UNIVERSIDAD REGIONAL AUTÓNOMA DE LOS ANDES “UNIANDES”
FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS
PROGRAMA DE MAESTRÍA EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL GRADO ACADÉMICO DE MAGISTER EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA
TEMA:
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE Cymbopogon
Citratus FRENTE A CEPAS DE Staphylococcus Aureus y Escherichia Coli
AUTOR: BQF. MENDOZA BUÑAY ALEX FERNANDO
TUTORES: ING. OÑA CISNEROS FABIÁN DAVID, MSC. PHD(C) DR. VITERI RODRÍGUEZ JUAN ALBERTO, MSC.
APROBACIÓN DE LOS TUTORES DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
CERTIFICACIÓN:
Quienes suscriben, legalmente CERTIFICAN QUE: El presente Trabajo de
Titulación realizado por el señor Mendoza Buñay Alex Fernando, maestrante
del Programa de Maestría en Farmacia Clínica y Hospitalaria, Facultad de
Ciencias Médicas, con el tema “Evaluación de la actividad antimicrobiana
de Cymbopogon Citratus frente a cepas de Staphylococcus aureus y
Escherichia coli”, ha sido prolijamente revisado, y cumple con todos los
requisitos establecidos en la normativa pertinente de la Universidad Regional
Autónoma de los Andes UNIANDES, por lo que se aprueba su presentación.
Ambato, abril del 2018
Ing. Oña Cisneros Fabián David, MSc. PhD (C)
TUTOR
Dr. Viteri Rodríguez Juan Alberto, MSc.
DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD
Yo, Mendoza Buñay Alex Fernando, maestrante del Programa de Maestría de Farmacia Clínica y Hospitalaria, Facultad de Ciencias Médicas, declaro que
todos los resultados obtenidos en el presente trabajo de investigación, previo a
la obtención del Grado Académico de MAGÍSTER EN FARMACIA CLÍNICA Y
HOSPITALARIA, son absolutamente originales, auténticos y personales; a excepción de las citas, por lo que son de mi exclusiva responsabilidad.
Ambato, abril del 2018
______________________________
BQF. Mendoza Buñay Alex Fernando
CI. 060332230-6
DERECHOS DE AUTOR
Yo, Mendoza Buñay Alex Fernando, declaro que conozco y acepto la disposición constante en el literal d) del Art. 85 del Estatuto de la Universidad
Regional Autónoma de los Andes, que en su parte pertinente dice: El
patrimonio de la UNIANDES está constituido por…”La propiedad intelectual
sobre las Investigaciones, trabajos científicos o técnicos, proyectos profesionales y consultoría que se realicen en la Universidad o por cuenta de ella...”
Ambato, abril del 2018
______________________________
BQF. Mendoza Buñay Alex Fernando
CI. 060332230-6
INDICE GENERAL
PORTADA
APROBACIÓN DE LOS TUTORES DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD
DERECHOS DE AUTOR
INDICE GENERAL
RESUMEN
ABSTRACT
INTRODUCCIÓN ... 1
ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACIÓN ... 1
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ... 2
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ... 3
OBJETO DE LA INVESTIGACIÓN ... 4
CAMPO DE ACCIÓN ... 4
IDENTIFICACIÓN DE LA LÍNEA DE INVESTIGACIÓN ... 4
OBJETIVO GENERAL... 4
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 4
IDEA A DEFENDER ... 5
APORTE TEÓRICO, SIGNIFICACIÓN PRÁCTICA Y NOVEDAD CIENTÍFICA ... 5
CAPÍTULO I. ... 7
1 MARCO TEÓRICO ... 7
1.1 ORIGEN Y EVOLUCIÓN DEL OBJETO DE INVESTIGACIÓN ... 7
1.2 USO DE LAS PLANTAS MEDICINALES... 7
1.3 ESTUDIOS ETNOBOTÁNICOS Y ETNOFARMACOLÓGICOS ... 8
1.4 CYMBOPOGON CITRATUS ... 8
1.4.2 Actividad Antimicrobiana ... 10
1.5 EXTRACCIÓN DE PRINCIPIOS ACTIVOS ... 11
1.5.1 Métodos De Extracción En Fitoquímica ... 11
1.5.2 Extracción sólido-líquido ... 11
1.5.3 Maceración ... 12
1.5.4 Percolación o lixiviación ... 12
1.5.5 Extracción líquido-líquido ... 12
1.5.6 Extracto alcohólico ... 13
1.5.7 Extracto acuoso... 13
1.5.8 Compuestos fenólicos ... 14
1.5.9 Análisis de fenoles totales. ... 14
CAPÍTULO II. ... 18
2 MARCO METODOLÓGICO ... 18
2.1 DESCRIPCIÓN DEL ÁREA DE ESTUDIO ... 18
2.2 TRABAJO DE CAMPO ... 18
2.3 ANÁLISIS DE DATOS ETNOBOTÁNICOS ... 19
2.4 ÍNDICE DE VALOR DE USO DE ESPECIES... 19
2.5 OBTENCIÓN DEL EXTRACTO ... 21
2.5.1 Acondicionamiento ... 21
2.6 IDENTIFICACIÓN DE LA COMPOSICIÓN FITOQUÍMICA DEL EXTRACTO DEL CYMBOPOGON CITRATUS ... 22
2.7 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL EXTRACTO DE CYMBOPOGON CITRATUS ... 23
2.7.1 Ensayo antimicrobiano- Método de difusión de discos ... 23
2.8 DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO METODOLÓGICO PARA EL DESARROLLO DE LA INVESTIGACIÓN ... 23
2.9 ANÁLISIS DE RESULTADOS OBTENIDOS EN EL ESTUDIO. ... 24
2.9.2 Caracterización fitoquímica del extracto de Cymbopogon citratus . 26
2.9.3 Evaluación de la actividad antimicrobiana ... 27
CAPÍTULO III. ... 30
3 DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS. ... 30
CONCLUSIONES ... 34
RECOMENDACIONES ... 35
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
RESUMEN
Las propiedades demostradas por especies del género Poáceas se deben a su
composición química, basada principalmente en flavonoides, diterpenos y
triterpenos. Éste género ha sido objeto de numerosos estudios fitoquímicos y
de actividad biológica. El presente trabajo evaluó la actividad antimicrobiana in
vitro del extracto etanólico y aceite esencial de Cymbopogon citratus sobre
cepas de Staphylococcus aureus y Escherichia coli mediante la técnica de
difusión de disco en agar. Se evaluaron cuatro concentraciones del extracto
etanólico al 25%, 50%, 75% y 100% así como el aceite esencial al 100% y
agua bidestilada estéril como control negativo. Se realizó la lectura de los halos
de inhibición a las 24 horas de incubada la muestra. Como resultado se
encontró que los extractos etanólicos de Cymbopogon citratus presentaron
actividad antimicrobiana contra Staphylococcus aureus (25%, HI promedio= 4.0
mm; 50% HI promedio= 5.0 mm: 75% HI promedio= 6.0 mm; 100% HI
promedio= 8.0 mm; A.E.: 9.7) y Escherichia coli (50%, HI promedio= 0.5 mm;
75% HI promedio= 5.2 mm; 100% HI promedio= 8.2 mm; A.E. HI promedio= 3.0
mm). Se estableció que la actividad bactericida aumenta de forma proporcional
a la concentración del extracto y que el efecto del aceite esencial es superior al
extracto alcohólico sobre Staphylococcus aureus (p0.001). En conclusión,
existe un efecto bactericida mostrado por el extracto bruto etanólico y aceite
esencial de Cymbopogon citratus sobre Staphylococcus aureus y Escherichia
coli. Estudios posteriores son necesarios para elucidar su efecto in vivo y
evaluar su toxicidad.
Palabras clave: Cymbopogon citratus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli
ABSTRACT
The properties evidenced in different species of the genus Poáceas are based
on their chemical composition (flavonoids, diterpenes and triterpenes).
