Programa de Doctorado en Biociencias Moleculares
Generación de iPSC como modelo de estudio de enfermedades mitocondriales causadas
por mutaciones en GFM1 y POLG
Francisco Zurita Díaz
Madrid, 2018
Facultad de Medicina
Universidad Autónoma de Madrid
Generación de iPSC como modelo de estudio de enfermedades mitocondriales causadas
por mutaciones en GFM1 y POLG
Memoria que, para optar al grado de doctor en Biociencias Moleculares, presenta:
Francisco Zurita Díaz
Licenciado en Bioquímica
Directores de la tesis:
Dra. M.ª Esther Gallardo Pérez
Investigador Miguel Servet
Dr. Rafael Garesse Alarcón
Catedrático de Universidad
Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina. Universidad Autónoma de Madrid Instituto de Investigaciones Biomédicas "Alberto Sols". CSIC/UAM.
Facultad de Medicina
Mª Esther Gallardo Pérez, Investigador Miguel Servet del Instituto de Investigación Sanitaria del Hospital 12 de Octubre, i+12 y Rafael Garesse Alarcón, Catedrático de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad Autónoma de Madrid, como Directores de Tesis,
CERTIFICAN:
Que Don Francisco Zurita Díaz, con DNI 47337644X, licenciado en Bioquímica por la Universidad de Sevilla, ha realizado, bajo nuestra dirección, el trabajo titulado:
“Generación de iPSC como modelo de estudio de enfermedades mitocondriales causadas por mutaciones en GFM1 y POLG "
Una vez supervisado el trabajo, avalamos los resultados obtenidos y consideramos que reúne todos los requisitos necesarios en cuanto a originalidad y calidad para ser presentado como Tesis Doctoral con el objetivo de optar al título de Doctor en Biociencias Moleculares por la Universidad Autónoma de Madrid.
En Madrid, a 08 de Mayo de 2018.
M.ª Esther Gallardo Pérez Rafael Garesse Alarcón
Directora de la Tesis Director de la Tesis
Esta tesis doctoral ha sido realizada gracias a la concesión de una ayuda para la Formación de Profesorado Universitario (FPU13/00544) por parte del Ministerio de Educación, Cultura y Deporte a Francisco Zurita Díaz con una duración de tres años y cinco meses.
A todos aquellos con los
que me crucé durante este
camino y me dieron calor
Intenta no convertirte en un hombre de éxito sino en un hombre de valor
Albert Einstein
Agradecimientos
Gracias a todos los que directa o indirectamente me habéis acompañado durante mi tesis doctoral porque sin vosotros nada hubiera sido igual.
En primer lugar, gracias a mis directores de tesis. Gracias, Esther, por darme la oportunidad de trabajar por primera vez como científico y poder realizar la tesis en el laboratorio; por confiar en mí cuando ni siquiera yo lo hacía, por guiarme cuando estaba atascado y compartir conmigo tu experiencia. Espero que estés orgullosa del trabajo de estos años y que no te olvides de mi nombre con el paso del tiempo ☺. Gracias, Rafa, por abrirme las puertas del laboratorio y apoyarme en esta bonita y difícil etapa de la tesis.
El GRACIAS con mayúsculas va dirigido a Teresa, al principio mi jefa; después, mi compañera de laboratorio y, luego, mi compañera de vida. Gracias por enseñarme todos tus conocimientos y poner a punto tantas técnicas; por animarme en los momentos difíciles, por hacerme reír un día sí y otro también, y por enseñarme lo que verdaderamente es ser optimista. Espero que nunca pierdas esa gran ilusión que te caracteriza y que te hace brillar los ojitos.
Gracias al resto de miembros del B19 que me habéis acompañado durante esta etapa. Gracias, Miguel, por sacar siempre un rato cuando te tenía que preguntar cualquier duda y sobre todo gracias por recibir y reenviar a Esther ese email con el que quería solicitar la beca lanzadera CIBERER. Sin ti no hubiera llegado al laboratorio y me hubiera perdido esta gran aventura. Gracias, Belén, por tu amabilidad y tu apoyo en los primeros seminarios del B19. Gracias, Sarita, por todo tu respaldo desde que llegué al laboratorio y sobre todo por echarme tantas manos con la biosíntesis; sin tu ayuda no hubiera sido capaz de hacerlo. Gracias, Ramiro, por estar siempre dispuesto a echar un cable, por todo ese material del autoclave que siempre sacabas un hueco para colocar. Gracias, Albert, por acogerme como uno más del grupo y por tus enseñanzas con el Blue-Native. Gracias, Cris, por todos esos millones de feeder irradiadas, por todos esos miles de pedidos y por esos cientos de veces que me has ayudado a localizar cualquier reactivo. Gracias, Laura, por tener siempre una sonrisa y por esas
cariñosa. Gracias, Marketa, por tu ayuda con esas iPSC de OPA. Gracias a los nuevos fichajes del equipo iPSeros, a Maricarmen, a Bea, a Nathalie, a Marta, y a Viky, porque, aunque no hemos coincidido mucho, unos meses en el cuartito equivalen a décadas en la vida real. Gracias al resto de personas presentes y pasadas del B19: a María, a Ana, a Rubén, a Sandra, a Sophie, y a Cris, la Granaína.
Gracias también al B20. Gracias, Marga y Juan, por vuestras aportaciones en los seminarios. Gracias, Pedro, por esas conversaciones después de las cuales nos quedábamos más rayados aún. Gracias, Bego y Lidia, por vuestra simpatía. Gracias también a Chema, a Sara Laine y a Sonia, que de una manera u otra habéis vivido esta tesis.
Gracias al resto de compañeros de pasillo y amigos. Gracias, Antoñito, por ser como eres. Gracias, Raúl, por esas conversaciones tan surrealistas, por esos almuerzos inolvidables en la cafetería, por tus pedidos en Amazon, por tu apoyo con los geles, por tu ayuda con los astrocitos y sobre todo por ser un buen amigo. Gracias, Lourdes, por tu alegría contagiosa. Gracias a Alfredo, a César, a Marta Celorio, a Ángela, y a Marta B11, por esas BBQ de bioquímica memorables.
Gracias a mis compañeros del “furbito” Omar, Adri, Manu, José B16, Nachocito, Diego CR7, Nacho, Adrián Palencia, León, Luiska, Antonio, Javi, Sergio, Ricardo, Coral, Francesc, Emilio, Oscar, Valerio y los Danis por esos fantásticos partidos que nunca olvidaré. Espero seguir por aquí y poder compartir más pachangas con vosotros.
Gracias Laura "12 de Octubre" por esas cadenas interminables, ha sido un placer conocerte, ¡¡¡ vamos EQUIPOOO!!!. Gracias Miguel Ángel por apoyarme durante mis charlas del CIBERER y del i+12.
Gracias a los servicios que me han apoyado durante esta tesis doctoral, no solo por sus conocimientos técnicos sino por su simpatía y cariño. Gracias a Leandro Sastre por esas qPCR; a Laura de citometría; a María Teresa, Raquel y Patricia del SPR, y a Mercedes de cultivos. Gracias a Raquel y Carmen del servicio de lavado y autoclave.
Gracias a nuestras limpiadoras Cari, Rosmeri, Rosi, Gema y Jesús del servicio de limpieza. En especial, gracias a Lucía Sánchez, a Diego Navarro, a Lucía Guerrero y a Arancha, por vuestro interés y disponibilidad para buscar soluciones, porque hacéis que sea un placer ir al confocal y estar con vosotros.
Gracias, Ana Sánchez, José Pérez, Margarita Fernández e Isabel Sánchez por ayudarme con todos esos papeles para el doctorado y la FPU.
Gracias a Oscar Hernán, a Teresa González, a Pilar Eraso y a Ana por esas maravillosas prácticas. Gracias, en espacial, a Víctor Calvo por toda su ayuda con esos miles de documentos de docencia.
Gracias a Noelia Beneto e Isaac Canals por todos esos emails para resolverme dudas sobre las SNM.
