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Evaluación de la actividad antimicrobiana de Cymbopogon citratus frente a cepas de Staphilococus Aureus y Escherichia Coli

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(1)

UNIVERSIDAD REGIONAL AUTÓNOMA DE LOS ANDES “UNIANDES”

FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS

PROGRAMA DE MAESTRÍA EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL GRADO ACADÉMICO DE MAGISTER EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA

TEMA:

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE Cymbopogon

Citratus FRENTE A CEPAS DE Staphylococcus Aureus y Escherichia Coli

AUTOR: BQF. MENDOZA BUÑAY ALEX FERNANDO

TUTORES: ING. OÑA CISNEROS FABIÁN DAVID, MSC. PHD(C) DR. VITERI RODRÍGUEZ JUAN ALBERTO, MSC.

(2)

APROBACIÓN DE LOS TUTORES DEL TRABAJO DE TITULACIÓN

CERTIFICACIÓN:

Quienes suscriben, legalmente CERTIFICAN QUE: El presente Trabajo de

Titulación realizado por el señor Mendoza Buñay Alex Fernando, maestrante

del Programa de Maestría en Farmacia Clínica y Hospitalaria, Facultad de

Ciencias Médicas, con el tema “Evaluación de la actividad antimicrobiana

de Cymbopogon Citratus frente a cepas de Staphylococcus aureus y

Escherichia coli”, ha sido prolijamente revisado, y cumple con todos los

requisitos establecidos en la normativa pertinente de la Universidad Regional

Autónoma de los Andes UNIANDES, por lo que se aprueba su presentación.

Ambato, abril del 2018

Ing. Oña Cisneros Fabián David, MSc. PhD (C)

TUTOR

Dr. Viteri Rodríguez Juan Alberto, MSc.

(3)

DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD

Yo, Mendoza Buñay Alex Fernando, maestrante del Programa de Maestría de Farmacia Clínica y Hospitalaria, Facultad de Ciencias Médicas, declaro que

todos los resultados obtenidos en el presente trabajo de investigación, previo a

la obtención del Grado Académico de MAGÍSTER EN FARMACIA CLÍNICA Y

HOSPITALARIA, son absolutamente originales, auténticos y personales; a excepción de las citas, por lo que son de mi exclusiva responsabilidad.

Ambato, abril del 2018

______________________________

BQF. Mendoza Buñay Alex Fernando

CI. 060332230-6

(4)

DERECHOS DE AUTOR

Yo, Mendoza Buñay Alex Fernando, declaro que conozco y acepto la disposición constante en el literal d) del Art. 85 del Estatuto de la Universidad

Regional Autónoma de los Andes, que en su parte pertinente dice: El

patrimonio de la UNIANDES está constituido por…”La propiedad intelectual

sobre las Investigaciones, trabajos científicos o técnicos, proyectos profesionales y consultoría que se realicen en la Universidad o por cuenta de ella...

Ambato, abril del 2018

______________________________

BQF. Mendoza Buñay Alex Fernando

CI. 060332230-6

(5)

INDICE GENERAL

PORTADA

APROBACIÓN DE LOS TUTORES DEL TRABAJO DE TITULACIÓN

DECLARACIÓN DE AUTENTICIDAD

DERECHOS DE AUTOR

INDICE GENERAL

RESUMEN

ABSTRACT

INTRODUCCIÓN ... 1

ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACIÓN ... 1

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ... 2

FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ... 3

OBJETO DE LA INVESTIGACIÓN ... 4

CAMPO DE ACCIÓN ... 4

IDENTIFICACIÓN DE LA LÍNEA DE INVESTIGACIÓN ... 4

OBJETIVO GENERAL... 4

OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 4

IDEA A DEFENDER ... 5

APORTE TEÓRICO, SIGNIFICACIÓN PRÁCTICA Y NOVEDAD CIENTÍFICA ... 5

CAPÍTULO I. ... 7

1 MARCO TEÓRICO ... 7

1.1 ORIGEN Y EVOLUCIÓN DEL OBJETO DE INVESTIGACIÓN ... 7

1.2 USO DE LAS PLANTAS MEDICINALES... 7

1.3 ESTUDIOS ETNOBOTÁNICOS Y ETNOFARMACOLÓGICOS ... 8

1.4 CYMBOPOGON CITRATUS ... 8

(6)

1.4.2 Actividad Antimicrobiana ... 10

1.5 EXTRACCIÓN DE PRINCIPIOS ACTIVOS ... 11

1.5.1 Métodos De Extracción En Fitoquímica ... 11

1.5.2 Extracción sólido-líquido ... 11

1.5.3 Maceración ... 12

1.5.4 Percolación o lixiviación ... 12

1.5.5 Extracción líquido-líquido ... 12

1.5.6 Extracto alcohólico ... 13

1.5.7 Extracto acuoso... 13

1.5.8 Compuestos fenólicos ... 14

1.5.9 Análisis de fenoles totales. ... 14

CAPÍTULO II. ... 18

2 MARCO METODOLÓGICO ... 18

2.1 DESCRIPCIÓN DEL ÁREA DE ESTUDIO ... 18

2.2 TRABAJO DE CAMPO ... 18

2.3 ANÁLISIS DE DATOS ETNOBOTÁNICOS ... 19

2.4 ÍNDICE DE VALOR DE USO DE ESPECIES... 19

2.5 OBTENCIÓN DEL EXTRACTO ... 21

2.5.1 Acondicionamiento ... 21

2.6 IDENTIFICACIÓN DE LA COMPOSICIÓN FITOQUÍMICA DEL EXTRACTO DEL CYMBOPOGON CITRATUS ... 22

2.7 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL EXTRACTO DE CYMBOPOGON CITRATUS ... 23

2.7.1 Ensayo antimicrobiano- Método de difusión de discos ... 23

2.8 DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO METODOLÓGICO PARA EL DESARROLLO DE LA INVESTIGACIÓN ... 23

2.9 ANÁLISIS DE RESULTADOS OBTENIDOS EN EL ESTUDIO. ... 24

(7)

2.9.2 Caracterización fitoquímica del extracto de Cymbopogon citratus . 26

2.9.3 Evaluación de la actividad antimicrobiana ... 27

CAPÍTULO III. ... 30

3 DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS. ... 30

CONCLUSIONES ... 34

RECOMENDACIONES ... 35

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

(8)

RESUMEN

Las propiedades demostradas por especies del género Poáceas se deben a su

composición química, basada principalmente en flavonoides, diterpenos y

triterpenos. Éste género ha sido objeto de numerosos estudios fitoquímicos y

de actividad biológica. El presente trabajo evaluó la actividad antimicrobiana in

vitro del extracto etanólico y aceite esencial de Cymbopogon citratus sobre

cepas de Staphylococcus aureus y Escherichia coli mediante la técnica de

difusión de disco en agar. Se evaluaron cuatro concentraciones del extracto

etanólico al 25%, 50%, 75% y 100% así como el aceite esencial al 100% y

agua bidestilada estéril como control negativo. Se realizó la lectura de los halos

de inhibición a las 24 horas de incubada la muestra. Como resultado se

encontró que los extractos etanólicos de Cymbopogon citratus presentaron

actividad antimicrobiana contra Staphylococcus aureus (25%, HI promedio= 4.0

mm; 50% HI promedio= 5.0 mm: 75% HI promedio= 6.0 mm; 100% HI

promedio= 8.0 mm; A.E.: 9.7) y Escherichia coli (50%, HI promedio= 0.5 mm;

75% HI promedio= 5.2 mm; 100% HI promedio= 8.2 mm; A.E. HI promedio= 3.0

mm). Se estableció que la actividad bactericida aumenta de forma proporcional

a la concentración del extracto y que el efecto del aceite esencial es superior al

extracto alcohólico sobre Staphylococcus aureus (p0.001). En conclusión,

existe un efecto bactericida mostrado por el extracto bruto etanólico y aceite

esencial de Cymbopogon citratus sobre Staphylococcus aureus y Escherichia

coli. Estudios posteriores son necesarios para elucidar su efecto in vivo y

evaluar su toxicidad.