Numerous research studies have been conducted to understand the
phytochemical properties as well as the biological activity of this genus.
This project analyzed the in vitro antimicrobial activity of the ethanolic extract
and the Cymbopogon citratus essential oil on strains of Staphylococcus aureus
and Escherichia coli, using the agar diffusion testing method.
Four different concentrations of ethanolic extract were evaluated (25%, 50%,
75%, 100%), essential oil (100%), and sterile, distilled water as negative
control. After 24 hours of incubation, the zones of inhibition were analyzed and
it was observed that the ethanolic extracts of Cymbopogon citratus had the
following antimicrobial activity against Staphylococcus aureus: 25%, Average
HI: 4.0 mm; 50%, Average HI: 5.0 mm; 75%, Average HI: 6.0 mm; 100%,
Average HI: 8.0 mm; E.O.: 9.7 mm. The antimicrobial activity against
Escherichia coli was: 50%, Average HI: 0.5 mm; 75%, Average HI: 5.2 mm;
100%, Average HI: 8.2 mm; E.O.: 3.0 mm.
It was established that the bactericidal activity increases proportionally to the
concentration of the extract and that the effects of the essential oil against the
strains of Staphylococcus aureus were higher (p<0.001).
As a conclusion, it was found that both raw ethanolic extract and Cymbopogon
citratus essential oil have bactericidal effects against Staphylococcus aureus
and Escherichia coli. However, further research is required to elucidate the in
vitro effects and to evaluate toxicity.
1
INTRODUCCIÓN
Antecedentes de la investigación
La medicina tradicional ha sido transferida de generación en generación desde
tiempos inmemoriales, la cual se fundamenta en la actividad curativa de una
gran variedad de plantas. A pesar de los avances en la producción de la
medicina moderna, las plantas medicinales no han perdido su importancia; por
el contrario, el desarrollo de los medicamentos modernos ha sido resultado de
las distintas formas de aprovechar las plantas medicinales. La producción de
nuevos medicamentos requiere obligatoriamente la exploración de nuevos
moléculas con actividad biológica que son obtenidas de la variedad de
especies vegetales (1). El uso de plantas con propiedades curativas ha
aumentado en todo el mundo debido a su presunta eficacia. Aproximadamente
el 80% de la población general, especialmente en los países en desarrollo,
utiliza las hierbas medicinales para la atención primaria de salud. (2-3). Por
esta razón constituyen alternativas importantes a la medicina convencional
para las comunidades pobres que habitan en áreas rurales y carecen de
acceso a los servicios de salud estatales y privados (4-5).
El Cymbopogon citratus, comúnmente conocida como hierba de limón, es una hierba tropical perenne con hojas delgadas y largas, cultivada
principalmente en regiones tropicales y subtropicales de América del Sur.
Esta especie, ha sido ampliamente reconocida por su utilidad etnobotánica y
medicinal. (6-7). Investigaciones recientes han demostrado que diversos
compuestos químicos de C. citratus poseen propiedades antibacterianas,
antifúngicas, analgésicas y repelentes (7), entre la composición química de
la planta podemos distinguir que existen los siguientes metabolitos
limoneno, citral, geraniol, sesquiterpenos, verbenona, aldehído y cetonas
(17). Uno de estos compuestos con actividad biológica es el
3,7-dimethyl-2,6-octadienal o también llamado citral que presenta la mayor parte de la
bioeficacia de la planta (8).
Varios estudios llevados a cabo con extractos acuosos y alcohólicos de las
2
Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans y Escherichia coli, así como
frente al hongo Candida albicans, mostraron actividad bacteriostática y
bactericida en los cultivos de los cuatro especies nombradas (9 -10).
Investigaciones realizadas en América Latina en las cuales se utilizó el
extracto de aceite esencial de C. citratus, para la elaboración de cremas,
verificando la actividad antimicrobiana contra cepas de hongos y bacterias,
demostrándose que existe inhibición del crecimiento antimicrobiano
relacionada con la presencia del citral principal componente de la planta C.
citratus (18).
Otras investigaciones indican que existe una mayor actividad antimicrobiana
en el aceite esencial del C. citratus en comparación con el extracto
hidroalcohólico, en las cuales se evidencio que las bacterias presentaban
menor crecimiento cuando eran expuestas al extracto hidroalcohólico razón
por la cual el extracto del aceite esencial es una mejor técnica para la
extracción de los principios activos, de la misma manera otros
investigadores han propuesto que existe variación entre las partes de la
planta ya que los mismos extractos obtenidos de dichas partes presentan
diferentes actividades antimicrobianas cuando son empleados para el
control de las bacterias (19-20).
Planteamiento del Problema
De acuerdo a la Organización Mundial de la Salud la aparición de resistencia a
los antimicrobianos entre los microbios patógenos y oportunistas representa un
problema grave y recurrente para el tratamiento de las infecciones (11),
constituyendo uno de los mayores problemas de la Salud Pública Mundial,
porque incrementa la propagación de enfermedades infecciosas causadas por
microorganismos multiresistentes a los antimicrobianos, y generando una
necesidad constante del desarrollo de nuevos fármacos para tratar dichas
patologías (12).
Las infecciones causadas por microorganismos multiresistentes se asocian con
3
aumento en la mortalidad y un incremento en los costos derivados de la
atención clínica que amenaza la sostenibilidad de cualquier sistema de salud.
De este tipo de microorganismos el Staphylococcus aureus y la Escherichia coli
son dos ejemplos representativos de patógenos más importantes (13). El
Staphylococcus aureus es un coco gram positivo con capacidad patógena para causar enfermedades tanto adquiridas en la comunidad como nosocomiales
que van desde infecciones leves de la piel hasta enfermedades graves, como
endocarditis, neumonía, sepsis y síndrome de shock tóxico (14). Esta bacteria
desarrollo resistencia a la meticilina ocasionando que los pacientes infectados
incrementen su probabilidad de morir en un 64% (15).
La Escherichia coli es un bacilo gram negativo que se desarrolla como un organismo comensal del tracto gastrointestinal de humanos y muchos
animales. Algunas cepas patógenas causan enfermedades diarreicas, mientras
que otras causan infecciones extraintestinales siendo la principal causa de
infecciones del tracto urinario, ya sea nosocomial o adquirida en la
comunidad (16). E. coli desarrollo resistencia a las fluoroquinolonas un
medicamento de amplio uso en el tratamiento de las infecciones urinarias (15).
En referencia a lo expuesto, a través del presente estudio, se pretende aportar
a la exploración e investigación de la actividad biológica del extracto de C. citratus frente cepas de S. aureus y E. coli, con el propósito de lograr una alternativa terapéutica a las patologías causadas por los citados patógenos.
El objetivo de esta investigación es demostrar la actividad antimicrobiana del
extracto hidroalcóholico y el aceite esencial del C. citratus contra las cepas de
S. aureus y E. coli, mediante la experimentación en un cultivo in vitro
controlado.
Formulación del problema
¿Presenta actividad antimicrobiana el extracto y el aceite del Cymbopogon
4
Objeto de la investigación
Actividad antimicrobiana del extracto y aceite del Cymbopogon citratus
(Limoncillo).
Campo de acción
Actividad antimicrobiana del extracto y aceite del Cymbopogon citratus
(Limoncillo)contra las cepas de Staphylococcus aureus y de Escherichia coli.
Identificación de la línea de investigación
Estudios microbiológicos.
Objetivo general
Evaluar la actividad antimicrobiana del extracto hidroalcólico y aceite del
Cymbopogon citratus frente a cepas de Staphylococcus aureus y de
Escherichia coli.
Objetivos específicos
Obtener el aceite esencial del Cymbopogon citratus.
Obtener el extracto hidroalcohólico del Cymbopogon citratus.
Realizar el tamizaje fitoquímico del extracto y del aceite del Cymbopogon
citratus.