Gracias a mis compañeros de máster: Damián, Sara, Raquel, Manu y Ana Carmen, por ser como sois. Gracias a mis “brothers”: Antonio García, Javi Torres y Antonio Boza, por esos fabulosos años de facultad. Gracias a Esther Palomino por su cariño y por enseñarme lo que es ser constante.
Gracias a mi profesor, Antonio Ayala, por esas fascinantes clases de nutrición y darme la oportunidad de solicitar esa beca de colaboración con la que conocí realmente lo que es un laboratorio. Gracias, Mario, por enseñarme todos tus conocimientos y tratarme tan bien cuando llegué al laboratorio. Gracias a Naranjo por todas esas horas de trabajo y risas con las ratillas y cortando cerebrillos. No puedo olvidarme de dar las gracias al resto de compañeros: Alex, Rianne, Ana, Rocío, Afrah, Venero y Antonio.
Gracias a mis amigos: Félix, Uñita, DjNeo, Pablo, Juani, Turu, Poki, Joselu, Chorlo, Migue, Mallen, Pikiki, Kruje, Arias, Ruchy…, que desde la distancia me habéis acompañado estos años. Gracias a mis compis del WoW: Fran, Trolin, Sikalas, Elzor,
Davich, Kechup y Chirly por esas incontables bgs, aleas, e iccs que me hacían desconectar del mundo.
Por último, los más importantes, mi familia. Gracias, papá, por enseñarme a ser un hombre de palabra, un hombre trabajador y honrado que vela por el bienestar de su familia. Gracias, mamá, por todo tu trabajo en casa, por todas esas horas preguntándome la lección, por todos esos viajes a Sevilla -fuese cual fuese el motivo- y por enseñarme que, si todos pusiéramos un poquito de nuestra parte, el mundo sería un lugar mejor. Sin vuestro trabajo y sacrificio no hubiera conseguido llegar tan lejos,
¡GRACIAS! Gracias a mi hermana Lolina por su amor y apoyo. Gracias a mi “hermano”
Lagui por estar SIEMPRE ahí. Gracias a mis abuelos, a mis tí@s y a mis prim@s por todo vuestro cariño y por creer en mí. En especial, a mi tío José por su apoyo con la redacción del presente trabajo. Espero no defraudaros nunca.
¡Muchas gracias a todos!
Resumen/Summary
Las enfermedades mitocondriales (EM) constituyen un amplio grupo de patologías genéticas cuyo nexo de unión es una disfunción en el sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS). Actualmente, no existen tratamientos efectivos para estas enfermedades debido, entre otras causas, a la falta de modelos de enfermedad adecuados. En este sentido, la utilización de la tecnología de las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) puede ser de gran ayuda para conocer los mecanismos patogénicos involucrados en las EM.
Por ello, en esta tesis se han generado y caracterizado iPSC a partir de un individuo sano y de dos pacientes con EM causadas por mutaciones en los genes nucleares: GFM1, que codifica para el factor de elongación de la traducción mitocondrial G1 (EFG1) y POLG, que codifica para la subunidad catalítica de la ADN polimerasa mitocondrial.
Posteriormente, las líneas iPSC se han diferenciado a neuronas y astrocitos con el propósito de establecer modelos in vitro de ambas patologías. En el modelo con mutaciones en el gen GFM1 se aprecia un defecto en OXPHOS en las líneas de células madre neuronales (NSC). Además los altos niveles de láctico extracelular, tanto en NSC como en neuronas, revelan un posible incremento del metabolismo glucolítico para obtener ATP por esta vía. Todo ello sugiere una posible alteración en la capacidad respiratoria mitocondrial en las células derivadas del paciente causada probablemente por bajos niveles de la proteína EFG1. Asimismo, la presencia de estas mutaciones dificulta la diferenciación correcta de las líneas de NSC a neuronas y astrocitos. Por otro lado, el modelo con la mutación en el gen POLG ha permitido detectar actividad disminuida en algunos complejos de la cadena de transporte electrónico en las NSC, junto con altos niveles de láctico y un menor número de copias de ADN mitocondrial en las neuronas derivadas del paciente.
En resumen, los diferentes tipos celulares diferenciados a partir de las líneas iPSC de ambos pacientes recapitulan, al menos en parte, algunos de los aspectos bioquímicos de la patología y se confirman como un buen modelo in vitro para el estudio de estas EM. Además, estos modelos podrían permitir, en el futuro, la búsqueda de dianas farmacológicas y el cribado de fármacos de alto rendimiento.
Mitochondrial diseases (MD) constitute a wide range of genetic diseases whose common link is an impairment of the oxidative phosphorylation system (OXPHOS). At this moment, there are no effective treatments available for MD, due in part to the lack of appropriate experimental models. In this sense, induced pluripotent stem cells (iPSC) technology emerges as a promising possibility to study the pathogenic mechanisms involved in MD.
In this doctoral thesis, iPSC from a healthy individual and two patients suffering from MD caused by GFM1 and POLG nuclear gene mutations have been generated and characterized. GFM1 encodes for the mitochondrial translation elongation factor G1 (EFG1) and POLG for the catalytic subunit of the mitochondrial DNA polymerase.
Subsequently, iPSC were differentiated into neurons and astrocytes in order to establish in vitro models for both pathologies. In the model harboring mutations in the GFM1 gene a defect in OXPHOS in the neural stem cell lines (NSC) has been found.
Moreover, high extracellular lactate levels both in NSC and neurons could suggest an increase in the glycolytic pathway to obtain ATP. All these data might point out to an alteration in the mitochondrial respiratory capacity in patient-derived cells, probably caused by low EFG1 protein levels. Likewise, the presence of these mutations hinders the NSC proper differentiation into neurons and astrocytes. On the other hand, the model harboring mutations in the POLG gene showed a diminished activity in some of the electron transport chain complexes in NSC. Besides, higher lactic acid levels and lower mitochondrial DNA copy number have been found in neuron patient-derived cells.
In summary, the different cell types obtained by differentiation of iPSC lines from both patients mimic, at least partially, some biochemical features related to these MD and validate themselves to be a proper in vitro model for the study of these disorders. Besides, these models could allow, in the near future, the finding of pharmacological targets and the development of a high-throughput drug screening platform.