Palabras clave: Cymbopogon citratus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli

(9)

ABSTRACT

The properties evidenced in different species of the genus Poáceas are based

on their chemical composition (flavonoids, diterpenes and triterpenes).

Numerous research studies have been conducted to understand the

phytochemical properties as well as the biological activity of this genus.

This project analyzed the in vitro antimicrobial activity of the ethanolic extract

and the Cymbopogon citratus essential oil on strains of Staphylococcus aureus

and Escherichia coli, using the agar diffusion testing method.

Four different concentrations of ethanolic extract were evaluated (25%, 50%,

75%, 100%), essential oil (100%), and sterile, distilled water as negative

control. After 24 hours of incubation, the zones of inhibition were analyzed and

it was observed that the ethanolic extracts of Cymbopogon citratus had the

following antimicrobial activity against Staphylococcus aureus: 25%, Average

HI: 4.0 mm; 50%, Average HI: 5.0 mm; 75%, Average HI: 6.0 mm; 100%,

Average HI: 8.0 mm; E.O.: 9.7 mm. The antimicrobial activity against

Escherichia coli was: 50%, Average HI: 0.5 mm; 75%, Average HI: 5.2 mm;

100%, Average HI: 8.2 mm; E.O.: 3.0 mm.

It was established that the bactericidal activity increases proportionally to the

concentration of the extract and that the effects of the essential oil against the

strains of Staphylococcus aureus were higher (p<0.001).

As a conclusion, it was found that both raw ethanolic extract and Cymbopogon

citratus essential oil have bactericidal effects against Staphylococcus aureus

and Escherichia coli. However, further research is required to elucidate the in

vitro effects and to evaluate toxicity.

(10)

1

INTRODUCCIÓN

Antecedentes de la investigación

La medicina tradicional ha sido transferida de generación en generación desde

tiempos inmemoriales, la cual se fundamenta en la actividad curativa de una

gran variedad de plantas. A pesar de los avances en la producción de la

medicina moderna, las plantas medicinales no han perdido su importancia; por

el contrario, el desarrollo de los medicamentos modernos ha sido resultado de

las distintas formas de aprovechar las plantas medicinales. La producción de

nuevos medicamentos requiere obligatoriamente la exploración de nuevos

moléculas con actividad biológica que son obtenidas de la variedad de

especies vegetales (1). El uso de plantas con propiedades curativas ha

aumentado en todo el mundo debido a su presunta eficacia. Aproximadamente

el 80% de la población general, especialmente en los países en desarrollo,

utiliza las hierbas medicinales para la atención primaria de salud. (2-3). Por

esta razón constituyen alternativas importantes a la medicina convencional

para las comunidades pobres que habitan en áreas rurales y carecen de

acceso a los servicios de salud estatales y privados (4-5).

El Cymbopogon citratus, comúnmente conocida como hierba de limón, es una hierba tropical perenne con hojas delgadas y largas, cultivada

principalmente en regiones tropicales y subtropicales de América del Sur.

Esta especie, ha sido ampliamente reconocida por su utilidad etnobotánica y

medicinal. (6-7). Investigaciones recientes han demostrado que diversos

compuestos químicos de C. citratus poseen propiedades antibacterianas,

antifúngicas, analgésicas y repelentes (7), entre la composición química de

la planta podemos distinguir que existen los siguientes metabolitos

limoneno, citral, geraniol, sesquiterpenos, verbenona, aldehído y cetonas

(17). Uno de estos compuestos con actividad biológica es el

3,7-dimethyl-2,6-octadienal o también llamado citral que presenta la mayor parte de la

bioeficacia de la planta (8).

Varios estudios llevados a cabo con extractos acuosos y alcohólicos de las

(11)

2

Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans y Escherichia coli, así como

frente al hongo Candida albicans, mostraron actividad bacteriostática y

bactericida en los cultivos de los cuatro especies nombradas (9 -10).

Investigaciones realizadas en América Latina en las cuales se utilizó el

extracto de aceite esencial de C. citratus, para la elaboración de cremas,

verificando la actividad antimicrobiana contra cepas de hongos y bacterias,

demostrándose que existe inhibición del crecimiento antimicrobiano

relacionada con la presencia del citral principal componente de la planta C.

citratus (18).

Otras investigaciones indican que existe una mayor actividad antimicrobiana

en el aceite esencial del C. citratus en comparación con el extracto

hidroalcohólico, en las cuales se evidencio que las bacterias presentaban

menor crecimiento cuando eran expuestas al extracto hidroalcohólico razón

por la cual el extracto del aceite esencial es una mejor técnica para la

extracción de los principios activos, de la misma manera otros

investigadores han propuesto que existe variación entre las partes de la

planta ya que los mismos extractos obtenidos de dichas partes presentan

diferentes actividades antimicrobianas cuando son empleados para el

control de las bacterias (19-20).

Planteamiento del Problema

De acuerdo a la Organización Mundial de la Salud la aparición de resistencia a

los antimicrobianos entre los microbios patógenos y oportunistas representa un

problema grave y recurrente para el tratamiento de las infecciones (11),

constituyendo uno de los mayores problemas de la Salud Pública Mundial,

porque incrementa la propagación de enfermedades infecciosas causadas por

microorganismos multiresistentes a los antimicrobianos, y generando una

necesidad constante del desarrollo de nuevos fármacos para tratar dichas

patologías (12).

Las infecciones causadas por microorganismos multiresistentes se asocian con

(12)

3

aumento en la mortalidad y un incremento en los costos derivados de la

atención clínica que amenaza la sostenibilidad de cualquier sistema de salud.

De este tipo de microorganismos el Staphylococcus aureus y la Escherichia coli

son dos ejemplos representativos de patógenos más importantes (13). El

Staphylococcus aureus es un coco gram positivo con capacidad patógena para causar enfermedades tanto adquiridas en la comunidad como nosocomiales

que van desde infecciones leves de la piel hasta enfermedades graves, como

endocarditis, neumonía, sepsis y síndrome de shock tóxico (14). Esta bacteria

desarrollo resistencia a la meticilina ocasionando que los pacientes infectados

incrementen su probabilidad de morir en un 64% (15).

La Escherichia coli es un bacilo gram negativo que se desarrolla como un organismo comensal del tracto gastrointestinal de humanos y muchos

animales. Algunas cepas patógenas causan enfermedades diarreicas, mientras

que otras causan infecciones extraintestinales siendo la principal causa de

infecciones del tracto urinario, ya sea nosocomial o adquirida en la

comunidad (16). E. coli desarrollo resistencia a las fluoroquinolonas un

medicamento de amplio uso en el tratamiento de las infecciones urinarias (15).

En referencia a lo expuesto, a través del presente estudio, se pretende aportar

a la exploración e investigación de la actividad biológica del extracto de C. citratus frente cepas de S. aureus y E. coli, con el propósito de lograr una alternativa terapéutica a las patologías causadas por los citados patógenos.

El objetivo de esta investigación es demostrar la actividad antimicrobiana del

extracto hidroalcóholico y el aceite esencial del C. citratus contra las cepas de

S. aureus y E. coli, mediante la experimentación en un cultivo in vitro

controlado.

Formulación del problema

¿Presenta actividad antimicrobiana el extracto y el aceite del Cymbopogon

(13)

4

Objeto de la investigación

Actividad antimicrobiana del extracto y aceite del Cymbopogon citratus

(Limoncillo).

Campo de acción

Actividad antimicrobiana del extracto y aceite del Cymbopogon citratus

(Limoncillo)contra las cepas de Staphylococcus aureus y de Escherichia coli.

Identificación de la línea de investigación

Estudios microbiológicos.

Objetivo general

Evaluar la actividad antimicrobiana del extracto hidroalcólico y aceite del

Cymbopogon citratus frente a cepas de Staphylococcus aureus y de

Escherichia coli.

Objetivos específicos

 Obtener el aceite esencial del Cymbopogon citratus.

 Obtener el extracto hidroalcohólico del Cymbopogon citratus.

