Verde: vía biosintetica Rojo: vía secretora Azul: vía de recuperación

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Las células eucarióticas poseen un mecanismo mediante el cual pueden incorporar moléculas del exterior llamado ENDOCITOSIS, y otro mecanismo para secretar moléculas al exterior llamado

EXOCITOSIS.

Ambos mecanismos están compuestos por un sistema complejo de trafico de vesículas que involucra la membrana celular y las membranas del ER (retículo endoplásmico) y el aparato de Golgi, entre muchas otras.

Verde: vía biosintetica Rojo: vía secretora

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Gaitan, Cell 2003

El proceso de endocitosis involucra la internalización de parches de membrana plasmática por distintos mecanismos

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Las células internalizan fragmentos de su membrana plasmática en forma de pequeñas vesículas y en un proceso continuo.

Existen dos formas principales de endocitosis:

Pinocitosis

: internalización de pequeñas

macromoléculas y fluidos extracelulares.

(<150 nm de

diámetro)

Fagocitosis

:

ingestión de partículas grandes

como microorganismos o debris celular.

(> 250nm de

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Todas las células eucarióticas están

continuamente

ingiriendo fluidos y moléculas por pinocitosis, solo

células especializadas (fagocíticas: macrófagos,

neutrófilos) ingieren partículas grandes.

La tasa de internalización de membrana plasmática

difiere entre células; los macrófagos y fibroblastos

internalizan el equivalente al 100% de su membrana

plasmática cada 30 y 120 min, respectivamente.

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El área de la membrana plasmática y el volumen de las células permanece constante durante el proceso activo de endocitosis, lo cual implica que es balanceado por un proceso

inverso denominado exocitosis (es un proceso mediante el cual las vesículas internas de la célula se fusionan con la

membrana plasmática para secretar fluidos o material)

membrana

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PINOCITOSIS

La mayoría de las células eucarióticas incorporan continuamente fluidos y solutos por medio de pinocitosis.

Gran cantidad de la membrana plasmática de la célula es incorporada dentro de ella por endocitosis y retorna a la superficie celular por exocitosis.

El tipo de pinocitosis más estudiada es la denominada

endocitosis mediada por receptor, en donde se internalizan moléculas específicas selectivamente. Estas moléculas se encuentran en el espacio extracelular en concentraciones bajas, como pueden ser hormonas, factores de crecimiento, anticuerpos, hierro, enzimas, vitaminas y colesterol.

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Las moléculas específicas que son internalizadas se pegan a proteínas denominadas

receptores

, que están localizadas en el exterior de la superficie celular y poseen un sitio específico de pegado a la molécula.

Una vez que la molécula se pega a su receptor, estos se mueven en la membrana plasmática y se concentran en pequeñas depresiones llamadas

clathrin-coated pits

.

Estas depresiones son invaginaciones de la membrana celular y se encuentran cubiertos por una proteína denominada clatrina. Estas invaginaciones son utilizadas para la vía endocítica, en donde macromoléculas específicas son incorporadas dentro de la célula.

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LAS INVAGINACIONES DE CLATRINA

OCUPAN EL 2% DE LA MEMBRANA

PLASMATICA.

LAS VESICULAS (RECUBIERTAS DE

CLATRINA)

SE FORMAN EN 1 MINUTO

Y EN

SEGUNDOS SE FUSIONAN CON LOS

ENDOSOMAS TEMPRANOS.

EN FIBROBLASTOS SE FORMAN 2500

VESICULAS POR MINUTO

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Cuando se desprenden las vesículas de la membrana plasmática y se liberan al espacio intracelular, se remueve la cubierta de clatrina.

Las vesículas que aun transportan los receptores y las moléculas unidas específicamente se fusionan con la membrana de otra organela denominada endosoma.

La función de los endosomas es empaquetar a las moléculas en nuevas vesículas y “enviarlas” a diferentes lugares dentro de la célula.

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Endocitosis mediada por

vesículas cubiertas con clatrina

Lodish et al, MCB 2004

microscopía electrónica

Clatrina

Proteína que facilita la endocitosis de receptores en vesículas pequeñas (>0.1 µm de diámetro) formando y reorganizando una “capa” sobre la cara citoplasmática de la membrana.