Índice
1 Abreviaturas ... 31
2 Introducción ... 35
2.1 Mitocondrias ... 37
2.1.1 Estructura ... 37
2.1.2 Genética mitocondrial ... 38
2.1.2.1 Replicación del ADNmt... 40
2.1.2.2 Traducción del ADNmt ... 42
2.1.3 Funciones de la mitocondria ... 43
2.2 Enfermedades mitocondriales ... 44
2.2.1 Enfermedades mitocondriales causadas por mutaciones en el ADNmt ... 45
2.2.2 Enfermedades mitocondriales causadas por mutaciones en el ADNn... 46
2.2.2.1 Defectos en la ADN polimerasa mitocondrial ... 47
2.2.2.2 Defectos en el factor de elongación de la traducción mitocondrial ... 48
2.3 Células madre pluripotentes ... 49
2.3.1 Aplicaciones de las iPSC ... 51
2.3.2 hiPSC como modelo de enfermedades mitocondriales ... 52
3 Objetivos ... 57
4 Material y Métodos ... 61
4.1 Material ... 63
4.1.1 Reactivos, soluciones y tampones ... 63
4.1.1.1 ROCK inhibitor ... 63
4.1.1.2 Colagenasa tipo IV ... 63
4.1.1.3 Albúmina de suero bovino ... 63
4.1.1.4 Factor de crecimiento básico de fibroblastos ... 64
4.1.1.5 Tampón fosfato ... 64
4.1.1.6 Paraformaldehído ... 64
4.1.1.7 Ácido ascórbico ... 64
4.1.1.8 Piruvato ... 65
4.1.1.9 Emetina ... 65
4.1.1.10 Inhibidores y desacoplantes para medidas de respirometría ... 65
4.1.2 Radioisótopos ... 66
4.1.3 Cultivos primarios ... 66
4.1.4 Oligonucleótidos ... 67
4.1.5 Anticuerpos ... 70
4.1.5.1 Anticuerpos para el análisis de diferenciación in vitro mediante EB ... 70
4.1.5.2 Anticuerpos para detectar marcadores de pluripotencia en iPSC ... 70
4.1.5.3 Anticuerpos para identificar células madre neuronales, neuronas y astrocitos ... 71
4.1.5.4 Anticuerpos para la cuantificación de EGF1 mediante Western blot ... 72
4.1.6 Medios de cultivo ... 72
4.2 Métodos ... 77
4.2.1 Expansión, criopreservación y descongelación de cultivos primarios ... 77
4.2.1.2 Mioblastos ... 78
4.2.2 Expansión, criopreservación y descongelación de iPSC ... 79
4.2.2.1 iPSC crecidas sobre feeder ... 79
4.2.2.2 Adaptación de iPSC cultivadas sobre células feeder a matrigel ... 82
4.2.2.3 iPSC crecidas sobre matrigel hESC ... 83
4.2.3 Reprogramación no integrativa de fibroblastos ... 85
4.2.4 Análisis de la pluripotencia de líneas iPSC ... 85
4.2.4.1 Análisis de fosfatasa alcalina ... 85
4.2.4.2 Análisis de expresión de genes de pluripotencia mediante RT- qPCR ... 85
4.2.4.3 Análisis de hipometilación de las regiones promotoras en genes de pluripotencia ... 86
4.2.4.4 Detección de marcadores específicos de células pluripotentes mediante inmunofluorescencia ... 87
4.2.4.5 Ensayo de diferenciación in vitro mediante EB ... 87
4.2.5 Estudios de confirmación de la calidad de las líneas iPSC ... 88
4.2.5.1 Análisis de la huella genética de ADN ... 88
4.2.5.2 Análisis de detección del virus Sendai en iPSC ... 89
4.2.5.3 Análisis del cariotipo ... 90
4.2.6 Diferenciación de iPSC hacia células del sistema nervioso central ... 90
4.2.6.1 Generación de masas neuronales esféricas a partir de iPSC ... 90
4.2.6.2 Expansión, criopreservación y descongelación de SNM ... 92
4.2.6.3 Diferenciación de los SNM a neuronas ... 93
4.2.6.4 Generación de células madre neuronales a partir de iPSC ... 93
4.2.6.5 Expansión, criopreservación y descongelación de NSC ... 94
4.2.6.6 Diferenciación de NSC a neuronas y astrocitos ... 95
4.2.7 Aislamiento de ADN de células en cultivo ... 96
4.2.8 Aislamiento de ARN de células en cultivo ... 96
4.2.9 Transcripción en reverso de ARN total ... 97
4.2.10 Extracción y cuantificación de proteínas a partir de células en cultivo ... 97
4.2.11 Análisis de detección de micoplasmas ... 97
4.2.12 Detección de NSC, neuronas y astrocitos mediante inmunofluorescencia ... 97
4.2.13 Análisis de mutaciones ... 97
4.2.14 Determinación del haplogrupo mitocondrial. ... 98
4.2.15 Métodos empleados en la caracterización de la función mitocondrial ... 98
4.2.15.1 Medida del consumo de O2 por respirometría de alta resolución ... 98
4.2.15.2 Cuantificación de ácido láctico extracelular ... 99
4.2.15.3 Determinación de la actividad de los complejos de la cadena respiratoria mediante espectrofotometría ... 100
4.2.15.4 Análisis in vivo de la síntesis de proteínas mitocondriales ... 100
4.2.15.5 Cuantificación de EFG1 mediante Western blot ... 101
4.2.15.6 Identificación de deleciones en el ADNmt mediante PCR larga ... 101
4.2.15.7 Cuantificación absoluta de niveles de ADNmt mediante qPCR multiplex ... 102
4.2.16 Análisis estadístico... 103
5 Resultados ... 105
5.1 Generación de líneas iPSC a partir de fibroblastos con Sendai virus ... 107
5.1.1 Generación de líneas iPSC controles ... 107
5.1.1.1 Caracterización molecular y funcional de la pluripotencia de líneas iPSC controles ... 108
5.1.1.2 Otros estudios de confirmación de la calidad de la de líneas iPSC controles ... 109 5.1.2 Generación de líneas iPSC portadoras de mutaciones en el gen GFM1 ... 111
5.1.2.1 Caracterización molecular y funcional de la pluripotencia de las líneas iPSC portadoras de mutaciones en el gen GFM1 ... 112 5.1.2.2 Otros estudios de confirmación de la calidad de la de líneas iPSC
portadoras de mutaciones en el gen GFM1 ... 113 5.2 Generación de neuronas a partir de SNM derivadas de iPSC controles e iPSC
portadoras de dos mutaciones en el gen GFM1 ... 115 5.3 Generación de neuronas a partir de NSC derivadas de iPSC controles e iPSC
portadoras de dos mutaciones en el gen GFM1 ... 116 5.4 Generación de astrocitos a partir de NSC derivadas de iPSC controles e iPSC
portadoras de dos mutaciones en el gen GFM1 ... 117 5.5 Estudios de caracterización de la función mitocondrial en las líneas portadoras de
dos mutaciones en el gen GFM1 ... 118 5.5.1 Medida del consumo de O2, por respirometría de alta resolución, en
fibroblastos, iPSC, SNM, NSC, neuronas y astrocitos obtenidos a partir de un paciente con dos mutaciones en el gen GFM1 ... 119 5.5.2 Cuantificación de producción de ácido láctico extracelular en fibroblastos,
iPSC, NSC y neuronas obtenidas a partir de un paciente con dos mutaciones en el gen GFM1 ... 120 5.5.3 Medida de la actividad de los complejos de la cadena respiratoria
mitocondrial por espectrofotometría en fibroblastos, iPSC y NSC obtenidos a partir de un paciente con dos mutaciones en el gen GFM1... 121 5.5.4 Análisis in vivo de la síntesis de proteínas mitocondriales en fibroblastos y
NSC obtenidas a partir de un paciente con dos mutaciones en el gen GFM1 ... 122 5.5.5 Cuantificación de los niveles de EGF1 en fibroblastos, NSC y neuronas
obtenidas a partir de un paciente con dos mutaciones en el gen GFM1 ... 123 5.6 Generación de líneas iPSC portadoras de una mutación en el gen POLG ... 123
5.6.1 Caracterización molecular y funcional de la pluripotencia de líneas iPSC portadoras de una mutación en el gen POLG... 124 5.6.2 Otros estudios de confirmación de la calidad de las líneas iPSC portadoras
de una mutación en el gen POLG ... 125 5.7 Generación de neuronas a partir de NSC derivadas de iPSC controles e iPSC
portadoras de una mutación en el gen POLG ... 126 5.8 Generación de astrocitos a partir de NSC derivadas de iPSC controles e iPSC
portadoras de una mutación en el gen POLG ... 127 5.9 Caracterización de la función mitocondrial en las líneas portadoras de una
mutación en el gen POLG ... 127 5.9.1 Cuantificación de producción de ácido láctico extracelular en fibroblastos,
NSC y neuronas obtenidas a partir de un paciente con mutación en el gen POLG ... 128 5.9.2 Medida de la actividad de los complejos de la cadena respiratoria
mitocondrial por espectrofotometría en fibroblastos y NSC obtenidos a partir de un paciente con una mutación en el gen POLG ... 128 5.9.3 Identificación de deleciones en el ADNmt, mediante PCR-larga, en
fibroblastos, iPSC y neuronas obtenidas a partir de un paciente con una mutación en el gen POLG ... 129
5.9.4 Análisis de la cantidad de moléculas de ADNmt, mediante qPCR, en fibroblastos y neuronas obtenidas a partir de un paciente con una
mutación en el gen POLG ... 130
6 Discusión ... 159
6.1 Metodología de generación de iPSC. Ventajas del virus Sendai ... 161