 Realizar el tamizaje fitoquímico del extracto y del aceite del Cymbopogon

citratus.

 Probar la actividad antimicrobiana del extracto y el aceite frente a cepas de

(14)

5

Idea a defender

El aceite esencial y el extracto hidroalcohólico del Cymbopogon citratus

presenta actividad antimicrobiana en contra de las cepas de Staphylococcus

aureus y de Escherichia coli

Aporte teórico, significación práctica y novedad científica

En el caso de las bacterias se ha evidenciado un pronunciado desarrollo de

varias cepas con resistencia antimicrobiana a la gran mayoría de

antimicrobianos existentes en la actualidad, lo que ha incrementado la

mortalidad de la población por falta de nuevas alternativas farmacoterapéuticas

para el tratamiento de las patologías causadas por dichos microorganismos,

esta investigación promoverá el uso de las plantas como fuente

complementaria al tratamiento clínico de enfermedades causadas por

microorganismos resistentes. A partir de la presente propuesta de estudio se

pretende evaluar la actividad antimicrobiana del extracto hidroalcohólico del

Cymbopogon citratus frente a las cepas de Staphylococcus aureus, causantes

de infecciones de la piel, osteomielitis, neumonía y cepas de Escherichia coli,

causantes de diarreas, infecciones urinarias y meningitis; fortaleciendo de esta

manera, las investigaciones ya existentes sobre la capacidad que tiene el

extracto del Cymbopogon citratus para inhibir el desarrollo de estas bacterias. De obtenerse resultados positivos en cuanto a actividad bacteriostática y

bactericida se habrá aportado a la evidencia científica que respalda su uso

como potenciales vías de tratamiento con aplicación clínica a futuro.

La planta de Cymbopogon citratus es originaria de la India y Malasia, en el Ecuador se encuentra distribuida en tres de las cuatro regiones naturales del

Ecuador, principalmente en el sur del país, esta planta crece a una

determinada altura de dos metros de alto, con hojas de entre 20 y 100 cm de

longitud y 1,5 cm generalmente de ancho. Cymbopogon citratus es una

alternativa más saludable, de la cual no se han reportado efectos secundarios a

más de ser una opción más económica a comparación del alto costo en la

(15)

6

las enfermedades causadas por estas bacterias. Por esta razón dentro del

ámbito de estudio de la actividad antimicrobiana del Cymbopogon citratus

frente a cepas de Staphylococcus aureus y Escherichia coli existen varias

investigaciones sobre este tema mencionando las realizadas por Okigbo RN y

Mmeka EC, entre otros, los cuales realizaron dichos estudios en el extranjero.

En nuestro mayor esfuerzo de búsqueda de evidencia científica sobre estudios

de Cymbopogon citratus en Ecuador, no se han encontrado datos ni artículos científicos publicados; lo que faculta a la presente propuesta como la primera

en ser llevada a cabo a nivel nacional con la premisa de abrir una nueva arista

de investigación dentro de la línea de la exploración de fitofármacos en la que

se busca promover el interés científico de la comunidad para la búsqueda de

nuevas alternativas más amigables para mantener una adecuada salud y que

sirva de fuente de información para el desarrollo de futuras investigaciones

(16)

7

CAPÍTULO I.

1 MARCO TEÓRICO

1.1 Origen y evolución del objeto de Investigación

El uso de prácticas de salud complementarias es tan antiguo como la aparición

de la especie humana, porque desde el principio de la civilización son parte de

las prácticas de atención familiar y comunitaria. Entre las distintas prácticas

complementarias utilizadas y difundidas a través de la cultura popular, las

plantas medicinales siempre ocupan lugar destacado y durante mucho tiempo

fue el principal recurso terapéutico utilizado para tratar la salud de las personas

y sus familias (21).

Los mercados tradicionales en el sur de Ecuador y dentro de la región andina

son especialmente importantes para el comercio de recursos vegetales entre la

población local, incluso antes de la colonización española; por lo tanto, los

estudios etnobotánicos son actualmente necesarios e importantes. Estos

espacios estratégicos persisten para el valor cultural de la medicina tradicional

reflejado en el mayor consumo de plantas medicinales, que abarcan todos los

niveles socioeconómicos de la población rural y urbana (22).

1.2 Uso de las plantas medicinales

El uso de las plantas medicinales es común en los países a nivel mundial,

aunque gran parte de ella desconoce muchas de sus propiedades, formas de

empleo y modos de aplicación. Para avanzar en el conocimiento de la gestión

tradicional de los recursos naturales de origen vegetal y de las relaciones entre

las sociedades humanas y las plantas, se realizan estudios etnobotánicos que

son de gran relevancia en los últimos años, ya que varias compañías

farmacéuticas están interesadas en las plantas como un gran potencial, para la

obtención de fármacos de origen natural que son útiles en el tratamiento de las

(17)

8

1.3 Estudios Etnobotánicos y Etnofarmacológicos

La Etnobotánica trata del estudio de las relaciones existentes entre los

vegetales y la especie humana. Por un sesgo metodológico y conceptual,

desde su origen, la etnobotánica se ha centrado en los pueblos indígenas, las

sociedades iletradas. Sin embargo, se ha demostrado repetidas veces que el

conocimiento y práctica popular referidos a las plantas pueden ser también

investigados en las sociedades más complejas. Por otra parte, la

Etnofarmacología es definida como la exploración científica interdisciplinaria de

los agentes biológicamente activos y tradicionalmente empleados o conocidos

por el hombre (24).

1.4 Cymbopogon citratus

Entre varias especies con propiedades medicinales, Cymbopogon citratus

(Poaceae), una especie popularmente conocida como "hierba de limón",

muestra un número infinito de aplicaciones y es popularmente utilizado por

personas en muchos países. En Brasil, por ejemplo, el té, la infusión y los

extractos de C. citratus, que se preparan con hojas frescas o secas, se usan a

menudo en la medicina popular como un medicamento reconstituyente,

digestivo, antitusia y eficaz contra los resfriados, con una analgésico,

antihermético, anticardiopático, antitérmico, antiinflamatorio de los conductos

urinarios, efecto diurético, y antiespasmódico (25) (Negrelle y Gomes 2007).

Además, los extractos de hierba de limón y sus aceites esenciales también se

usan en las industrias de alimentos (aromatizantes), perfumes y cosméticos, y

este uso tiene una importancia económica razonable en varios países (26)

(Oliveira et al., 1997).

Como consecuencia de innumerables aplicaciones de C. citratus, se han

realizado varios estudios con el objetivo de ampliar el conocimiento sobre la

composición química de las hojas de hierba de limón, que son las partes

utilizadas con fines medicinales. Estos estudios han revelado que, aunque la

(18)

9

varía de acuerdo con el origen geográfico, las sustancias aisladas e

identificadas de las hojas son principalmente alcaloides, saponina, asitosterol,

terpenos, alcoholes, cetona, flavonoides, ácido clorogénico, ácido cafeico,

ácido cumárico y azúcares (25, 26).

Aunque los extractos de plantas de hierba de limón se han utilizado

ampliamente en la medicina popular, la investigación científica ha encontrado

alguna sustancia potencialmente tóxica en esta especie. Se observaron efectos

hepatotóxicos y nefrotóxicos en ratones tratados con extractos líquidos de C.

citratus (30% y 80%) (27) (Guerra et al., 2000), lo que indica la necesidad de una investigación más detallada sobre su citotoxicidad (27).

1.4.1 Actividad Biológica

Como se ha mencionado en apartados anteriores, C. citratus es una planta

herbácea, pertenece a la familia Poaceae, que se cultiva en varios países

especialmente por sus aceites esenciales y por uno de sus constituyentes

principales que es el citral, el cual es usado como materia prima para la síntesis

de compuestos aromáticos y vitamina A (28). En Colombia el C. citratus está

adaptado a los diversos pisos climáticos, es frecuente encontrarlo en avenidas

y jardines familiares como planta ornamental y medicinal. De forma general, el

C. citratus se usa como anticatarral, febrífugo, antitusivo, estomáquico,

carminativo, expectorante y ansiolítico, para aliviar el vómito, antiespasmódico,

antitusivo, analgésico, antipirético, como depresor del sistema nervioso central y para disminuir el colesterol. Se reporta también como antipalúdico, diaforético

y estimulante, diurético y en el control de la presión arterial (25, 28).