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Formación de vesículas cubiertas con clatrina en la

membrana celular

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Secuencia de eventos moleculares durante la endocitosis mediada por vesículas de clatrina

Proteínas adaptadoras se asocian a la membrana, reclutan proteínas cargo y clatrina.

Dinamina media la fisión de la vesícula con hidrólisis de GTP. Proteínas accesorias

desensamblan la cubierta en un proceso que depende de la hidrólisis de ATP.

ATP hidrólisis

Gundelfinger, NRMCB 2003

GTP hydrolysis

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Proteínas adaptadoras reconocen señales de endocitosis en el tallo citosólico de proteínas de transmembrana

AP2 ! NPXY ej. integrinas, receptor de LDL

AP2 ! YXXØ ej: receptores de transferrina, M6P AP2 ! LL ej: caderinas, receptor de Fc

Eps ! ubiquitina ej: EGFR, E-caderinas

AP2 X representa cualquier aminoácido

Ø representa un residuo hidrofóbico

señales reconocidas por proteínas adaptadoras citosólicas

N: Asn Y: Tyr P: Pro L: Leu

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La distinción de endosomas tempranos y tardíos se basa en el tiempo post

internalización, localización subcelular, pH, y en la presencia de proteínas

marcadoras.

Las moléculas internalizadas pueden reciclar tanto a partir de endosomas tempranos como tardíos. Los cuerpos multivesiculares se forman por la invaginación de la membrana de los endosomas tardíos.

Distintos compartimientos o "estaciones" del flujo

vesicular endocítico

pH6

pH5

pH4.5

MT

El transporte endocítico depende de microtúbulos (MT)

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Destino de las proteínas

Destino de las proteínas

endocitadas

endocitadas

"

reciclado de receptores

"

reciclado de receptores y sus ligandos

"

desensibilización y reciclado de receptores

"

degradación en lisosomas

La diferencia en los receptores incorporados en la célula mediante el proceso de endocitosis mediada por receptor es que una vez que liberan las moléculas que transportaron y que abandonan el endosoma pueden dirigirse a diferentes destinos. No como ocurre durante la fagocitosis en donde todo el material que entra a la célula termina en los lisosomas para su degradación

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!Reciclado de receptores

Un ejemplo de endocitosis mediada por receptor es la incorporación de colesterol en células de mamíferos.

Este descubrimiento fue realizado por Michael Brown y Joseph Goldstein, quienes estudiaban la internalización del colesterol en células del torrente sanguíneo. Dicho estudio fue galardonado con el Premio Nobel en Medicina en el año 1985.

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Cuando las células necesitan colesterol para la síntesis de

membrana, sintetizan el receptor de LDL que es una proteína de transmembrana. Estos receptores se localizan en las

invaginaciones (“pits”) de clatrina y al unir LDL comienza la endocitosis.

El colesterol sanguíneo es transportado en complejos lipoproteicos = partículas de LDL

(low density lipoprotein)

Una fracción de la membrana endocitada retorna a la superficie (reciclado). El receptor de LDL es reciclado mas de 100 veces antes de ser degradado. Cada ciclo dura ~10-20 min.

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Reciclado de receptores

Las partículas de colesterol LDL se unen a receptores de LDL en la superficie de las células y son endocitadas en vesículas de clatrina. El receptor LDL posee la señal de endocitosis NPXY la cual es reconocida por partículas AP2 y clatrina.

Los receptores endocitados se disocian de las partículas LDL en el medio ácido de los endosomas tardíos y son reciclados a la superficie.

N: Asn Y: Tyr P: Pro

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Las partículas de LDL son transportadas al lisosoma en donde enzimas digestivas las degradan en aminoácidos,

colesterol y ácidos grasos. Luego el colesterol es liberado al citoplasma donde es utilizado para la síntesis de membrana nueva.

Cuando se acumula colesterol en la célula se apaga la síntesis del receptor LDL dentro de la célula.

Aderem, Alan, and David M. Underhill. "Mechanisms of Phagocytosis in Macrophages." Annual Review of Immunology 17 (1999): 593–623.

Alberts, Bruce, et al. Molecular Biology of the Cell, 4th ed. New York: Garland Publishing, 2000.

