientes sufren hipoxia intrauterina grave y nacen con acumulación masiva generalizada de líquidos, una alteración denominada hidropesía fetal. En las α - talasemias más leves desarrollan anemia, debido a la precipitación gradual de Hb H en el eritrocito. Esto produce la formación de inclusiones en el eritrocito maduro dañando las células, las cuales son eliminadas por el bazo, trayendo como consecuencia la anemia.(4)

1.7.5.2 β- TALASEMIAS

(45)

Las β-talasemias obedecen a una disminución en la síntesis de cadenas β de globina. La intensidad del déficit depende del grado de alteración genética y pude variar desde una síntesis deficiente o parcial (β+ talasemia) hasta una ausencia total de síntesis (β 0 talasemia). (19)

El exceso de cadenas α produce un tetrámero insoluble, el cual precipita, trayendo como consecuencia mayores trastornos hematológicos, como es una mayor lisis celular y por lo tanto una anemia más severa. Este cuadro es conocido como beta talasemia mayor, anemia de Cooley o anemia Mediterránea, cuando el paciente es homocigoto (βo- tal) o beta talasemia menor cuando es heterocigoto o portador (β+tal), en la que el paciente presenta una anemia leve, no requiere tratamiento y solo amerita consejería genética.(19)

Las β- talasemias comparten muchas características con las α - Talasemias. La producción disminuida de la β- Globina provoca anemia microcítica, hipocrómica y el desequilibrio en la síntesis de globina produce precipitación del exceso de cadenas α, lo que a su vez provoca daño en la membrana eritrocítica.(2)

En contraste con la α - globina, sin embargo, la cadena β es solo importante en el período postnatal. Por lo tanto, el inicio de la β-talasemia se hace evidente hasta unos meses después del nacimiento, cuando la β-globina reemplaza normalmente la γ - globina como la principal cadena no α, y solo la síntesis de la principal hemoglobina del adulto la Hb A se reduce. (2)

(46)

Las cadenas α en exceso resultan insolubles y así se precipitan en precursores de eritrocitos y se destruyen en la médula ósea. Debido a que el gen delta se halla intacto, la producción de Hb A2 continúa y, de hecho, la elevación del nivel de Hb A2, es propia de los heterocigotos de β-talasemia. El nivel de Hb F también se incrementa, pero no debido a la reactivación del gen de la globina γ que se detuvo al nacimiento, sino a causa de la supervivencia selectiva y quizá también de la producción incrementada de la población minoritaria de eritrocitos adultos que contienen Hb F.(2)

La patogenia molecular de la β-talasemia es más compleja y heterogénea que la de la α - talasemia. A diferencia de la α, la deleción de genes es una causa poco frecuente de la β-talasemia. Entre los casos reconocidos de deleción del gen β, un padecimiento conocido como "persistencia hereditaria pancelular de Hb F" tiene manifestaciones clínicas mínimas debido a síntesis eficiente de cadenas γ en el cromosoma donde hay deleción de los genes β y δ. Hay varios pasos en la síntesis de β globina que pueden alterarse y producir un genotipo talasémico, mutaciones en uno de los segmentos interpuestos del gen de globina o cerca de él, lo que causa errores en la elaboración del RNAm. A menudo se sintetizan cadenas β pero en cantidad reducida (talasemia β +). Otros tienen mutaciones sin sentido en la región de codificación, produciendo una terminación prematura de las cadenas de β - globina: Siendo esta última la causa más frecuente de β + talasemia.(3)

(47)

1.8 ESTUDIOS REALIZADOS EN LOS PAISES CARIBEÑOS

En estudios realizados en poblaciones del Caribe, se observa que su constitución hematológica refleja los rasgos genéticos heredados de los antepasados indígenas, así como de los inmigrantes africanos, asiáticos y europeos que se establecieron. De esta manera, las hemoglobinas anormales, presentes en la actualidad, son herencia de otras poblaciones, como es el caso de la Hb S y C originarias de África y las talasemias alfa y beta de África, Asia y Europa.(20)