A través de análisis por cromatografía de gases (CG/EM) se identificaron 18

compuestos que representan el 97.4% de los constituyentes del aceite

esencial. Los componentes mayoritarios identificados fueron los monoterpenos

geranial (41.8%) y neral (34.9%), los cuales constituyen una mezcla de

esteroisomeros conocida como citral, siendo este el 76.7% del aceite obtenido.

(19)

10

investigación química del aceite esencial de hojas de C. citratus, colectado en

el Distrito de Santa Marta revela una alta concentración de monoterpenos

(94.3%), estos datos son consistentes con los reportados en la literatura

científica (28).

Tabla 1. Cantidad relativa (%) de los componente presentes en el aceite

esencial de C. citratus, determinada por CG-EM. Adaptado de (29)

No. Pico Tr (min) Identificación Cantidad Relativa (%) 1 19.47 6-metil-5-hepten-2-ona 0.9

2 19.68 Mirceno 0.6

3 24.33 Linalol 1.5

4 26.43 Trans-Crisantemal 0.3

5 27.49 Isogeranial 0.7

6 27.73 M 152 0.6

7 29.21 Nerol + Citronelol 1.5

8 29.81 Neral 34.9

9 30.11 Geraniol 10.1

10 30.87 Geranial 41.8

11 31.31 M+ 186 0.7

12 31.51 M+186 0.7

13 34.85 Acetato de geranilo 1.5

14 36.88 Trans-Cariofileno 0.2

15 37.12 Cis--Bergamotero 0.1

16 38.99 2-Tridecanona 0.2

17 43.19 Neo-intermedol 0.9

18 43.98 -Cadinol 0.2

19 44.37 Intermedeol 0.2

20 53.75 M+286

21 60.51 2,2’-Metilenbis[6-tert-butil-p-cresol] 1.5 22 62.85 Monoetilhexil ftalato 0.3

1.4.2 Actividad Antimicrobiana

A partir de varios estudios se ha descubierto que C. citratus posee propiedades

antidepresivas, antioxidantes, antisépticas, astringentes, bactericidas,

fungicidas, nerviosas y sedantes (29). Además, varios trabajos han informado

sobre la actividad antibacteriana del aceite esencial de C. citratus contra una amplia gama de organismos que comprenden microorganismos grampositivos

y gramnegativos, levaduras y hongos. En estos estudios se observó que los

(20)

11

gram negativos (31). Se encontró que el aceite de C. citratus es efectivo contra

Acinetobacter baumanii, Aeromonas veronii, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia y Salmonella enterica serotipo typhimurium.

1.5 Extracción de Principios Activos

1.5.1 Métodos De Extracción En Fitoquímica

Cuando se da inicio a un estudio fitoquímico se debe tener claro qué tipo de

metabolitos es posible determinar en la especie que está siendo estudiada, y

aún más en concreto, en la parte de la planta de la que se va a realizar el

extracto, ya que de estos factores depende el método de extracción que se

debe utilizar para el material vegetal. En la mayoría de los estudios se hace la

extracción del material vegetal seco y pulverizado para que se logre mayor

permeabilidad del solvente y por lo tanto se genere un mayor rendimiento en la

extracción debido a que, en la mayoría de los casos, los compuestos a estudiar

son parte del metabolismo secundario, permanecen sin descomponerse en la

estructura de la planta y no se volatilizan fácilmente. La polaridad de los

compuestos a extraer es un factor determinante en el tipo de solvente que se

debe emplear, por ende, si se quieren extraer mayoritariamente compuestos

como 45 esteroles, se debe utilizar un solvente como éter de petróleo,

cumarinas uno como hexano y alcaloides con uno como etanol y

posteriormente con un ácido diluido. La extracción con etanol es muy común ya

que con este se extraen sustancias de todas las polaridades, además este es

un solvente estable (poco reactivo) y económico, también se puede evaporar

fácilmente (32).

1.5.2 Extracción sólido-líquido

La extracción sólido líquido permite la extracción de un componente de interés

soluble de un sólido con el contacto con un disolvente, en fitoquímica la fase

portadora sólida sería el material vegetal, el soluto sería el extracto obtenido a

(21)

12

1.5.3 Maceración

El principio de la maceración consiste en la obtención de extractos, gracias al

duradero tiempo de contacto que el solvente debe tener con el material vegetal,

que debe estar pulverizado o molido para lograr una mayor superficie de

contacto con el solvente, este proceso es realizado a temperatura ambiente. Es

conveniente realizar agitaciones frecuentes para la homogenización del

procedimiento y así tratar de influenciar el rendimiento de la extracción, el

poder de extracción del solvente va disminuyendo a medida que pasa el tiempo

de contacto con el material vegetal; para la realización de este tipo de extractos

es conveniente la protección del recipiente de extracción de la luz solar, ya que

esta puede llegar a descomponer sustancias fotolábiles. Después de la

realización del extracto por medio de un filtrado es necesario lavar el material

vegetal restante con más solvente para la obtención del extracto total (33).

1.5.4 Percolación o lixiviación

Consiste en el paso del disolvente a temperatura ambiente sin la aplicación de

presión (solo por la acción de la gravedad), a través del material vegetal

finamente molido, el 46 hecho de que el solvente pase detenidamente por las

partículas del sólido hace que disuelva la mayor cantidad de metabolitos que le

es posible y debido a que es continua la adición de solvente se logra una

extracción muy efectiva utilizando esta técnica (31,34)

1.5.5 Extracción líquido-líquido

La extracción líquido-líquido, es un proceso de transferencia de una o varias

sustancias desde una fase líquida a otra líquida que es inmiscible con la

primera. Esto se debe al reparto que ocurre entre las dos fases de compuestos

de diversas polaridades. Generalmente una de las fases es acuosa, y la otra es

orgánica, esta última se denomina extractante ya que es el responsable de la

(22)

13

1.5.6 Extracto alcohólico

Método I (método de extracción caliente) - Transferir a un erlenmeyer con

tapón de vidrio aproximadamente 4 g, exactamente pesados, del material en

polvo grueso y secado al aire. Agregar 100 ml de alcohol y pesar el erlenmeyer.

Agitar y dejar en reposo durante 1 hora. Conectar un refrigerante al erlenmeyer

y calentar suavemente a ebullición durante 1 hora, enfriar y pesar. Ajustar

nuevamente al peso original mediante el agregado de alcohol. Agitar y filtrar

rápidamente a través de un filtro seco. Transferir 25 ml del filtrado a un

cristalizador y evaporar hasta sequedad en baño de agua. Secar a 105 °C

durante 6 horas, enfriar en un desecador durante 30 minutos y pesar

inmediatamente. Calcular el contenido, en mg por g, de materia extraíble en

alcohol en la muestra empleada (36).

Método II (método de extracción fría) - Transferir a un erlenmeyer con tapón de

vidrio aproximadamente 4 g, exactamente pesados, de material en polvo

grueso y secado al aire. Agregar 100 ml de alcohol, tapar el erlenmeyer y

macerar durante 24 horas, agitando frecuentemente durante las primeras 8

horas y luego dejar reposar. Filtrar rápidamente, tomando precauciones para

evitar la pérdida de alcohol. Evaporar 25 ml del filtrado hasta sequedad en un

cristalizador previamente pesado y secar a 105 °C hasta peso constante.

Calcular el contenido, en mg por g, de la materia extraíble en alcohol en la

muestra empleada (37).

1.5.7 Extracto acuoso

Método I (método de extracción caliente) - Proceder según se indica para el

Método I en Extracto alcohólico, excepto que se debe emplear agua en lugar

de alcohol (37).