6.2 Confirmación de la pluripotencia y de la calidad de las líneas iPSC generadas ... 162
6.3 Diferencias observadas en la diferenciación neuronal y astroglial entre las NSC de pacientes y controles... 165
6.4 Modelo in vitro de EM causadas por mutaciones en genes nucleares ... 172
6.4.1 GFM1 ... 172
6.4.2 POLG ... 175
7 Conclusiones ... 177
8 Bibliografía ... 181
9 Anexos ... 195
1 Abreviaturas
AANE Aminoácidos no esenciales
ADM Medio de diferenciación a astroglial ADNmt ADN mitocondrial
ADNn ADN nuclear
adPEO Oftalmoplejia externa progresiva autosómica dominante AE Actividad específica
AFP α-fetoproteína
AHS Síndrome de Alpers-Huttenlocher ANS Espectro de neuropatía atáxica AP Fosfatasa alcalina
ARA-C Citarabina ARNr ARN ribosómico ARNt ARN de transferencia
arPEO Oftalmoplejia externa progresiva autosómica recesiva b-FGF Factor de crecimiento básico de fibroblastos
BSA Albúmina de suero bovino Células ES Células madre embrionarias
CI-CV Complejos de la cadena respiratoria CI-CV CMP Células madre pluripotentes
CPEO Oftalmoplejia externa progresiva crónica CS Citrato sintasa
CTE Cadena de transporte electrónico DMEM Medio Dulbecco’s Modified Eagle’s DMSO Dimetil sulfóxido
EB Cuerpo(s) embrionario(s)
EFG1 Factor de elongación de la traducción mitocondrial G1 EM Enfermedades mitocondriales
FCCP Carbonilcianuro-p-trifluorometoxifenilhidrazona GFAP Proteína ácida fibrilar glial
GFR Growth Factor Reduced
iPSC Células madre pluripotentes inducidas
KSS Síndrome de Kearn-Sayre
LHON Neuropatía óptica hereditaria de Leber
LS Síndrome de Leigh
MAP2 Proteína asociada a microtúbulos 2
MCHS Espectro de miocerebrohepatopatía infantil
MELAS Miopatía con encefalopatía, acidosis láctica y accidentes cerebrovasculares MEMSA Epilepsia mioclónica, miopatía y ataxia sensorial
MERRF Epilepsia mioclónica y fibras rojas rasgadas
MM Medio de marcaje
MME Membrana mitocondrial externa MMI Membrana mitocondrial interna
mtSSB Proteína de unión a ADN de cadena sencilla NARP Neuropatía, ataxia y retinitis pigmentosa NDM Medio de diferenciación neuronal NEM Medio de expansión neuronal NHDF Fibroblastos de piel humanos control NIM Medio de inducción neuronal
NP Precursores neuronales NSC Células madre neuronales OXPHOS Fosforilación oxidativa
POLG ADN polimerasa gamma mitocondrial qPCR PCR cuantitativa
RFLP Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción RN Rosetas neuronales
ROS Especies reactivas de oxígeno SBF Suero bovino fetal
SeV Virus Sendai
SGM Medio de crecimiento de células musculares esqueléticas SMA α-actina de músculo liso
SNM Masas neuronales esféricas Tuj1 β-3-tubulina
2 Introducción
2.1 Mitocondrias 2.1.1 Estructura
La mitocondria es un orgánulo celular presente en casi todas las células eucariotas [1, 2]. Aunque fue descrita por primera vez en 1890 por Altmann [3], su estructura no se conoció hasta 60 años más tarde gracias a las contribuciones de Palade y Sjostrand [4]. Estructuralmente presenta una doble membrana: la membrana mitocondrial externa (MME), permeable a pequeñas moléculas e iones, y la membrana mitocondrial interna (MMI), mucho menos permeable, por lo que necesita de la presencia de transportadores específicos que permitan el paso de moléculas, metabolitos e iones a través de ella [5].
Estas membranas definen dos compartimentos claramente diferenciados en su interior: el espacio intermembrana, localizado entre ambas, y la matriz mitocondrial, en el interior de la MMI [6]. La MMI se pliega sobre sí misma formando unas invaginaciones lamelares denominadas crestas mitocondriales [7] (figura 1). Estas crestas permiten incrementar en gran medida la superficie de la MMI y su capacidad funcional [8], razón por la cual células con mayores requerimientos energéticos, no sólo presentan mayor número de mitocondrias [9], sino que estas presentan un mayor número de crestas mitocondriales [7]. Cabe destacar que, aunque tradicionalmente se ha considerado a las mitocondrias como orgánulos individuales y estáticos, hoy en día se conoce que las mitocondrias forman un sistema reticular dinámico que va experimentando cambios en su morfología y distribución mediante continuos eventos de fusión y fisión [10].
Figura 1: Estructura de la mitocondria.
Estructuralmente presentan una doble mem- brana: membrana mitocondrial externa (MME) y membrana mitocondrial interna (MMI). Estas membranas definen dos com- partimentos: el espacio intermembrana, loca- lizado entre ambas y la matriz mitocondrial, en el interior de la MMI. La MMI se pliega sobre sí misma formando crestas mitocon- driales.
2.1.2 Genética mitocondrial
Desde hace varias décadas se conoce que las mitocondrias poseen su propio ADN (ADNmt) [11] y una maquinaria de transcripción en su interior [12]. Sin embargo, a pesar de la existencia de un sistema genético propio, la mayoría de las proteínas que constituyen el proteoma mitocondrial (aproximadamente unas 1500 proteínas) [13]
están codificadas por genes nucleares. Estas proteínas son traducidas por ribosomas citoplasmáticos y transportadas a la mitocondria a través de diversos sistemas de importe [14]. Por este motivo, las mitocondrias se consideran orgánulos semiautónomos ya que su genoma tiene una capacidad codificante limitada y necesita la contribución del genoma nuclear (ADNn) para su correcto funcionamiento [15].
Entre estos genes nucleares, podemos encontrar genes relacionados con subunidades estructurales de la cadena de transporte electrónico (CTE), genes implicados en la biogénesis mitocondrial, en procesos de fusión-fisión mitocondrial o que participan en el ensamblaje de la CTE entre otros [1].
El ADNmt humano consiste en una pequeña molécula de ADN circular de doble cadena con un tamaño de 16,5 kb [16] cuya secuencia de referencia puede consultarse en la página web del "National Center for Biotechnology Information"
(www.ncbi.nlm.ni-h.gov/NC_012920.1). La estructura genética del ADNmt es extraordinariamente compacta, con apenas espacios intergénicos y sin intrones [1, 16].
Su capacidad codificante es muy limitada puesto que codifica un número reducido de genes, solo treinta y siete: trece polipéptidos que forman parte de la CTE, dos ARN ribosómicos (ARNr 12S y 16S) y veintidós ARN de transferencia (ARNt) [16] esenciales para la síntesis de proteínas en la mitocondria [17, 18] (figura 2). Las dos cadenas que constituyen la molécula de ADNmt se diferencian en su composición nucleotídica; una de ellas es rica en guanina, con una mayor densidad, denominándose cadena pesada (H), mientras que la otra es rica en citosinas, denominándose cadena ligera (L) [1]. En la cadena L se encuentran genes que codifican para ocho ARNt y un polipéptido (MT- ND6) de la CTE, mientras que el resto de genes se encuentran en la cadena H [19].
La mayor región no codificante del ADNmt, denominada D-loop en mamíferos, contiene los tres promotores a partir de los cuales se inicia la transcripción tanto de la cadena pesada (H) como de la ligera (L) (HSP1, HSP2 y LSP), así como el origen de replicación de la cadena pesada (OH) [16, 20]. La segunda región no codificante del ADNmt es una secuencia de apenas treinta nucleótidos, que contiene el origen de replicación de la cadena ligera (OL) [20].
La genética mitocondrial presenta otra serie de características que la diferencian claramente de la nuclear:
1. El genoma mitocondrial es poliploide ya que una célula posee de cientos a miles de copias de ADNmt [21, 22] dependiendo de la demanda energética [1].
En este sentido pueden darse dos situaciones posibles: homoplasmia, cuando todas las moléculas presentes son idénticas, o heteroplasmia, cuando coexisten diferentes variantes de ADNmt [21, 23]. Esta propiedad de la genética mitocondrial es clave para entender la patogenia producida por mutaciones en el ADNmt, ya que provoca un fenómeno conocido como “efecto umbral”, en el que el fenotipo de una determinada mutación no sólo depende de la severidad de ella, sino que está modificado por el porcentaje de moléculas de ADNmt que la presentan [24].
Figura 2: Estructura del ADNmt humano.
