INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERÍA QUÍMICA E INDUSTRIAS EXTRACTIVAS
Sección de Estudios de Posgrado e Investigación
DETERMINACIÓN EXPERIMENTAL DE SOLUBILIDADES DE LICOPENO EN
DISOLVENTES SUPERCRÍTICOS
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS
EN INGENIERÍA QUÍMICA PRESENTA
VICTOR HUGO SOTO RUIZ
Director: Dr. Luis Alejandro Galicia Luna.
México, D. F. Junio 2009.
A G R A D E C I M I E N T O S
Al Dr. Luis Alejandro Galicia Luna, por su participación en la dirección del presente trabajo de tesis y por el gran apoyo recibido durante de mis estudios de Maestría.
Al Instituto Politécnico Nacional que a través de la Escuela Superior de Ingeniería Química e Industrias Extractivas me permitió realizar mis estudios de Maestría.
Al Programa Institucional para la Formación de Investigadores (P.I.F.I.) y al Programa Institucional de Becas del Instituto Politécnico Nacional, por el apoyo económico otorgado durante mis estudios de Maestría.
A los miembros del jurado, Dr. Roberto Limas Ballesteros, Dr. Christian Bouchot, Dra. Tatiana Timoshina Lukianova, Dr. Juan Ramón Avendaño Gómez, Dr. Octavio Elizalde Solis por sus acertados comentarios que contribuyeron al mejoramiento de esta tesis.
A mis profesores de Posgrado y Licenciatura por sus enseñanzas y conocimientos transmitidos durante mis estudios.
A los miembros del área administrativa de la S.E.P.I. - E.S.I.Q.I.E., en especial a la Sra. Ma. de Lourdes Limón López y el Lic. Agustín Villareal por el apoyo para realizar los trámites administrativos durante el desarrollo de mis estudios de posgrado.
A mis compañeros y amigos del laboratorio de termodinámica, Dr. Octavio Elizalde Solis, Dr. Félix Francisco Betancourt Cárdenas, M. en C. Luis Enrique Camacho Camacho, Ing. Andrea Rodríguez Calderón, Ing. Sergio Álvarez Badillo, Ing. Rodolfo Quevedo Nolasco, por los intercambios de ideas, el apoyo recibido en diferentes momentos del desarrollo de mi trabajo de investigación y lo más importante su amistad. Gracias a todos los amigos que he conocido desde que llegue a la ciudad y me han brindado su amistad.
D E D I C T O R I A
Este trabajo se lo dedico a Dios por estar siempre conmigo, darme las oportunidades y la capacidad de aprovecharlas.
A mi mamá Gabriela Ruiz Cabrera, por sus consejos y la educación que me ha transmitido. A mis hermanos Benjamín y Gabriela quienes siempre me alentaron a seguir adelante. Este logro no hubiera sido posible sin su apoyo. Gracias por creer en mí y apoyarme tanto, ¡los amo!
A mis tíos Fernando Javier Olivas Zúñiga y Consuelo Ruiz Cabrera quienes me han brindado todo el apoyo y comprensión durante el desarrollo de estudios de Licenciatura y Posgrado. A mis primos, Fernando Isaac Olivas Ruiz, Javier Aarón Olivas Ruiz y José Daniel Olivas Ruiz con quienes he pasado tantos buenos momentos juntos.
¡Todavía faltan más carnales!
A mis madres Yolanda Cabrera e Hilda Camacho que siempre me dijeron: ¡adelante! A toda mi familia y amigos quienes siempre están conmigo en las buenas y las malas.
Í N D I C E
Lista de símbolos y abreviaturas III
Lista de figuras V
Lista de tablas VII
Resumen X
Abstract XII
Introducción XIV
1. Generalidades 1
1.1 Generalidades 1
1.1.1 Carotenoides 1
1.1.2 Características del licopeno 4
1.1.3 Aplicaciones del licopeno 7
1.1.4 Generalidades de los fluidos supercríticos 8 1.1.5 Solubilidad de sólidos en fluidos supercríticos 10
1.1.6 Modelos termodinámicos 11
1.1.7 Métodos experimentales para determinar solubilidades 14
1.2 Antecedentes 18
1.2.1 Extracción de licopeno con disolventes orgánicos 18 1.2.2 Extracción y solubilidades de licopeno en fluidos
supercríticos. 19
2. Metodología y equipo experimental utilizado 23
2.1 Calibración de equipos de medición 24
2.1.1 Calibración de termómetros de platino 24 2.1.2 Calibración del transductor de presión 26
2.1.3 Calibración del DAD-HPLC 27
2.2 Equipo experimental utilizado para la determinación de Solubilidades de sólidos en disolventes supercríticos 36
2.3 Procedimiento experimental 37
2.4 Verificación del método y equipo experimental 39 2.5 Extracción de licopeno de tomates frescos con n-hexano 48
2.5.1 Extracción 49
2.5.2 Reacción de saponificación/cristalización 51
3. Resultados y discusión 53
Conclusiones 61
Recomendaciones 62
Referencias bibliográficas 63
Anexo A : Procedimientos de calibración de aparatos los de
medición 71
Anexo B : Desarrollo de las ecuaciones para el cálculo de las
incertidumbres de las mediciones experimentales 76
LISTA DE SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS
A Área.
A´, B´, C´ Parámetros de ajuste de la ecuación 1.
Ac Acido.
Amb Relativo al ambiente.
C Concentración.
DAD Detector de Arreglo de Diodos.
DTV Densímetro de Tubo Vibrante.
E.S.I.Q.I.E. Escuela Superior de Ingeniería Química e Industrias Extractivas.
HPLC Cromatografía de líquidos de alta resolución (siglas en ingles).
I.P.N. Instituto Politécnico Nacional.
b
m, Parámetros de ajuste de calibración del DAD.
min Minutos.
MS-T Méndez Santiago y Teja.
p Peso.
P Presión.
PM Peso molecular.
Pv Presión de vapor.
R Constante universal de los gases.
Ref Referencia.
T Temperatura.
V Volumen.
vis Visible.
Vol Volumen.
y Fracción molar de la fase fluida.
Subíndices
1 Disolvente.
2 Soluto.
Sol Sólido.
c Critico.
Eb Ebullición.
FF Fase fluida.
Fsc Fluido supercrítico
Letras griegas
φ Coeficiente de fugacidad.
σ Desviación estándar.
λ Longitud de onda.
ρ Densidad.
ω Factor acéntrico.