Probar la actividad antimicrobiana del extracto y el aceite frente a cepas de
5
Idea a defender
El aceite esencial y el extracto hidroalcohólico del Cymbopogon citratus
presenta actividad antimicrobiana en contra de las cepas de Staphylococcus
aureus y de Escherichia coli
Aporte teórico, significación práctica y novedad científica
En el caso de las bacterias se ha evidenciado un pronunciado desarrollo de
varias cepas con resistencia antimicrobiana a la gran mayoría de
antimicrobianos existentes en la actualidad, lo que ha incrementado la
mortalidad de la población por falta de nuevas alternativas farmacoterapéuticas
para el tratamiento de las patologías causadas por dichos microorganismos,
esta investigación promoverá el uso de las plantas como fuente
complementaria al tratamiento clínico de enfermedades causadas por
microorganismos resistentes. A partir de la presente propuesta de estudio se
pretende evaluar la actividad antimicrobiana del extracto hidroalcohólico del
Cymbopogon citratus frente a las cepas de Staphylococcus aureus, causantes
de infecciones de la piel, osteomielitis, neumonía y cepas de Escherichia coli,
causantes de diarreas, infecciones urinarias y meningitis; fortaleciendo de esta
manera, las investigaciones ya existentes sobre la capacidad que tiene el
extracto del Cymbopogon citratus para inhibir el desarrollo de estas bacterias. De obtenerse resultados positivos en cuanto a actividad bacteriostática y
bactericida se habrá aportado a la evidencia científica que respalda su uso
como potenciales vías de tratamiento con aplicación clínica a futuro.
La planta de Cymbopogon citratus es originaria de la India y Malasia, en el Ecuador se encuentra distribuida en tres de las cuatro regiones naturales del
Ecuador, principalmente en el sur del país, esta planta crece a una
determinada altura de dos metros de alto, con hojas de entre 20 y 100 cm de
longitud y 1,5 cm generalmente de ancho. Cymbopogon citratus es una
alternativa más saludable, de la cual no se han reportado efectos secundarios a
más de ser una opción más económica a comparación del alto costo en la
6
las enfermedades causadas por estas bacterias. Por esta razón dentro del
ámbito de estudio de la actividad antimicrobiana del Cymbopogon citratus
frente a cepas de Staphylococcus aureus y Escherichia coli existen varias
investigaciones sobre este tema mencionando las realizadas por Okigbo RN y
Mmeka EC, entre otros, los cuales realizaron dichos estudios en el extranjero.
En nuestro mayor esfuerzo de búsqueda de evidencia científica sobre estudios
de Cymbopogon citratus en Ecuador, no se han encontrado datos ni artículos científicos publicados; lo que faculta a la presente propuesta como la primera
en ser llevada a cabo a nivel nacional con la premisa de abrir una nueva arista
de investigación dentro de la línea de la exploración de fitofármacos en la que
se busca promover el interés científico de la comunidad para la búsqueda de
nuevas alternativas más amigables para mantener una adecuada salud y que
sirva de fuente de información para el desarrollo de futuras investigaciones
7
CAPÍTULO I.
1 MARCO TEÓRICO
1.1 Origen y evolución del objeto de Investigación
El uso de prácticas de salud complementarias es tan antiguo como la aparición
de la especie humana, porque desde el principio de la civilización son parte de
las prácticas de atención familiar y comunitaria. Entre las distintas prácticas
complementarias utilizadas y difundidas a través de la cultura popular, las
plantas medicinales siempre ocupan lugar destacado y durante mucho tiempo
fue el principal recurso terapéutico utilizado para tratar la salud de las personas
y sus familias (21).
Los mercados tradicionales en el sur de Ecuador y dentro de la región andina
son especialmente importantes para el comercio de recursos vegetales entre la
población local, incluso antes de la colonización española; por lo tanto, los
estudios etnobotánicos son actualmente necesarios e importantes. Estos
espacios estratégicos persisten para el valor cultural de la medicina tradicional
reflejado en el mayor consumo de plantas medicinales, que abarcan todos los
niveles socioeconómicos de la población rural y urbana (22).
1.2 Uso de las plantas medicinales
El uso de las plantas medicinales es común en los países a nivel mundial,
aunque gran parte de ella desconoce muchas de sus propiedades, formas de
empleo y modos de aplicación. Para avanzar en el conocimiento de la gestión
tradicional de los recursos naturales de origen vegetal y de las relaciones entre
las sociedades humanas y las plantas, se realizan estudios etnobotánicos que
son de gran relevancia en los últimos años, ya que varias compañías
farmacéuticas están interesadas en las plantas como un gran potencial, para la
obtención de fármacos de origen natural que son útiles en el tratamiento de las
8
1.3 Estudios Etnobotánicos y Etnofarmacológicos
La Etnobotánica trata del estudio de las relaciones existentes entre los
vegetales y la especie humana. Por un sesgo metodológico y conceptual,
desde su origen, la etnobotánica se ha centrado en los pueblos indígenas, las
sociedades iletradas. Sin embargo, se ha demostrado repetidas veces que el
conocimiento y práctica popular referidos a las plantas pueden ser también
investigados en las sociedades más complejas. Por otra parte, la
Etnofarmacología es definida como la exploración científica interdisciplinaria de
los agentes biológicamente activos y tradicionalmente empleados o conocidos
por el hombre (24).
1.4 Cymbopogon citratus
Entre varias especies con propiedades medicinales, Cymbopogon citratus
(Poaceae), una especie popularmente conocida como "hierba de limón",
muestra un número infinito de aplicaciones y es popularmente utilizado por
personas en muchos países. En Brasil, por ejemplo, el té, la infusión y los
extractos de C. citratus, que se preparan con hojas frescas o secas, se usan a
menudo en la medicina popular como un medicamento reconstituyente,
digestivo, antitusia y eficaz contra los resfriados, con una analgésico,
antihermético, anticardiopático, antitérmico, antiinflamatorio de los conductos
urinarios, efecto diurético, y antiespasmódico (25) (Negrelle y Gomes 2007).
Además, los extractos de hierba de limón y sus aceites esenciales también se
usan en las industrias de alimentos (aromatizantes), perfumes y cosméticos, y
este uso tiene una importancia económica razonable en varios países (26)
(Oliveira et al., 1997).
Como consecuencia de innumerables aplicaciones de C. citratus, se han
realizado varios estudios con el objetivo de ampliar el conocimiento sobre la
composición química de las hojas de hierba de limón, que son las partes
utilizadas con fines medicinales. Estos estudios han revelado que, aunque la
9
varía de acuerdo con el origen geográfico, las sustancias aisladas e
identificadas de las hojas son principalmente alcaloides, saponina, asitosterol,
terpenos, alcoholes, cetona, flavonoides, ácido clorogénico, ácido cafeico,
ácido cumárico y azúcares (25, 26).
Aunque los extractos de plantas de hierba de limón se han utilizado
ampliamente en la medicina popular, la investigación científica ha encontrado
alguna sustancia potencialmente tóxica en esta especie. Se observaron efectos
hepatotóxicos y nefrotóxicos en ratones tratados con extractos líquidos de C.
citratus (30% y 80%) (27) (Guerra et al., 2000), lo que indica la necesidad de una investigación más detallada sobre su citotoxicidad (27).
1.4.1 Actividad Biológica
Como se ha mencionado en apartados anteriores, C. citratus es una planta
herbácea, pertenece a la familia Poaceae, que se cultiva en varios países
especialmente por sus aceites esenciales y por uno de sus constituyentes
principales que es el citral, el cual es usado como materia prima para la síntesis
de compuestos aromáticos y vitamina A (28). En Colombia el C. citratus está
adaptado a los diversos pisos climáticos, es frecuente encontrarlo en avenidas
y jardines familiares como planta ornamental y medicinal. De forma general, el
C. citratus se usa como anticatarral, febrífugo, antitusivo, estomáquico,
carminativo, expectorante y ansiolítico, para aliviar el vómito, antiespasmódico,
antitusivo, analgésico, antipirético, como depresor del sistema nervioso central y para disminuir el colesterol. Se reporta también como antipalúdico, diaforético
y estimulante, diurético y en el control de la presión arterial (25, 28).