Molécula de ADN circular bicatenario de 16,5kb que codifica para 22 ARNt (letras identificativas de los aminoácidos en la circunferencia interior; en blanco), 2 ARNr (MT-RNR1 y 2; en rosa), 7 subunidades del complejo I (MT-ND1, 2, 3, 4, 4L, 5, 6; en rojo), 1 subunidad del complejo III (MT- CYB; en azul), 3 subunidades del complejo IV (MT-CO1, MT-CO2, MT-CO3; en amarillo) y 2 subunidades del complejo V (MT-ATP6, y 8; en verde). Región no codificante D-loop (color gris) contiene el origen de replicón de la cadena pesada OH. OL origen de replicación de la cadena ligera.
2. El ADNmt se hereda exclusivamente por vía materna en mamíferos [25], aunque se ha descrito un caso esporádico de herencia paterna [26].
3. La molécula de ADNmt presenta un código genético propio que varía ligeramente del código genético universal [27].
4. Las moléculas de ADNmt pueden replicarse de manera independiente al ciclo celular, repartiéndose al azar durante la mitosis, fenómeno que se conoce como segregación mitótica y que puede dar como resultado células hijas con distinto contenido de ADNmt [28].
El ADNmt es especialmente susceptible de acumular cambios comparado con el ADNn [1]. Este fenómeno puede deberse a: i) un mayor daño oxidativo debido a la cercanía del ADNmt a la fuente más importante de especies reactivas de oxigeno (ROS), la CTE [29, 30]; ii) a la falta de histonas protectoras [31]; iii) a ineficientes mecanismos de reparación y iv) a defectos en la replicación [30].
El efecto de estos cambios en la secuencia mitocondrial varía desde mutaciones que producen enfermedades severas, a polimorfismos. El conjunto de estos polimorfismos estables, en principio neutros, acumulados a lo largo de evolución en las poblaciones humanas, se conoce como haplogrupos mitocondriales. Cada haplogrupo está definido por cambios específicos en la secuencia del ADNmt, que no suelen ser heteroplásmicos y se clasifican utilizando una nomenclatura con letras de la A a la Z [1]. Es importante destacar que los haplogrupos mitocondriales influyen en la predisposición individual a un amplio espectro de enfermedades humanas [32], incluyendo enfermedades mitocondriales tales como la Neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON) [33].
2.1.2.1 Replicación del ADNmt
Inicialmente se consideró que el ADNmt estaba desprotegido; sin embargo, durante las últimas décadas se ha visto que el ADNmt está cubierto y empaquetado por proteínas formando unos agregados denominados nucleoides [15, 17, 34]. Estos complejos ADNmt-proteínas están asociados con la MMI y espaciados uniformemente a lo largo de las crestas mitocondriales [1]. Estos nucleoides poseen entre una o dos
molécula de ADNmt [34] junto con la maquinaría requerida para su replicación, transcripción, reparación y empaquetamiento [35].
Aunque actualmente existe gran controversia acerca de la regulación de la biogénesis del ADNmt en células de mamíferos, se ha descrito que la replicación del ADNmt sucede de manera continua a lo largo del ciclo celular y de forma independiente a la replicación del ADNn. A pesar de ello, la replicación y el mantenimiento de la integridad del ADNmt se maneja completamente desde el núcleo [1].
En eucariotas, el ADNmt es replicado en un “replisoma” (un complejo formado entre el ADNmt y las proteínas que constituyen la maquinaria de replicación) por la acción concertada de la ADN polimerasa gamma mitocondrial (POLG) y factores de replicación tales como la proteína de unión a ADN de cadena sencilla (mtSSB), la helicasa de ADNmt (Twinkle), topoisomerasas y factores de iniciación, entre otros [15, 35, 36]. POLG es la única polimerasa descrita, hasta hoy, que ejerce su función en la mitocondria. En humanos, el holoenzima es un herotrímero compuesto por una subunidad catalítica codificada por el gen POLG y dos subunidades accesorias codificadas por el gen POLG2 [15]. En cuanto a los factores accesorios de la replicación, Twinkle es una helicasa codificada por el gen C10orF2 que desenrolla la doble hélice de ADNmt facilitando el paso de la ADN polimerasa sobre la cadena molde [36]. También se ha visto que tiene actividad primasa, requerida para sintetizar los cebadores durante la síntesis de ADNmt [1]. mtSSB es una proteína de unión al ADN de cadenas sencilla codificada por el gen mtSSB que estabiliza regiones del ADNmt monocatenarias en la horquilla de replicación, potenciando la actividad de POLG [1].
En humanos, han sido identificadas varias topoisomerasas (topoisomerasa I y IIIα) encargadas de liberar la tensión generada en la molécula circular de ADNmt durante el proceso de replicación [1].
2.1.2.2 Traducción del ADNmt
La mayor parte del proteoma mitocondrial está codificado en el ADN nuclear;
sin embargo, algunas de sus proteínas están codificadas en el ADNmt y son sintetizadas por la maquinaria de traducción mitocondrial [1, 17].
Aunque las mitocondrias poseen su propia maquinaria de traducción mitocondrial [37], tan solo los ARNr 12S y 16S que forman el ribosoma mitocondrial (mitorribosomas) y los ARNt están codificados en el ADNmt [16, 17]. El resto de componentes, incluyendo aproximadamente 80 proteínas ribosomales, las aminoacil- ARNt sintetasas y los factores de iniciación, elongación y terminación de la traducción están codificados en el ADNn y son importados al interior de la mitocondria [17, 38].
Los componentes responsables de la traducción mitocondrial son diferentes de sus equivalentes citosólicos y están más relacionados con los de las bacterias; no obstante, los mecanismos de la traducción siguen los mismos pasos principales:
iniciación, elongación, terminación y reciclaje del ribosoma [17, 37].
En mamíferos se han identificado dos factores de iniciación de la traducción:
mtIF2 y mtIF3 [39, 40]; tres factores de elongación: mtEF-Tu, mtEF-Ts y mtEFG1 [41-43]
y tres factores de terminación mitocondriales: mtRF1a, mtRRF1 y mtRRF2 (mtEFG2) [41, 44, 45].
El proceso de traducción mitocondrial comienza gracias a los factores de iniciación mitocondrial mtIF2 y mtIF3, que posibilitan la separación de las dos subunidades (28S y 39S) del mitorribosoma 55S facilitando la formación del complejo de iniciación (mitorribosoma, ARNm y ARNt-Met). En cuanto se liberan los factores de iniciación, comienza la elongación. En ella, los factores de elongación mitocondrial mtEF-Tu, mtEF-Ts y mtEFG1 intervienen en la translocación del mitorribosoma permitiendo el movimiento de un nuevo ARNt aminoacilado del sitio A al sitio P, donde se cataliza el enlace peptídico. Cuando el codón de parada llega al sitio A, comienza la terminación en la que el factor de liberación mitocondrial mtRF1a desencadena la hidrólisis del enlace entre el ARNt terminal y el polipéptido naciente. Como paso final,
los factores de reciclado mitocondrial mtRRF1 y mtRRF2 inducen la liberación del ARNm, ARNt y las subunidades del mitorribosoma [17, 37, 38].
2.1.3 Funciones de la mitocondria
En la mitocondria tienen lugar numerosas rutas metabólicas tales como el ciclo de Krebs, la β-oxidación de ácidos grasos, la síntesis de grupos hemo [1, 5], centros sulfoférricos [46], esteroides [1] y lípidos [5, 47], entre otras. Al mismo tiempo, la mitocondria participa en procesos celulares esenciales como en la producción de ROS [48, 49], apoptosis [50, 51] y homeostasis del calcio [52]. Pero, sin lugar a dudas, la función más relevante de la mitocondria es la generación de energía en forma de ATP mediante un proceso denominado fosforilación oxidativa (OXPHOS), que es llevado a cabo por la CTE. La CTE está constituida por cinco complejos enzimáticos multiheteroméricos (CI-CV) más dos transportadores de electrones (coenzima Q y citocromo C) [21] localizados en la MMI [7]. En esta CTE, los complejos I y II son los responsables de la oxidación de los cofactores reducidos NADH y FADH2 procedentes del catabolismo de los nutrientes. Los electrones cedidos por estas coenzimas son trasladados desde unos transportadores a otros de forma secuencial y a favor de potencial oxidorreductor hasta que, en última instancia, reducen el O2 a H2O mediante el complejo IV. Esta transferencia de electrones a través de los diferentes componentes de la CTE está acoplada al bombeo de protones por los complejos I, III, y IV desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana, generando un gradiente electroquímico [21, 53]. La energía generada por la disipación de este gradiente de protones a través del complejo V o ATPasa se utiliza para la síntesis de ATP a partir de ADP+ Pi según la teoría quimiosmótica de Mitchell (1967) [54] (figura 3).