Mukherjee, Sushmita, Richik N. Ghosh, and Frederick R. Maxfield. "Endocytosis." Physiological Reviews 77 (1997): 759–803.

Schmid, Sandra L. "Clathrin-Coated Vesicle Formation and Protein Sorting: An Integrated Process." Annual Review of Biochemistry 66 (1997): 511–548.

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!

Reciclado de

receptores y ligandos

Las células incorporan hierro a través de la endocitosis mediada por receptor de ferro-transferrina. En el medio ácido de los endosomas tardíos el hierro se disocia y se exporta al citosol.

La apotransferrina y su receptor

permanecen unidos y son reciclados a la superficie, donde se disocian.

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!Desensibilización y reciclado de receptores

Los receptores unidos al EGF se

autofosforilan y activan vías de señalización intracelulares.

Los receptores se endocitan en vesículas con clatrina.

En los endosomas tempranos una fracción de los receptores son defosforilados y

reciclados a la superficie.

Sorkin & Zastrow, NRMCB 2002

EGF

dephosphorylation

auto

phosphorylation

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!

Transporte de receptores y ligandos a lisosomas

Endosomas tempranos que transportan proteínas endocitadas (azul) y vesículas que transportan proteínas lisosomales desde el trans-Golgi (rojo y verde) se fusionan con endosomas tardíos. Las proteínas a ser degradadas se internalizan por invaginación formando cuerpos multivesiculares. Eventualmente, los cuerpos multivesiculares se fusionan con lisosomas.

Sorkin & Zastrow, NRMCB 2002

la internalización de receptores tirosina kinasas (EGFR) en los cuerpos multivesiculares impide

su reciclado y termina la señalización.

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La mono-ubiquitinilación actúa como una señal de direccionamiento al lisosoma

Mosesson / Yarden, IMAJ 2006

Receptores tirosina kinasa activados (ej. EGFR), E-caderinas, etc. pueden ser monoubiquitinados por E3-ubiquitina ligasas (ej. Cbl). Esto constituye una señal que es reconocida por proteínas adaptadoras (ej. Eps15, Hrs, STAM) que contribuyen a concentrar los receptores en cuerpos multivesiculares (MVB) y a su degradación en lisosomas.

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FAGOCITOSIS

La fagocitosis es un tipo de endocitosis

en donde se

ingieren partículas grandes o microorganismos enteros. Es un proceso mediado por actina. Extensiones de la membrana plasmática envuelven el material ingerido formando vesículas grandes llamadas FAGOSOMAS.

Eucariontes unicelulares (Protozoa) se alimentan a través de este medio, mientras que los animales superiores poseen células especializadas para tal fin como los macrófagos o neutrófilos.

Estas células ingieren microorganismos y también están involucradas en la limpieza de células apoptóticas o senescentes.

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Neutrófilos

: se encuentran en gran cantidad en

sangre, pueden entrar rápidamente a los tejidos y

fagocitan patógenos durante una inflamación aguda.

Macrófagos

: están fuertemente relacionados con los

monocitos en sangre, estas células predominan en

inflamaciones crónicas.

Células dendríticas y linfocitos B

: la fagocitosis en

estas células es importante durante la elaboración de

una respuesta inmune específica y no durante la

destrucción directa del patógeno

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La fagocitosis consiste en la ingesta de partículas grandes a partir de la formación de pseudópodos

Microscopía electrónica de barrido de un macrófago fagocitando dos eritrocitos. Las flechas señalan los bordes de las extensiones citoplasmáticas ricas en

actina denominadas pseudópodos, que engolfan los eritrocitos.

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Microscopía electrónica de un neutrófilo fagocitando una bacteria, que está en proceso de división.

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Existe fagocitosis de:

Microorganismos

Partículas insolubles

Células dañadas o muertas

Debris celular

Diferentes etapas durante la fagocitosis

Quimiotaxis

Adherencia

Formación de pseudópodos

Formación del fagosoma

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La fagocitosis se inicia por el pegado de partículas (material inerte, microorganismos o células muertas) a receptores en la superficie celular, posiblemente a extensiones cortas, “pseudopodos”, presentes en la superficie de células como pueden ser los macrófagos.

