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EVALUACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LOS GENES QUE CODIFICAN PARA PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO HSP DE PLÁNTULAS DE ARROZ (Oryza
sativa) IRRADIADAS CON 60Co TOLERANTE, RESISTENTE Y SUSCEPTIBLE AL ESTRÉS POR ALTAS TEMPERATURAS.
RODOLFO ELÍAS ARCE LOZANO CINDY JOHANNA MARTINEZ SAAVEDRA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA
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EVALUACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LOS GENES QUE CODIFICAN PARA PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO HSP DE PLÁNTULAS DE ARROZ (Oryza
sativa) IRRADIADAS CON 60Co TOLERANTE, RESISTENTE Y SUSCEPTIBLE AL ESTRÉS POR ALTAS TEMPERATURAS.
RODOLFO ELÍAS ARCE LOZANO CINDY JOHANNA MARTÍNEZ SAAVEDRA
Proyecto de Trabajo de Grado para optar al título de Licenciado en Química y Licenciado en Biología
Dr. LUIS FRANCISCO BECERRA GALINDO Licenciado en Biología. Msc. Ciencias Biológicas.
Director
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA
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LA UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
No se hace responsable de las ideas, ni del contenido del presente trabajo, aquí expuesto por sus autores, según el artículo 117 Acuerdo 029 que el Consejo Superior de la
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Nota de Aceptaciónmmm
_________________________ Jurado (Nombre/Firma)
_________________________ Director (Nombre/Firma)
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AGRADECIMIENTOS
Le damos gracias en primera instancia a Dios, por darnos la vida, la sabiduría, paciencia y la oportunidad de recorrer este camino, donde aprendimos y crecimos a nivel personal y profesional.
A nuestros padres y hermanos por su cariño, paciencia y apoyo incondicional en cada una de las etapas de este proceso.
Agradecemos al profesor Francisco Becerra ¨Pacho¨ y Luis Armando Quevedo por darnos la oportunidad de ingresar al grupo de investigación de Biología Molecular BIOMOL y confiar en nuestro trabajo, por sus consejos y por compartir sus conocimientos cuando lo requeríamos. A los integrantes de BIOMOL quienes nos apoyaron para culminar este trabajo, de igual manera a los integrantes del almacén de biología por su apoyo incondicional, en especial a Andrés Caballero.
A la Universidad Distrital que nos abrió las puertas para formarnos como Licenciados en biología y química y permitirnos conocer grandes personas, amigos y profesores. Agradecemos a cada una de las personas que nos acompañaron de una u otra manera en este camino.
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5.1. HIPÓTESIS DE VARIEDADES ... 12
5.2. HIPÓTESIS DE TRATAMIENTOS ... 12
6. OBJETIVOS ... 13
7.1.2. Morfología del arroz ... 15
7.1.3. Crecimiento y desarrollo de la planta de arroz ... 19
7.2. ESTRÉS POR FACTORES ABIÓTICOS ... 21
7.2.1. Estrés por altas temperaturas ... 21
7.3. MEJORAMIENTO DEL ARROZ ... 23
7.3.1. Fedearroz 473 ... 23
7.3.2. Fedearroz Mocarí ... 24
7.3.3. Línea Avanzada Lv 1645 ... 24
7.4. PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO ... 24
7.4.1. Clasificación de las proteínas de choque térmico ... 25
7.5. PCR EN TIEMPO REAL ... 37
7.5.1. Fases de una PCR ... 38
7.5.2. Cuantificación mediante PCR en tiempo real ... 38
7.6. ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA CON DODECIL SULFATO DE SODIO (SDS-PAGE) ... 39
7.6.1. Preparación del gel de poliacrilamida con SDS ... 39
8. METODOLOGÍA ... 42
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8.2. PRE GERMINACIÓN ... 42
8.3. MEDIO DE CULTIVO YANG XIAO´ER ... 42
8.4. GERMINACIÓN ... 43
8.5. ESTRÉS TÉRMICO ... 43
8.6. DISEÑO DE CEBADORES ... 43
8.7. EXTRACCIÓN DE ARN ... 45
8.8. QRT- PCR ... 45
8.9. EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES ... 46
8.10. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNA TOTAL ... 47
8.10.1. Cuantificación por Bradford ... 47
8.11. SDS-PAGE ... 47
8.12. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO... 48
9. RESULTADOS Y ANÁLISIS ... 49
9.1. ESTANDARIZACIÓN DE PRIMER’S ... 49
9.1.1. Gen Hsp 16.9 ... 49
9.1.2. Gen Hsp 18 ... 50
9.1.3. Gen Hsp 26.7 ... 50
9.2. TASA DE GERMINACIÓN ... 52
9.3. CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS ... 53
9.3.1. Características fenotípicas en el Tratamiento control (TC) ... 53
9.3.2. Características fenotípicas en el Tratamiento 1 (T1) ... 56
9.3.3. Características fenotípicas en el Tratamiento 2 (T2) ... 58
9.3.4. Crecimiento de las tres variedades en los tratamientos ... 59
9.4. EXTRACCIÓN ARN ... 60
9.9. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE LOS GENES POR VARIEDAD ... 106
9.9.1. Variedad Fedearroz 473 ... 106
9.9.2. Variedad Mocarí ... 108
9.9.3 Variedad Línea avanzada1645 ... 109
9.10. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES ... 110
9.10.1. Cuantificación de Proteínas totales Tratamiento Control ... 112
9.10.2. Cuantificación de Proteínas totales Tratamiento 1 ... 112
9.10.3. Cuantificación de Proteínas totales Tratamiento 2 ... 113
9.11. SDS-PAGE ... 113
9.11.1. Geles SDS-Page Tratamiento Control (TC ... 113
9.11.2. Geles de SDS-Page Tratamiento 1 (T1) ... 114
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10. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO ... 117
10.1. ANÁLISIS DE DISTRIBUCIÓN DE LOS DATOS ... 118
10.2. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DESCRIPTIVO ... 118
10.2.1. Histograma ... 118
10.2.2. BoxPlot ... 119
10.2.3. Pruebas de significación ... 121
10.3. ANALISIS DE VARIANZA (ANOVA) ... 122
10.4. CORROBORACIÓN DE HIPÓTESIS ... 129
11. CONCLUSIONES ... 130
12. RECOMENDACIONES ... 132
13. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 133
14. ANEXOS ... 143
ANEXO 1. SECUENCIAS DE CADN Y PRIMER’S ... 143
ANEXO 2. PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN EN PLANTAS ... 148
ANEXO 3. CUANTIFICACIÓN DE ADN ... 151
ANEXO 4. KIT PCR ... 152
ANEXO 5. EXTRACCIÓN DE ARN EN PLANTAS ... 153
ANEXO 6. KIT QRT-PCR ... 154
ANEXO 7. TINCIÓN CON AZUL DE COOMASIE. ... 155
ANEXO 8. CUANTIFICACIÓN EXTRACCIONES DE ARN ... 156
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Morfología de la planta de arroz [23]... 15
Figura 2. Morfología de los órganos vegetativos. a. raíz; b. tallo; c. hoja ... 17
Figura 3. Morfología de los órganos reproductores. a. panícula de arroz; b. espiguilla y c. semilla ... 18
Figura 4. Fases de crecimiento y desarrollo de la planta de arroz ... 20
Figura 5. Función de las proteínas de choque térmico en la célula. ... 25
Figura 6. Clasificación y organización de dominios de proteínas de la familia Hsp100 .... 26
Figura 7. Estructura de la proteína ClpB. ... 27
Figura 8. Estructura de proteínas de la familia Hsp90. ... 29
Figura 9. ciclo ATPasa de Hsp90 ... 29
Figura 10. estructura lineal de proteínas de la familia Hsp70. ... 31
Figura 11. Mecanismo de acción de la Hsp70, que es dependiente de ATP, y co-chaperonas como Hsp40. ... 32
Figura 12. a. estructura lineal de las proteínas de la familia Hsp60 ... 33
Figura 13. a. Estructura primaria de las proteínas del a familia sHsp ... 35
Figura 14. Mecanismo de accion de las proteinas de la familia sHsp. ... 36
Figura 15. Representación gráfica de las fases de PCR junto con el ciclo umbral CT ... 38
Figura 16. Polimerización de poliacrilamida... 41
Figura 17. a. electroforesis en gel discontinuo de poliacrilamida con SDS; b. luego de la electroforesis las proteínas se visualizan con azul de coomassie. ... 41
Figura 18. Visualización del gradiente de temperatura del gen Hsp 16.9 en Gel Doc XR System Bio Rad, amplificado por PCR. ... 49