La prevalencia de hemoglobinas anormales en el Caribe en estudios de 32 grupos en 14 países en una muestra de 12.220 individuos, muestran que la hemoglobinopatía más común es el rasgo heterocigoto (Hb AS) la presentaron entre:

11,6 y 13,9% de los individuos estudiados. Los homocigotos (Hb SS), que frecuentemente producen una anemia letal (anemia de células falciforme), ha sido reportada alrededor del 0,7%. La variante Hb AC también es frecuente entre 0.2- 4,6% de los sujetos, la cual es originaria del oeste- centro de África y documentada en Sur América. Nos sorprendió encontrar en 12 de las poblaciones estudiadas la Hb SC, estimando la frecuencia en Jamaica de Hb SS y de Hb SC en 3,2/1.000 y 2,0/1.000 nacidos vivos, respectivamente. (7).

La menor frecuencia encontrada en el Caribe corresponde a: Hb AD, Hb AE y Hb AG. De estas hemoglobinopatías, incluyendo tanto la Hb AS y la Hb AC, son relativamente más frecuentes en el Mediterráneo y Asia. La Hb D probablemente se encontró en el Sureste Asiático y arribó más tarde al Caribe a través de migraciones

(48)

más que por una mutación independiente (Milner, 1963). La combinación genética Hb AF, también llamada persistencia hereditaria de hemoglobina fetal (HPFH), fue descubierta en Bahamas, Jamaica y Curacao.(7)

Otras hemoglobinas anormales detectadas en el Caribe: la Hb Korle - Bu y la Hb G philadelphia, localizadas en Ghana y la costa de Marfil encontradas en Costa Rica,

Panamá, Cuba, Jamaica, Martinica y Colombia. Estos hallazgos demuestran la región de origen de la población de raza negra. El origen de otras variantes no esta claro (Colombo y Martínez 1981): tal es el caso de la Hb D Punjab, típicamente asiática, la cual ha sido reiteradamente encontrada en Europa y América Tropical. (7) La Tabla 1 muestra los resultados sobre la frecuencia relativa de la Hb S y Hb C en muestreos realizados en diferentes países de la cuenca del Caribe, específicamente en grupos de raza negra y / o negroide.(11)

TABLA 1. FRECUENCIA ( %) DE HB S Y HB C EN POBLACIÓN NEGRA/

NEGROIDE DE PAÍSES DEL CARIBE. (11).

(49)

País No. individuos AS AC

Barbados - 7.5 5.0

Colombia 1.184 11.2 -

Costa Rica 3.830 7.1 2.3

Cuba 6.996 6.1 3.0

Dominica 589 16.0 -

Guadalupe 10.559 8.1 2.5

Guatemala 150 18.0 -

Haití 807 13.2 2.6

Honduras 1.671 10.0 1.2

Jamaica 1.249 10.5 3.5

Martinica 1.154 7.1 3.9

Panamá 7.604 16.0 1.3

Puerto Rico 1.921 7.1 0.4

Rep. Dominicana 798 7.0 1.1

St. Tomas 1.769 9.4 4.0

Surinam 1.058 17.1 2.6

Trinidad 547 6.8 2.9

Venezuela 2.132 8.7 0.9

Los hallazgos clínicos encontrados en el Caribe son variados, en particular alteraciones anatómicas, fisiológicas y bioquímicas. Estudios recientes han encontrado diferencias significativas en las características anatómicas entre el heterocigoto y el homocigoto de Hb S, al mismo tiempo disminución en el peso, un bajo desarrollo esquelético y retardo de la menarquia se ha encontrado en niños con Hb SS y Hb SC. Los portadores de Hb S (Hb AS), no muestran ningún daño anatómico ni mental y su desarrollo es similar a los que presentan hemoglobina normal. (13).