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Posteriormente los eventos rápidos de señalización promueven la reorganización del citoesqueleto (mayoritariamente actina) y como consecuencia la extensión de los pseudopodos. A pesar que la mayoría de los modelos de fagocitosis proponen a la membrana plasmática como la principal fuente de membrana para la formación de los fagosomas (proceso de invaginación) (Aa) se ha demostrado que otras endomembranas también contribuyen a este proceso.

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Los endosomas reciclados, que son reclutados a la superficie celular mediante el proceso denominado exocitosis (Ab), han sido identificados como potencial fuente de membrana para la

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También se ha demostrado que otra importante fuente de membrana que está involucrada en la fagocitosis es el retículo endoplásmico (ER), en un proceso denominado fagocitosis mediada por ER (Ac). Existen muchos trabajos en donde se muestra que las proteínas que usualmente están en la membrana plasmática o en los endosomas reciclados (Rab4 y Rab11) y en ER (calreticulina y calnexina) también están presentes en los fagosomas indicando la potencial participación de estas membranas en la fagocitosis.

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En algunos casos se demostró que los lisosomas también se fusionan con la membrana plasmática durante la fagocitosis (Ad). Se pudo observar que en algunos fagosomas se encuentran asociadas proteínas lisosomales (LAMP)

y proteínas reticulares (calnexina) lo que indica que ambas organelas participaron en la contribución de membrana para la biogénesis de dicho compartimiento.

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Luego de su formación, los fagosomas maduran en fagolisosomas mediante una serie de eventos de fusión con endosomas tempranos (EE), endosomas tardíos (LE) y lisosomas (Ly). Este proceso de maduración permite a los fagosomas adquirir propiedades microbicidas y la habilidad de procesar antígenos.

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Factores importantes que ayudan a destruir

microorganismos en los fagolisosomas

Proteínas NADPH oxidasa: están en las membranas de los

fagolisosomas y generan radicales oxígeno que reaccionan con proteínas, lípidos y otras moléculas biológicas.

Oxido nítrico: reacciona con radicales oxígeno y generan moléculas que dañan otras moléculas biológicas.

Proteínas antimicrobianas: proteasas, elastasas. Son esenciales para eliminar varias bacterias. Otra proteína antimicrobiana es la lisosima que actúa sobre la pared celular de algunas bacterias gram positivas.

Péptidos antimicrobianos: defensinas y otros péptidos. Atacan la membrana celular de la bacteria.

Transportadores de hidrógeno: acidifican el fagolisosoma provocando la eliminación de varios microorganismos. También activan proteasas

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- mycobacteria, Salmonella y la forma promastigote de Leishmania alteran la maduración del fagosoma

inhibiendo la fusión con LE y Ly (no hay degradación ni muerte de los microorganismos).

-Coxiella y la forma amastigote de Leishmania sobrevive dentro de los fagolisosomas.

- Brucella y Legionella pueden inducir fusión de la membrana plasmática del fagosoma con elementos de la

vía biosintetica permitiendo su replicación en compartimientos con características de ER.

Algunos patógenos intracelulares que han coexistido durante largos períodos de tiempo con su huésped han desarrollado diversas estrategias para escapar a los mecanismos defensivos de sus huéspedes, como por ejemplo la degradación en fagolisosomas.

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Endocitosis

independiente

de clatrina

Las caveolas están presentes en la mayoría de las células. Se forman en dominios especializados de la

membrana plasmática ricos en colesterol, glicoesfingolípidos y proteínas unidas por GPI (glico fosfatidil inositol) denominados "lipid rafts".

Caveolina: es la principal proteína estructural de las caveolas. La selección del cargo esta determinada por la composición lipídica de la membrana de la caveola.

vesícula con clatrina

Microscopía electrónica de caveolas

caveolas

membrana plasmática

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Acoplamiento entre exocitosis y endocitosis en el terminal pre-sináptico

Lodish et al, MCB2004

1. Los neurotransmisores (rojo) son almacenados en vesículas sinápticas que se acumulan ancladas a la membrana.

La fusión de membranas es prevenida por la proteína sinaptotagmina.

2. En respuesta a potenciales de acción, se abren canales de calcio, sinaptotagmina une calcio y altera su conformación,

permitiendo la fusión de las vesículas y la liberación de los neurotransmisores al espacio sináptico.