Figura 19. Visualización del gradiente de temperatura del gen Hsp 18 en Gel Doc XR System Bio Rad, amplificado por PCR. . ... 50
Figura 20. Visualización del gradiente de temperatura del gen Hsp 26.7 en Gel Doc XR System Bio Rad, amplificado por PCR. 1: 57ºC; 2:57.6ºC; 3:58.2ºC; 4: 59.1ºC; 5:60.2ºC; 6:61,6ºC; 7:62.8ºC; Marcador Hyperlader IV (M); Actina (Ac). ... 51
Figura 21. a) Amplificación de los primer’s por PCR, visualización en Gel Doc XR System Bio Rad. 1) gen Hsp 16.9; 2) gen Hsp 18; 3) gen Hsp 26.7; 4) Marcador Hyperladder IV; 5) gen Hsp 70; 6) gen Hsp 90. b) Marcador de peso molecular Hyperladder IV . 51 Figura 22. a. semillas sembradas en cajas de Petri; b. 40 semillas de cada variedad por caja; c. brote de raíz en la semilla, d; germinación de la semilla. ... 53
Figura 23. F473 TC E1 ... 54
Figura 24. F473 TC E2 ... 54
Figura 25. F473 TC E3 ... 54
Figura 26. F473 irradiada TC E1 ... 54
Figura 27. F473 irradiada TC E2 ... 54
Figura 28. F473 irradiada TC E3 ... 54
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Figura 30. Mocari TC E2 ... 55
Figura 31. Mocari TC E3 ... 55
Figura 32. Mocari irradiada TC E1 ... 55
Figura 33. Mocari irradiada TC E2 ... 55
Figura 34.Mocari irradiada TC E3... 55
Figura 35. Lv 1645 TC E1 ... 55
Figura 41. F473 irradiada T1 E1 ... 57
Figura 42. F473 irradiada T1 E2 ... 57
Figura 43. F473 irradiada T1 E3 ... 57
Figura 44. Mocari irradiada T1 E1 ... 57
Figura 45. Mocari irradiada T1 E2 ... 57
Figura 46. Mocari irradiada T1 E3 ... 57
Figura 47. Lv 1645 irradiada T1 E1 ... 57
Figura 48. Lv 1645 irradiada T1 E2 ... 57
Figura 49. Lv 1645 irradiada T1 E3 ... 57
Figura 50. F473 irradiada T2 E1 ... 58
Figura 51. F473 irradiada T2 E2 ... 58
Figura 52. F473 irradiada T2 E3 ... 58
Figura 53. Mocari irradiada T2 E1 ... 58
Figura 54. Mocari irradiada T2 E2 ... 58
Figura 55. Mocari irradiada T2 E3 ... 58
Figura 56. Lv 1645 irradiada T2 E1 ... 58
Figura 57. Lv 1645 irradiada T2 E2 ... 58
Figura 58. Lv 1645 irradiada T2 E3 ... 58
Figura 59. Visualización del gel de poliacrilamida SDS-PAGE con tinción azul de Comassie. ... 114
Figura 60. Visualización del gel de poliacrilamida SDS-Page con tinción azul de Comassie. ... 115
Figura 61. Visualización del gel de poliacrilamida SDS-Page con tinción azul de Comassie. ... 115
Figura 62. Conjunto de datos activos. ... 118
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LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Clasificación taxonómica dela arroz... 15
Tabla 2. Fases y etapas del desarrollo del arroz [17,19,20] ... 20
Tabla 3. Efecto de la temperatura en el desarrollo y crecimiento de la planta de arroz [5] .. 22
Tabla 4. Rango de separación de proteínas, según el porcentaje de acrilamida [81] ... 40
Tabla 5. Composición nutricional para un litro de cultivo líquido r..Yang Xiao´er... 42
Tabla 6. Condiciones de estrés térmico para cada uno de los tratamientos (TC, T1 y T2) . 43 Tabla 7. Secuencias de cebadores para los genes de interés realizados en Integrated DNA Tecnologies (IDT). ... 44
Tabla 8. Volúmenes para PCR para un tubo /muestra ... 44
Tabla 9. Programa PCR en tiempo real para Hsp70, Hsp90 y sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7) ... 45
Tabla 10. Cronograma de extracción de ARN para un día ... 45
Tabla 11. Volúmenes para qRT-PCR para un tubo /muestra ... 46
Tabla 12. Programa PCR en tiempo real para Hsp70, Hsp90 y sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7) ... 46
Tabla 13. Cronograma de extracción de proteínas totales para un día ... 47
Tabla 14. Concentraciones para la preparación de la curva de calibración con BSA y las muestras [89] ... 47
Tabla 15. SDS-PAGE 12.5% para proteínas de alto peso molecular ... 48
Tabla 16. Temperatura de anillamiento y pb para los primer’s de interés ... 52
Tabla 17. Porcentajes de germinación de las 3 variedades ... 53
Tabla 18. Comparación del crecimiento de los genotipos F473, Mocarí, Lv 1645 control e irradiadas, en las tres extracciones del tratamiento control. ... 53
Tabla 19. Registro fotográfico de las tres variedades durante el tratamiento control. Tomado por: Autoría propia Arce R, Martínez C (2016). ... 54
Tabla 20. Registro fotográfico de las tres variedades durante el tratamiento 1. Tomado por: Autoría propia Arce R, Martínez C (2016). ... 57
Tabla 21. Registro fotográfico de las tres variedades durante el tratamiento 2. Tomado por: Autoría propia Arce R, Martínez C (2016). ... 58
Tabla 22. Comparación del crecimiento de los genotipos F473, M, Lv 1645 irradiadas, en las tres extracciones del tratamiento TC, T1, T2. ... 59
Tabla 23. Concentración de Hsp90 en estándar y muestras problema en la E1. ... 64
Tabla 24. Concentración de Hsp90 en estándar y muestras problema en la E2. ... 66
Tabla 25. Concentración de Hsp90 en estándar y muestras problema en la E3. ... 68
Tabla 26. Concentración de Hsp70 en estándar y muestras problema en la E1 ... 75
Tabla 28. Concentración de Hsp70 en estándar y muestras problema en la E3 ... 77
Tabla 29. Concentración de Hsp26.7 en estándar y muestras problema en la E1 ... 81
Tabla 30. Concentración de Hsp26.7 en estándar y muestras problema en la E2 ... 83
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Tabla 32. Concentración de Hsp18 en estándar y muestras problema en la E1 ... 90
Tabla 33. Concentración de Hsp18 en estándar y muestras problema en la E2 ... 91
Tabla 34. Concentración de Hsp18 en estándar y muestras problema en la E3 ... 93
Tabla 35. Concentración de Hsp16.9 en estándar y muestras problema en la E1 ... 98
Tabla 36. Concentración de Hsp16.9 en estándar y muestras problema en la E2 ... 100
Tabla 37. Concentración de Hsp16.9 en estándar y muestras problema en la E3 ... 101
Tabla 38. Cuantificación relativa de cada uno de los genes usando actina como gen de referencia ... 104
Tabla 39. Absorbancia de la curva patrón y las muestras del Tratamiento Control (TC), Tratamiento 1 (T1) y del Tratamiento 2 (T2) en las tres variedades Fedearroz 473 (F473), Mocarí y Línea Avanzada 1645 (Lv1645)... 110
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Gráfica 4. a. curva de amplificación estándar de Hsp90; b. curva estándar de Hsp90... 62
Gráfica 5. Expresion de Hsp90 en la E1 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar ... 63
Gráfica 6. Expresion de Hsp90 en la E2 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ... 65
Gráfica 7. Expresion de Hsp90 en la E3 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ... 67
Gráfica 8. Comparación de la Expresión Hsp90 de las variedades en los tres tratamientos ... 69
Gráfica 9. a. curva de amplificación estándar de Hsp70; ... 71
Gráfica 10. Expresion de Hsp70 en la E1 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ... 72
Gráfica 11. Expresion de Hsp70 en la E2 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ... 74
Gráfica 12. Expresion de Hsp70 en la E3 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ... 76
Gráfica 13. Comparación de la Expresión Hsp70 de las variedades en los tres tratamientos ... 77
Gráfica 14. a. curva de amplificación estándar de Hsp70;b. curva estándar de Hsp70... 79
Gráfica 15. Expresion de Hsp26,7 en la E1 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ... 80
Gráfica 16. Expresion de Hsp26,7 en la E2 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ... 82
Gráfica 17. Expresion de Hsp26,7 en la E3 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ... 84
Gráfica 18. Comparación de la Expresión Hsp26.7 de las variedades en los tres tratamientos. ... 86
Gráfica 19. a. curva de amplificación estándar de Hsp18; b. curva estándar de Hsp18... 88