Figura 3: Cadena de transporte electrónico. Complejos I-V de la CTE localizados en la MMI.Los complejos I y II captan electrones de los cofactores NADH y FADH2 que finalmente serán cedidos al O2. Este transporte electró- nico está acoplado al bombeo de H+ desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana generando un gra- diente electroquímico. La disipación
2.2 Enfermedades mitocondriales
Dado el amplio número de procesos celulares en los que participa la mitocondria, no es de extrañar que defectos en la función mitocondrial y, en particular, defectos en la síntesis de ATP sean la causa de un amplio número de patologías.
Las enfermedades mitocondriales (EM) o encefalopatías mitocondriales [55]
constituyen un amplio grupo de enfermedades genéticas raras cuyo nexo de unión es una disfunción en el sistema OXPHOS [28], excluyéndose por tanto disfunciones en otros procesos mitocondriales [56]. Aunque las EM tienen entidad propia, se ha observado la asociación entre disfunción mitocondrial y condiciones patológicas más comunes tales como: enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, cáncer, diabetes y obesidad entre otras [57]. Incluso, parece haber relación entre la disminución en la expresión de genes mitocondriales y el envejecimiento humano normal [58].
Las EM son muy heterogéneas [59], pueden aparecer en cualquier edad [60], a veces presentan una evolución progresiva [28] y con alta frecuencia son multisistémicas, afectando preferencialmente a órganos con mayor demanda energética como cerebro, músculo esquelético y corazón [59, 60]. Además, cabe resaltar que las EM se caracterizan por presentar heterogeneidad genética, donde diferentes mutaciones pueden causar un mismo fenotipo, y heterogeneidad clínica, donde una misma mutación puede originar distintos fenotipos, y generar, incluso, síndromes solapantes [59]. Debido al amplio espectro de presentaciones clínicas y a la dificultad de asociar fenotipo y genotipo, es difícil calcular la prevalencia de estas enfermedades, aunque estudios epidemiológicos recientes han determinado que las EM son más comunes de lo que se pensaba, con una prevalencia de 1 por cada 4.300 adultos, lo que las convierte en uno de los trastornos neuromusculares hereditarios más comunes [15, 61].
Teniendo en cuenta que la biogénesis del sistema OXPHOS depende de proteínas y factores sintetizados en el ADNmt y ADNn, las EM resultan de mutaciones
este sentido, desde un punto de vista genético, las EM se pueden clasificar en dos grandes categorías en función de si la mutación responsable de la patología se encuentra en el genoma mitocondrial (causando un trastorno mitocondrial primario) o en genes nucleares que codifican proteínas de destino mitocondrial (causando un trastorno mitocondrial secundario) [1, 21, 57].
2.2.1 Enfermedades mitocondriales causadas por mutaciones en el ADNmt
Las primeras mutaciones en el ADNmt se describieron en 1988. Se trataba de una deleción en el ADNmt de pacientes con miopatía mitocondrial [62] y una mutación en el gen MT-ND4 en una familia con LHON [63]. Desde entonces se han descrito más de 300 mutaciones (http://www.mitomap.org) que afectan a todos los genes codificados en el ADNmt [21]. Incluso se han descrito mutaciones en la región no codificante D-LOOP que podrían modificar el número de copias de ADN mitocondrial [64]. En cualquier caso, estas mutaciones se pueden clasificar entre reordenamientos (deleciones y duplicaciones) y mutaciones puntuales [1, 21]:
Reordenamientos. Los reordenamientos más frecuentes en el ADNmt son las deleciones únicas, que consisten en la pérdida de un fragmento de longitud variable en cualquier región de la molécula de ADNmt [28]. Existe una zona de mayor predisposición para este fenómeno, conocida por ello como deleción común. Esta deleción tiene un tamaño de aproximadamente unas 5kb y abarca la región comprendida entre los genes MT-ND5 y MT-ATP8 [65]. Las deleciones se presentan siempre en heteroplasmia [21, 28] y parece ser que no son hereditarias sino que surgen esporádicamente en el oocito materno o durante la embriogénesis temprana [1, 28]. Aunque de forma general, se necesita que aproximadamente un 50-60% de moléculas de ADNmt presenten la deleción para que se manifieste la enfermedad [1], no existe una correlación clara entre los tamaños o porcentajes de ADNmt delecionados y la severidad de la patología [28]. Estos reordenamientos se asocian fundamentalmente a fenotipos que incluyen oftalmoplejia externa progresiva crónica (CPEO) [66], el síndrome de Kearn-Sayre (KSS) [66] y el síndrome de Pearson [67].
Mutaciones puntuales. Estas mutaciones afectan tanto a los genes que codifican los ARN mitocondriales (ARNt y ARNr) como a los genes que codifican subunidades estructurales de la CTE [28, 68]. El gen mitocondrial para el que se han descrito más mutaciones puntuales causantes de patologías en humanos es el que codifica para MT-TL1 [28]. Aunque estas mutaciones a menudo son heteroplásmicas, pueden presentarse también en homoplasmia [1] y, al contrario que en el caso de las deleciones, usualmente son heredadas [28].
Generalmente se necesita la presencia de un 80-90% de moléculas de ADNmt mutadas para que se manifieste la patología [1]. Estas mutaciones puntuales originan diferentes fenotipos clínicos tales como miopatía con encefalopatía, acidosis láctica y accidentes cerebrovasculares (MELAS) [69], epilepsia mioclónica y fibras rojas rasgadas (MERRF) [70], neuropatía, ataxia y retinitis pigmentosa (NARP) [71], Sindrome de Leigh (LS) [21] y LHON [63].
2.2.2 Enfermedades mitocondriales causadas por mutaciones en el ADNn
Teniendo en cuenta que sólo 13 de las aproximadamente 1.500 proteínas que forman parte del proteoma mitocondrial están codificadas por el ADNmt [1, 13], no es de extrañar que la gran mayoría de los trastornos mitocondriales se deban a mutaciones en genes nucleares que codifican proteínas mitocondriales [72]. La primera mutación en el ADNn asociada a enfermedad mitocondrial fue descrita en 1995 por el grupo de Arnold Munnich. Se trataba de una mutación en una subunidad de la succinato deshidrogenasa (CII) en dos hermanas que presentaban LS. [73].
Estas mutaciones en genes nucleares que afectan, directa o indirectamente, al sistema OXPHOS pueden clasificarse en diferentes grupos teniendo en cuenta los procesos en los que participan: i) genes involucrados en el mantenimiento, replicación o transcripción del ADNmt; ii) genes que forman parte del aparato de traducción mitocondrial; iii) genes que codifican subunidades estructurales de la CTE; iv) genes que codifican factores de ensamblaje de los complejos de la CTE; v) genes que codifican proteínas de rutas como dinámica mitocondrial y apoptosis; vi) genes que componen la maquinaria de importe de las proteínas mitocondriales y vii) genes que
codifican proteínas relacionadas con el mantenimiento de las membranas mitocondriales [1, 21, 28, 74, 75].
Durante esta tesis doctoral nos hemos centrado en el estudio de un gen implicado en la replicación del ADNmt, concretamente POLG y en un gen implicado en la traducción mitocondrial, concretamente GFM1.