Un número de alteraciones fisiológicas se ha identificado, especialmente cardiovasculares y renales. Las células rojas falciformes en todo caso son más frágiles, entre un 25- 50 % de las que presentan hemoglobina normal. Esta fragilidad

(50)

trae como consecuencia problemas en circulación, primariamente la oclusión de micro capilares y arteriolas por trombos, resultando crisis de dolor. (13)

La enfermedad de células falciforme aumenta la probabilidad de muerte en los primeros años de vida. En los estudios realizados en Jamaica la probabilidad de morir de estos niños alcanza hasta el 13% en los primeros 2 años de vida comparado con el 1% en niños con hemoglobina normal. Aunque la mayor mortalidad en individuos con Hb SS se presenta más frecuentemente entre los 6 y 12 años de edad y las principales causas son la falla esplénica y las infecciones respiratorias por pneumococo. Otras causas menos comunes de muerte en personas jóvenes incluyen septicemia, meningitis, crisis aplástica y gastroenteritis. (20).

1.9 ESTUDIOS REALIZADOS EN COLOMBIA

La tabla 2 muestra los resultados de hallazgos de hemoglobinas anormales encontradas en diferentes grupos de la población colombiana. (13)

Tabla 2. RESULTADOS DE ESTUDIOS REALIZADOS EN DIFERENTES POBLACIONES DE COLOMBIA.

ESTUDIO, AÑO POBLACIÓN N PROPORCIÓN DE

HEMOGLOBINOPATIAS Restrepo, 1966-1970 Indígena (Antioquia) 776 ---

Negra (Choco) 1.422 13,5

Mixtas- pacientes (Antio) 2.817 2,2

Pacientes hospitalizados

(Med)

2.466 6,6

Engelkes, 1989 Negra (Chocó) 810 5,2 Espinel, 1991 Negra (Chocó) 1.043 3,8 Indígena (Chocó) 52 21,2

(51)

Fonseca, 1994 Altiplano Cundí boyacense 300 0,6 Gover, 1995 Negra (Cauca) 1.474 15

Bernal, 1995 San Andrés y Providencia 544 14,3

En general la frecuencia de hemoglobinopatías en los estudios realizados fluctúa entre 0,6 y 21,2%, lo que indica que el espectro de la prevalecía de este tipo de patologías es amplio y depende de los factores raciales y geográficos. (13).

El portador de S (AS) es la hemoglobinopatía reportada con mayor frecuencia en los estudios en Colombia. Restrepo en población negra del Chocó encontró el 8,7%.

Engelkes, en seis veredas del Alto y medio Atrato reportó un promedio de 3,6%.

Espinel en población negra del Chocó encontró el 3,8% y en una población indígena del Chocó el 21,2%; esta población indígena estudiada está separada de la población negra por el río; en todos los estudios revisados las poblaciones indígenas investigadas no presentan hemoglobinopatías. Gover en poblaciones del Cauca reporta 8,2% y Bernal en las islas de San Andrés y Providencia el 6,8%. La hemoglobina SS fue encontrada por Gover en un 0,3% y Bernal en un 0,2% en sus respectivas poblaciones de estudio, señaladas anteriormente.(13,14)

Otras hemoglobinopatías como: Hb C en su forma homocigota (CC), Fonseca y Gover las encontraron en un 0,06%, mientras que los heterocigotos (AC), Restrepo, Gover y Bernal las reportaron en un 2,3%, 5,8% y 2,9% de los casos respectivamente. Además, la Hb DD solo fué identificada en un 0,06% de los casos

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por Gover. Un caso de persistencia hereditaria de Hb F (PHHF) es reportado por Bernal es sus estudios.(13,14)

Acerca de las talasemias, Fonseca reporta un caso de heterocigoto para delta- talasemia y Bernal 1,7% para alfa-talasemia y el 2% para S-β-talasemia de los casos.(13,14)

2. OBJETIVOS

El objetivo general de este estudio es estimar la frecuencia de las hemoglobinopatías presentes en los niños de ambos sexos entre uno y diez años de edad que consultan a los hospitales: Pediátrico y General de Barranquílla.