Gráfica 20. Expresion de Hsp18 en la E1 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades F473, Mocarí, Lv 1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ... 89
Gráfica 21. Expresion de Hsp18 en la E2 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades F473, Mocarí, Lv 1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ... 91
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Gráfica 23. Comparación de la Expresión Hsp18 de las variedades en los tres tratamientos. ... 94 Gráfica 24. a. curva de amplificación estándar de Hsp16.9; b. curva estándar de Hsp16.9
... 96 Gráfica 25. Expresion de Hsp16.9 en la E1 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades F473, Mocarí, Lv 1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ... 97 Gráfica 26. Expresion de Hsp16.9 en la E2 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades F473, Mocarí, Lv 1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ... 99 Gráfica 27. Expresion de Hsp16.9 en la E3 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades F473, Mocarí, Lv 1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ... 101 Gráfica 28. Comparación de la Expresión Hsp16.9 de las variedades en los tres
tratamientos. ... 102 Gráfica 29. Cuantificación relativa de los genes Hsp16,9, Hsp18, Hsp26,7, Hsp70 y
Hsp90 en las tres variedades. ... 105 Gráfica 30. Expresión de los genes Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7, Hsp70 y Hsp90 en la
variedad F473 en el TC, T1 y T2... 107 Gráfica 31. Expresión de los genes Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7, Hsp70 y Hsp90 en la
variedad Mocarí en el TC, T1 y T2. ... 109 Gráfica 32. Expresión de los genes Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7, Hsp70 y Hsp90 en la
variedad Lv1645 en el TC, T1 y T2. ... 110 Gráfica 33. Curva estándar por método de Bradford. ... 111 Gráfica 34. Valores de la extracción de proteínas del tratamiento control TC relacionados
con la curva estándar. ... 112 Gráfica 35. Valores de la extracción de proteínas del tratamiento 1 T1 relacionados con la
curva estándar. ... 112 Gráfica 36. Valores de la extracción de proteínas del tratamiento 2 T2 relacionados con la
curva estándar. ... 113 Gráfica 37. Histograma de frecuencias contrastando el número de copias (SQ) con las variedades F473, Lv 1645 y Mocarí. ... 119 Gráfica 38. a. BoxPlot contrastando SQ vs VARIEDADES. b. BoxPlot contrastando SQ vs TRATAMIENTOS. ... 120 Gráfica 39. BoxPlot Variedades F473, MOCARÍ y Lv1645 vs Número de Copias (SQ).
... 123 Gráfica 40. BoxPlot Tratamientos TC (28 °C), T1 (35 °C) y T2 (42 °C) vs Número de Copias (SQ). ... 124 Gráfica 41. Básica de Diagnostico. 1. Residuos Frente a Ajustados. 2. Residuos tipificados frente a cuantiles teórico. 3. Escala-posición: raíz de valor absoluto de residuo frente a valores ajustados. 4. Residuos tipificados frente a palancaje. ... 127 Gráfica 42. Gráfica de efectos. Relación entre las medias de Variedad, Tratamiento y Gen.
1 RESUMEN
Las plantas son organismos que se encuentran constantemente expuestos a diferentes tipos de estrés abiótico alterando su desarrollo óptimo y por ende la productividad de los cultivos se ve afectada. Debido al estrés generado por la variación de temperatura, las plantas han desarrollado un grupo de proteínas conocidas como proteínas de choque térmico (HSP), que actúan como chaperonas moleculares, ayudando a la planta en los procesos de plegamiento adecuado de proteínas, transporte a través de membranas, modulación de la actividad proteica y regulación de la degradación de proteínas, aportando de esta manera, tolerancia a la planta frente al cambio constante de temperatura.
El presente trabajo evaluó la expresión de los genes que codifican las proteínas de choque térmico sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7), Hsp70 y Hsp90 en variedades de arroz (Oryza sativa): Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Línea avanzada Lv 1645 que han sido irradiadas con una dosis de 60 Gy de 60Co en su primera generación. Para tal fin se realizaron cultivos hidropónicos con medio Yang para cada una de las variedades; una vez alcanzaron el estadio de plántula fueron sometidas a estrés térmico durante un día de 11:00 am a 3:10 pm de la siguiente manera: un tratamiento control (TC) a una temperatura de 28°C, un tratamiento de estrés moderado (T1) a 35°C y un tratamiento de estrés alto (T2) a 42°C. Durante cada tratamiento se realizaron tres extracciones de ARN y proteínas totales para cada variedad en tres momentos diferentes; la primera extracción se hizo a las 11:10 am, la segunda a la 1:10 pm y la última a las 3:10 pm
El ARN se cuantifico a través de Thermo Scientific NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer, posteriormente se escogieron las muestras de mejores características para el desarrollo del trabajo. Por medio de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (q-RT-PCR) se hizo una cuantificación absoluta de los genes de interés; se cuantificaron las proteínas totales por el método de Bradford, adicional a ello se realizaron geles de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) al 12.5%.
Como resultados se obtuvo que los tres genotipos F473, Mocarí Lv 1645 no presentan diferencias significativas en el crecimiento de las plántulas durante las cuatro horas de exposición al estrés térmico por altas temperaturas, por otro lado una dosis de 60 Gy de 60Co genera alteraciones físicas en las variedades Mocarí y Lv 1645, a nivel de expresión de proteínas de choque térmico (Hsp) en los tres genotipos, esta incrementa a medida que aumenta la temperatura como mecanismo de protección de la plántula y la expresión de estos genes está relacionada con la tolerancia a altas temperaturas, siendo Fedearroz 473 tolerante, Mocarí resistente y Línea avanzada 1645 susceptible a altas temperaturas. A nivel proteico se concluye que la proteínas que presenta mayor intensidad corresponde a 50 kDa, siendo está correspondiente a proteínas glutelinicas que constituyen entre el 70 y 90% de proteínas totales en arroz.
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1. INTRODUCCIÓN
Durante los últimos siglos se ha observado una serie de cambios en las condiciones climáticas generales del planeta, este fenómeno denominado "cambio climático global” ha sido de gran importancia en estudios en el aumento en la temperatura del planeta, encontrándose que durante los últimos 30 años la temperatura media del planeta ha aumentado entre 0,5°C a 3°C [1]. A su vez, diversos modelos predicen que en los próximos 50 años la temperatura global del planeta podría incrementarse entre 1,3°C a 5,8°C comparado con tiempos pre-industriales [1]. Si bien este aumento global de la temperatura afectará a todos los ecosistemas del planeta, se ha establecido que algunos de ellos serán más sensibles que otros a dichas modificaciones climáticas [2].
Las plantas al estar expuesta a este estrés abiótico (altas temperaturas), han desarrollado adaptaciones fisiológicas que le permiten un mejor rendimiento. Diversos estudios demuestran que una de estas adaptaciones es la producción de proteínas de choque térmico (HSP) las cuales son conservadas evolutivamente y el estímulo para la transcripción de estas proteínas es un fenómeno común en todos los seres vivos. Sin embargo, un cambio de temperatura significativo en un periodo de tiempo corto, disminuye las posibilidades de adaptación de los seres vivos en especial de las plantas, por esta razón, el fitomejoramiento juega un papel importante en la creación de distintas variedades de plantas que sean capaces de soportar todo tipo de estrés abiótico.