2.2.2.1 Defectos en la ADN polimerasa mitocondrial
La mitocondria posee un sistema de replicación propio constituido por la ADN polimerasa mitocondrial (POLG) y factores de replicación tales como mtBBB, Twinkle, topoisomerasas entre otros [35, 36]. Debido a que este proceso es esencial para el mantenimiento de una correcta función mitocondrial, mutaciones en los componentes de esta maquinaria de replicación del ADNmt pueden causar patologías mitocondriales. Un grupo muy común de defectos en la replicación del ADNmt es el que se debe a mutaciones en el gen nuclear POLG [1], el cual codifica para la subunidad catalítica de la ADN polimerasa mitocondrial (POLG). Esta subunidad catalítica posee tres actividades: i) ADN polimerasa 5´->3´; ii) exonucleasa 3´->5´
(requerida para la corrección de errores) y iii) 5’-deoxirribosa fosfato liasa (requerida para la reparación del ADNmt) [76]. Defectos en POLG pueden originar mutaciones puntuales (debidas a fallos en la actividad correctora), depleción y deleciones (debidos a fallos en la actividad polimerasa) en el ADNmt provocando defectos en OXPHOS y por tanto EM [1, 28, 36]. Los trastornos relacionados con defectos en POLG actualmente están definidos por, al menos, seis fenotipos principales de enfermedad neurodegenerativa que incluyen: síndrome de Alpers-Huttenlocher (AHS), espectro de miocerebrohepatopatía infantil (MCHS), epilepsia mioclónica, miopatía y ataxia sensorial (MEMSA), espectro de neuropatía atáxica (ANS), oftalmoplejia externa progresiva autosómica recesiva (arPEO) y oftalmoplejia externa progresiva autosómica dominante (adPEO) [36].
2.2.2.2 Defectos en el factor de elongación de la traducción mitocondrial
Otras EM se asocian con mutaciones en genes implicados en la traducción mitocondrial. Dado que este proceso es crucial para el mantenimiento de la función mitocondrial, mutaciones en este sistema pueden originar fallos en el sistema OXPHOS y, por tanto, patología. Un grupo muy interesante de defectos en la síntesis de proteínas mitocondriales es el que se debe a mutaciones en el gen nuclear GFM1, que codifica el factor de elongación de la traducción mitocondrial G1 (EFG1). Este factor, con dominio GTPasa, cataliza la translocación del aminoacil-ARNt desde el sitio A del ribosoma al sitio P junto con la salida coordinada del ARNt descargado del ribosoma, de tal forma que queda expuesto el siguiente codón del ARNm en el sitio A del ribosoma [31] (figura 4).
Las mutaciones en este gen se asocian sistemáticamente con un déficit combinado en OXPHOS y una elevación persistente de lactato en sangre. Aunque a nivel clínico la sintomatología es heterogénea, las alteraciones neurológicas y/o hepáticas están siempre presentes. Generalmente, este tipo de enfermedades suele presentar una aparición temprana junto con una evolución rápida y progresiva que finalmente desemboca en la muerte del paciente. Las principales causas de muerte se deben a complicaciones respiratorias (debidas a la disfunción neurológica) y/o a un fallo multisistémico debido a una disfunción hepática grave [77].
Figura 4: Función del factor de elongación de la traducción mitocondrial G1.
Este factor es una GTPasa que cataliza la translocación del aminoacil-ARNt desde el sitio A del ribosoma al sitio P junto con la salida coordinada del ARNt descargado durante la elongación de la traducción mitocondrial.
2.3 Células madre pluripotentes
Las células madre pluripotentes (CMP) están definidas por dos características esenciales: i) tienen la capacidad de diferenciarse en todos los tipos celulares presentes en un organismo adulto y ii) poseen la habilidad de proliferación indefinida o autorrenovación [78-80], gracias a modificaciones únicas en la cromatina y a un circuito regulatorio en el que participan factores de transcripción como NANOG, OCT4 y SOX2 [78, 79, 81]. Entre las CMP podemos encontrar las células madre embrionarias (células ES, del inglés Embryonic Stem Cells)1 y las células madre pluripotentes inducidas (iPSC, del inglés Induced Pluripotent Stem Cells)1 [78, 79]. Las células ES son las responsables de la formación del embrión en animales y pueden aislarse a partir de una región del blastocisto (un estado temprano del desarrollo embrionario) denominada masa celular interna [79, 82]. A pesar de que en 1981 Evans aisló y estableció un cultivo de células mES [83], no fue hasta 1998 cuando Thomson estableció el primer cultivo de células hES [84]. Aunque estas hES podrían ser usadas en aplicaciones de medicina regenerativa, existen problemas éticos y legales asociados al uso de embriones humanos, así como posibles problemas de rechazo después de su trasplante en pacientes [85].
Para solventar estos problemas, en 2016, Yamanaka y colaboradores demostraron que se podía generar in vitro CMP a través de la “reprogramación” de fibroblastos adultos de ratón, un tipo celular ya especializado y sin potencialidad [85].
Un año más tarde, se replicó este experimento en fibroblastos adultos humanos [86].
Estas nuevas células madre artificiales, denominadas células madre pluripotentes inducidas o iPSC, se obtuvieron mediante la expresión exógena y transitoria de cuatro factores de transcripción OCT4, SOX2, KLF4 y C-MYC, implicados en el mantenimiento de la pluripotencia de las células ES [85, 86]. Ambos trabajos constituyen la prueba de que el proceso de diferenciación celular se puede revertir y han supuesto que Yamanaka haya sido galardonado con el premio Nobel en Medicina y Fisiología en 2012, compartido con el británico John Gourdon.
Las iPSC presentan prácticamente todas las características observadas en las células ES [82]. En primer lugar, necesitan la presencia de monocapas de fibroblastos inactivados mitóticamente (feeder) que les proporcionan soporte físico y factores solubles necesarios para su crecimiento [80]. Debido a que la presencia de estas células feeder en los cultivos limitan las posibles aplicaciones de las iPSC y células ES, se han desarrollado medios de cultivo y soportes libres de feeder [87].
En cultivo tanto las iPSC como las células ES, crecen formando colonias compactas [83, 85] con uniones intercelulares mediadas por E-cadherinas [80] y uniones al sustrato a través de integrinas [87].
Las células que componen estas colonias son pequeñas con un alto porcentaje núcleo/citoplasma [84, 85] y con una elevada tasa de proliferación [81]
(figura 5).
Desde un punto de vista molecular, estas células presentan alta actividad de la enzima fosfatasa alcalina (AP, de sus siglas en inglés), la cual es un marcador de pluripotencia que correlaciona con la capacidad de autorrenovación y el mantenimiento de un estado indiferenciado en estas células pluripotentes [88]. Sin embargo, debido a que existen distintas isoformas de esta enzima en diferentes tejidos (intestino, placenta, huesos, hígado…) [88] también se recurre a la detección de otros marcadores específicos de células pluripotentes humanas como SSEA3, SSEA4, Tra-1- 60, Tra-1-81, OCT4, SOX2 y KLF4 [85, 89].
Desde un punto de vista funcional, estas CMP tienen la capacidad de diferenciarse y dar lugar a distintos tipos celulares de las tres capas embrionarias tanto in vitro, mediante la formación de cuerpos embrionarios (EB, del inglés Embryoid Body), como in vivo, mediante la formación de teratomas [83, 85].
Metabólicamente, las CMP presentan un metabolismo claramente glucolítico distinguible de las células diferenciadas donde la mayor parte del ATP proviene del sistema OXPHOS [90]. En este sentido, la glucolisis no sólo proporciona moléculas de
Figura 5: Morfología de las CMP.
Imagen de una colonia iPSC (señalada con una flecha) creciendo sobre células feeder.
intermediarios metabólicos necesarios para la biosíntesis de nucleótidos y lípidos esenciales para la rápida proliferación celular [91].
Se ha asumido la idea, basada en gran parte en evidencias morfológicas, de que las CMP contienen mitocondrias inmaduras y bioenergéticamente inactivas comparadas con las de células diferenciadas. Sin embargo, en un estudio de 2011, Zhang y colaboradores observaron que las CMP tenían una CTE funcional con actividad similar a la de células diferenciadas junto con que el ATP, generado principalmente por glucolisis, era consumido por la ATP sintasa o complejo V para mantener parcialmente el potencial de membrana mitocondrial en estas células. Además, revelaron que la proteína desacoplante (UCP2) desempeña un papel regulador en el metabolismo energético de estas CMP controlando el acceso del sustrato piruvato a la mitocondria [81].