LISTA DE FIGURAS
Fig.1. Estructura química de los carotenoides. 3
Fig. 2. Isómeros geométricos de licopeno. 6
Fig. 3. Diagrama de fases para una sustancia pura. 8 Fig. 4. Clasificación de los métodos experimentales para determinar
el equilibrio de fases. 14
Fig. 5. Sistema de calibración de temperatura 25
Fig.6. Sistema de calibración de presión 26
Fig. 7. Cromatograma HPLC de capsaicina estándar. 29
Fig. 8. Curva de calibración con estándar de capsaicina. 30 Fig. 9. Residuales de la calibración con capsaicina. 30
Fig. 10. Cromatograma HPLC con paracetamol estándar. 31
Fig. 11. Curva de calibración con paracetamol estándar. 32 Fig. 12. Residuales de la calibración con paracetamol. 32
Fig. 13. Cromatograma HPLC con licopeno estándar 33
Fig. 14. Curva de calibración con licopeno estándar 34
Fig. 15. Residuales de la calibración con licopeno. 35
Fig. 16. Diagrama del equipo de medición de solubilidades. 36
Fig. 17. Solubilidades de capsaicina en CO2 supercrítico a 313 K. 42
Fig. 18. Solubilidades de capsaicina en CO2 supercrítico a 318 K. 43 Fig. 19. Correlación MS-T de la solubilidad de capsaicina en CO2
supercrítico. 44
Fig. 20. Solubilidades de capsaicina en CO2: datos experimentales y
calculados con el modelo MS-T 44
Fig.21. Solubilidades de paracetamol en CO2 supercrítico a 313 K 45 Fig. 22. Correlación de la solubilidad de paracetamol en CO2
supercrítico con el modelo MS-T 47 Fig. 23 Solubilidades de paracetamol: datos experimentales y
calculados con el modelo MS-T 47 Fig. 24. Diagrama de bloques para extracción de licopeno de
tomates frescos. 48
Fig. 25. Secado de tomates 49
Fig. 26. Equipo de evaporación 50
Fig. 27. Cromatogramas de licopeno: (A) de reactivo estándar y (B)
extracto de tomate 52
Fig. 28. Solubilidades de licopeno en CO2 supercrítico: datos
experimentales y de literatura 54 Fig. 29. Correlación MS-T de la solubilidad de licopeno en CO2 56
Fig. 30. Solubilidades de licopeno en CO2: datos experimentales y
calculados con el modelo MS-T 57
Fig. 31. Correlación MS-T de la solubilidad de licopeno en propano supercrítico 59 Fig. 32. Solubilidad de licopeno en propano supercrítico 59
Fig. A1. Calibración del transductor de presión 74 Fig. A2. Residuales entre la presión de referencia y la presión
calculada 74
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Propiedades de licopeno 5
Tabla 2. Extracción de licopeno con disolventes orgánicos 18
Tabla 3. Extracción con CO2 supercrítico 20 Tabla 4. Solubilidades de licopeno en CO2 supercrítico. 21
Tabla 5. Identificación de licopeno reportado en literatura por HPLC 22
Tabla 6. Pureza de los reactivos utilizados en este trabajo 23 Tabla 7. Pureza de los disolventes utilizados como fase movil en la
identificación por HPLC 28
Tabla 8. Desviación estándar en las calibraciones del DAD-HPLC 28 Tabla 9. Sistemas medidos para la verificación de la metodología y
el equipo experimental. 40
Tabla 10. Ajuste de los parámetros A´, B´ y C´ y desviación absoluta promedio del modelo con los datos experimentales. 40 Tabla 11. Solubilidades de capsaicina en CO2 a 313 K 41
Tabla 12. Solubilidades de capsaicina en CO2 a 318 K 43
Tabla 13. Solubilidades de paracetamol en CO2 48
Tabla 14. Sistemas estudiados en la determinación de solubilidades 53
Tabla 15. Ajuste de los parámetros A´, B´ y C´ y desviación absoluta promedio del modelo con los datos experimentales de
licopeno 54
Tabla 16. Solubilidades de licopeno en CO2 55
Tabla 17. Solubilidades de licopeno es propano supercrítico. 58
R E S U M E N
En este trabajo se determinó la solubilidad del licopeno (obtenido del tomate) en propano y CO2 supercríticos a diferentes condiciones de temperatura y presión. El licopeno se encuentra presente en vegetales, frutas rojas y principalmente en el tomate. Este compuesto es un carotenoide empleado en la industria alimenticia, cosmética y farmacéutica, además favorece la salud del ser humano. Esta contribución aporta información básica para el desarrollo del proceso de extracción de licopeno con fluidos supercríticos.
Las mediciones de las solubilidades se realizaron en un equipo basado en el método dinámico-analítico. El equipo está conformado de una celda de equilibrio visual (50 cm3) fabricada en acero inoxidable 316L que opera hasta 30 MPa y 473 K. La celda está acoplada a una válvula de seis vías, la cual envía muestras en línea de la fase fluida saturada con sólido (licopeno) hacia un cromatógrafo de líquidos HPLC.
La cantidad del sólido presente en la fase fluida (solubilidad) es cuantificada en el HPLC.
La metodología experimental utilizada en este aparato para la determinación de solubilidades de sólidos en fluidos supercríticos, se verificó comparando los resultados obtenidos con los datos reportados en la literatura. Para este propósito se estudiaron las solubilidades de capsaicina y paracetamol en dióxido de carbono supercrítico.
El método propuesto por Ausich y Sanders [patente 5858700, E.U, 1999] para la obtención de licopeno a partir del tomate se adecuó y modificó; esto se realizó debido a que un gramo de licopeno grado reactivo, con 98% de pureza tiene un costo muy elevado. Con esta
técnica se obtuvieron 5 gramos de este compuesto con una pureza de 80% determinada mediante análisis en HPLC. El licopeno extraído del tomate se utilizó para el estudio de solubilidades de este compuesto en CO2 y propano supercríticos.
La solubilidad del licopeno en CO2 supercrítico se determinó a las temperaturas de 313 y 323 K y presiones de 10 a 23 MPa; a estas condiciones las solubilidades se encuentran entre 1.5x10-9 y 6.1x10-7 mol de licopeno/mol de CO2. En el caso de la solubilidad del licopeno en propano supercrítico, el intervalo de solubilidades es de 4.3x10-5 a 9.2x10-5mol de licopeno/mol de propano a condiciones de 378 y 398 K en el intervalo de 5 a 23 MPa.
A partir de los resultados de solubilidad de licopeno en fluidos supercríticos se establece que el propano es mejor disolvente que el CO2. La ecuación propuesta por Méndez-Santiago y Teja (MS-T) [Fluid Phase Equilibria, 158-160, 1999, 501-510] se utilizó para verificar la consistencia interna de los datos obtenidos en este trabajo.
A B S T R A C T
In this work, the solubility of lycopene from tomato in supercritical propane and CO2 were determined at different temperatures and pressures. Lycopene is present in vegetables, red fruits and mainly in tomatoes. This compound is a carotenoid used in food, cosmetic and pharmaceutical industry; moreover it participates in human health. This contribution provides basic data for the development of the supercritical fluid extraction process of lycopene.
The solubility measurements were developed in an apparatus based on the dynamic-analytic method. This device consist of a visual cell (50 cm3) made of stainless steel 316L to operate up to 30 MPa and 473 K. The cell is connected to a six-way valve to send on-line samples of the solid (lycopene) saturated fluid phase to a liquid chromatography (HPLC).
The experimental methodology used in this apparatus for the determination solid solubilities in supercritical fluids was tested by comparing the obtained results with respect to the literature data.
Therefore, the solubilities of capsaicin and acetaminophen in supercritical carbon dioxide were studied.
The technique proposed by Ausich and Sanders [patent 5858700, US, 1999] to obtain lycopene from tomato was adapted and modified; this was done because of the very high cost of 13 milligram of lycopene standard with 98% of purity. From this technique, 5 grams of this compound were obtained with a purity of 80% estimated by HPLC analysis. Lycopene from tomato was used for studying the solubilities of lycopene in supercritical CO2 and propane.
The solubility of lycopene in supercritical CO2 was measured at the temperatures of 313 and 323 K, and pressures from 10 to 23 MPa. At these conditions the solubilities are between 1.5x10-9 and 6.1x10-7 mol of lycopene/mol of CO2. In the case of the solubility of lycopene in supercritical propane, the solubility range is from 4.3x10-5 to 9.2 x10-5 mol of lycopene/mol of propane at 378 and 398 K, and from 5 to 23 MPa.