En los resultados de diversas investigaciones, la Federación Nacional de Arroceros en Colombia, FEDEARROZ, ha creado ciertas variedades de la especie Oryza Sativa, de las cuales algunas son implementadas en distintas regiones de Colombia. FEDEARROZ 473, FEDEARROZ Mocarí y Línea Avanzada (Lv 1645), son plantas que se utilizan actualmente en Colombia. Debido a la geografía del país, existen territorios con temperaturas que superan los valores de resistencia térmica teóricos para el desarrollo óptimo de la planta, lo cual no afecta la producción del grano en estos cultivos; una de las razones es la expresión de las proteínas de choque térmico que cumplen diversas funciones fisiológicas, como colaborar en la adquisición de la estructura terciaria de las proteínas en formación, interviniendo en su ensamble, translocación y secreción así como también en la degradación o reparación de proteínas anormales o actuando como chaperonas moleculares.
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2. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA
Las plantas de arroz Oryza Sativa, es uno de los cultivos de mayor importancia a nivel mundial después del trigo. Su importancia radica debido a que el arroz es el alimento básico de más de la mitad de la población mundial, ya que su producción se extiende en más de 100 países en los continentes de Asia, América, Europa y África, lo que conlleva a que sea una de las fuentes económicas de mayor importancia en el mundo.
El cultivo de arroz se concentra en Asia, principalmente en la China, donde se produce cerca del 90% de la producción mundial. En Colombia se cultiva esta planta en 211 municipios produciendo más de 1 millón de toneladas al año. El cultivo de arroz, requiere de unas condiciones de temperatura, humedad, y nutrientes adecuados para una producción óptima. No obstante, los cambios en el clima que se han generado en los últimos años, han provocado aumento en la temperatura de hasta 5°C, alterando la temperatura óptima en cada una de las fases de crecimiento de la planta haciendo que esta entre en un periodo de estrés, lo que conlleva disminución y pérdidas en la producción del cultivo.
Diversos estudios han demostrado que los organismos vivos sintetizan un grupo de proteínas como respuesta al estrés térmico conocidas como Proteínas de Choque Térmico (HSP), que están relacionadas con la defensa frente a los efectos del estrés por alta temperatura siendo muy conservadas evolutivamente.
De acuerdo a lo mencionado anteriormente, en este trabajo de grado se aborda la siguiente pregunta de investigación:
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3. ANTECEDENTES
El presente trabajo toma como antecedentes los trabajos de grado y artículos internacionales relacionados al estudio de las proteínas de choque térmico, bajo estrés abiótico. Dentro de los cuales podemos citar:
En el año 2013, en Colombia, Cañate Olaya J y Novoa Sánchez C[3]. presentaron una investigación en la Universidad Distrital Francisco José de Caldas sobre la relación en la respuesta al estrés térmico por calor en plántulas de arroz Oryza sativa de la línea avanzada Lv 1645 y las variedades FEDEARROZ 473 y MOCARÍ con la expresión de los genes que codifican para las proteínas de choque térmico HSP70 y HSP90, donde demostraron que dichas proteínas tenían mayor expresión en el tratamiento utilizado a mayor temperatura 42 °C con todos los genotipos y en los otros dos tratamientos de 28 y 35 °C existió una menor expresión de estos genes. También comprobaron que entre los tratamientos de menor temperatura no se presentaron diferencias significativas en los niveles de expresión. Al ser esta la primera investigación donde se comparan los niveles de expresión entre las proteínas HSP70 y HSP90 en estrés calórico en Colombia los resultados se convierten en un primer reporte de la expresión de esta proteína para el país, debido a que existen pocos estudios de la HSP70 en Oryza sativa.
En el mismo año en el mes de julio se publicó en la revista “Cell Stress & Chaperones” el trabajo realizado en la India por Sarkar, N. K., Kundnani, P., & Grover, A [4] titulado “Functional analysis of Hsp70 superfamily proteins of rice (Oryza sativa)” en el cual se identificó y caracterizó la funcionalidad de genes Hsp70 en el genoma del arroz, para entender la red funcional de chaperonas. También, analizaron ADN mitocondrial de arroz mHsp70 y se propone como supresor de calor y muerte celular programada, inducida por H2O2 corroborando la información de Qi et al. 2011 [5,6]. Se identificaron 32 genes de dominio Hsp70 en el genoma del arroz, que constituyen esta superfamilia, esto incluye 24 Hsp70 y 8 genes Hsp110. Por último se realizó un análisis de la expresión de Transcripción que reveló que varias Hsp70 se rigen bajo diferentes condiciones de estrés y los genes se expresan constitutivamente o es regulado por el desarrollo.
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SbHsp70-1 ARNm se expresa constitutivamente en hojas y el tallo, pero se incrementa significativamente en choque térmico a 42 °C. Al choque de frío a 4 °C, el nivel de transcripción de ARNm SbHsp70-1 aumentó en la hoja, pero no se observó ningún cambio significativo en el tallo. La expresión de la pET28a-SbHsp70-1 en células de Escherichia coli bajo el estrés por calor resultaron en su supervivencia incluso a temperatura más alta (65 °C). Los resultados de la investigación sugieren que SbHsp70-1 es una proteína inducible por calor que confiere tolerancia térmica a las células bacterianas y puede ser un objetivo prometedor para estudiar la tolerancia al estrés en los cultivos.
Con relación a las proteínas de choque térmico (HSP90) Chong, L. P., Wang, Y., Gad, N., Anderson, N., Shah, B., & Zhao, R [8]. publicaron en el mes de junio del año 2015 en la revista “Journal of Experimental Botany” una investigación titulada “A highly charged region in the middle domain of plant endoplasmic reticulum (ER)-localized heat-shock protein 90 is required for resistance to tunicamycin or high calcium-induced ER stresses” donde analizaron la secuencia de ER-localización en Arabidopsis de HSP90.7 y otras proteínas ER Grp94 de plantas y animales, e identificaron una región corta, cargada, específicamente presente en el dominio medio de proteínas Grp94 derivados de plantas. Para entender el papel de esta región cargada, se analizaron en el estudio las plantas transgénicas que expresan una proteína mutante, HSP90.7Δ22, que tenía esta región cargada eliminada demostrando que las plántulas que expresan HSP90.7Δ22 habían mejorado significativamente la sensibilidad al estrés inducida por tunicamicina o una alta concentración de calcio, aunque su actividad chaperona en general es la prevención de la proteína modelo a partir de la agregación inducida por calor no se vio afectada significativamente. También se analizó la actividad de hidrólisis de ATP vinculante y de tipo salvaje y las proteínas mutantes HSP90.7, en donde encontraron que tenían ligeramente diferentes afinidades de unión a ATP. Finalmente, utilizando dos híbridos de levadura, se identificó un pequeño conjunto de interactores HSP90.7 y se demostró que la región cargada no se requiere para la interacción con el cliente candidato, aunque puede afectar su afinidad de unión, proporcionando así los posibles objetivos para una mayor investigación HSP90.7 de funciones.
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ABA mientras OsHSP24.1 fue suprimida por la ABA. Estas observaciones implican que los nueve genes OsHSP pueden desempeñar diferentes funciones en desarrollo de la planta y las respuestas de estrés abiótico. Los datos en la investigación sobre los nueve genes OsHSP sugieren que OsHSPs se expresan bajo condiciones normales con preferencia de tejido; OsHSPs expresión se mejora, en general bajo el estrés por calor y algunas HSPs pueden ser inducida por estrés por sal y PEG; y ambas vías ABA-dependiente e -independiente pueden existir en la transducción de señales de estrés para regular la expresión de HSP.
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estrés por calor [13]. Los resultados de esta investigación proporcionan nueva información sobre el mecanismo de regulación de sHsps en el arroz.