Teniendo en cuenta que estas hiPSC presentan propiedades moleculares y funcionales similares a las células hES (morfología, proliferación, antígenos de superficie, actividad telomerasa, etc.) [86, 92, 93], junto con que evitan la controversia del uso de embriones humanos y disminuyen el rechazo en los trasplantes al provenir del mismo paciente, se consideran como una herramienta de gran potencial en la medicina personalizada [60, 78, 82]. Sin embargo, a pesar de que las iPSC son biológicamente indistinguibles de las células ES, algunos estudios han detectado variaciones genéticas y epigenéticas en iPSC que han generado cierta preocupación acerca de que estas diferencias puedan comprometer su utilidad [92, 94].
2.3.1 Aplicaciones de las iPSC
La tecnología de las iPSC es una herramienta prometedora para la investigación en ciencia básica y aplicada. En primer lugar, las iPSC pueden usarse para recapitular aspectos del desarrollo embrionario humano in vitro [95]. Por otro lado, la generación de líneas iPSC portadoras de mutaciones seguida de su posterior diferenciación al tejido afectado en la enfermedad puede ser un instrumento poderoso para modelizar enfermedades genéticas y permitir el cribado de alto rendimiento de potenciales fármacos para su tratamiento [60, 86, 93, 96]. Desde otra perspectiva, teniendo en
los fármacos fracasan en las fases preclínicas y clínicas del descubrimiento de nuevos medicamentos, la generación de cardiomiocitos derivados de hiPSC controles constituye una excelente alternativa para predecir esta alteración en las primeras fases de la investigación preclínica [97].
Por último, la generación de líneas hiPSC derivadas de pacientes con determinadas enfermedades genéticas con su defecto genético corregido podría permitir que sean empleadas en ensayos de terapia celular y en medicina regenerativa [98]. Con respecto a la obtención de iPSC libres de mutación, existen diferentes estrategias como las técnicas de edición genómica (nucelasas Zinc-Finger, TALENS y CRISPR/Cas9) que no sólo son capaces de corregir mutaciones en el ADNn, sino que también permiten la edición del genoma mitocondrial [99-102]. Otras posibilidades interesantes son: i) la generación de líneas iPSC individuales libres de mutación a través de la segregación espontánea del ADNmt heteroplásmico durante o tras la reprogramación [103-105] o ii) la sustitución de mitocondrias por transferencia nuclear en el caso de mutaciones homoplásmicas en el ADNmt [104] (figura 6).
2.3.2 hiPSC como modelo de enfermedades mitocondriales
Las EM son patologías heterogéneas y complejas no solo por la participación de dos genomas sino también por la naturaleza poliploide del ADNmt y la gran heterogeneidad clínica y genética que presentan. A pesar de los notables avances en el conocimiento de las bases moleculares de las EM, el desarrollo de nuevas terapias para estos trastornos es lento debido, en parte, a la falta de modelos de enfermedad adecuados. Es por ello, que la utilización de la tecnología de las iPSC puede ser de gran ayuda para conocer los mecanismos patogénicos involucrados en las EM y el posterior desarrollo de tratamientos que permitan la transición desde cuidados paliativos a intervenciones terapéuticas basadas en medicina regenerativa.
Hasta la fecha, se han publicado varios trabajos en los que se generan líneas hiPSC que poseen mutaciones en su ADNn o ADNmt para la modelización de EM, algunas de las cuales han sido generadas en nuestro laboratorio durante el desarrollo de esta tesis doctoral [106-113]. En el caso de EM originadas por mutaciones en el ADNmt se han generado diferentes modelos:
a) En 2013 Cherry y colaboradores realizaron un estudio en el que demostraron que las células eritroides derivadas de hiPSC portadoras de una deleción del mtDNA de 2,5 kb, causante del síndrome de Pearson, presentaban la acumulación de gránulos de hierro, típica de la enfermedad [114].
b) Del mismo modo existen varios trabajos que han demostrado la presencia de defectos mitocondriales en células derivadas de hiPSC portadoras de la mutación m.3243A>G en el gen MT-TL1 asociada al síndrome de MELAS.
Cabe destacar el estudio publicado por Hämäläinen y colaboradores (2013) en el que se demuestra que existe una deficiencia mitocondrial en neuronas derivadas de hiPSC, así como un papel relevante de la mitofagia como mecanismo patogénico subyacente a la patología [105].
c) El síndrome de MERRF, en más del 80 % de los casos, se debe a la mutación m.8344A>G en el gen MT-TK. Se ha publicado que la presencia de esta mutación en cardiomiocitos y progenitores neurales derivados de hiPSC produce una disfunción mitocondrial, fragmentación mitocondrial y un incremento de ROS [115].
d) Respecto a modelos del LS, es interesante resaltar el estudio realizado en 2016 por Zheng y colaboradores en el que observaron una clara disfunción mitocondrial (potencial de membrana mitocondrial elevado, una mayor producción de ROS y una disminución de la respiración basal) y una neurodegeneración en neuronas derivadas de hiPSC portadoras de la mutación m.8993T>G en el gen MT-ATP6 [116]. En 2015 Ma y colaboradores demostraron una disfunción mitocondrial en fibroblastos y células musculares portadoras de esta misma mutación, pero no analizaron el fenotipo neuronal, el tipo celular principalmente afectado en el LS [104].
Figura 6: Aplicaciones de las hiPSC. 1. Realización de una biopsia de piel. 2. Obtención de fibroblastos con la mutación. 3. Reprogramación de los fibroblastos con virus Sendai para la generación de hiPSC portadoras de la mutación. 4. Diferenciación de hiPSC al tejido afectado en el paciente para su utilización como modelos celulares de la enfermedad y cribado de fármacos para el tratamiento de las mismas. 5. Corrección genética de hiPSC para obtención de hiPSC sin la mutación. 6. Diferenciación de hiPSC corregidas al tipo celular diana afectado en el paciente. 7. Utilización de células diferenciadas sanas para terapia celular en el paciente. 8. Las hiPSC con o sin mutación, en sí mismas, constituyen un modelo in vitro del desarrollo embrionario.
Con relación a las EM originadas por mutaciones en el ADNn también se han generado varios modelos:
a) El síndrome de Alpers es una encefalohepatopatía causada por mutaciones en el gen POLG y que se caracterizada por defectos en la estructura y función mitocondrial. El estudio realizado por Li y colaboradores (2015) demostró que los hepatocitos derivados de hiPSC portadoras de la mutación p.A467T en el gen POLG presentaban depleción de ADNmt, bajos niveles de expresión de la ADN polimerasa mitocondrial, una función OXPHOS disminuida y una estructura mitocondrial anormal [117].
b) El síndrome de Barth es una miopatía mitocondrial causada por mutaciones en el gen TAZ, una aciltransferasa que participa en la biogénesis de cardiolipina, el principal fosfolípido de la MMI. En 2014, Wang y colaboradores observaron que cardiomiocitos derivados de hiPSC con la mutación c.517delG o c.328T>C en el gen TAZ presentaban sarcómeros dispersos e irregulares junto con una función mitocondrial alterada (red mitocondrial fragmentada, altos niveles de ROS, bajos niveles de ATP y una baja actividad del complejo V, entre otras) [118].
c) El síndrome de deficiencia de coenzima Q es un grupo heterogéneo de EM causadas por mutaciones en genes responsables de la biosíntesis del transportador de electrones mitocondrial coenzima Q y que principalmente afecta al cerebro y al músculo esquelético. En 2017, Romero-Moya y colaboradores demostraron que hiPSC portadoras de la mutación c.483G>C en el gen COQ4 mostraban deficiencias en coenzima Q y defectos en la respiración mitocondrial junto con dificultad para diferenciar a células musculares esqueléticas donde observaban mitocondrias anormales y nuevamente disfunción mitocondrial.
d) La miocardiopatía hipertrófica mediada por SCO2 es una EM causada por mutaciones en el gen SCO2, el cual codifica para un factor de ensamblaje del complejo IV de la CTE. En el estudio publicado por Hallas et al (2017) se