From the experimental results for the solubility of lycopene in supercritical solvents is concluded that propane is a better solvent than CO2. The equation proposed by Mendez-Santiago and Teja (MT-S) [Fluid Phase Equilibria, 158-160, 1999, 501-510] was used to verify the internal consistency of the obtained data.
I N T R O D U C C I Ó N
En México se tiene un exceso de producción en los cultivos de tomate (licopersicum esculentum), como consecuencia las propias organizaciones de productores proceden a retirar coordinadamente parte de la producción (tirándose miles de toneladas de tomate). De esta manera se evita la saturación del mercado y la baja de precios [1,2]. En base a lo anterior se podría proponer el uso del excedente de producción en lugar de tirarlo y así aprovechar al máximo este producto en la extracción de licopeno.
Por otra parte, existen carotenoides obtenidos sintéticamente que se utilizan como suplemento alimenticio, sin embargo son diferentes a los carotenoides naturales ya que no son metabolizados por el cuerpo de manera eficiente. Por lo tanto es necesario obtener estos compuestos a partir de fuentes naturales[3].
Actualmente, la extracción de productos naturales a partir de frutas o vegetales se realiza utilizando disolventes en fase liquida (hexano, éter de petróleo, alcoholes, entre otros), sin embargo el producto final se encuentra contaminado del disolvente. Los resultados obtenidos en esta tesis formarán parte de la información básica para desarrollar un proceso de extracción de licopeno del tomate usando fluidos supercríticos. Este tipo de fluidos tienen la ventaja de que se puede separa fácilmente el producto final del disolvente.
Para el desarrollo y optimización de un proceso de extracción de productos naturales utilizando fluidos supercríticos se necesitan datos experimentales y modelos termodinámicos. La medición de solubilidades
de licopeno en disolventes supercríticos es importante para aplicar y comprobar la precisión de éstos modelos.
El objetivo de este trabajo es la determinación experimental de las solubilidades de licopeno en propano y licopeno en CO2. Ambos fluidos se utilizaron a condiciones supercríticas con la finalidad de comparar la capacidad de disolver al licopeno y de esta manera definir el mejor disolvente a las condiciones de temperatura y presión reportadas.
El motivo principal por el cual se utilizó propano se debe a que el licopeno es un caroteno soluble en alcanos y otras sustancias no polares.
En el caso del CO2, es el fluido supercrítico más empleado como disolvente porque es relativamente inerte, barato, no tóxico, reciclable e inflamable, además que sus propiedades críticas pueden ser alcanzadas fácilmente comparado con otros disolventes.
Para una mejor descripción del presente trabajo, se distribuyó en cuatro secciones principales:
En el capítulo 1 se presenta las características y propiedades de licopeno así como sus aplicaciones. También se incluye el tema de la solubilidad, características y generalidades de los fluidos supercríticos, modelos termodinámicos y métodos experimentales para la determinación de solubilidades en fluidos supercríticos. Posteriormente se describe la información encontrada en bibliografía con respecto a los fluidos supercríticos aplicados al licopeno.
En el capítulo 2 se describe el procedimiento experimental llevado a cabo en las calibraciones y en la determinación de las solubilidades.
También se detalla el equipo utilizado, las características de los reactivos empleados y la metodología experimental para determinar las solubilidades de sólidos en disolventes supercríticos.
Los resultados y análisis de datos se presentan en el capítulo 3, así como las comparaciones de los datos obtenidos en esta tesis con los publicados en la literatura, además se reportan las correlaciones de los datos obtenidos experimentalmente.
Por último se presentan las conclusiones y recomendaciones en base a los resultados obtenidos, además las referencias bibliográficas consultadas para sustentar el presente trabajo.
Capítulo 1.
GENERALIDADES
1.1 GENERALIDADES
En esta sección se dan conceptos, características y propiedades para ubicar el tema de esta tesis e introducirlo de manera general. Además se describen, las propiedades físico-químicas y la estructura química de los carotenoides; particularmente del licopeno con la finalidad conocer las características del licopeno relacionadas a sus usos y funciones.
Debido a que los experimentos que se realizaron en este trabajo son a condiciones supercríticas del disolvente, se trataran tópicos relacionados a los fluidos supercríticos y las características que los hacen útiles como disolventes en procesos de extracción. También se discute la definición de solubilidad desde el punto de vista termodinámico con relación a los fluidos supercríticos y el efecto al modificar sus condiciones de temperatura y presión.
1.1.1 CAROTENOIDES
Los carotenoides son los pigmentos más abundantes en la naturaleza, existen más de 600 especies, pero sólo 20 están presentes en el cuerpo humano y entre los más importantes se encuentran el β-caroteno, licopeno y luteína [4].
Estas sustancias brindan los llamativos colores naranja, amarillo, rojo y púrpura a algunas plantas y animales [5]. Estos se pueden dividir en dos principales grupos [6,7]:
ﻩ Carotenos: cadenas lineales o cíclicas de polienos. Se encuentran hidrocarbonados y aportan la coloración rojiza o anaranjada, principales
precursores de la vitamina A (transformación que ocurre en el hígado e intestino delgado).
ﻩ Xantofilas: carotenos con grupos funcionales –OH y =O.
Con funciones oxigenadas dotan de la coloración amarillenta, actuando como protectores frente a la radiación solar.
Los carotenoides se constituyen por 8 unidades de isopreno, su estructura principal contiene 22 carbonos (tetraterpeno simétrico y lineal [7]) y al final de sus dos extremos 9 carbonos adicionales en cada una, con arreglos diferentes [6]. La estructura química de algunos carotenoides y su clasificación se presenta en la Figura 1.
Entre las múltiples funciones de los carotenoides, además de dar pigmentación, se encuentra su gran poder antioxidante, por lo que algunas industrias se interesan en usarlos, también existen estudios donde se demuestra que son precursores de la vitamina A [8-13].
Se ha comprobado que los carotenoides tienen otro beneficio en la salud del cuerpo humano, puesto que tienen la capacidad de inhibir el crecimiento de ciertas células cancerígenas y ayudar a combatir o prevenir otras enfermedades [12,14-17],como arterogenesis, descalcificación de huesos, degeneración de ojos y daños neuronales.
Por las razones expuestas anteriormente se ha incrementado el uso de estas sustancias extraídas a partir de productos naturales [18].
Los carotenoides son liposolubles y solubles en otros disolventes como el cloroformo, acetona, dietileter, etc. Los carotenos son muy solubles en disolventes no polares, y las xantofilas se disuelven mucho más en disolventes polares. Los carotenoides son sólidos a temperatura ambiente y pueden cristalizarse en diversas formas coloridas desde rojo hasta violeta oscuro [19].
Fig.1. Estructura química de los carotenoides, el recuadro punteado en el β-caroteno encierra los 22 carbonos de la estructura principal, la cual es común en todos los carotenoides [6].
Los carotenoides pueden absorber específicamente la luz en las regiones ultravioleta (UV) y visible del espectro de absorción, por lo que pueden ser identificados en un intervalo de longitud de onda (λ) de 420 – 510 nm y por ende cada carotenoide tiene un espectro de absorción característico.
Los carotenoides se degradan por una oxidación química al contacto con oxígeno, ozono, permanganato alcalino, ácido crómico. Los subproductos resultantes dependen de la ubicación en que ocurre el ataque.
Debido a la combinación espontánea con oxígeno del aire a temperatura ambiente los carotenoides experimentan auto-oxidación en presencia de oxígeno desarrollando un proceso en cadena de radicales libres tanto en solución como en forma cristalina. Factores como temperatura, luz, humedad y algunos metales estimulan dicho proceso.