En noviembre del 2014 en la revista “PLoS ONE” fue publicada la investigación realizada por Company, N., Nadal, A., Ruiz, C., & Pla, M [14]. titulada “Production of Phytotoxic Cationic α-Helical Antimicrobial Peptides in Plant Cells Using Inducible Promoters” demostrando que la producción de péptidos recombinantes fitotóxicos en plantas transgénicas es posible gracias a la limitación estricta de la expresión transgénica de ciertos tejidos y en diferentes condiciones, y principalmente en la minimización de esta expresión durante la transformación y regeneración de las plantas transgénicas, lo cual es esencial para obtener biofábricas vegetales viables. Sobre la base de todo el trancriptoma de datos disponibles en línea, este estudio se identificó el promotor Os.hsp82 que fue altamente inducida en respuesta a choque térmico. Con esta estrategia, se generaron líneas de arroz transgénicas que producen rendimientos moderados de derivados gravemente fitotóxicos BP100 sobre la exposición a altas temperaturas. Además, un umbral para la expresión génica en tejidos y etapas seleccionadas se establece experimentalmente, por debajo del cual los promotores correspondientes deben ser adecuados para la conducción de la expresión de proteínas recombinantes en fitotóxicos plantas modificadas genéticamente. Se utilizaron cuatro secuencias [AK063751.1 (Os.hsp82), X60820.1, AU165294 y AK071240 (Os.hsp18)] que codificadas proteínas de choque térmico que pertenecen a las familias de Hsp90 (Os.hsp82) y Hsp pequeñas (sHsp). Específicamente, el gen Os.hsp18, que codifica a Hsp18.0 citosólica de clase II, tenía muy alta expresión tras la inducción, aunque el análisis de microarrays demostró que conserva algo de actividad en etapas y condiciones que son fundamentales para la producción de plantas transgénicas de desarrollo. Os.hsp82 tenía extremadamente baja expresión en tejidos de control y alcanzó altos niveles de expresión en respuesta al calor, pero Os.hsp18 no fueron inducidos de manera significativa por otras condiciones de estrés, tales como frío, NaCl y la sequía. Hemos producido péptidos antimicrobianos a-helicoidales fitotóxicos derivados de BP100 en las plantas sobre la base de una estricta regulación de la transcripción del transgén.
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la fisiología de la semilla, se generaron líneas de sobreexpresión específicos en Arabidopsis de semillas para OsHSP18.2. El análisis funcional demostró que OsHSP18.2 tiene capacidad para mejorar vigor de la semilla y la longevidad mediante la reducción de la acumulación de ROS nocivo en las semillas. Además, las semillas de Arabidopsis transformadas también mostraron un mejor rendimiento en la germinación y emergencia de cotiledón bajo condiciones adversas. Por último el estudio demuestra que OsHSP18.2 es una proteína sensible al envejecimiento que funciona como una chaperona molecular y, posiblemente, protege y estabiliza las proteínas celulares del daño irreversible en particular durante la maduración de secado, desecación y el envejecimiento en las semillas mediante la restricción de la acumulación de ROS y por lo tanto mejora el vigor de la semilla, la longevidad y el establecimiento de plántulas.
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4. JUSTIFICACIÓN
Los enormes avances logrados en la investigación científica en el área de la Genética Molecular durante las últimas décadas han posibilitado progresos trascendentales en la aplicación de las tecnologías biológicas en el área productiva. El objetivo de las investigaciones en Genética Molecular, actualmente se centra en usar estos conocimientos para el desarrollo de una metodología técnica y económicamente competitiva, que a través del uso inteligente y respetuoso de los sistemas vivientes y los organismos, facilite la resolución de importantes problemas productivos y sociales. Los profesionales que trabajan con este tipo de sistemas biológicos deben conocer profundamente las problemáticas que estos sistemas presentan y consecuentemente, estar preparados para contribuir a la solución de las mismas. Por lo tanto, deben adquirir herramientas que les permitan profundizar, complementar y actualizar conocimientos y habilidades que completen su formación profesional, en el área de la Genética Molecular. En la biología hay áreas especializadas en el estudio de los organismos vegetales, que junto a la química se encargan de realizar investigaciones con miras al mejoramiento de cultivos y cosechas, con el fin de lograr una óptima producción de las especies y un mejoramiento en cuanto a su resistencia a los agentes externos, tales como la temperatura, salinidad, humedad, metales pesados, entre otros. La expresión de proteínas en especial de choque térmico (HSP) está determinada por diversos factores que afectan el metabolismo de la planta, en particular por estrés térmico. Las plantas de arroz son una de las principales fuentes alimenticias de la población mundial, y están siendo afectadas por el calentamiento global, razón por la cual resulta relevante establecer la expresión de los genes que codifican estas proteínas, lo anterior se enmarca en la rama de la Genética Molecular.
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12 5. HIPÓTESIS
5.1. HIPÓTESIS DE VARIEDADES
Hipótesis nula (H0): el estrés por alta temperatura no genera diferencias en la expresión de genes que codifican las proteínas de choque térmico sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7) Hsp70 y Hsp 90 en las variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Lv 1645 irradiadas con 60Co.
Hipótesis alterna (H1): el estrés por alta temperatura si genera diferencias en la expresión de genes que codifican las proteínas de choque térmico sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7) Hsp70 y Hsp 90 en las variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Lv 1645 irradiadas con 60Co.
5.2. HIPÓTESIS DE TRATAMIENTOS
Hipótesis nula (H0): las variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Lv 1645 no presentan diferencias significativas en la expresión de genes que codifican las proteínas de choque térmico sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7) Hsp70 y Hsp 90 en los diferentes tratamientos (TC, T1 y T2).
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6. OBJETIVOS
6.1. OBJETIVO GENERAL
Evaluar la expresión de los genes que codifican las proteínas de choque térmico sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7) Hsp70 yHsp90 de tres variedades Fedearroz 473, Mocarí, Lv 1645 irradiadas con 60Co de Oryza Sativa, mediante qRT-PCR y SDS-PAGE.
6.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Germinar semillas de arroz Oryza Sativa de las variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí, Lv 1645 irradiadas con 60Co, mediante cultivo hidropónico.
Inducir a estrés térmico las plántulas de arroz Oryza Sativa de las variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí, Lv 1645 irradiadas con 60Co.
Evaluar la expresión de los genes que codifican las proteínas de choque térmico sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7) Hsp70 y Hsp90 de plántulas de arroz Oryza Sativa de las variedades Fedearrodz 473, Fedearroz Mocarí, Lv 1645 irradiadas con 60Co a través de qRT-PCR y SDS-PAGE.
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7. MARCO TEÓRICO
7.1. GENERALIDADES DEL ARROZ
El origen del arroz se ubica en el continente asiático, donde comenzó a cultivarse aproximadamente hace 10.000 años principalmente al sur de la India, de allí se extendió a China, y posteriormente se estableció en Corea y Japón [17], probablemente hubo varias rutas por las cuales se introdujo el arroz desde Asia a otras partes del mundo.
El género Oryza tiene más de 24 especies silvestres que crecen en regiones inundadas, semi-sombreadas y bosques en el sureste Asiático, Austria, África, Sur y Centro América [18] siendo la especie Oryza sativa L. la de mayor importancia económica en el mundo; dentro de esta especie se presentan dos grupos: Índica y Japónica consideradas razas eco geográficas. Estos grupos mantienen características particulares diferenciadas en cuanto a porte o altura de plantas, coloración del follaje, tipo de macollamiento, tipo de grano, tendencia al desgrane y sensibilidad al fotoperiodo [17].
El tipo Índica, se cultiva en los climas tropicales, pero también prospera en condiciones climáticas templadas, representando así la mayor parte de la producción mundial de arroz y es la que se utiliza actualmente en todo el territorio colombiano. Este grupo se caracteriza por presentar mayor altura que otras variedades, macollamiento denso, hojas largas e inclinadas de color verde pálido y grano de tamaño mediano a largo [19]. Debido al alto contenido de amilosa, le da un aspecto blando y seco al grano, haciéndolo poco apto para la desintegración en la cocción [19]. En torno a ellas, los trabajos de mejoramiento genético han dado lugar a la producción de variedades de porte bajo, con excelente capacidad de macollamiento y altos rendimientos [19,20].
El tipo Japónica, se cultiva y se consume sobre todo en zonas climáticas templadas y tropicales de tierras altas, en Australia, China, Taiwán, la República Democrática de Corea, la Unión Europea, Japón, Rusia, Turquía y los Estados Unidos (Estado de California). Está, se distingue de la índica, por tener hojas erectas de color verde intenso, y una capacidad de macollamiento menor que las de tipo índica, sus granos son cortos y anchos y su contenido bajo de amilosa lo hace susceptible a la desintegración durante la cocción [19,20].