A través de análisis por cromatografía de gases (CG/EM) se identificaron 18
compuestos que representan el 97.4% de los constituyentes del aceite
esencial. Los componentes mayoritarios identificados fueron los monoterpenos
geranial (41.8%) y neral (34.9%), los cuales constituyen una mezcla de
esteroisomeros conocida como citral, siendo este el 76.7% del aceite obtenido.
10
investigación química del aceite esencial de hojas de C. citratus, colectado en
el Distrito de Santa Marta revela una alta concentración de monoterpenos
(94.3%), estos datos son consistentes con los reportados en la literatura
científica (28).
Tabla 1. Cantidad relativa (%) de los componente presentes en el aceite
esencial de C. citratus, determinada por CG-EM. Adaptado de (29)
No. Pico Tr (min) Identificación Cantidad Relativa (%) 1 19.47 6-metil-5-hepten-2-ona 0.9
2 19.68 Mirceno 0.6
3 24.33 Linalol 1.5
4 26.43 Trans-Crisantemal 0.3
5 27.49 Isogeranial 0.7
6 27.73 M 152 0.6
7 29.21 Nerol + Citronelol 1.5
8 29.81 Neral 34.9
9 30.11 Geraniol 10.1
10 30.87 Geranial 41.8
11 31.31 M+ 186 0.7
12 31.51 M+186 0.7
13 34.85 Acetato de geranilo 1.5
14 36.88 Trans-Cariofileno 0.2
15 37.12 Cis--Bergamotero 0.1
16 38.99 2-Tridecanona 0.2
17 43.19 Neo-intermedol 0.9
18 43.98 -Cadinol 0.2
19 44.37 Intermedeol 0.2
20 53.75 M+286
21 60.51 2,2’-Metilenbis[6-tert-butil-p-cresol] 1.5 22 62.85 Monoetilhexil ftalato 0.3
1.4.2 Actividad Antimicrobiana
A partir de varios estudios se ha descubierto que C. citratus posee propiedades
antidepresivas, antioxidantes, antisépticas, astringentes, bactericidas,
fungicidas, nerviosas y sedantes (29). Además, varios trabajos han informado
sobre la actividad antibacteriana del aceite esencial de C. citratus contra una amplia gama de organismos que comprenden microorganismos grampositivos
y gramnegativos, levaduras y hongos. En estos estudios se observó que los
11
gram negativos (31). Se encontró que el aceite de C. citratus es efectivo contra
Acinetobacter baumanii, Aeromonas veronii, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia y Salmonella enterica serotipo typhimurium.
1.5 Extracción de Principios Activos
1.5.1 Métodos De Extracción En Fitoquímica
Cuando se da inicio a un estudio fitoquímico se debe tener claro qué tipo de
metabolitos es posible determinar en la especie que está siendo estudiada, y
aún más en concreto, en la parte de la planta de la que se va a realizar el
extracto, ya que de estos factores depende el método de extracción que se
debe utilizar para el material vegetal. En la mayoría de los estudios se hace la
extracción del material vegetal seco y pulverizado para que se logre mayor
permeabilidad del solvente y por lo tanto se genere un mayor rendimiento en la
extracción debido a que, en la mayoría de los casos, los compuestos a estudiar
son parte del metabolismo secundario, permanecen sin descomponerse en la
estructura de la planta y no se volatilizan fácilmente. La polaridad de los
compuestos a extraer es un factor determinante en el tipo de solvente que se
debe emplear, por ende, si se quieren extraer mayoritariamente compuestos
como 45 esteroles, se debe utilizar un solvente como éter de petróleo,
cumarinas uno como hexano y alcaloides con uno como etanol y
posteriormente con un ácido diluido. La extracción con etanol es muy común ya
que con este se extraen sustancias de todas las polaridades, además este es
un solvente estable (poco reactivo) y económico, también se puede evaporar
fácilmente (32).
1.5.2 Extracción sólido-líquido
La extracción sólido líquido permite la extracción de un componente de interés
soluble de un sólido con el contacto con un disolvente, en fitoquímica la fase
portadora sólida sería el material vegetal, el soluto sería el extracto obtenido a
12
1.5.3 Maceración
El principio de la maceración consiste en la obtención de extractos, gracias al
duradero tiempo de contacto que el solvente debe tener con el material vegetal,
que debe estar pulverizado o molido para lograr una mayor superficie de
contacto con el solvente, este proceso es realizado a temperatura ambiente. Es
conveniente realizar agitaciones frecuentes para la homogenización del
procedimiento y así tratar de influenciar el rendimiento de la extracción, el
poder de extracción del solvente va disminuyendo a medida que pasa el tiempo
de contacto con el material vegetal; para la realización de este tipo de extractos
es conveniente la protección del recipiente de extracción de la luz solar, ya que
esta puede llegar a descomponer sustancias fotolábiles. Después de la
realización del extracto por medio de un filtrado es necesario lavar el material
vegetal restante con más solvente para la obtención del extracto total (33).
1.5.4 Percolación o lixiviación
Consiste en el paso del disolvente a temperatura ambiente sin la aplicación de
presión (solo por la acción de la gravedad), a través del material vegetal
finamente molido, el 46 hecho de que el solvente pase detenidamente por las
partículas del sólido hace que disuelva la mayor cantidad de metabolitos que le
es posible y debido a que es continua la adición de solvente se logra una
extracción muy efectiva utilizando esta técnica (31,34)
1.5.5 Extracción líquido-líquido
La extracción líquido-líquido, es un proceso de transferencia de una o varias
sustancias desde una fase líquida a otra líquida que es inmiscible con la
primera. Esto se debe al reparto que ocurre entre las dos fases de compuestos
de diversas polaridades. Generalmente una de las fases es acuosa, y la otra es
orgánica, esta última se denomina extractante ya que es el responsable de la
13
1.5.6 Extracto alcohólico
Método I (método de extracción caliente) - Transferir a un erlenmeyer con
tapón de vidrio aproximadamente 4 g, exactamente pesados, del material en
polvo grueso y secado al aire. Agregar 100 ml de alcohol y pesar el erlenmeyer.
Agitar y dejar en reposo durante 1 hora. Conectar un refrigerante al erlenmeyer
y calentar suavemente a ebullición durante 1 hora, enfriar y pesar. Ajustar
nuevamente al peso original mediante el agregado de alcohol. Agitar y filtrar
rápidamente a través de un filtro seco. Transferir 25 ml del filtrado a un
cristalizador y evaporar hasta sequedad en baño de agua. Secar a 105 °C
durante 6 horas, enfriar en un desecador durante 30 minutos y pesar
inmediatamente. Calcular el contenido, en mg por g, de materia extraíble en
alcohol en la muestra empleada (36).
Método II (método de extracción fría) - Transferir a un erlenmeyer con tapón de
vidrio aproximadamente 4 g, exactamente pesados, de material en polvo
grueso y secado al aire. Agregar 100 ml de alcohol, tapar el erlenmeyer y
macerar durante 24 horas, agitando frecuentemente durante las primeras 8
horas y luego dejar reposar. Filtrar rápidamente, tomando precauciones para
evitar la pérdida de alcohol. Evaporar 25 ml del filtrado hasta sequedad en un
cristalizador previamente pesado y secar a 105 °C hasta peso constante.
Calcular el contenido, en mg por g, de la materia extraíble en alcohol en la
muestra empleada (37).
1.5.7 Extracto acuoso
Método I (método de extracción caliente) - Proceder según se indica para el
Método I en Extracto alcohólico, excepto que se debe emplear agua en lugar
de alcohol (37).