Método II (método de extracción fría) - Proceder según se indica para el

Método II en Extracto alcohólico, excepto que se debe emplear agua en lugar

(23)

14

1.5.8 Compuestos fenólicos

Los compuestos fenólicos, entre los cuales se encuentran los flavonoides,

presentan una amplia ubicuidad en la naturaleza. Son responsables del buen

funcionamiento de las plantas y, en su relación con el hombre, son utilizados

para tratar desordenes cardiovasculares y prevenir algunos cánceres. Poseen

una estructura química adecuada para ejercer actividad antioxidante, la cual

está íntimamente relacionada con tales propiedades. Para su extracción se

utilizan solventes polares cuyo extracto posteriormente se concentra. Los

compuestos fenólicos constituyen una de las principales clases de metabolitos

secundarios de los vegetales, donde desempeñan diversas funciones

fisiológicas

Los flavonoides, uno de los dos grandes grupos de compuestos fenólicos junto

con los ácidos fenólicos, son un grupo extenso de compuestos derivados del benzo-γ-pirano. Dependiendo del grado de oxidación y de sustitución del anillo

pirano central pueden subdividirse en flavonas, flavonoles, flavononas,

isoflavonas, flavanos y antocianinas. Está comprobado que los flavonoides son

importantes para el desarrollo y buen funcionamiento de las plantas al

protegerlas contra agentes agresores externos, como la radiación UV,

microorganismos, animales herbívoros y del medio ambiente (38).

1.5.9 Análisis de fenoles totales.

La concentración de fenoles totales en extractos fue medida por

espectrofotometría, basándose en una reacción colorimétrica de

óxido-reducción. El agente oxidante utilizado fue el reactivo de Folin-Ciocalteu (38).

El ensayo Folin-Ciocalteu se utiliza como medida del contenido en compuestos

fenólicos totales en productos vegetales. Se basa en que los compuestos

fenólicos reaccionan con el reactivo de Folin-Ciocalteu, a pH básico, dando

lugar a una coloración azul susceptible de ser determinada

espectrofotométricamente a 765 nm. Este reactivo contiene una mezcla de

wolframato sódico y molibdato sódico en ácido fosfórico, y reacciona con los

(24)

15

(formado por las dos sales en el medio ácido), de color amarillo, al ser reducido

por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso (39).

El mecanismo de reacción es una reacción redox, por lo que además puede

considerarse también, como un método de medida de la actividad antioxidante

total. La oxidación de los polifenoles presentes en la muestra, causa la

aparición de una coloración azulada que presenta un máximo de absorción a

765 nm, y que se cuantifica por espectrofotometría en base a una recta patrón

Actividad Antimicrobiana y Resistencia

Durante varias décadas, la resistencia a los antimicrobianos (AMR) ha sido una

amenaza creciente para el tratamiento efectivo de una gama cada vez mayor

de infecciones causadas por bacterias, parásitos, virus y hongos. La RAM

produce una reducción de la eficacia de los fármacos antibacterianos,

antiparasitarios, antivirales y antimicóticos, lo que hace que el tratamiento de

los pacientes sea difícil, costoso o incluso imposible. El impacto en pacientes

particularmente vulnerables es más obvio, lo que resulta en una enfermedad

prolongada y una mayor mortalidad. La magnitud del problema en todo el

mundo y el impacto de la resistencia a los antimicrobianos en la salud humana,

y en los costos para el sector de la salud y el impacto social más amplio, aún

se desconocen en gran medida.

Se han intentado algunas estimaciones de los efectos económicos de la

resistencia a los antimicrobianos, y los hallazgos son inquietantes. Por ejemplo,

el costo anual solo para el sistema de salud de los EE. UU. Se ha estimado en

US $ 21 a $ 34 mil millones de dólares, acompañado por más de 8 millones de

días adicionales en el hospital. Debido a que AMR tiene efectos mucho más

allá del sector de la salud, se proyectó, hace casi 10 años, provocar una caída

en el producto interno bruto (PIB) del 0.4% al 1.6%, lo que se traduce en

muchos miles de millones de dólares actuales a nivel mundial. La resistencia a

los antimicrobianos es un desafío complejo para la salud pública mundial, y no

existe una estrategia única o simple que pueda contener por completo la

aparición y propagación de organismos infecciosos que se vuelven resistentes

a los antimicrobianos disponibles. El desarrollo de la resistencia a los

antimicrobianos es un fenómeno natural en los microorganismos y se ve

(25)

16

agentes antimicrobianos en humanos y animales. La falta actual de nuevos

antimicrobianos en el horizonte para reemplazar aquellos que se vuelven

inefectivos aumenta la urgencia de la necesidad de proteger la eficacia de los

medicamentos existentes (40).

El desarrollo e implementación de estrategias efectivas para reducir la

aparición y propagación de la RAM, y para evaluar el efecto de las

intervenciones para hacerlo, dependen de la recopilación de información

representativa precisa sobre el alcance del problema y su impacto. La OMS ha

promovido durante muchos años el monitoreo mundial de la resistencia a los

antimicrobianos y ha tomado medidas para concienciar sobre la inminente

crisis de salud pública que provocará.

Entre una serie de iniciativas de la OMS, en 2001 se publicó la Estrategia

mundial para la contención de la resistencia a los antimicrobianos, y la AMR fue

el tema central del Día Mundial de la Salud en 2011 cuando se emitió un

paquete de políticas AMR de 6 puntos. La Asamblea Mundial de la Salud, a

través de varias resoluciones a lo largo de los años, ha pedido una aplicación

más intensa de la estrategia global, destacando la necesidad de una vigilancia

reforzada de la resistencia a los antimicrobianos y una mayor capacidad de

laboratorio para llevarla a cabo y una reducción en el uso inapropiado de

antimicrobianos.

La capacidad de realizar pruebas de susceptibilidad antimicrobiana, que

pueden informar la vigilancia de la RAM, también está dentro del alcance del

Reglamento Sanitario Internacional, que estipula el requisito de acceso de los

Estados Partes a la capacidad de investigar cualquier brote de enfermedad que

pueda representar un amenaza internacional a la salud pública. Todavía

quedan muchas lagunas en los esfuerzos para contener la AMR. Muchos

diversos patógenos bacterianos, virales, fúngicos y parasitarios muestran

resistencia, y para algunas enfermedades específicas (por ejemplo,

tuberculosis [TB], VIH, gripe y malaria) existen programas que abordan la

resistencia, y muchas de las preocupaciones más inmediatas y urgentes se

relacionan a la resistencia a los antibióticos en las bacterias comunes. La

(26)

17

infecciones comunes y potencialmente mortales adquiridas en los hospitales y

en la comunidad, para las cuales el tratamiento es cada vez más difícil o, en

algunos casos, imposible.

A pesar de la importancia de estas infecciones, existen importantes lagunas en

la información sobre el alcance, la propagación, la evolución y el impacto de la

ABR. La urgencia se suma, en particular, a la falta de nuevas opciones

terapéuticas en la cartera de desarrollo para reemplazar aquellas que pierden

su eficacia a medida que las bacterias se vuelven resistentes a ellas. Por lo

tanto, el enfoque principal de este informe es sobre ABR, para lo cual el

(27)

18

CAPÍTULO II.

2 MARCO METODOLÓGICO

2.1 Descripción del área de estudio

La presente investigación se realizó en el área andina del cantón Cayambe, parroquia Cangahua, provincia de Pichincha – Ecuador; 0°02′38″N 78°09′22″O,

altitud de 3895 m.s.n.m. En el suroeste de la parroquia de Cangahua se

encuentra el volcán inactivo Pambamarca, en cuyo páramo a mediados del

segundo milenio se construyeron pucarás, posiblemente por lo indios caranquis

o por los incas.

2.2 Trabajo de campo

El estudio etnobotánico se llevó a cabo entre enero y marzo de 2018. La zona

de estudio se visitó con el fin de realizar conversaciones con habitantes de la

comunidad andina del cantón Cangahua para informarlos sobre los objetivos

del presente estudio. Para el tamaño de la muestra de informantes se empleó

la base de datos publicados en el Plan de Desarrollo y Ordenamiento (PD y

OT) de la parroquia de Cangahua en 2014 publicado por el Gobierno Autónomo

Descentralizado de la Parroquia de Cangahua.