La foto-oxidación es el blanqueado por oxidación a causa del oxígeno en el aire;
el α- y β- caroteno se degradan más rápido que el licopeno.
Como se puede observar en la Figura 1 dentro de la clasificación de los carotenoides, el licopeno se encuentra en el conjunto de los carotenos. En la siguiente sub-sección se describirán las características de esta sustancia.
1.1.2 CARACTERÍSTICAS DEL LICOPENO
El licopeno es un caroteno que se encuentran en el tomate en mayor concentración (70-80%) [3], también se encuentra en otras frutas y vegetales rojos, como la sandia, toronja rosada, papaya, guayaba, chabacano [16,17]. Esta sustancia aporta desde un color rojo brillante a rosado, según la cantidad que contengan. Además de recolectar la energía de la luz y ser un protector contra el daño que esta puede causar, también es uno de los carotenoides antioxidantes más potentes, incluso mayor que el β-caroteno [20,21].
El licopeno es uno de los carotenos más comunes en el cuerpo humano [16] y brinda una aportación muy importante en su salud [18]. En estudios recientes se relaciona a este compuesto con la disminución en el riesgo de contraer cáncer
(especialmente en la próstata) y otras enfermedades [16,17, 20-23]. En la siguiente sección se presentarán más aplicaciones y usos del licopeno.
Tabla 1. Propiedades fisicoquímicas de licopeno
Propiedad Referencia
Formula C40H56 [6]
PM 536.87 g/gmol [26]
Tfusión 446.38 K [27]
Color Rojo [16,17,21-23]
Estado físico
(condiciones amb.) Sólido [26]
Nombre químico por su estructura
2,6,10,14,19,23,27,31-octametil- 2,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,30-
dotriacontatridecano
[24]
Otros nombres psi-caroteno, Rhodopurpurin
TEb. 740.173 K *
TC 897.398 K *
PC 0.3278 MPa *
VC 1.609 cm3/mol *
ω 1.7284 *
ρ liq. (20 °C) 0.8943 g/cm3 **
* Estas propiedades fueron calculadas por el método de contribución de grupos de Constantinou y Gani [28] para tener un valor aproximado de su comportamiento. Estas propiedades no se encuentran reportadas en la literatura, posiblemente porque la molécula se descompone por debajo de su temperatura de ebullición.
** Se utilizó el método de contribución de grupos de Elbro [28] para predicciones de densidad de liquido como función de la temperatura.
El licopeno es un terpeno formado por ocho isoprenos, es decir, es un caroteno acíclico que tiene 13 dobles enlaces conjugados [17] causantes de la coloración roja.
Cada doble enlace reduce la energía requerida para que los electrones lleguen a niveles de transición de mayor energía, por lo que la molécula atrapa la luz visible de longitudes de onda más largas (400-500 nm [24]), absorbiendo la mayor parte del espectro visible observándose de coloración rojiza [16].
Fig. 2. Isómeros geométricos de licopeno [31,32].
La mayor fuente de licopeno en la dieta del ser humano es el tomate, en donde su concentración puede ser de 50 mg/kg o mayor. Investigaciones recientes [25] han evaluado el contenido nutrimental del jugo de tomate, y determinado que del 72 al 92%
del licopeno en el tomate se encuentra en la fracción insoluble en agua y en la cáscara.
En la tabla 1 se presentan algunas propiedades físico-químicas de licopeno.
Por otro lado, en la revisión bibliográfica se encontraron reportados el efecto de la temperatura en el licopeno y se puede observar que a temperaturas menores a 343 K, la temperatura no afecta en lo absoluto al isómero del licopeno que se encuentra de forma natural (trans-licopeno). El efecto de la temperatura provoca la conversión de trans-licopeno a los isómeros cis, los cuales son mejores en cuanto a la aplicación a nivel industrial de este compuesto [29,30]. En la figura 2 se muestran los diferentes isómeros geométricos del licopeno.
1.1.3 APLICACIONES DEL LICOPENO
El licopeno es un compuesto que, se utiliza ampliamente a nivel industrial [29,30]
como colorante debido a su fácil impregnación en superficies porosas. Algunas de las aplicaciones de este compuesto a nivel industrial son:
• En la industria alimenticia: se usa como colorante y antioxidante en alimentos como el yogurt, queso, pan, y cereales [29,30].
• En la industria farmacéutica: es suplemento alimenticio y también tiene aplicaciones en la fabricación de medicinas [29,30].
• En la industria cosmética: como pigmento; en bloqueadores solares y cremas para el cuidado de la piel [29,30].
También existen estudios que muestran que con una cuidadosa oxidación selectiva de licopeno (ozonización), se puede obtener ácido levulínico [33], el cual es usado en la manufactura de nylon, gomas sintéticas, plásticos y fármacos [16]. Asimismo, este ácido se usa en cigarrillos para incrementar la nicotina en el humo y tener una mejor unión de esta con los receptores neuronales [34].
Además esta sustancia se ha relacionado con la disminución, control y prevención de diversos tipos de cáncer, principalmente en próstata, boca, colon, estómago, tracto digestivo y enfermedades como osteoporosis, problemas cardiovasculares, infertilidad del hombre, así como en la regulación del sistema inmunológico [29]. Estas capacidades se deben a su poder antioxidante, debido a que es capaz de prevenir la oxidación de proteínas de baja densidad [35] y el poder reaccionar con los radicales libres que atacan a las células [1,2,4,5,36].
1.1.4 GENERALIDADES DE LOS FLUIDOS SUPERCRÍTICOS
En este trabajo se utilizaron fluidos supercríticos como disolventes para la determinación de solubilidades de licopeno. En el diagrama de fases de la Figura 3 se ilustra gráficamente la definición de fluido supercrítico para una sustancia pura, este fluido se encuentra a condiciones de presión y temperatura mayores a las críticas.
Como en esta región no se puede distinguir entre líquido y gas, se les llama de manera general fluidos [37].
Fig. 3. Diagrama de fases para una sustancia pura.
Las propiedades volumétricas, termodinámicas y de transporte de los fluidos supercríticos se encuentran entre las propiedades de líquido y gas. Estas propiedades aportan características muy útiles como disolventes a los fluidos supercríticos para su
T REGION
SUPERCRITICA
LIQUIDO
GAS
SÓLIDO
PUNTO CRITICO PUNTO TRIPLE
P
Pc
Tc
utilización en extracciones. La densidad de estos fluidos, parecida a la de un líquido, les da la capacidad de ser disolventes adecuados para extracción; su relativamente baja viscosidad y alta difusividad, parecida a la de un gas, le facilita la penetración en el soluto [38].
Una ventaja más del uso de los fluidos supercríticos, es que se pueden modificar sus propiedades drásticamente, con pequeños cambios en la temperatura y en la presión o con la adición de un codisolvente para aumentar la selectividad con respecto al soluto de interés.
Otro aspecto importante de los disolventes supercríticos más usados a nivel industrial, es su fácil manejo y disponibilidad [39]. Además, son materiales que no afectan el medio ambiente y se usan cerca de la temperatura ambiental y en ausencia de aire, lo cual reduce el riesgo de un daño por oxidación a los compuestos a extraer y disminuye los altos costos energéticos [6]. Ejemplos de estos son el dióxido de carbono, agua y propano.
El CO2 es el fluido supercrítico más empleado como disolvente porque es relativamente inerte, barato, no tóxico, reciclable e inflamable, además que sus propiedades críticas (P = 7.374 MPa y c T = 304.12 K) pueden ser alcanzadas c fácilmente comparado con otros disolventes.