Método II (método de extracción fría) - Proceder según se indica para el
Método II en Extracto alcohólico, excepto que se debe emplear agua en lugar
14
1.5.8 Compuestos fenólicos
Los compuestos fenólicos, entre los cuales se encuentran los flavonoides,
presentan una amplia ubicuidad en la naturaleza. Son responsables del buen
funcionamiento de las plantas y, en su relación con el hombre, son utilizados
para tratar desordenes cardiovasculares y prevenir algunos cánceres. Poseen
una estructura química adecuada para ejercer actividad antioxidante, la cual
está íntimamente relacionada con tales propiedades. Para su extracción se
utilizan solventes polares cuyo extracto posteriormente se concentra. Los
compuestos fenólicos constituyen una de las principales clases de metabolitos
secundarios de los vegetales, donde desempeñan diversas funciones
fisiológicas
Los flavonoides, uno de los dos grandes grupos de compuestos fenólicos junto
con los ácidos fenólicos, son un grupo extenso de compuestos derivados del benzo-γ-pirano. Dependiendo del grado de oxidación y de sustitución del anillo
pirano central pueden subdividirse en flavonas, flavonoles, flavononas,
isoflavonas, flavanos y antocianinas. Está comprobado que los flavonoides son
importantes para el desarrollo y buen funcionamiento de las plantas al
protegerlas contra agentes agresores externos, como la radiación UV,
microorganismos, animales herbívoros y del medio ambiente (38).
1.5.9 Análisis de fenoles totales.
La concentración de fenoles totales en extractos fue medida por
espectrofotometría, basándose en una reacción colorimétrica de
óxido-reducción. El agente oxidante utilizado fue el reactivo de Folin-Ciocalteu (38).
El ensayo Folin-Ciocalteu se utiliza como medida del contenido en compuestos
fenólicos totales en productos vegetales. Se basa en que los compuestos
fenólicos reaccionan con el reactivo de Folin-Ciocalteu, a pH básico, dando
lugar a una coloración azul susceptible de ser determinada
espectrofotométricamente a 765 nm. Este reactivo contiene una mezcla de
wolframato sódico y molibdato sódico en ácido fosfórico, y reacciona con los
15
(formado por las dos sales en el medio ácido), de color amarillo, al ser reducido
por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso (39).
El mecanismo de reacción es una reacción redox, por lo que además puede
considerarse también, como un método de medida de la actividad antioxidante
total. La oxidación de los polifenoles presentes en la muestra, causa la
aparición de una coloración azulada que presenta un máximo de absorción a
765 nm, y que se cuantifica por espectrofotometría en base a una recta patrón
Actividad Antimicrobiana y Resistencia
Durante varias décadas, la resistencia a los antimicrobianos (AMR) ha sido una
amenaza creciente para el tratamiento efectivo de una gama cada vez mayor
de infecciones causadas por bacterias, parásitos, virus y hongos. La RAM
produce una reducción de la eficacia de los fármacos antibacterianos,
antiparasitarios, antivirales y antimicóticos, lo que hace que el tratamiento de
los pacientes sea difícil, costoso o incluso imposible. El impacto en pacientes
particularmente vulnerables es más obvio, lo que resulta en una enfermedad
prolongada y una mayor mortalidad. La magnitud del problema en todo el
mundo y el impacto de la resistencia a los antimicrobianos en la salud humana,
y en los costos para el sector de la salud y el impacto social más amplio, aún
se desconocen en gran medida.
Se han intentado algunas estimaciones de los efectos económicos de la
resistencia a los antimicrobianos, y los hallazgos son inquietantes. Por ejemplo,
el costo anual solo para el sistema de salud de los EE. UU. Se ha estimado en
US $ 21 a $ 34 mil millones de dólares, acompañado por más de 8 millones de
días adicionales en el hospital. Debido a que AMR tiene efectos mucho más
allá del sector de la salud, se proyectó, hace casi 10 años, provocar una caída
en el producto interno bruto (PIB) del 0.4% al 1.6%, lo que se traduce en
muchos miles de millones de dólares actuales a nivel mundial. La resistencia a
los antimicrobianos es un desafío complejo para la salud pública mundial, y no
existe una estrategia única o simple que pueda contener por completo la
aparición y propagación de organismos infecciosos que se vuelven resistentes
a los antimicrobianos disponibles. El desarrollo de la resistencia a los
antimicrobianos es un fenómeno natural en los microorganismos y se ve
16
agentes antimicrobianos en humanos y animales. La falta actual de nuevos
antimicrobianos en el horizonte para reemplazar aquellos que se vuelven
inefectivos aumenta la urgencia de la necesidad de proteger la eficacia de los
medicamentos existentes (40).
El desarrollo e implementación de estrategias efectivas para reducir la
aparición y propagación de la RAM, y para evaluar el efecto de las
intervenciones para hacerlo, dependen de la recopilación de información
representativa precisa sobre el alcance del problema y su impacto. La OMS ha
promovido durante muchos años el monitoreo mundial de la resistencia a los
antimicrobianos y ha tomado medidas para concienciar sobre la inminente
crisis de salud pública que provocará.
Entre una serie de iniciativas de la OMS, en 2001 se publicó la Estrategia
mundial para la contención de la resistencia a los antimicrobianos, y la AMR fue
el tema central del Día Mundial de la Salud en 2011 cuando se emitió un
paquete de políticas AMR de 6 puntos. La Asamblea Mundial de la Salud, a
través de varias resoluciones a lo largo de los años, ha pedido una aplicación
más intensa de la estrategia global, destacando la necesidad de una vigilancia
reforzada de la resistencia a los antimicrobianos y una mayor capacidad de
laboratorio para llevarla a cabo y una reducción en el uso inapropiado de
antimicrobianos.
La capacidad de realizar pruebas de susceptibilidad antimicrobiana, que
pueden informar la vigilancia de la RAM, también está dentro del alcance del
Reglamento Sanitario Internacional, que estipula el requisito de acceso de los
Estados Partes a la capacidad de investigar cualquier brote de enfermedad que
pueda representar un amenaza internacional a la salud pública. Todavía
quedan muchas lagunas en los esfuerzos para contener la AMR. Muchos
diversos patógenos bacterianos, virales, fúngicos y parasitarios muestran
resistencia, y para algunas enfermedades específicas (por ejemplo,
tuberculosis [TB], VIH, gripe y malaria) existen programas que abordan la
resistencia, y muchas de las preocupaciones más inmediatas y urgentes se
relacionan a la resistencia a los antibióticos en las bacterias comunes. La
17
infecciones comunes y potencialmente mortales adquiridas en los hospitales y
en la comunidad, para las cuales el tratamiento es cada vez más difícil o, en
algunos casos, imposible.
A pesar de la importancia de estas infecciones, existen importantes lagunas en
la información sobre el alcance, la propagación, la evolución y el impacto de la
ABR. La urgencia se suma, en particular, a la falta de nuevas opciones
terapéuticas en la cartera de desarrollo para reemplazar aquellas que pierden
su eficacia a medida que las bacterias se vuelven resistentes a ellas. Por lo
tanto, el enfoque principal de este informe es sobre ABR, para lo cual el
18
CAPÍTULO II.
2 MARCO METODOLÓGICO
2.1 Descripción del área de estudio
La presente investigación se realizó en el área andina del cantón Cayambe, parroquia Cangahua, provincia de Pichincha – Ecuador; 0°02′38″N 78°09′22″O,
altitud de 3895 m.s.n.m. En el suroeste de la parroquia de Cangahua se
encuentra el volcán inactivo Pambamarca, en cuyo páramo a mediados del
segundo milenio se construyeron pucarás, posiblemente por lo indios caranquis
o por los incas.
2.2 Trabajo de campo
El estudio etnobotánico se llevó a cabo entre enero y marzo de 2018. La zona
de estudio se visitó con el fin de realizar conversaciones con habitantes de la
comunidad andina del cantón Cangahua para informarlos sobre los objetivos
del presente estudio. Para el tamaño de la muestra de informantes se empleó
la base de datos publicados en el Plan de Desarrollo y Ordenamiento (PD y
OT) de la parroquia de Cangahua en 2014 publicado por el Gobierno Autónomo
Descentralizado de la Parroquia de Cangahua.