OBJETIVOS ESPECIFICOS:

1. Identificar las variantes de hemoglobina mediante electroforesis e isoelectroenfoque.

2. Correlacionar los hallazgos de hemoglobinopatías con el cuadro clínico de los pacientes.

3. Correlacionar los resultados de las variantes de hemoglobina con la biometría

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4. Elaborar un árbol genealógico de los pacientes afectados

5. Realizar consejería genética a la familia del afectado

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3. MATERIALES Y METODOS.

Se realizó un estudio de tipo descriptivo en niños de uno a diez años, en la ciudad de Barranquilla durante 1997 a 1998.

3. 1. SELECCION DE LA MUESTRA POBLACIONAL

El criterio para la selección de la muestra fue: los primeros 400 pacientes de ambos sexos entre uno a diez años de edad que consultaran por cualquier motivo a los servicios de emergencia y de medicina interna en los hospitales: Pediátrico y General de Barranquílla, previo consentimiento de los padres o acompañantes para ser incluido en el estudio.

La población de Barranquílla, según el censo de 1993 es de un total de 993.759 habitantes. De ellos, los niños con edades entre 1 y 10 años están calculados en 201.991, representando el 20% de la población total. Estos dos hospitales tienen una cobertura de aproximadamente el 30-40% de la población total de Barranquílla, principalmente habitantes del sur de la ciudad, con las siguientes características:

proceden de diversas regiones del litoral atlántico, alto grado de entrecruzamiento genético y alta tasa de natalidad.(12)

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3. 2. INDIVIDUOS A ANALIZAR.

Los pacientes que consultaron a estos centros hospitalarios, se eligieron mediante muestreo aleatorio simple y a las muestras de sangre obtenidas se les asignó un código para evitar el sesgo. A cada paciente se le elaboró una breve historia clínica con ayuda de sus familiares.

3. 3 CÁLCULO DE LA MUESTRA.

Se calculó mediante la fórmula generalmente usada para determinar tamaño de muestras, a través de la cual se obtuvo un total de 338 sujetos, sin embargo se incluyeron 400 lo cual da una confiabilidad del 99%.

FORMULA:

Confiabilidad = 99%

Error máximo aceptado = 1% α = 0,01 Z= 2,576 p= 15% q= 100 – 15 N = 338

3. 4. METODOS

3. 4. 1. EXTRACCION Y MANEJO DE LA MUESTRA

Previo consentimiento informado de los pacientes y de sus familiares se procedió a extraer 5 c. c. de sangre por punción venosa en tubos vacutainer que contienen EDTA como anticoagulante. Estos tubos se conservaron refrigerados en una nevera

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portátil a 6 C aproximadamente.

En el mismo día de la toma, las muestras fueron trasladadas a un laboratorio particular de la ciudad en donde se les realizó las pruebas biométricas. Un día después en los laboratorios de Bioquímica de la Universidad del Norte se les realizaron las siguientes pruebas: a) Inducción de drepanocítos, b) Estabilidad al isopropanol, c) Cuadro hemático, d) Electroforesis en acetato de celulosa, e isoelectroenfoque, e) Hb F y Hb A 2. Estas últimas se realizaron en el laboratorio de genética del Instituto Nacional de Salud en Bogotá, antes de los 8 días de tomada la muestra.

3.4.2 HEMATOCRITO E INDICES ERITROCITARIOS

El cuadro hemático se le realizó a cada una de las 400 muestras proveniente de los niños que participaron en el estudio, por medio de un contador de células automatizado, el cual proporcionó los siguientes índices eritrocitarios:

1. Recuento de glóbulos rojos (RGR), por mm3 de sangre.

2. Hemoglobina (Hb), gramos por 100 ml de sangre.

3. Hematocrito (HCTO), como porcentaje del volumen que ocupa los eritrocitos en un volumen determinado de sangre.

4. Hemoglobina corpuscular media (HCM), como promedio del peso en mg/dl.

5. Volumen corpuscular medio (VCM), como volumen promedio del glóbulo rojo en fl.

6. Concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM), concentración media

Referencias

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