Para el desarrollo de un proceso de separación es necesario conocer el comportamiento de las fases involucradas en el sistema. La solubilidad es uno de los parámetros más importante en el desarrollo de un proceso de extracción por fluidos supercríticos, ya que con estos datos es posible determinar aproximadamente las condiciones a las cuales se puede llevar a cabo la separación del compuesto deseado o bien evitar regiones donde se presenten comportamientos multifásicos.
1.1.5 SOLUBILIDAD DE SÓLIDOS EN FLUIDOS SUPERCRITICOS
Como se mencionó anteriormente, la solubilidad es una variable importante para el desarrollo de procesos de extracción, por lo que a continuación se describen algunas de sus características.
La solubilidad en fase supercrítica es la fracción mol de soluto en la fase fluida y teóricamente está dada por:
( )
−
= RT
Pv P v Pφ
y Pv
s
2 2
2 2
2 exp (1) Donde Pv2 es la presión de vapor del sólido, v es el volumen molar del sólido, s2 φ2 es el coeficiente de fugacidad del sólido en la fase gaseosa [38].
Hablando de disolventes supercríticos existe un límite en la cantidad de soluto que puede contener la mezcla disolvente + soluto. Se define la solubilidad como la cantidad máxima de soluto que puede tener una mezcla homogénea de disolvente supercrítico + soluto [40]. La capacidad del disolvente depende de la densidad, la cual es función de la temperatura y de la presión [40].
En los últimos años se han desarrollado muchas investigaciones a nivel académico e industrial con fluidos supercríticos [40]. El uso de los fluidos supercríticos como disolventes se debe al comportamiento de su solubilidad, Luque de Castro et.
al.[38] lo resume de la siguiente manera:
• En general la solubilidad aumenta con el incremento de la densidad del disolvente. La densidad aumenta con el incremento de la presión.
• El incremento es mayor cerca del punto crítico del fluido supercrítico como resultado del cambio drástico en la densidad del disolvente.
• La solubilidad aumenta, permanece constante o bien disminuye con el incremento de la temperatura a presión constante, dependiendo de que el factor dominante sea la presión de vapor del soluto o la densidad del disolvente.
• A presiones bajas la densidad disminuye con la temperatura; por el contrario a presiones altas se incrementa marcadamente con la temperatura.
• Existen variaciones en la solubilidad dependiendo del peso molecular del soluto cuando se tienen compuestos de estructura molecular similar.
En base al último resultado del comportamiento de los fluidos supercríticos, se propuso el uso de propano como disolvente en este trabajo, debido a que no presenta polaridad en su molécula y es un compuesto hidrocarbonado al igual que el licopeno.
1.1.6 MODELOS TERMODINÁMICOS
Se han propuesto diferentes modelos para correlacionar y/o predecir la solubilidad de sólidos en disolventes supercríticos [37,41,42]. Estos modelos están basados en métodos empíricos que usan la densidad del disolvente o el parámetro de solubilidad. La relación que tiene la solubilidad del sólido y2 (en términos de fracción molar) y la densidad está básicamente representada por la siguiente ecuación empírica:
B A
y2 = ln 1 +
ln ρ (2)
donde A y B son constantes.
Por otra parte, la relación entre y2 y el parámetro de solubilidad del disolvente δ1 está representada por:
F D C
y2 = 12+ 1+
log δ δ (3)
donde C, D y F son constantes. Las ecuaciones empíricas pueden ser aplicadas a la predicción de solubilidades siempre y cuando se conozcan la densidad del disolvente o el parámetro de solubilidad. Sin embargo, los parámetros en ambas ecuaciones no tienen un significado físico claro y por consecuencia sería difícil aplicar las ecuaciones empíricas a sistemas desconocidos.
En cálculos de equilibrio de fases, en específico la solubilidad, es frecuente el uso de ecuaciones de estado. Para el caso de solubilidades de sólidos en fluidos supercríticos, se han utilizado ecuaciones de tipo van der Waals [41], por ejemplo, Soave-Redlich-Kwong [44] y Peng-Robinson [45].
Los cálculos con ecuaciones de estado, no proporcionan resultados satisfactorios si se usan ecuaciones de estado cúbicas [46], para sistemas solido + fluido supercrítico. También, cabe señalar, que este tipo de modelos, utilizan ciertas propiedades de sustancias puras, que en muchas ocasiones no están disponibles para solutos sólidos, como las propiedades críticas, volúmenes molares y presiones de sublimación, factor acéntrico, entre otros.
Otro método para la representación de solubilidades es mediante la correlación de datos experimentales de la solubilidad contra la densidad del disolvente. Algunos ejemplos de este tipo de correlaciones son las propuestas por Mendez-Santiago y Teja
[41], Chrastil [47], Dobbs y Johnston [46], Yau y Tsai [49], entre otros. Este tipo de modelos en su mayoría son empíricos de forma logarítmica y lineal.
Para este trabajo se eligió el modelo de Mendez-Santiago y Teja [41] (MS-T), debido a que los datos de solubilidad de licopeno en CO2 supercrítico reportados en la literatura [6] están correlacionados con este modelo. Además este modelo no necesita propiedades críticas, presiones de sublimación o factor acéntrico del sólido. Este modelo expresado de manera lineal simple se fundamenta en la teoría de disoluciones diluidas y se usa para verificar la consistencia interna de los datos obtenidos así como para comprobar su precisión.
Las solubilidades de sólidos en disolventes supercríticos que son de interés en este trabajo (licopeno, capsaicina, paracetamol), se encuentran reportadas en la literatura[13,41,50,51] y están correlacionadas con el modelo MS-T. Estas correlaciones sirven para comparar los resultados obtenidos con los publicados por otros autores.
El modelo MS-T correlaciona el logaritmo del factor de incremento de solubilidad, E, contra la densidad del disolvente, ρ, mediante la expresión:
ρ B A E
Tln = + (4) Psat
P E y
2
= 2 (5)
La ecuación (4) se simplifica con una relación de tipo Claussius-Clapeyron cuando no se tiene disponible la presión de sublimación, P2sat del sólido en el intervalo de temperatura experimental:
(
y P)
A B CTT ln 2 = ′+ ′ρ1+ ′ (6) Donde los parámetros A’, B’, C’ son independientes de la temperatura y presión.
Mendez-Santiago y Teja [41] aplicaron su modelo propuesto para correlacionar diferentes sistemas de solubilidad de sólido en CO2 supercrítico. Como resultado encontraron que las desviaciones absolutas promedio (AAD) oscilan entre 3% y 40%.
Las variaciones indican la precisión y consistencia interna de los datos. Los datos con mayores desviaciones son menos precisos.
La consistencia interna de los datos está determinada por la desviación absoluta promedio (AAD):
Nd
100
* (%)
Nd 1
i 2
2 2
exp cal
∑
exp=
−
= y
y y
AAD (7)
Donde
2exp
y y
2cal
y son las solubilidades experimental y calculada del sólido en fracción molar, respectivamente y Nd es el número de datos experimentales.
Al comparar la tendencia lineal del modelo comparado con los datos experimentales se verifica la consistencia interna de los datos. Esta correlación es válida para un amplio intervalo de temperaturas y está limitado solo por densidades menores a la mitad de la densidad crítica del disolvente.
1.1.7 METODOS EXPERIMENTALES PARA DETERMINAR SOLUBILIDADES
En esta sección se presentan los métodos experimentales de solubilidades de sólidos, líquidos y gases en disolventes con el objetivo ubicar el método experimental utilizado en este trabajo de investigación.