7.1.1. Clasificación taxonomía
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Tabla 1. Clasificación taxonómica dela arroz
Reino Plantae
Subreino Tracheobionta División Magnoliophyta
Clase Monocotiledóneas
Orden Poales
Familia Poaceas
Tribu Oryzeae
Genero Oryza
Especie Oryza Sativa L Grupos Indica, Japonica 7.1.2. Morfología del arroz
El arroz es una gramínea anual, de tallos redondos y huecos compuestos por nudos y entrenudos, hojas de lámina plana unidas al tallo por la vaina y su inflorescencia es en panícula. El tamaño de la planta varía de 0.4 m (enanas) hasta más de 7.0 m (flotantes) [20]. Los órganos de la planta se dividen en dos grupos (figura 1): órganos vegetativos (raíz, hoja y tallos), y órganos reproductivos (flor y semillas) [21,22].
16 7.1.2.1. Órganos vegetativos
Raíz
Las raíces son delgadas, fibrosas, y fasciculadas [21], durante su desarrollo la planta de arroz comprende dos tipos de raíces (figura 2a): las seminales (temporales) y las adventicias o principales (permanentes).
Las raíces seminales, temporales o primarias se originan en la radícula, viven un corto tiempo después de la germinación y son reemplazadas por las raíces adventicias [22]. Las raíces adventicias, secundarias o permanentes se forman a partir de los nudos inferiores del tallo joven. En los estadios iniciales de crecimiento estas raíces son blancas, cortas y gruesas; a medida que la planta crece las raíces se alargan, se adelgazan y se ramifican en abundancia [17,21].
Las puntas de las raíces están protegidas por una masa de células, llamada coleorriza, para facilitar la penetración de la raíz en el suelo. La forma y el desarrollo de las raíces del arroz dependen del medio de cultivo y el nivel de nitrógeno en el suelo. Cuando los suelos están inundados la parte externa de las raíces toma una coloración amarillo rojiza, debido a la presencia de compuestos férricos; en los suelos aireados las raíces conservan su coloración blanca [17,19] cuando las raíces son de color negro es debido a una alta concentración de sulfuros en el suelo.
Tallo
El tallo de arroz se forma de nudos y entrenudos alternados (figura 2b). El tallo de una planta de arroz, en sus inicios, es una estructura muy corta (mucho menos de 1 cm) y subterránea donde se encuentran bien diferenciados los nudos, en secuencia alterna con los entrenudos que más tarde se alargan. En cada nudo se forma una hoja y una yema; este último puede desarrollarse dando lugar a una macolla o hijo [19] Las macollas primarias emergen sucesivamente del primero, segundo y de los demás nudos que siguen al nudo principal del tallo; las macollas secundarias nacen del segundo nudo de cada hijo primario; y las macollas terciarias, nacen del segundo nudo de cada macolla primaria. Entre los 50 y 55 días, el tallo deja de ser subterráneo, al iniciar su proceso de alargamiento, para convertirse en una estructura hueca y cilíndrica, donde los entrenudos basales se conservan muy cortos y los superiores se alargan sobre los 10 o 15 centímetros [17].
17 Hoja
Las hojas se distribuyen en forma alterna a un lado y otro a lo largo del tallo, son envainadoras, con el limbo lineal, agudo, largo y plano La primera hoja que aparece en un nudo basal del tallo principal se denomina profilo el cual no tiene lámina y está constituido por dos brácteas aquilladas. En cada nudo, con excepción del nudo de la panícula, se desarrolla una hoja. La última hoja que nace en el tallo debajo de la panícula es llamada hoja bandera [22].
En el máximo desarrollo del estado de plántula el arroz muestra seis hojas, de las cuales tres están completamente formadas, dos en proceso de crecimiento y una muerta [17]. En una hoja completa se distinguen las siguientes partes (figura 2c): la vaina, el cuello y la lámina. La vaina o base de la hoja, sale de un nudo y envuelve el entrenudo superior llegando en algunos casos hasta el nudo siguiente. Es generalmente glabra y puede tener pigmentos de antocianinas en su base o en sectores de la superficie. El pulvínulo de la vaina es una protuberancia situada encima del punto de unión de la vaina con el tallo, en algunos casos es confundido con el nudo [17,19]
Figura 2. Morfología de los órganos vegetativos. a. raíz; b. tallo; c. hoja. Recuperado y modificado de: http://www7.uc.cl/sw_educ/cultivos/cereales/arroz.htm [24]]
18 7.1.2.2. Órganos reproductores
Flor
Las flores (figura 3a) de arroz están reunidas en una inflorescencia compuesta llamada panícula, está situada sobre el nudo apical del tallo, llamado nudo ciliar [20]. La panícula consta de un eje principal, cuya parte superior corresponde al raquis y la inferior al pedúnculo o cuello, el cual se encuentra más o menos cubierto por la hoja bandera. Sobre el raquis se forman ramificaciones (primarias, secundarias y hasta terciarias), que finalmente rematan en el pedicelo (ramificación terminal) y sobre éste se desarrollan las espiguillas, conformada por tres estratos de piezas florales, de los cuales el más importante es el de las glumas fértiles, denominadas lemma y pálea; estructuras que en definitiva van a conformar la cáscara del grano [17,19].
Las flores comprenden seis estambres y un pistilo. Los estambres son filamentos delgados que sostienen las anteras que son alargadas y bífidas y contienen los granos de polen; en el pistilo se distinguen el ovario que es de cavidad simple y contiene un solo ovulo; el estilo es corto y termina en un doble estigma plumoso, que presenta diferentes colores según la variedad de arroz: puede ser blanco, verde pálido, amarillo, purpura pálido o purpura [19,20]. Los lodículos son dos protuberancias redondeadas y transparentes que se encuentran en la base de la flor, al lado de la palea. Durante la antesis los lodículos se ponen turgentes logrando que la lemma y la palea se separen, simultáneamente se alargan los estambres y las anteras emergen. La dehiscencia de las anteras puede efectuarse antes o al mismo tiempo en que se abren las lemmas, mostrando tendencia a la cleistogamia. Después de que las anteras hayan derramado el polen las lemmas se cierran [17,19,20]. A diferencia del maíz, las flores del arroz tienen los dos sexos en la misma flor.
Figura 3. Morfología de los órganos reproductores. a. panícula de arroz; b. espiguilla y c.
semilla. Recuperado y modificado de:
19 Semillas
La semilla de arroz corresponde a un ovario maduro, seco e indehiscente, que consta de las siguientes partes (figura 3c):
La cascara formada por la lema, la palea y las partes asociadas a estas dos estructuras. Las lemas estériles, la raquilla, la arista y el embrión que está situado en el lado ventral
de la semilla, cerca de la lemma.
El endospermo, que provee alimento durante la germinación.
Debajo de la lemma y la palea hay tres capas de células que constituyen el pericarpio; debajo de éstas se encuentran dos capas, el tegumento y la aleurona [21]. El embrión consta de la plúmula u hojas embrionarias y la radícula o raíz embrionaria primaria. La plúmula está cubierta por el coleóptilo, y la radícula está envuelta por la coleorriza [21,22].
El grano de arroz descascarado se conoce como arroz integral, y pueden clasificarse de acuerdo a su tamaño en [19]:
Grano extralargo (EL) : 7.5 mm o mas Grano largo (L): de 6.6 a 7.4. mm Grano medio (M): 5.6 a 6.5 mm Grano corto (C): 5.5. mm o menos
7.1.3. Crecimiento y desarrollo de la planta de arroz
El crecimiento de la planta de arroz es un proceso fisiológico continuo, corresponde a un ciclo completo desde la germinación hasta la maduración del grano [25] (figura 4).El ciclo de vida de la planta está comprendido entre 100 a 210 días generalmente y siendo el más común entre 130 a 150 días, el cual puede variar dependiendo de las características genéticas de la planta o de la influencia del ambiente [20,25].
El crecimiento de la planta de arroz se divide en tres fases, donde se desarrollan nueve etapas [10], (tabla 2).
20
Figura 4. Fases de crecimiento y desarrollo de la planta de arrozRecuperado de: Sánchez C. Identificación y cuantificación de especies del genero Merluccius mediante la utilización de PCR a tiempo real [26].
Las fases reproductiva y de maduración tienen por lo general, una duración constante. La fase vegetativa es la que determina la duración del ciclo de vida de las variedades [17].
Tabla 2. Fases y etapas del desarrollo del arroz [17,19,20]
Fase Etapa
Vegetativa (55 a 60 días)
0 Germinación de la semilla (5-7 días). Desde el humedecimiento de la semilla hasta la aparición de la primera hoja a través del coleoptilo.