En la población objeto de estudio se estratifico por grupos etarios y se tomó tan
solo a la población ubicada en los rangos quinquenales de 65 a 69, 70 a 74 y
75 a 79, que corresponden al grupo de adultos mayores según lo defino por le
Ministerio de Salud del Ecuador. La población obtenida a partir de la
estratificación fue de 665 individuos de los cuales, bajo autodefinición étnica,
558 (83.9%) correspondieron a la etnia indígena, 99 (14.9%) etnia mestiza, 4
(0.6%) etnia blanca, 2 (0.3%) etnia mulata y 2(0.2%) a la etnia
afrodescendiente.
La muestra población de estudio se estableció en 332 individuos que respetó la
proporción étnica encontrada en la población adulta mayor, resultado de la
estratificación inicial. Por tanto, el total de encuestas que se aplicó se
19
participar en el estudio se les aplicaron entrevistas semiestructuradas en las
que se indagó sobre las plantas empleadas para tratar alguna enfermedad, los
usos medicinales tradicionales, métodos de preparación, vía de administración
y partes de la planta que frecuentemente usan.
2.3 Análisis de datos etnobotánicos
La información etnobotánica proporcionada por los habitantes del área de
estudio, fue organizada en una base de datos empleando una hoja de cálculo
de Microsoft Office Excel 2011 bajo licencia personal. Los porcentajes y
frecuencias de las citaciones de las plantas medicinales asociadas a la
medicina tradicional, se utilizaron para el análisis etnobotánico. Se emplearon
tres índices para determinar la importancia de las diferentes especies
identificadas en el área de estudio.
2.4 Índice de valor de uso de especies
Este índice expresa la importancia o valor cultural de una especie determinada
para todos los informantes entrevistados. Para estimar el índice de valor de uso
general de cada especie para todos los informantes (IVUs) se utilizó la formula.
𝐼𝑉𝑈𝑠 =∑ 𝑖𝑉𝑈𝑖𝑠
𝑁𝑠
Dónde:
VUis = valor de uso de la especie por cada informante
Ns = es el nñumero de informantes para cada especie
Conocimiento relativo de la especie por varios informantes (RVU).
20 𝑅𝑉𝑈 =∑ 𝑉𝑈𝑖𝑠𝐼𝑉𝑈𝑠
𝑁𝑠𝑝
Dónde:
VUis = Valor de uso de la especie por cada informante
IVUs = Es el índice de valor de uso de la especie
Nsp = Es el número de especies
Nivel de uso significativo
Para estimar el nivel de uso significativo para cada especie y verificar su
aceptación cultural, se utilizó la siguiente ecuación. Esta metodología, expresa
que aquellos usos medicinales que son citados con una frecuencia superior o
igual al 20%, por las personas encuestadas que usan plantas como primer
recurso para un determinado problema de salud, pueden considerarse
signifcativos desde el punto de vista de su aceptaci´n cultural y, por tanto, se
consideran para investigaciones científicas.
𝑈𝑆𝑇 =𝑈𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑒 (𝑠)
𝑁𝑖𝑠 𝑋 100
Dónde:
Uso de especie (s) = Número de citaciones para cada especie
21
2.5 Obtención del extracto 2.5.1 Acondicionamiento
Las muestras de Cymbopogon citratus recolectadas cumplieron con los
procesos de: selección, lavado, secado y triturado, tratando de mantener la
genuinidad y propiedades que a ella se le atribuyen. Se seleccionaron así a las
hojas en mejor estado morfológico.
El lavado se realizó con agua potable sumergiéndolas en un recipiente,
tratando de eliminar la mayor cantidad de impurezas, sin llegar a perder los
beneficios de la muestra, posterior a esto se llevó a sequedad en un espacio
ventilado sin la incidencia directa de la luz solar por 7 días.
La planta seca o el residuo de la extracción, se somete a tres extracciones
sucesivas según la (Ilustración 1), a cada extracto I, II, III, se mide el volumen
obtenido y se calcula su concentración, esto se expresa en gramos de
sustancias extraidas por ml del extracto. Para ello se toma una alícuota de 5 ml
y se pasa a una cápsula previamente tarada, se evapora a sequedad en baño
de agua y se pesa nuevamente.
22
2.6 Identificación de la composición fitoquímica del extracto del
Cymbopogon citratus
Para el tamizaje fitoquímico se llevaron a cabo distintos protocolos con la
finalidad de identificar los distintos compuestos y metabolitos secundarios.
Estos procedimientos se resumen en la Tabla2, en la que se detalla el nombre
del ensayo, el metabolito a ser identificado, procedimiento y el resultado que
marca la presencia o ausencia de un determinado compuesto.
Tabla 2. Técnicas para el tamizaje fitoquímico. Adaptado de (32-39)
Ensayo Metabolito Procedimiento Resultado
Dragendorff
Alcaloides.
Observamos si la alícuota del extracto está disuelta en un solvente orgánico, éste se evapora, en un baño de agua y el residuo redisolverse en 1 mL de ácido clorhídrico al 1 % en agua.
Si observamos que el extracto es acuoso, a la alícuota se le añade 1 gota de ácido clorhídrico
concentrado. Con la solución acuosa ácida se realiza el ensayo, añadiendo 3 gotas del reactivo.
Si hay opalescencia se considera (+) turbidez definida
(++), precipitado (+++).
Wagner y Mayer
De igual manera se parte en los casos anteriores de la solución acida, y se añade 2 ó 3 gotas del
reactivo.
Baljet Lactonas.
Observamos si la alícuota del extracto se encuentra en alcohol, se evapora el solvente en baño de agua y debe redisolverse en la menor cantidad de alcohol (1mL). En estas condiciones adicionamos 1mL de
reactivo.
La aparición de una coloración roja (++) o precipitado rojo
(+++).
Borntrager Quinonas.
Observamos si la alícuota del extracto no se encuentra en cloroformo, evaporamos el solvente en
baño de agua y el residuo redisolverse en 1mL de cloroformo.
Adicionamos 1mL hidróxido de sodio, hidróxido de potasio o amonio al 5% en agua. Agitamos mezclando las fases y se deja en reposo hasta su
posterior separación.
Si la fase acuosa alcalina se colorea de rosado o rojo.
Coloración rosada (++), coloración roja (+++).
Liebermann-Burchard
Triterpenos y/o esteroides.
Adicionamos 1mL de anhídrido acético y se mezcla bien. Por la pared del tubo de ensayo se dejan resbalar 2-3 gotas de ácido sulfúrico concentrado sin
agitar.
1. Rosado 2. Verde intenso-visible
3. Verde oscuro-negro
Catequinas Catequinas
Tomamos una gota de la fracción alcohólica, con la ayuda de un capilar y se aplica la solución sobre papel filtro. Sobre la mancha se aplica solución de
carbonato de sodio.
Verde carmelita a la luz UV.
Fehling Azúcares Reductores.
Si la alícuota del extracto no se encuentra en agua, se evapora el solvente en baño de agua y el residuo
redisolverse en 1–2 mL de agua. Se adiciona 2mL del reactivo y se calienta en baño
de agua 5–10 min la mezcla.
Solución se colorea de rojo o aparece precipitado rojo.
Cloruro Férrico
Compuestos fenólicos y/o taninos.
Observamos si el extracto es acuoso se añade acetato de sodio para neutralizar y tres gotas de una solución de tricloruro férrico al 5% en solución salina fisiológica a una alícuota del extracto alcohólico se
adiciona el reactivo.
Coloración rojo- vino, verde intenso, azul.
Shinoda Flavonoides.
Observamos si la alícuota del extracto se encuentra en alcohol, se diluye con 1 mL de ácido clorhídrico
concentrado y un pedacito de cinta de magnesio metálico.
Después de la reacción se espera 5 minutos, se añade 1 mL de alcohol amílico, se mezclan las fases
y se deja reposar hasta que se separen.