Para la determinación experimental de equilibrio de fases existen diversos métodos.
Estos se dividen ya sea según la forma de alcanzar el equilibrio o en la forma de medición de composición en el equilibrio [52-54]. En la figura 4 se presenta un esquema de la clasificación de los métodos experimentales para la determinación de equilibrios de fases.
Fig. 4. Clasificación de los métodos experimentales para medir el equilibrio de fases[37].
Forma de alcanzar el equilibrio
Estático
Dinámico
Celda de volumen constante Celda de volumen variable
Recirculación Semi-flujo Flujo continúo
Medición de composición en el equilibrio
Analítico Sintético
En la medición de solubilidades de sólidos en fluidos supercríticos sólo se determina la composición de la fase fluida. El método más frecuentemente utilizado es de tipo dinámico [37,39, 42] debido a las ventajas que presenta, las cuales se describen más adelante.
Método estático: En este método, el sólido y el disolvente supercrítico se introducen a la celda de equilibrio, se agita el sistema hasta alcanzar el equilibrio entre las dos fases iníciales a temperatura constante. La composición de la fase fluida se cuantifica después de llegar al equilibrio. Esto se realiza mediante el análisis de las muestras de la fase en estudio dentro de un equipo analítico [54-56].
Las ventajas de este método son [39, 42]:
• El equilibrio de fases se determina visualmente.
• Las transiciones de fase (que se determinan visualmente) y las inversiones de fase se pueden detectar fácilmente.
• Las solubilidades de los sólidos y líquidos en mezclas binarias se conocen sin tener que realizar muestreo.
• Pueden estudiarse polímeros, líquidos o sólidos pesados.
• Se necesitan pequeñas cantidades de disolvente y soluto en cada experimento.
• La presión de la mezcla puede ajustarse continuamente a una composición y temperatura fijas.
• Se pueden tomar muestras cuando se trabaja con mezclas multicomponentes.
Las desventajas son [39, 42] :
• Determinar la solubilidad del sólido en el fluido supercrítico puede tomar mucho tiempo.
Método dinámico: La condición de equilibrio de fases se favorece mediante la recirculación de la fase fluida, los más representativos son:
Recirculación, en el cual se utiliza una bomba para recircular la fase supercrítica y forzarla a tener contacto con el sólido contenido en la celda, hasta alcanzar el equilibrio y saturar al disolvente con el sólido. Después se muestrea la fase fluida para cuantificar su composición.
Semi-flujo, el disolvente fluye dentro de una celda de equilibrio empacada con sólido a la presión y temperatura de estudio con flujo constante. El disolvente sale de la celda y se expande en una trampa adecuada donde el sólido precipita. La solubilidad se determina con la cantidad de sólido que hay en la trampa y la cantidad de disolvente que pasa por un medidor de flujo.
Las ventajas de estos tipos de sistemas de flujo son [39, 42] :
• Se utiliza un procedimiento de muestreo directo.
• Pueden obtenerse muchos datos de solubilidad rápidamente y con reproducibilidad aceptable.
• Pueden obtenerse datos de equilibrio.
Las desventajas son [39, 42] :
• El soluto puede bloquear la válvula milimétrica y provocar errores en la medición de solubilidades.
• El arrastre del soluto no disuelto en la fase rica en disolvente supercrítico es posible a altas velocidades de flujo del segundo.
• Pueden ocurrir cambios de fase que no se detecten.
• Las altas presiones pueden ocasionar que la densidad de la fase rica en fluido supercrítico sea mayor que la densidad de la fase líquida rica en soluto. Esto provoca que la fase del disolvente desplace al soluto de las columnas de equilibrio, generando valores erróneos de solubilidad.
• Se deben diseñar cuidadosamente los experimentos de equilibrio con mezclas multicomponentes para evitar el agotamiento de uno o más de los componentes durante el experimento.
Método sintético: El sólido y disolvente se introducen en una celda de equilibrio, de manera secuencial. El número de moles de cada componente se calcula mediante pesadas sucesivas o por la determinación del volumen a cierta presión. Pesando la celda se tiene una mayor precisión en los resultados. La desventaja en este método es que solo se puede saber las condiciones de saturación de una sola composición a la vez.
Método analítico: Después de obtener a la condición de equilibrio, una o varias muestras de la fase fluida saturada con el sólido son recolectadas de la celda y se cuantifica en un equipo analítico. Las técnicas de análisis pueden ser cromatografía de gases, cromatografía de líquidos, espectrometría de masas, UV, entre otros.
El método experimental para la determinación de solubilidades de sólidos en disolventes supercríticos utilizado en este trabajo es de tipo dinámico-analítico con recirculación de la fase fluida. Este aparato se ubica dentro de la clasificación mostrada en la figura 4 y se describe en el capítulo 2.
Las ventajas de la metodología y el equipo experimental utilizado en este trabajo, además de las mencionadas anteriormente son:
• La muestra a analizar se toma directamente de la celda de equilibrio y se envía en línea al equipo de análisis. Este arreglo evita el contacto del sólido con el oxigeno del aire y la luz previniendo su descomposición.
• El equipo analítico puede cuantificar solubilidades hasta composiciones mínimas de 10-9 mol de sólido/mol del disolvente
1.2 ANTECEDENTES.
1.2.1 EXTRACCIÓN DE LICOPENO CON DISOLVENTES ORGÁNICOS
La extracción de licopeno se realiza actualmente con disolventes orgánicos. En consecuencia, varios científicos se han interesado por minimizar las trazas de disolventes orgánicos en los extractos y de ser posible no usarlos en la extracción.
Estos disolventes son líquidos tóxicos que son difíciles de remover y en la mayoría de los casos no llegan a eliminarse completamente [3, 11, 29]. También este tipo de disolventes son muy difíciles de reutilizar debido a que al separarlos del extracto, quedan contaminados y deben desecharse.
Ejemplos de este tipo de disolventes usados en la extracción de licopeno se presentan en la tabla 2 [6, 11, 12, 57].
Tabla 2. Extracción de licopeno con disolventes orgánicos.
Disolventes más usados
Rendimiento
(g de licopeno/kg tomate) Referencia Benceno
Cloroformo 0.11 [12]
Éter de petróleo 0.18 [6]
Hexano Acetona Metanol
0.8 - 1.2 [57]
hexano 0.8 [58]
Hexano Acetona Etanol Etil acetato
0.12 [59]
Los disolventes más empleados en la extracción de licopeno son el éter de petróleo y el hexano con porcentajes de recuperación de 77-90% con purezas del extracto del 80-90%. Mayeaux et. al. [57] extraen licopeno con una mezcla de hexano/acetona/metanol (1:1:1, v/v/v) obteniendo un rendimiento del 0.8 – 1.2 g de licopeno/kg de tomate. La adición de disolventes polares para la extracción tiene como finalidad el aumentar la selectividad en la extracción hacia el licopeno.
Los mejores rendimientos de extracción de licopeno con disolventes orgánicos son los extraídos con éter de petróleo y hexano, además de una mezcla hecha con hexano/etanol/acetona con rendimientos del 90%. Lin y Chen [59] realizaron extracciones con diferentes disolventes orgánicos y mezclas entre ellos. Las más altas concentraciones de licopeno en los extractos fueron con obtenidas con etanol/hexano (4:3, v/v), seguido de la mezcla etanol/acetona/hexano (2:1:3, v/v/v). En la tabla 2 se listan los disolventes utilizados.