1 Plántula (15-20 días). Desde la aparición de la primera hoja hasta la aparición del primer hijo
2 Macollamiento (30 -35 días). Desde la aparición del primer hijo hasta el máximo macollamiento (2Mx)
3 Elongación del tallo (5-7 días). Desde el alargamiento del cuarto entrenudo hasta inicio (micro) del primordio floral.-
Reproductiva (35 días)
4 Inicio de panícula (10-11 días). Desde la formación microscópica del primordio floral hasta hacerse visible.
5 Desarrollo de panícula (20-25 días). Desde que se hace visible hasta la emergencia a través de la hoja bandera
6 Floración (7-10 días). Desde la apertura de glumas en el tercio superior hasta la emergencia total y fecundación.
Maduración (30 días)
7 Grano lechoso (7-10 días). Desde la fecundación hasta la formación inicial del grano.
21 7.2. ESTRÉS POR FACTORES ABIÓTICOS
Las plantas en la naturaleza, están constantemente expuestas a estrés abiótico o ambiental. El estrés abiótico vegetal se define como todo factor externo que afecte negativamente el crecimiento, productividad y capacidad reproductiva o de supervivencia de las plantas [10,27,28]. Si el estrés es demasiado intenso o el periodo de acción es demasiado largo los daños latentes se transforman en daños irreversibles que pueden afectar a la planta entera o partes de la misma [29]. Se estima que únicamente un 10% de la superficie de la tierra arable se encuentra libre de estrés. Cerca del 20% de la tierra presenta algún tipo de deficiencia o toxicidad mineral, el 26% es afectado por estrés de sequía y el 15% por congelación [29]. Incluso las plantas que se encuentran protegidas por invernadero y túneles presentan eventos de estrés biótico y abiótico disminuyendo la productividad y calidad de los cultivos [29]. Son múltiples los factores ambientales que originan estrés en las plantas, entre ellos se encuentra: deficiencias o excesos de agua y nutrientes minerales, pasando por altos contenidos salinos de los suelos, altas o bajas temperaturas extremas, excesiva radiación solar (PAR, UVB), excesiva alcalinización o acidificación de los suelos y factores mecánicos (compactación de los suelos, viento, nieve, granizo) hasta la presencia de contaminantes químicos en los suelos (metales pesados, agentes xenobióticos, etc.) o en el aire (SO2, O3, óxidos de nitrógeno (NOx), HF, nitrato de peroxiacetilo, etc.) [27].
En los cultivos de arroz el estrés abiótico afecta la planta por dos vías, la primera perjudica directamente los procesos fisiológicos involucrados en la producción del grano, tales como crecimiento vegetativo, desarrollo de espiguillas y llenado de grano y la segunda vía afecta indirectamente los rendimientos a través de la incidencia de enfermedades e insectos fitófagos [30]. El estrés que sufre la planta está relacionado con la tolerancia al mismo, siendo este la capacidad que tiene la planta para hacer frente a las condiciones desfavorables y se mide mediante el rendimiento del cultivo, el crecimiento, o los procesos de asimilación primaria (incorporación de CO2 y minerales) que están relacionados con el crecimiento [27,28]. 7.2.1. Estrés por altas temperaturas
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Durante la germinación y crecimiento de la plántula temperaturas de 45°C provocan la aparición de punta blanca, bandas cloróticas y manchas sobre la lámina de las hojas; cuando la temperatura es de 35°C el macollamiento es reducido. En la fase reproductiva un estrés de alta temperatura a 38°C o más da lugar a una reducción del número de espiguillas [32].Estudios previos, por Yoshida [33] han mostrado que las espiguillas en antesis que son expuestas a temperaturas superiores a 35°C por cerca de 5 días durante la etapa de floración resultan estériles, la cual es causada por una pobre dehiscencia y una baja producción de polen, y de allí que se presenta un bajo número de granos de polen que germinan en el estigma [20,34]. Así mismo, se ha encontrado que menos de una hora de exposición a altas temperaturas es suficiente para inducir esterilidad en arroz (Jagadish et al, 2007).
Además, la fotosíntesis en el cultivo del arroz es severamente afectada por temperaturas superiores a los 40°C, y se encuentra relacionada directamente con el contenido de clorofila de la hoja [20]. Cuando se exceden los límites de temperatura óptimos se presentan alteraciones fisiológicas importantes, como desnaturalización de proteínas, alteraciones de la fluidez de membranas, inhibición en el transporte de electrones, entre otras, afectando el crecimiento, desarrollo y el rendimiento final del cultivo [20,35].
Tabla 3. Efecto de la temperatura en el desarrollo y crecimiento de la planta de arroz [5] Etapas de desarrollo
Temperatura
alta (°C) Efecto Temperatura
óptima (°C)
Macollamiento 33 Reducido 25-31
Iniciación de la
Antesis (floración) 35 Esterilidad 30-33
Maduración 30 Menor llenado del
23 7.3. MEJORAMIENTO DEL ARROZ
El objetivo principal del Fitomejoramiento es desarrollar variedades que presenten mayores rendimientos de producción, mayor resistencia a plagas, enfermedades y efectos ambientales que puedan alterar su ciclo su vida [19,20]. Encontrar una variedad que cumpla y satisfaga las necesidades del agricultor requiere de un ardua investigación de casi siete a doce años. Los tres métodos más usados en el mejoramiento son el masal, el de pedigree y el de retrocruzamiento; no obstante, actualmente se está haciendo uso de agentes mutagénicos tanto químicos como físicos [19,22].
Los mutagénicos físicos son un amplio grupo de radiaciones entre las que se encuentran los rayos gamma, rayos X, neutrones, ultravioleta, partículas alfa, beta y protones. Estas radiaciones pueden ser divididas en ionizantes y no ionizantes; la primera categoría incluye aquellas radiaciones capaces de producir iones al interactuar con la materia (rayos X, gamma, protones y neutrones), mientras que la segunda se refiere a los rayos ultravioleta que transfieren la energía por excitación [20,36].
Las principales fuentes de rayos gamma son los isotopos 60Co, y 137Cs, utilizados ampliamente en radiobiología [20,22]. Las radiaciones provenientes de estos isotopos rompen las moléculas de agua, produciendo iones (H+, H-, OH+, OH-), radicales libres (Ho, OHo) y peróxidos (O22-) que atacan las moléculas de ADN y ARN, los cromosomas y las enzimas [22]. De este modo, se presentan cambios permanentes y heredables en el genoma del tejido tratado [22]. Para el año 2000 la Agencia Internacional de Energía Atómica (AIEA) reporta 434 variedades de arroz obtenidas mediante esta técnica, para mejorar características como la calidad del grano, la altura de la planta, el potencial de rendimiento, calidad culinaria, tolerancia al frio, resistencia a Pyricularia , entre otros.
Estudios realizados en el 2010 por Castilla [36] mostraron que la variedad Fedearroz 473 y Fedearroz Mocarí presentaron mayor adaptación a altas temperaturas (34°C) en Ambalema y el Espinal municipios del Tolima; la variedad de mayor rendimiento fue Fedearroz 473. Junto a ello se encontró que la variedad Fedearroz Lv 1645 presenta bajos rendimientos ante este tipo de estrés. A partir de esto se escogieron para el presente estudio las variedades Fedearroz 473 (resistente), Fedearroz Mocarí (tolerante) y Lv 1645 (susceptible) a estrés por altas temperaturas, las cuales han sido irradiadas con 60Co.
7.3.1. Fedearroz 473
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de secano sin curvas a nivel, es afectada por Helmintosporiosis en hoja y en el cuello. Esta variedad registra buen comportamiento en ambos semestres. Se siembra en la actualidad en Caribe seco, húmedo y el Centro del país donde se encuentran las zonas con más altas temperaturas debido a su buen rendimiento en dichos sitios [30].
7.3.2. Fedearroz Mocarí
Es un genotipo liberado hacia el año 2010 al mercado nacional, se caracteriza por un alto vigor inicial, periodo vegetativo corto, buena capacidad de macollamiento, excelente calidad molinera y buena sanidad foliar. En cuanto a la oferta ambiental, es de amplia adaptabilidad y estabilidad. Está aprobada para las zonas del Caribe seco, húmedo y centro del país, sin embargo, en los meses del año donde la temperatura alcanza su máximo, tiende a bajar su producción. Un reciente trabajo realizado en el centro del país con respecto a la nutrición con Nitrógeno, indica que se obtiene un aumento en el rendimiento significativo cuando se aplica el 60% del Nitrógeno programado hacia el inicio del primordio floral [30].