Cuando el alcohol amílico se colorea de amarillo, naranja, carmelita o rojo; intenso en
todos los casos.
23
secuencia C6-C3-C6 del grupo de los
flavonoides.
con 1 mL de HCl concentrado. Se deja enfriar y se adiciona 1mL de agua y 2 mL de alcohol amílico. Se
agita y se deja separar las dos fases.
marrón en la fase amílica.
Resinas Resinas. Adicionamos a 2mL de la solución alcohólica, 10 mL de agua destilada. Precipitado.
Espuma Saponinas.
Observamos si la alícuota se encuentra en alcohol, se diluye con 5 veces su volumen en agua y se agita
la mezcla fuertemente durante 5–10 min.
Si aparece espuma en la superficie del líquido.
2.7 Evaluación de la Actividad Antimicrobiana del Extracto de
Cymbopogon citratus
2.7.1 Ensayo antimicrobiano- Método de difusión de discos
En placas Petri de agar (Mueller Hinton) sembradas (0.5 McFarland) cada una
de las cepas activas en estudió, se colocó discos de papel filtro (ø 5 mm), con
la ayuda de una plantilla numerada, sobre cada disco se secó (15 µL) extractos
y sus respectivas diluciones, control de solventes (Agua estéril, DMSO) y
control de antimicrobianos por triplicado, esto se incubó en una estufa por 24
horas a 37°C.
2.8 Descripción del procedimiento metodológico para el desarrollo de la investigación
Para el presente estudio, se obtuvo un extracto etanólico a partir de las hojas
de plantas frescas de C. citratus. Este extracto se caracterizó en lo referente a
los grupos químico incluidos en el mismo. Finalmente, el extracto fue probado
en ensayos in vitro frente a S. aureus y E. coli por triplicado y en ensayos diferentes con el objetivo de ganar robustez estadística y obtener datos fiables.
Como controles se usaron DMSO, Clorhexidina y agua bidetilada estéril.
El diseño experimental de esta investigación conlleva observar el efecto del
extracto bruto etanólico de C. citratus sobre S. aureus y E. coli en diluciones prestablecidas de 25%, 50%, 75% y 100%. Para realizar el análisis estadístico
de los datos, se aplicó ANOVA de una sola vía con ajuste de Bonferroni para
24
extracto. Un análisis de ANOVA de dos vías se aplicó para establecer las
diferencias entre tratamientos con un ajuste de prueba de Tukey. La
significancia, se reportó con un intervalo de confianza del 95% y significancia
estadística menor o igual a 0.05. Para realizar estos cálculos, se empleó los
programas estadísticos SPSS 13.0 y Graphpad Prism 7 con software bajo
licencia institucional.
2.9 Análisis de resultados obtenidos en el estudio. 2.9.1 Estudio etnofarmacológico
Tabla 3. Datos obtenidos a partir de las encuestas aplicadas a la población de estudio involucrada en la investigación. Se expresa los valores numéricos y porcentuales.
Planta
Veces citadas por encuestados
(n=332)
IVU UST (%) RVU
Manzanilla 61 1,00 69,3 13,4
Orégano 39 1,00 44,3 8,6
Menta 38 1,00 43,2 8,4
Toronjil 31 1,00 35,2 6,8
Hierba Luisa 30 1,00 34,1 6,6
Ortiga 20 1,00 22,7 4,4
Limoncillo 19 1,00 21,6 4,2
Alfalfa 16 1,00 18,2 3,5
Eucalipto 16 1,00 18,2 3,5
Sábila 14 1,00 15,9 3,1
Llanten 13 1,00 14,8 2,9
Apio 12 1,00 13,6 2,6
Hinojo 12 1,00 13,6 2,6
Cedrón 10 1,00 11,4 2,2
Hierba Buena 10 1,00 11,4 2,2
Perejil 10 1,00 11,4 2,2
Matico 8 1,00 9,1 1,8
Tilo 8 1,00 9,1 1,8
Valeriana 8 1,00 9,1 1,8
Caballo Chupa 7 1,00 8,0 1,5
Malva 6 1,00 6,8 1,3
25
Borraja 4 1,00 4,5 0,9
Canela 4 1,00 4,5 0,9
Cola de Caballo 4 1,00 4,5 0,9
Hierba Mora 4 1,00 4,5 0,9
Paico 4 1,00 4,5 0,9
Romero 4 1,00 4,5 0,9
Tomillo 4 1,00 4,5 0,9
Tuna 4 1,00 4,5 0,9
Yutuyuyu 4 1,00 4,5 0,9
Casamarucha 2 1,00 2,3 0,4
Cuyuya 2 1,00 2,3 0,4
Diente de León 2 1,00 2,3 0,4
Hojas de Manzana 2 1,00 2,3 0,4
Jengibre 2 1,00 2,3 0,4
Mincuyu 2 1,00 2,3 0,4
Pataconyuyo 2 1,00 2,3 0,4
Salve Real 2 1,00 2,3 0,4
Sango Raiba 2 1,00 2,3 0,4
Sangoracha 2 1,00 2,3 0,4
Taraxaco 2 1,00 2,3 0,4
Tipo 2 1,00 2,3 0,4
Ilustración 2. Cuadro comparativo de porcentaje de uso de especies vegetales en población de estudio. Se ordena de mayor a menor uso y se expresa en tasa porcentual. Se destaca (color verde) la especie implicada en la presente investigación. 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 P o rc enta je Especie vegetal
26
2.9.2 Caracterización fitoquímica del extracto de Cymbopogon citratus
Tabla 4. Determinación de compuestos químicos presentes en el extracto
alcohólico de Cymbopogon citratus mediantes los ensayos descritos en la tabla
2
Composición del Extracto Alcohólico
Cymbopogon citratus
(Resultado)
Catequinas Catequinas +
Resinas Resinas -
Baljet Lactonas y cumarinas +
Liebermann-Burchard Triterpenos y/o esteroides ++ FeCl3 (Cloruro Ferrico) Taninos +
Borntrager Quinonas -
Shinoda Flavonoides +
Dragendorff Alcaloides -
Mayer Alcaloides -
Wagner Alcaloides -
Espuma Saponinas -
Escala arbitraria: (+) Presencia baja; (++) Presencia media; (+++) Presencia alta; (-) Ausencia
Los resultados del tamizaje fitoquímico presentados en la Tabla 4, evidencia la
presencia de compuestos fenólicos, ya que al extraer sucesivamente la
muestra seca y triturada de Cymbopogon citratus con solventes de polaridad
creciente las pruebas de: Catequinas, Baljet, Liebermann-Burchard, Cloruro
férrico y Shinoda fueron positivas, dando mayor intensidad de respuesta en la
prueba de Liebermann- Burchard, lo que coincide con los reportes de la
composición fitoquímica de otras familias de Cymbopogon citratus, en donde
demuestran que los compuestos fenólicos son los metabolitos secundarios más
27
2.9.3 Evaluación de la actividad antimicrobiana
Para la determinación del efecto inhibidor de los compuestos del extracto
etanólico de Cymbopogon citratus se realizó diluciones al 25%, 50%, 75% y
100%. Se las probó sobre el crecimiento in vitro de Staphylococcus aureus y
Escherichia coli. Se comparó la susceptibilidad del Staphylococcus aureus y
Escherichia coli, frente al extracto etanólico, al control positivo (clorhexidina al 0.12%) y a los controles negativos que fueron agua destilada estéril y DMSO
(suprimir el sesgo del diluyente). Los resultados se muestran en la ilustración 4.
Ilustración 3. Efecto bactericida in vitro de C. citratus sobre S. aureus y E. coli.
Se llevaron a cabo corridas estadísticas para establecer las diferencias entre
tratamientos y las diferencias de cada tratamiento, versus el control positivo.
Los parámetros de los análisis para el ANOVA de doble vía (two-way ANOVA)
28
Tabla 5. Análisis por ANOVA de doble vía para los datos obtenidos en los experimentos.