Los rendimientos mejoran con la temperatura del disolvente y con el tiempo de exposición de la materia prima en el disolvente. La mayoría de las extracciones se realizan a temperatura ambiente. Las temperaturas no exceden de 343 K para evitar la isomerización por temperatura. Además, la cantidad de licopeno en el tomate también depende de la variedad del fruto, condiciones ambientales durante su crecimiento y del grado de madurez [57].
1.2.2 EXTRACCION Y SOLUBILIDADES DE LICOPENO EN FLUIDOS SUPERCRITICOS
Aunque a partir de 1980 se han llevado a cabo investigaciones de la solubilidad de sólidos en fluidos supercríticos, se observó que existe poca información acerca de solubilidad de licopeno en disolventes supercríticos en la literatura. Por otra parte, la mayoría de esta información se refiere a la extracción de licopeno con disolventes supercríticos y no al tema de solubilidad.
Aunque los dos temas se encuentran estrechamente relacionados, los resultados reportados de extracción en la literatura no pueden compararse con los datos obtenidos en este trabajo. En la Tabla 3 se observan algunos resultados obtenidos de la extracción de licopeno con disolventes supercríticos.
Tabla 3. Extracción con CO2 supercrítico Presión
(MPa)
Temp.
(K)
Flujo de disolvente
% del total de licopeno recuperado
Materia
prima Método Ref.
45 343 18-20 (a) 60 Tomate
deshidratado
Dinámico- analítico [12]
34.47 359 2.5 (b) 61
Semillas y cáscara de
tomate
Dinámico- analítico [17]
46 353 50 (c) 90.2 Desperdicios
industriales
Dinámico- analítico [3]
40 373 2.5 (b) 94
Cáscara de tomate deshidratado
Dinámico- analítico [21]
(a)kg CO2/h (b)ml CO2 /min (c) kg CO2/kg muestra
El licopeno es el carotenoide que se encuentra en mayor proporción en el tomate, y en la literatura sólo se encuentra información de la extracción de licopeno con CO2 supercrítico a partir del tomate. Cadoni et. al.[60] observaron que el contenido del licopeno en CO2 supercrítico, que se extrae de la pulpa y la cáscara del tomate, varía dependiendo de la temperatura y presión de extracción[6]. La máxima extracción del licopeno es de ocho por ciento (mezclado) en las semillas y en la cáscara usando 130 partes (p/p) de CO2 a 353 K y 30 MPa.
También se encuentran reportadas en la literatura solubilidades de licopeno en CO2 supercrítico a 313, 323 y 333 K, en intervalos de presión de 17 a 42 MPa usando el método estático analítico [6]. En este trabajo las fracciones molares de licopeno disuelto en CO2, se encuentran en el intervalo de y2= 1.5x10-6 hasta y2=2.8x10-7. En la Tabla 4 se presentan las condiciones de temperatura y presión reportadas por los autores.
Tabla 4. Solubilidades de licopeno en CO2 supercrítico.
Materia Prima
Temperaturas (K)
Presiones (MPa)
Solubilidad máxima y
mínima (y2 x 106)
Método
Pasta de tomate
313 323 333
21.1 - 41.8 17.1 - 38.1 19.4 - 40.3
0.3 – 0.47 0.28 - 1.2 0.41 - 1.5
Estático-analítico
Con lo anterior se puede observar que tanto para la extracción, como para la medición de las solubilidades de licopeno, el único disolvente utilizado es el CO2
supercrítico. Además existe muy poca información, por lo que es conveniente la determinación de solubilidades en diferentes disolventes supercríticos para encontrar el disolvente más adecuado en una posible extracción de licopeno a partir del tomate.
Para determinar la concentración de licopeno en la fase fluida supercrítica se necesita contar con un equipo de análisis adecuado. En la literatura, existen diferentes técnicas analíticas para la identificación de licopeno como son: resonancia magnética nuclear, cromatografía de líquidos de alta eficiencia (HPLC), espectrometría de masas, calorímetro de escaneo diferencial y espectrofotometría de UV-visible.
El equipo analítico más utilizado es HPLC. Dentro de este equipo, en la literatura se recomienda el detector luz ultravioleta-visible (UV-Vis) o arreglo de diodos (DAD) y la columna utilizada tiene como fase estacionaria C18 y fase reversa. En este trabajo se utilizo la técnica por DAD-HPLC debido a que son sólidos fácilmente degradables que pueden absorber la luz visible y ultravioleta. En la tabla 5 se resume la identificación de licopeno por HPLC encontrado en la literatura:
Tabla 5. Identificación de licopeno reportado en literatura por HPLC Tipo de columna Detector
(λ)
Fase móvil (%v/v)
Flujo (ml/min.) Ref.
Chromolith
RP-18e NE
acetonitrilo, etilterbutileter 90:10
1
[23]
Zorbax C-18
UV-vis (475 nm)
Metanol, THF y agua 67:27:6
1.5
[12]
NE Fotodiodo
(476nm)
1-butanol, acetonitrilo, cloruro de metileno
2.0
[14]
Nucleosil 100 C-18
Fluorescente (295-330 nm)
N-hexano, alcohol absoluto
99.6:0.4 1.2
[3]
Phenomex Luna C-18
Electroquímico (350-700 mV)
Metanol, acetato de amonio
90:10 1.6
[17]
STR ODS-II UV-vis (470 nm)
Metano, THF 90:10
1.5
[21]
NE: no especificado
Capítulo 2.
METODOLOGÍA Y EQUIPO EXPERIMENTAL UTILIZADO
El trabajo experimental se realizó en el Laboratorio de Termodinámica Aplicado a Procesos con Fluidos Supercríticos de la sección de Estudios de Posgrado e Investigación del I.P.N. - E.S.I.Q.I.E, ya que se cuenta con los equipos y materiales necesarios. Los equipos utilizados para el desarrollo de este trabajo y sus principales características se describen dentro de este capítulo.
La pureza de los reactivos utilizados en la medición de solubilidades de sólidos en disolventes supercríticos y los sólidos utilizados en la calibración del DAD-HPLC se muestra en la tabla 6. Excepto del licopeno, el cual para la calibración del DAD-HPLC se utilizó el reactivo de alta pureza y para la medición de sus solubilidades en disolventes supercríticos se extrajo este compuesto del tomate debido al alto costo del reactivo estándar.
Tabla 6. Pureza de los reactivos utilizados en este trabajo.
Reactivo Pureza (%) Marca No. CAS Paracetamol (Acetaminofen) sigma ultra 99 Sigma 103-90-2
Capsaicina 95 Sigma 404-86-4
Licopeno de tomate (estándar) 98 Sigma 502-65-8
CO2 > 99.995 INFRA 124-38-9
Propano > 99.99 INFRA 74-98-06
Las sustancias utilizadas durante la realización de este trabajo no fueron tratadas ni purificadas previamente debido a que son de alta pureza. En el caso del licopeno,
tanto del reactivo estándar como del extraído del tomate, se tuvo el cuidado de no exponerlo a la luz y al oxigeno del aire por tiempos prolongados.
La metodología utilizada durante el desarrollo de este trabajo fue la siguiente:
1. Calibración de instrumentos periféricos de medición.
2. Verificación del método experimental.
3. Extracción de licopeno de tomates frescos.
4. Medición de solubilidades de licopeno en disolventes supercríticos.
A continuación se detalla el procedimiento y método experimental.
2.1 CALIBRACIÓN DE EQUIPOS DE MEDICIÓN
Con el fin de evitar errores y conocer la desviación que tienen los instrumentos de medición con respecto al valor real de cada variable fue necesaria la calibración de estos.