7.3.3. Línea Avanzada Lv 1645
Esta línea avanzada en la actualidad se encuentra en la fase de ensayos de rendimiento, pruebas que ha pasado con altos niveles de producción, sin embargo, estos ensayos al ser ejecutados en la zona Caribe donde las temperaturas son elevadas merma significativamente su rendimiento, por esta razón se ha clasificado como susceptible ante altas temperaturas, lo que compromete su liberación como variedad, aunque aún es prematuro sacar conclusiones ya que faltan más estudios para definir su viabilidad [3].
7.4. PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO
Debido a la sensibilidad de las fuerzas responsables del plegamiento de las proteínas a altas temperaturas, las proteínas se desnaturalizan fácilmente, o se pliegan de manera incorrecta; los organismos biológicos tienen un conjunto de proteínas que se expresan en respuesta a la alta temperatura que previenen o revierten los efectos del calor sobre la desnaturalización de las proteínas [37] estos se denominan proteínas de choque térmico (Heat shock proteins, HSP). Es importante aclarar que estas proteínas de choque térmico también se expresan como respuesta a otros tipos de estrés como temperaturas bajas, salinidad, metales pesados, sequia. Las Hsps están relacionadas con la adquisición de termo tolerancia, siendo muy conservadas evolutivamente, puesto que presentan función y estructura muy similar en archea, bacterias, levaduras, plantas y animales [38], Todas las HSP se caracterizan por la presencia de un N-terminal carboxílico llamado dominio de choque térmico [39].
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la modulación de la actividad de la proteína, la regulación de la degradación de proteínas y la prevención de la agregación de proteínas irreversibles [37,38] (figura 5).
7.4.1. Clasificación de las proteínas de choque térmico
Las proteínas de choque térmico se han agrupado en cinco familias denominadas: Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60 y sHsp’s (de bajo peso molecular), de acuerdo a sus estructura, peso molecular y grado de homología [10].
Figura 5. Función de las proteínas de choque térmico en la célula. Chaperonas de diversos tipos se unen a los polipéptidos recién sintetizados en los ribosomas, otras se unen a las proteínas que atraviesan las membranas de diversos organelos, o a proteínas que se han desnaturalizado debido a cualquier tipo de estrés. En todos los casos la función de las chaperonas es ayudar al correcto plegamiento de las proteínas, desagregación y reactivación de las proteínas. Recuperado y modificado de: Doyle S, Genest O, Wickner S. (2015) Protein rescue from aggregates by powerful molecular chaperone machines. [62].
7.4.1.1. Hsp100
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algunas son inducidas por calor y otras son constitutivas tanto en eucariotas como procariotas, y se localizan en el citosol, mitocondria y cloroplasto [28].
La primera Hsp100 fue descrita como componente de una proteasa dependiente de ATP en Escherichia coli, la proteasa caseinolitica (Clp). Esta proteasa posee tres miembros de regulación (ClpA, ClpB, ClpC) y un miembro catalizador (ClpP) [40]. La primera Hsp100 asilada en eucariotas fue la Hsp104 de Sacharomyces cerevisiae [41]. Esta proteína se expresa en respuesta al estrés y juega un papel central en la tolerancia a condiciones extremas [42]. En plantas superiores como arabidopsis, soja, tabaco, arroz, maíz, trigo, guisante y judía se ha logrado aislar proteínas correspondiente a esta familia, donde su estructura se asemeja a la ATP-dependiente ClpB de E. coli. [43]. Se ha demostrado que la expresión de Hsps100 en plantas se induce por una gran variedad de condiciones ambientales estresantes como calor, frio, salinidad, deshidratación y metales pesados. Además su expresión también está regulada durante el desarrollo [42]. En Oryza sativa, se aisló la Hsp110 kDa, que es homólogo de la Hsp104 de levadura y se expresa frente a estrés por altas y bajas temperaturas, salinidad y ABA [43].
De acuerdo a la presencia de uno o dos dominios de unión a ATP las Hsps100 se dividen en dos clases: clase I y clase II (figura 6). Las Hsp100 de clase I en su estructura contienen dos dominios de unión a ATP (NBD-1 yNBD-2); en un extremos se encuentra el dominio N- Terminal (domino N), seguido por un dominio de unión de nucleótidos (NBD-1), un dominio medio (dominio M), y un segundo dominio de unión a nucleótidos (NBD-2), seguido del dominio carboxilo (dominio C) [43]. Las proteínas de esta familia presentes en Oryza sativa, se clasifican en la clase I tipo (ClpB) (figura 7).
Figura 6. Clasificación y organización de dominios de proteínas de la familia Hsp100. La estructura de las proteínas Hsp100 están conformadas por dos clases. La Clase I posee un dominio N-terminal, seguido de un dominio de unión a sustrato 1 (NBD-1), posteriormente se encuentra el dominio M, le sigue una segunda región de unión a sustrato (NBD-2) y finalmente el dominio c-terminal. La clase II está formada únicamente un dominio de unión a sustrato similar al NBD-2 de la clase I. Recuperado de:
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Las Hsp100 de clase II contienen solo un dominio de unión a ATP que es similar al dominio NBD-2 de las Hsp100 de clase I [44]. Dentro de sus funciones se encuentra, facilitar la solubilidadx y eliminación de agregados de proteínas desnaturalizadas, implicando la participación de otras chaperonas como las HSP70 y proteasas [31,38]. Otra función descrita para las Hsp100 de plantas es su papel como reguladores de la expresión de genes [31,37].
Figura 7. Estructura de la proteína ClpB. Compuesta por un dominio N terminal (gris), una región de unión a sustrato 1 y 2 (NBD-1 y NBD-2) (azul y verde respectivamente, un dominio medio en espiral (naranja), en amarillo se muestra la presencia de nucleótido unido a las regiones NBD1 y NBD2. Protein rescue from aggregates by powerful molecular chaperone machines. Recuperado de: Doyle S, Genest O, Wickner S. (2015) Protein rescue from aggregates by powerful molecular chaperone machines. [62].
7.4.1.2. Hsp90
Las proteínas de esta familia tienen un tamaño que oscila entre 82 y 96 kDa, se encuentran en el citosol y retículo endoplasmatico. Estas proteínas son muy conservadas evolutivamente y esenciales para la viabilidad de las células eucariotas, siendo dependiente de ATP [45]. Hsp90 es una de las proteínas más abundantes en los eucariotas, representando aproximadamente el 1% de proteínas solubles totales bajo condiciones normales. A diferencia de otras proteínas la familia Hsp90 no actúa en el plegamiento de la proteína naciente, si no que interviene en el plegamiento final de la proteína.
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Para lograr su función, la Hsp90 trabaja en conjunto con un grupo de cofactores denominados co-chaperonas como p50, p23, Aha1 y proteínas con motivo TPR, que facilitan la maduración de la proteína cliente.
En los animales Hsp90 es muy conocida como un componente de un complejo que ayuda a doblar el receptor de glucocorticoides. En las plantas, Hsp90 participa en un complejo multiproteico similar que también incluye Hsp70 y una pequeña proteína ácida conocida como p23, [37] además son necesarias para el crecimiento y desarrollo normal de la planta. Por otro lado las Hsp90 es regulada en respuesta a diversos estrés abióticos y bióticos y también participan en la respuesta inmune de las plantas [47], aunque el mecanismo de acción aún no se conoce.
Se han aislado genes de Hsp90 en diferentes especies de plantas, en Arabidopsis thalina, se encuentra 7 proteínas de las cuales 4 se localizan en el citoplasma y se considera que las otras 3 se ubican en el retículo endoplasmatico y mitocondria [48]. También se han encontrado en Licopersicum esculentum [49] Zea mays [49], y Brassica napus [48] y Oryza sativa. En el arroz se expresó el gen Hsp90 en semillas y hojas bajo el estrés por sales (NaCl, NaHCO3 y Na2CO3), desecación, pH y temperatura alta [50]. Sin embargo no está claro su mecanismo molecular [47].