Table Analyzed C, Citratus
Two-way ANOVA Ordinary
Alpha 0,05
Source of Variation % of total variation P value P value summary Significant?
Interaction 14,1 <0,0001 a **** Yes
Row Factor 10,57 <0,0001 a **** Yes Column Factor 72,41 <0,0001 a **** Yes
ANOVA table SS DF MS F (DFn, DFd) P value
Interaction 93,32 6 15,55 F (6, 42) = 33,93 P<0,0001 a
Row Factor 69,98 1 69,98 F (1, 42) = 152,7 P<0,0001 a
Column Factor 479,2 6 79,87 F (6, 42) = 174,3 P<0,0001 a
Residual 19,25 42 0,4583
a Diferencia estadísticamente significativa
Continuando con en análisis de datos, se procede a correr un ANOVA de una
sola vía de múltiples comparaciones con un ajuste de Bonferroni (Bonferroni's
multiple comparisons test), con un intervalo de confianza al 95% y una
significancia fijada en menor o igual a 0.05, con el objetivo de establecer
diferencias entre los tratamientos aplicados al cultivo in vitro de S. aureus. Los
resultados de las múltiples comparaciones se muestran en la Tabla 6 y la
Ilustración 4.
Tabla 6. Análisis de datos por la prueba de múltiple comparación de Sidak aplicada a los datos obtenidos a partir de los ensayos experimentales.
Sidak's multiple comparisons test Mean Diff, 95,00% CI of diff, Significant? Summary Adjusted P Value
Staphylococcus aureus
Water vs. DMSO 0 -1,322 to 1,322 No ns >0,9999
Water vs. T1 (25%) -3,9 -5,222 to -2,578 Yes **** <0,0001
Water vs. T2 (50%) -4,9 -6,222 to -3,578 Yes **** <0,0001 Water vs. T3 (75%) -5,9 -7,222 to -4,578 Yes **** <0,0001
Water vs. T4 (100%) -7,9 -9,222 to -6,578 Yes **** <0,0001
Water vs. A.E. -9,65 -10,97 to -8,328 Yes **** <0,0001 Escherichia coli
Water vs. DMSO 0 -1,322 to 1,322 No ns >0,9999
Water vs. T1 (25%) 0 -1,322 to 1,322 No ns >0,9999
Water vs. T2 (50%) -0,4 -1,722 to 0,9216 No ns 0,9570
Water vs. T3 (75%) -5,15 -6,472 to -3,828 Yes **** <0,0001 Water vs. T4 (100%) -8,15 -9,472 to -6,828 Yes **** <0,0001
Water vs. A.E. -2,9 -4,222 to -1,578 Yes **** <0,0001
Finalmente, se evaluó las diferencias entre los tratamientos (Sidaki's multiple comparisons test), así como el porcentaje del efecto inhibitorio del extracto
29
Tabla 7. En base a los resultados obtenidos se infiere que existe diferencia
entre cada uno de los tratamientos, a excepción de la comparación entre el
tratamiento T1 vs. T2, T1 vs. T3, T2 vs. T3, T3 vs. T4 y T4 vs. A.E. En base a
los datos analizados se establece que la concentración del extracto está
directamente relacionada y es proporcional al efecto encontrado en el estudio.
Tabla 7. Comparación de tratamientos aplicados al cultivo in vitro de S. aureus
y E. coli mediante la prueba de múltiple comparación de Sidak aplicada a los datos obtenidos a partir de los ensayos experimentales.
Sidak's multiple comparisons test Mean Diff, 95,00% CI of diff, Significant? Summary Adjusted P Value
Staphylococcus aureus
DMSO vs. W ater 0 -1,544 to 1,544 No Ns >0,9999
DMSO vs. T1 (25%) -3,9 -5,444 to -2,356 Yes **** <0,0001 a
DMSO vs. T2 (50%) -4,9 -6,444 to -3,356 Yes **** <0,0001 a
DMSO vs. T3 (75%) -5,9 -7,444 to -4,356 Yes **** <0,0001 a
DMSO vs. T4 (100%) -7,9 -9,444 to -6,356 Yes **** <0,0001 a
DMSO vs. A.E. -9,65 -11,19 to -8,106 Yes **** <0,0001 a
Water vs. T1 (25%) -3,9 -5,444 to -2,356 Yes **** <0,0001 a
Water vs. T2 (50%) -4,9 -6,444 to -3,356 Yes **** <0,0001 a
Water vs. T3 (75%) -5,9 -7,444 to -4,356 Yes **** <0,0001 a
Water vs. T4 (100%) -7,9 -9,444 to -6,356 Yes **** <0,0001 a
Water vs. A.E. -9,65 -11,19 to -8,106 Yes **** <0,0001 a
T1 (25%) vs. T2 (50%) -1 -2,544 to 0,5439 No Ns 0,6010
T1 (25%) vs. T3 (75%) -2 -3,544 to -0,4561 Yes ** 0,0031 a
T1 (25%) vs. T4 (100%) -4 -5,544 to -2,456 Yes **** <0,0001 a
T1 (25%) vs. A.E. -5,75 -7,294 to -4,206 Yes **** <0,0001 a
T2 (50%) vs. T3 (75%) -1 -2,544 to 0,5439 No Ns 0,6010
T2 (50%) vs. T4 (100%) -3 -4,544 to -1,456 Yes **** <0,0001 a
T2 (50%) vs. A.E. -4,75 -6,294 to -3,206 Yes **** <0,0001 a
T3 (75%) vs. T4 (100%) -2 -3,544 to -0,4561 Yes ** 0,0031 a
T3 (75%) vs. A.E. -3,75 -5,294 to -2,206 Yes **** <0,0001 a
T4 (100%) vs. A.E. -1,75 -3,294 to -0,2061 Yes * 0,0148 a
Escherichia coli
DMSO vs. W ater 0 -1,544 to 1,544 No Ns >0,9999
DMSO vs. T1 (25%) 0 -1,544 to 1,544 No Ns >0,9999
DMSO vs. T2 (50%) -0,4 -1,944 to 1,144 No Ns >0,9999
DMSO vs. T3 (75%) -5,15 -6,694 to -3,606 Yes **** <0,0001 a
DMSO vs. T4 (100%) -8,15 -9,694 to -6,606 Yes **** <0,0001 a
DMSO vs. A.E. -2,9 -4,444 to -1,356 Yes **** <0,0001 a
Water vs. T1 (25%) 0 -1,544 to 1,544 No Ns >0,9999
Water vs. T2 (50%) -0,4 -1,944 to 1,144 No Ns >0,9999
Water vs. T3 (75%) -5,15 -6,694 to -3,606 Yes **** <0,0001 a
Water vs. T4 (100%) -8,15 -9,694 to -6,606 Yes **** <0,0001 a
Water vs. A.E. -2,9 -4,444 to -1,356 Yes **** <0,0001 a
T1 (25%) vs. T2 (50%) -0,4 -1,944 to 1,144 No Ns >0,9999
T1 (25%) vs. T3 (75%) -5,15 -6,694 to -3,606 Yes **** <0,0001 a T1 (25%) vs. T4 (100%) -8,15 -9,694 to -6,606 Yes **** <0,0001 a
T1 (25%) vs. A.E. -2,9 -4,444 to -1,356 Yes **** <0,0001 a
T2 (50%) vs. T3 (75%) -4,75 -6,294 to -3,206 Yes **** <0,0001 a T2 (50%) vs. T4 (100%) -7,75 -9,294 to -6,206 Yes **** <0,0001 a
T2 (50%) vs. A.E. -2,5 -4,044 to -0,9561 Yes *** 0,0001
T3 (75%) vs. T4 (100%) -3 -4,544 to -1,456 Yes **** <0,0001 a
T3 (75%) vs. A.E. 2,25 0,7061 to 3,794 Yes *** 0,0006
T4 (100%) vs. A.E. 5,25 3,706 to 6,794 Yes **** <0,0001 a