En la población objeto de estudio se estratifico por grupos etarios y se tomó tan

solo a la población ubicada en los rangos quinquenales de 65 a 69, 70 a 74 y

75 a 79, que corresponden al grupo de adultos mayores según lo defino por le

Ministerio de Salud del Ecuador. La población obtenida a partir de la

estratificación fue de 665 individuos de los cuales, bajo autodefinición étnica,

558 (83.9%) correspondieron a la etnia indígena, 99 (14.9%) etnia mestiza, 4

(0.6%) etnia blanca, 2 (0.3%) etnia mulata y 2(0.2%) a la etnia

afrodescendiente.

La muestra población de estudio se estableció en 332 individuos que respetó la

proporción étnica encontrada en la población adulta mayor, resultado de la

estratificación inicial. Por tanto, el total de encuestas que se aplicó se

(28)

19

participar en el estudio se les aplicaron entrevistas semiestructuradas en las

que se indagó sobre las plantas empleadas para tratar alguna enfermedad, los

usos medicinales tradicionales, métodos de preparación, vía de administración

y partes de la planta que frecuentemente usan.

2.3 Análisis de datos etnobotánicos

La información etnobotánica proporcionada por los habitantes del área de

estudio, fue organizada en una base de datos empleando una hoja de cálculo

de Microsoft Office Excel 2011 bajo licencia personal. Los porcentajes y

frecuencias de las citaciones de las plantas medicinales asociadas a la

medicina tradicional, se utilizaron para el análisis etnobotánico. Se emplearon

tres índices para determinar la importancia de las diferentes especies

identificadas en el área de estudio.

2.4 Índice de valor de uso de especies

Este índice expresa la importancia o valor cultural de una especie determinada

para todos los informantes entrevistados. Para estimar el índice de valor de uso

general de cada especie para todos los informantes (IVUs) se utilizó la formula.

𝐼𝑉𝑈𝑠 =∑ 𝑖𝑉𝑈𝑖𝑠

𝑁𝑠

Dónde:

VUis = valor de uso de la especie por cada informante

Ns = es el nñumero de informantes para cada especie

Conocimiento relativo de la especie por varios informantes (RVU).

(29)

20 𝑅𝑉𝑈 =∑ 𝑉𝑈𝑖𝑠𝐼𝑉𝑈𝑠

𝑁𝑠𝑝

Dónde:

VUis = Valor de uso de la especie por cada informante

IVUs = Es el índice de valor de uso de la especie

Nsp = Es el número de especies

Nivel de uso significativo

Para estimar el nivel de uso significativo para cada especie y verificar su

aceptación cultural, se utilizó la siguiente ecuación. Esta metodología, expresa

que aquellos usos medicinales que son citados con una frecuencia superior o

igual al 20%, por las personas encuestadas que usan plantas como primer

recurso para un determinado problema de salud, pueden considerarse

signifcativos desde el punto de vista de su aceptaci´n cultural y, por tanto, se

consideran para investigaciones científicas.

𝑈𝑆𝑇 =𝑈𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑒 (𝑠)

𝑁𝑖𝑠 𝑋 100

Dónde:

Uso de especie (s) = Número de citaciones para cada especie

(30)

21

2.5 Obtención del extracto 2.5.1 Acondicionamiento

Las muestras de Cymbopogon citratus recolectadas cumplieron con los

procesos de: selección, lavado, secado y triturado, tratando de mantener la

genuinidad y propiedades que a ella se le atribuyen. Se seleccionaron así a las

hojas en mejor estado morfológico.

El lavado se realizó con agua potable sumergiéndolas en un recipiente,

tratando de eliminar la mayor cantidad de impurezas, sin llegar a perder los

beneficios de la muestra, posterior a esto se llevó a sequedad en un espacio

ventilado sin la incidencia directa de la luz solar por 7 días.

La planta seca o el residuo de la extracción, se somete a tres extracciones

sucesivas según la (Ilustración 1), a cada extracto I, II, III, se mide el volumen

obtenido y se calcula su concentración, esto se expresa en gramos de

sustancias extraidas por ml del extracto. Para ello se toma una alícuota de 5 ml

y se pasa a una cápsula previamente tarada, se evapora a sequedad en baño

de agua y se pesa nuevamente.

(31)

22

2.6 Identificación de la composición fitoquímica del extracto del

Cymbopogon citratus

Para el tamizaje fitoquímico se llevaron a cabo distintos protocolos con la

finalidad de identificar los distintos compuestos y metabolitos secundarios.

Estos procedimientos se resumen en la Tabla2, en la que se detalla el nombre

del ensayo, el metabolito a ser identificado, procedimiento y el resultado que

marca la presencia o ausencia de un determinado compuesto.

Tabla 2. Técnicas para el tamizaje fitoquímico. Adaptado de (32-39)

Ensayo Metabolito Procedimiento Resultado

Dragendorff

Alcaloides.

Observamos si la alícuota del extracto está disuelta en un solvente orgánico, éste se evapora, en un baño de agua y el residuo redisolverse en 1 mL de ácido clorhídrico al 1 % en agua.

Si observamos que el extracto es acuoso, a la alícuota se le añade 1 gota de ácido clorhídrico

concentrado. Con la solución acuosa ácida se realiza el ensayo, añadiendo 3 gotas del reactivo.

Si hay opalescencia se considera (+) turbidez definida

(++), precipitado (+++).

Wagner y Mayer

De igual manera se parte en los casos anteriores de la solución acida, y se añade 2 ó 3 gotas del

reactivo.

Baljet Lactonas.

Observamos si la alícuota del extracto se encuentra en alcohol, se evapora el solvente en baño de agua y debe redisolverse en la menor cantidad de alcohol (1mL). En estas condiciones adicionamos 1mL de

reactivo.

La aparición de una coloración roja (++) o precipitado rojo

(+++).

Borntrager Quinonas.

Observamos si la alícuota del extracto no se encuentra en cloroformo, evaporamos el solvente en

baño de agua y el residuo redisolverse en 1mL de cloroformo.

Adicionamos 1mL hidróxido de sodio, hidróxido de potasio o amonio al 5% en agua. Agitamos mezclando las fases y se deja en reposo hasta su

posterior separación.

Si la fase acuosa alcalina se colorea de rosado o rojo.

Coloración rosada (++), coloración roja (+++).

Liebermann-Burchard

Triterpenos y/o esteroides.

Adicionamos 1mL de anhídrido acético y se mezcla bien. Por la pared del tubo de ensayo se dejan resbalar 2-3 gotas de ácido sulfúrico concentrado sin

agitar.

1. Rosado 2. Verde intenso-visible

3. Verde oscuro-negro

Catequinas Catequinas

Tomamos una gota de la fracción alcohólica, con la ayuda de un capilar y se aplica la solución sobre papel filtro. Sobre la mancha se aplica solución de

carbonato de sodio.

Verde carmelita a la luz UV.

Fehling Azúcares Reductores.

Si la alícuota del extracto no se encuentra en agua, se evapora el solvente en baño de agua y el residuo

redisolverse en 1–2 mL de agua. Se adiciona 2mL del reactivo y se calienta en baño

de agua 5–10 min la mezcla.

Solución se colorea de rojo o aparece precipitado rojo.

Cloruro Férrico

Compuestos fenólicos y/o taninos.

Observamos si el extracto es acuoso se añade acetato de sodio para neutralizar y tres gotas de una solución de tricloruro férrico al 5% en solución salina fisiológica a una alícuota del extracto alcohólico se

adiciona el reactivo.

Coloración rojo- vino, verde intenso, azul.

Shinoda Flavonoides.

Observamos si la alícuota del extracto se encuentra en alcohol, se diluye con 1 mL de ácido clorhídrico

concentrado y un pedacito de cinta de magnesio metálico.