3. Endocitosis acoplada recicla los transportadores de neurotransmisores. 4. Recarga de las vesículas con neurotransmisores.

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GLUT4

Coordinación de eventos de endocitosis y exocitosis

La unión de insulina a su receptor genera señales intracelulares que promueven la translocación de endosomas especializados conteniendo GLUT4 a la membrana plasmática. La expresión del GLUT4 en la superficie promueve la captación de glucosa.

GLUT4

adipocito o célula muscular

endosoma de reciclado

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Autofagocitosis o Autofagia es

el término que se utiliza para

la degradación de

componentes citoplasmáticos

en los lisosomas.

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Secuestro de material

(transporte a los lisososmas)

Degradación

Generación de aminoácidos / péptidos

(utilización de los productos obtenidos)

Pasos secuenciales de la autofagia

Cada uno de estos pasos cumple diferentes funciones de acuerdo en el contexto celular en el que se encuentre.

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Existen tres tipos principales de autofagia

- Microautofagia

- Macroautofagia

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Microautofagia

: es la invaginación directa de

materiales a los lisosomas.

Half-life of AV ~10min Lisosoma autofagosoma o vacuola autofagica (AV) Mizushima N. et al 2007

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Macroautofagia: es el secuestro de organelas o de proteínas en una vesícula de doble membrana llamada autofagosoma o vacuola

autofagica (AV) dentro de la célula. La membrana externa del

autofagosoma se fusiona con el lisosoma en el citoplasma para

formar el autofagolisosoma o autolisosoma en donde se degrada su contenido a partir de las hidrolasas lisosomales.

Half-life of AV ~10min

Lisosoma autofagosoma

o vacuola

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Autofagia mediada por chaperonas (CMA):

es el

término que se utiliza para describir la degradación de

proteínas citosólicas

específicas que contienen una

secuencia peptídica determinada

. Las chaperonas se

unen a estas proteínas y las transportan a los

lisosomas por medio de un receptor. (este es un

proceso selectivo y sólo involucra proteínas, no

transportan organelas, contrariamente a la autofagia

en donde el sistema de degradación es en general no

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Proteína 31Atg Half-life of AV ~10min Lisosoma autofagosoma o vacuola autofagica (AV)

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Uno de los principales factores que es considerado como disparador del proceso de autofagia es la reducción de nutrientes.

Levaduras: falta de nitrógeno es el principal estimulo para inducir autofagia.

Plantas: falta de nitrógeno y carbono.

Mamíferos: sistema altamente complicado. Depleción total de aminoácidos. Efecto individual de los aminoácidos. Depende el tipo de célula.

Aun no se conoce como censan la falta de alguno de los aminoácidos. (candidato: GCN2, proteína kinasa de pegado a tRNA)

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Otra postura es la que considera que la autofagia debería estar regulada por un sistema altamente organizado.

Se cree que el sistema endocrino, en particular la insulina, regula la autofagia in vivo. (Autofagia en hígado es suprimida por insulina y aumentada por glucagon).

También contribuyen a la regulación de la autofagia otras hormonas y factores de crecimiento.

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Una vez que el material es degradado en los lisosomas / vacuolas, las unidades monoméricas (ej. Aminoácidos) son exportados al citosol para ser reusados.

Atg22 (levaduras)

Avt3, Avt4 (levaduras)

-SLC36A1 / LYAAT-1 transportador lisosomal de aminoácidos (mamíferos).

Aun no se conoce contribución de la autofagia para la reutilización de lipidos y carbohidratos.

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Autofagia es una vía de degradación lisosomal que es

escencial para la sobrevida, la diferenciación, el desarrollo y el mantenimiento de la célula.

Autofagia cumple principalmente un rol adaptativo de proteger a los organismos de diversas patologías, como

pueden ser infecciones, cancer, enfermedades

neurodegenerativas.

Sin embargo, esta función puede ser destructiva o nociva para el organismo. Excesiva degradación por autofagia causa

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Control de calidad

Eliminacion de exceso de organelas no necesarias (peroxisomas, mitocondrias) Streptococcus, Shigella, Mycobacterium. Algunos microorganismos (Brucella, Legionella) utilizan la via autofagica para sobrevivir. (vacuolas protectivas)

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