La calibración se llevo a cabo en tres principales partes del sistema de medición:
termómetros de platino, transductor de presión y detector de arreglo de diodos del cromatógrafo de líquidos (DAD–HPLC), mediante comparación directa con patrones de referencia. Los procedimientos se describen en el anexo A y los equipos utilizados y los resultados obtenidos de la calibración se describen a continuación
2.1.1 CALIBRACIÓN DE TERMÓMETROS DE PLATINO
Los dos termómetros de platino (PT100 Ω de 2mm de diámetro) conectados a un indicador digital modelo F250 de Automatic Systems Laboratories se calibraron usando un patrón secundario de temperatura.
Este sistema está constituido de un puente termométrico de precisión modelo F300 de Automatic Systems Laboratories, que cuenta con un RTD de platino como referencia de 25 Ω con una precisión ±0.005 K en la escala ITS-90 marca Rosemount y un resistor externo de referencia de 25 Ω nominal marca Tinsley. El sistema fue
calibrado por el CENAM hasta 692.7 K con puntos fijos (punto triple del agua y puntos de solidificación de zinc y estaño). La temperatura reportada en las mediciones de solubilidad es un promedio entre los dos termómetros de platino PT100 Ω, encontrándose una diferencia de 0.01 K.
Los termómetros de platino se calibran cada seis meses con un sistema igual al anterior y se ilustra en la figura 5 para comparar la calibración hecha por INyMET y verificar que se encuentre dentro de la incertidumbre reportada por dicha empresa.
La incertidumbre para los dos termómetros de platino es de ±0.02 K. El procedimiento de esta calibración se encuentra detallado en el anexo A1.
Fig. 5. Sistema de calibración de temperatura Puente F300
Indicador de temperatura
Horno 1 1
2
1. Termómetro de platino PT 100 Ω
2. Termómetro de platino PT 25 Ω (referencia)
40.123
40.1234 40
2.1.2 CALIBRACIÓN DEL TRANSDUCTOR DE PRESIÓN
El transductor de presión DRUCK, modelo PDCR 910-1756, está conectado a un indicador de presión marca DRUCK modelo DPI-145. Para la calibración del transductor de presión se utilizó una balanza de pesos muertos (patrón primario) marca Desgranges
& Huot modelo 5304 con precisión de ±0.005% en escala completa, que utiliza aceite SebacateTM como fluido de presurización.
El sistema de calibración de presión se presenta en la figura 6. La temperatura del transductor se monitorea con un termómetro PT100 Ω e indicador de temperatura digital F250 y la presión atmosférica con un barómetro digital modelo DPI-141 marca DRUCK.
Fig.6. Sistema de calibración de presión
La calibración del transductor se realizó en un intervalo de presión de 1 a 30 MPa a temperatura ambiente (aproximadamente 298 K), debido a que el transductor de presión se encuentra en la parte superior externa del horno durante las mediciones.
Además, el transductor cuenta con compensación en presión, por lo que no es afectado por los cambios de temperatura en el sistema de medición.
El porcentaje de desviación de la presión calculada con respecto de la presión real es máximo ± 0.05%. El procedimiento de calibración y análisis de resultados se presentan en el anexo A2.
2.1.3 CALIBRACIÓN DEL DAD-HPLC
Un cromatógrafo de líquidos de alta eficiencia (HPLC) se utilizó para analizar y cuantificar la cantidad de sólidos presentes en la fase supercrítica. El equipo de análisis, modelo HPLC 1100 series marca Hewlett-Packard, cuenta con un detector de arreglo de diodos (DAD) de 190 a 950 nm, columna Altima C18 de 5 µm y 250x4.6 mm, precolumna Altima C18 de 5 µm y 250x4.6 mm, así como una válvula manual de inyección con volumen de 20 µL marca Rheodyne modelo 7725i.
El procedimiento de calibración se detalla en el anexo A3. La calibración del DAD se realizó con estándares de alta pureza de capsaicina, paracetamol y licopeno. La capsaicina y el paracetamol se utilizaron para la verificación del método experimental, del cual se hablará en la sección 2.2.
En la identificación de los reactivos mediante HPLC se utilizaron como fase fluida disolventes de alta pureza y se presentan en la Tabla 7. Previamente, las impurezas sólidas que posiblemente contengan los disolventes se eliminan utilizando un sistema de filtración que incluyen acrodiscos de nylon de 0.20 µm; además los disolventes se degasaron en un sonicador para evitar la presencia de gases que interfieran el análisis en el HPLC.
Los análisis HPLC de cada reactivo sólido se realizaron a diferentes condiciones cromatográficas, las cuales fueron tomadas de literatura. En el caso del licopeno las condiciones reportadas en la literatura se modificaron para tener una mejor resolución de los resultados cromatográficos.
Tabla 7. Pureza de los disolventes utilizados como fase móvil en la identificación HPLC.
Reactivo Pureza (%) Marca No. CAS
Acetona HPLC min. 99.5 Tecsiquim 67-64-1 Acetonitrilo HPLC min. 99.98 Tecnolab 75-05-8
Acido fosfórico 85 Tecsiquim 7664-38-2
Agua HPLC J.T.Backer 7732-18-3
Alcohol etílico absoluto 99.61 J.T.Backer 64-17-5 Fosfato de potasio monobásico min. 99.0 Tecsiquim 77-7877-0
Metanol HPLC min. 99.95 Tecnolab 67-56-1
n-Hexano 96.7 Fermont 110-59-3
Tetrahidrofurano min. 99 Tecsiquim 109-99-9
En la tabla 8 se presentan la desviación estándar producto de la calibración del DAD-HPLC con cada compuesto. El desarrollo de las ecuaciones para el cálculo de las incertidumbres de estas calibraciones se reporta en el anexo B1.
Tabla 8. Desviación estándar en las calibraciones del DAD-HPLC
Compuesto ±σAsol (UA)
m (ppm/UA)
b (ppm)
σm
±
(ppm/UA )
σb
± (ppm)
Csol
σ
±
(ppm) Capsaicina 24.22 0.0817 25.56 7.3x10-5 0.71 2.4 Paracetamol 23.44 0.0162 -0.37 9.5x10-5 0.31 0.5
Licopeno 55.06 5.9573x10-3 80.37 1.8x105 1.6 3.3
A continuación se detallan las calibraciones de cada compuesto.
Calibración del DAD-HPLC con capsaicina. Cinco diferentes con concentraciones de 1284.40, 963.30, 706.42, 449.54 y 250.88 ppm se prepararon en metanol. Las condiciones de operación del HPLC fueron las siguientes:
En la figura 7 se presenta un cromatograma de inyección de capsaicina obtenida con estas condiciones cromatográficas. En este se puede observar que el tiempo de retención de este compuesto es de 5 minutos.
0 2 4 6 8 10 min
mAU
0 100 200 300 400 500
DAD1 A, Sig=280,4 Ref=off (ENE08\CAPS0698.D)
4.882 5.426 6.702
Fig. 7. Cromatograma HPLC de capsaicina estándar.
En la figura 8 se muestra la curva de calibración con capsaicina, donde se puede observar, el ajuste y la ecuación resultante de la regresión lineal tiene como resultado los coeficientes m = 0.0817 y b= 25.5587. El porcentaje de desviación promedio en las áreas es de 0.14% y un porcentaje de error de 0.5% máximo.
Vol. Iny.: 20 µL
Presion: 10 MPa
Flujo: 1,0 ml/min
Temp.: 298 K
Disolventes: agua 30 %vol
acetonitrilo 70 %vol
Long de
onda 280 nm