Después de la reacción se espera 5 minutos, se añade 1 mL de alcohol amílico, se mezclan las fases

y se deja reposar hasta que se separen.

Cuando el alcohol amílico se colorea de amarillo, naranja, carmelita o rojo; intenso en

todos los casos.

(32)

23

secuencia C6-C3-C6 del grupo de los

flavonoides.

con 1 mL de HCl concentrado. Se deja enfriar y se adiciona 1mL de agua y 2 mL de alcohol amílico. Se

agita y se deja separar las dos fases.

marrón en la fase amílica.

Resinas Resinas. Adicionamos a 2mL de la solución alcohólica, 10 mL de agua destilada. Precipitado.

Espuma Saponinas.

Observamos si la alícuota se encuentra en alcohol, se diluye con 5 veces su volumen en agua y se agita

la mezcla fuertemente durante 5–10 min.

Si aparece espuma en la superficie del líquido.

2.7 Evaluación de la Actividad Antimicrobiana del Extracto de

Cymbopogon citratus

2.7.1 Ensayo antimicrobiano- Método de difusión de discos

En placas Petri de agar (Mueller Hinton) sembradas (0.5 McFarland) cada una

de las cepas activas en estudió, se colocó discos de papel filtro (ø 5 mm), con

la ayuda de una plantilla numerada, sobre cada disco se secó (15 µL) extractos

y sus respectivas diluciones, control de solventes (Agua estéril, DMSO) y

control de antimicrobianos por triplicado, esto se incubó en una estufa por 24

horas a 37°C.

2.8 Descripción del procedimiento metodológico para el desarrollo de la investigación

Para el presente estudio, se obtuvo un extracto etanólico a partir de las hojas

de plantas frescas de C. citratus. Este extracto se caracterizó en lo referente a

los grupos químico incluidos en el mismo. Finalmente, el extracto fue probado

en ensayos in vitro frente a S. aureus y E. coli por triplicado y en ensayos diferentes con el objetivo de ganar robustez estadística y obtener datos fiables.

Como controles se usaron DMSO, Clorhexidina y agua bidetilada estéril.

El diseño experimental de esta investigación conlleva observar el efecto del

extracto bruto etanólico de C. citratus sobre S. aureus y E. coli en diluciones prestablecidas de 25%, 50%, 75% y 100%. Para realizar el análisis estadístico

de los datos, se aplicó ANOVA de una sola vía con ajuste de Bonferroni para

(33)

24

extracto. Un análisis de ANOVA de dos vías se aplicó para establecer las

diferencias entre tratamientos con un ajuste de prueba de Tukey. La

significancia, se reportó con un intervalo de confianza del 95% y significancia

estadística menor o igual a 0.05. Para realizar estos cálculos, se empleó los

programas estadísticos SPSS 13.0 y Graphpad Prism 7 con software bajo

licencia institucional.

2.9 Análisis de resultados obtenidos en el estudio. 2.9.1 Estudio etnofarmacológico

Tabla 3. Datos obtenidos a partir de las encuestas aplicadas a la población de estudio involucrada en la investigación. Se expresa los valores numéricos y porcentuales.

Planta

Veces citadas por encuestados

(n=332)

IVU UST (%) RVU

Manzanilla 61 1,00 69,3 13,4

Orégano 39 1,00 44,3 8,6

Menta 38 1,00 43,2 8,4

Toronjil 31 1,00 35,2 6,8

Hierba Luisa 30 1,00 34,1 6,6

Ortiga 20 1,00 22,7 4,4

Limoncillo 19 1,00 21,6 4,2

Alfalfa 16 1,00 18,2 3,5

Eucalipto 16 1,00 18,2 3,5

Sábila 14 1,00 15,9 3,1

Llanten 13 1,00 14,8 2,9

Apio 12 1,00 13,6 2,6

Hinojo 12 1,00 13,6 2,6

Cedrón 10 1,00 11,4 2,2

Hierba Buena 10 1,00 11,4 2,2

Perejil 10 1,00 11,4 2,2

Matico 8 1,00 9,1 1,8

Tilo 8 1,00 9,1 1,8

Valeriana 8 1,00 9,1 1,8

Caballo Chupa 7 1,00 8,0 1,5

Malva 6 1,00 6,8 1,3

(34)

25

Borraja 4 1,00 4,5 0,9

Canela 4 1,00 4,5 0,9

Cola de Caballo 4 1,00 4,5 0,9

Hierba Mora 4 1,00 4,5 0,9

Paico 4 1,00 4,5 0,9

Romero 4 1,00 4,5 0,9

Tomillo 4 1,00 4,5 0,9

Tuna 4 1,00 4,5 0,9

Yutuyuyu 4 1,00 4,5 0,9

Casamarucha 2 1,00 2,3 0,4

Cuyuya 2 1,00 2,3 0,4

Diente de León 2 1,00 2,3 0,4

Hojas de Manzana 2 1,00 2,3 0,4

Jengibre 2 1,00 2,3 0,4

Mincuyu 2 1,00 2,3 0,4

Pataconyuyo 2 1,00 2,3 0,4

Salve Real 2 1,00 2,3 0,4

Sango Raiba 2 1,00 2,3 0,4

Sangoracha 2 1,00 2,3 0,4

Taraxaco 2 1,00 2,3 0,4

Tipo 2 1,00 2,3 0,4

Ilustración 2. Cuadro comparativo de porcentaje de uso de especies vegetales en población de estudio. Se ordena de mayor a menor uso y se expresa en tasa porcentual. Se destaca (color verde) la especie implicada en la presente investigación. 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 P o rc enta je Especie vegetal

(35)

26

2.9.2 Caracterización fitoquímica del extracto de Cymbopogon citratus

Tabla 4. Determinación de compuestos químicos presentes en el extracto

alcohólico de Cymbopogon citratus mediantes los ensayos descritos en la tabla

2

Composición del Extracto Alcohólico

Cymbopogon citratus

(Resultado)

Catequinas Catequinas +

Resinas Resinas -

Baljet Lactonas y cumarinas +

Liebermann-Burchard Triterpenos y/o esteroides ++ FeCl3 (Cloruro Ferrico) Taninos +

Borntrager Quinonas -

Shinoda Flavonoides +

Dragendorff Alcaloides -

Mayer Alcaloides -

Wagner Alcaloides -

Espuma Saponinas -

Escala arbitraria: (+) Presencia baja; (++) Presencia media; (+++) Presencia alta; (-) Ausencia

Los resultados del tamizaje fitoquímico presentados en la Tabla 4, evidencia la

presencia de compuestos fenólicos, ya que al extraer sucesivamente la

muestra seca y triturada de Cymbopogon citratus con solventes de polaridad

creciente las pruebas de: Catequinas, Baljet, Liebermann-Burchard, Cloruro

férrico y Shinoda fueron positivas, dando mayor intensidad de respuesta en la

prueba de Liebermann- Burchard, lo que coincide con los reportes de la

composición fitoquímica de otras familias de Cymbopogon citratus, en donde

demuestran que los compuestos fenólicos son los metabolitos secundarios más

(36)

27

2.9.3 Evaluación de la actividad antimicrobiana

Para la determinación del efecto inhibidor de los compuestos del extracto

etanólico de Cymbopogon citratus se realizó diluciones al 25%, 50%, 75% y

100%. Se las probó sobre el crecimiento in vitro de Staphylococcus aureus y

Escherichia coli. Se comparó la susceptibilidad del Staphylococcus aureus y

Escherichia coli, frente al extracto etanólico, al control positivo (clorhexidina al 0.12%) y a los controles negativos que fueron agua destilada estéril y DMSO

(suprimir el sesgo del diluyente). Los resultados se muestran en la ilustración 4.

Ilustración 3. Efecto bactericida in vitro de C. citratus sobre S. aureus y E. coli.

Se llevaron a cabo corridas estadísticas para establecer las diferencias entre

tratamientos y las diferencias de cada tratamiento, versus el control positivo.

Los parámetros de los análisis para el ANOVA de doble vía (two-way ANOVA)

(37)

28

Tabla 5. Análisis por ANOVA de doble vía para los datos obtenidos en los experimentos.

Table Analyzed C, Citratus

Two-way ANOVA Ordinary

Alpha 0,05

Source of Variation % of total variation P value P value summary Significant?

Interaction 14,1 <0,0001 a **** Yes

Row Factor 10,57 <0,0001 a **** Yes Column Factor 72,41 <0,0001 a **** Yes

ANOVA table SS DF MS F (DFn, DFd) P value

Interaction 93,32 6 15,55 F (6, 42) = 33,93 P<0,0001 a

Row Factor 69,98 1 69,98 F (1, 42) = 152,7 P<0,0001 a

Column Factor 479,2 6 79,87 F (6, 42) = 174,3 P<0,0001 a

Residual 19,25 42 0,4583

a Diferencia estadísticamente significativa

Continuando con en análisis de datos, se procede a correr un ANOVA de una

sola vía de múltiples comparaciones con un ajuste de Bonferroni (Bonferroni's

multiple comparisons test), con un intervalo de confianza al 95% y una

significancia fijada en menor o igual a 0.05, con el objetivo de establecer

diferencias entre los tratamientos aplicados al cultivo in vitro de S. aureus. Los

resultados de las múltiples comparaciones se muestran en la Tabla 6 y la

Ilustración 4.

Tabla 6. Análisis de datos por la prueba de múltiple comparación de Sidak aplicada a los datos obtenidos a partir de los ensayos experimentales.

Sidak's multiple comparisons test Mean Diff, 95,00% CI of diff, Significant? Summary Adjusted P Value

Staphylococcus aureus

Water vs. DMSO 0 -1,322 to 1,322 No ns >0,9999

Water vs. T1 (25%) -3,9 -5,222 to -2,578 Yes **** <0,0001

Water vs. T2 (50%) -4,9 -6,222 to -3,578 Yes **** <0,0001 Water vs. T3 (75%) -5,9 -7,222 to -4,578 Yes **** <0,0001

Water vs. T4 (100%) -7,9 -9,222 to -6,578 Yes **** <0,0001

Water vs. A.E. -9,65 -10,97 to -8,328 Yes **** <0,0001 Escherichia coli

Water vs. DMSO 0 -1,322 to 1,322 No ns >0,9999

Water vs. T1 (25%) 0 -1,322 to 1,322 No ns >0,9999

Water vs. T2 (50%) -0,4 -1,722 to 0,9216 No ns 0,9570

Water vs. T3 (75%) -5,15 -6,472 to -3,828 Yes **** <0,0001 Water vs. T4 (100%) -8,15 -9,472 to -6,828 Yes **** <0,0001

Water vs. A.E. -2,9 -4,222 to -1,578 Yes **** <0,0001

Finalmente, se evaluó las diferencias entre los tratamientos (Sidaki's multiple comparisons test), así como el porcentaje del efecto inhibitorio del extracto

(38)

29

Tabla 7. En base a los resultados obtenidos se infiere que existe diferencia

entre cada uno de los tratamientos, a excepción de la comparación entre el

tratamiento T1 vs. T2, T1 vs. T3, T2 vs. T3, T3 vs. T4 y T4 vs. A.E. En base a

los datos analizados se establece que la concentración del extracto está

directamente relacionada y es proporcional al efecto encontrado en el estudio.

Tabla 7. Comparación de tratamientos aplicados al cultivo in vitro de S. aureus

y E. coli mediante la prueba de múltiple comparación de Sidak aplicada a los datos obtenidos a partir de los ensayos experimentales.

Sidak's multiple comparisons test Mean Diff, 95,00% CI of diff, Significant? Summary Adjusted P Value

Staphylococcus aureus

DMSO vs. W ater 0 -1,544 to 1,544 No Ns >0,9999

DMSO vs. T1 (25%) -3,9 -5,444 to -2,356 Yes **** <0,0001 a

DMSO vs. T2 (50%) -4,9 -6,444 to -3,356 Yes **** <0,0001 a

DMSO vs. T3 (75%) -5,9 -7,444 to -4,356 Yes **** <0,0001 a

DMSO vs. T4 (100%) -7,9 -9,444 to -6,356 Yes **** <0,0001 a

DMSO vs. A.E. -9,65 -11,19 to -8,106 Yes **** <0,0001 a

Water vs. T1 (25%) -3,9 -5,444 to -2,356 Yes **** <0,0001 a

Water vs. T2 (50%) -4,9 -6,444 to -3,356 Yes **** <0,0001 a

Water vs. T3 (75%) -5,9 -7,444 to -4,356 Yes **** <0,0001 a

Water vs. T4 (100%) -7,9 -9,444 to -6,356 Yes **** <0,0001 a

Water vs. A.E. -9,65 -11,19 to -8,106 Yes **** <0,0001 a

T1 (25%) vs. T2 (50%) -1 -2,544 to 0,5439 No Ns 0,6010

T1 (25%) vs. T3 (75%) -2 -3,544 to -0,4561 Yes ** 0,0031 a

T1 (25%) vs. T4 (100%) -4 -5,544 to -2,456 Yes **** <0,0001 a

T1 (25%) vs. A.E. -5,75 -7,294 to -4,206 Yes **** <0,0001 a

T2 (50%) vs. T3 (75%) -1 -2,544 to 0,5439 No Ns 0,6010

T2 (50%) vs. T4 (100%) -3 -4,544 to -1,456 Yes **** <0,0001 a

T2 (50%) vs. A.E. -4,75 -6,294 to -3,206 Yes **** <0,0001 a

T3 (75%) vs. T4 (100%) -2 -3,544 to -0,4561 Yes ** 0,0031 a

T3 (75%) vs. A.E. -3,75 -5,294 to -2,206 Yes **** <0,0001 a

T4 (100%) vs. A.E. -1,75 -3,294 to -0,2061 Yes * 0,0148 a

Escherichia coli

DMSO vs. W ater 0 -1,544 to 1,544 No Ns >0,9999

DMSO vs. T1 (25%) 0 -1,544 to 1,544 No Ns >0,9999

DMSO vs. T2 (50%) -0,4 -1,944 to 1,144 No Ns >0,9999

DMSO vs. T3 (75%) -5,15 -6,694 to -3,606 Yes **** <0,0001 a

DMSO vs. T4 (100%) -8,15 -9,694 to -6,606 Yes **** <0,0001 a

DMSO vs. A.E. -2,9 -4,444 to -1,356 Yes **** <0,0001 a

Water vs. T1 (25%) 0 -1,544 to 1,544 No Ns >0,9999

Water vs. T2 (50%) -0,4 -1,944 to 1,144 No Ns >0,9999

Water vs. T3 (75%) -5,15 -6,694 to -3,606 Yes **** <0,0001 a

Water vs. T4 (100%) -8,15 -9,694 to -6,606 Yes **** <0,0001 a

Water vs. A.E. -2,9 -4,444 to -1,356 Yes **** <0,0001 a

T1 (25%) vs. T2 (50%) -0,4 -1,944 to 1,144 No Ns >0,9999

T1 (25%) vs. T3 (75%) -5,15 -6,694 to -3,606 Yes **** <0,0001 a T1 (25%) vs. T4 (100%) -8,15 -9,694 to -6,606 Yes **** <0,0001 a

T1 (25%) vs. A.E. -2,9 -4,444 to -1,356 Yes **** <0,0001 a

T2 (50%) vs. T3 (75%) -4,75 -6,294 to -3,206 Yes **** <0,0001 a T2 (50%) vs. T4 (100%) -7,75 -9,294 to -6,206 Yes **** <0,0001 a

T2 (50%) vs. A.E. -2,5 -4,044 to -0,9561 Yes *** 0,0001

T3 (75%) vs. T4 (100%) -3 -4,544 to -1,456 Yes **** <0,0001 a

T3 (75%) vs. A.E. 2,25 0,7061 to 3,794 Yes *** 0,0006

T4 (100%) vs. A.E. 5,25 3,706 to 6,794 Yes **** <0,0001 a

Referencias

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