Trabajo Fin de Máster:
Efecto de la infección con Anaplasma phagocytophilum sobre la
apoptosis en células de garrapata
Mª Luisa Martínez de Carnero García
VºBºDirectores:
Mª Pilar Alberdi Vélez José de la Fuente
Instituto de Investigación en Recursos Cinegéticos-IREC(CSIC-UCLM-JCCM) Universidad de Castilla-La Mancha
ABSTRACT/RESUMEN………3
1.INTRODUCCIÓN………...4
1.1. Garrapatas como vectores de transmisión de enfermedades…………4
1.2. Anaplasma phagocytophilum………...5
1.3. Presentación clínica de la Anaplasmosis………...7
1.4. Importancia zoonótica………...8 1.5. Mecanismo de Apoptosis……….9 1.6. Objetivos………...12 1.7. Hipótesis………...13 2.MATERIALES Y MÉTODOS………....14 2.1 Cultivos Celulares………...14 2.2 Inhibición/Inducción de la apoptosis……….14
2.3 Extracción de ADN y ARN………15
2.4 Ensayos de actividad de la enzima Hexoquinasa……….16
2.5 Ensayos de actividad de la enzima de apoptosis Caspasa 9……….16
2.6 PCR a tiempo real………..17
2.7 Inmunofluorescencia con células de garrapata……….17
2.8 Análisis filogenético………18
3. RESULTADOS………..19
3.1 A. phagocytophilum inhibe la apoptosis para facilitar la infección de células de garrapatas ISE6 e IRE/CTVM20………19
3.2 Efecto de la temperatura de incubación en la infección con A. phagocytophilum sobre los niveles de apoptosis en células de garrapata de la líneas celulares ISE6 e IRE/CTVM20………...21
3.3 La infección con A. phagocytophilum inhibe la actividad de la enzima hexoquinasa………..22
3.4 La infección con A. phagocytophilum inhibe la actividad de la enzima caspasa 9 (CASP9)……….23
3.6 Análisis filogenético………....26
4. DISCUSIÓN……….27
5. CONCLUSIONES………29
6. AGRADECIMIENTOS……….30
ABSTRACT
Anaplasma phagocytophilum is an intracellular tick-borne rickettsial pathogen, which causes granulocytic anaplasmosis in various species of livestock, companion animals and also in humans. A. phagocytophilum infects vertebrate host neutrophils where it multiplies within a parasitophorous vacuole, thus evading host defenses while inhibiting apoptosis and promoting cytoskeleton rearrangement for infection and multiplication.
Previous studies have shown that A. phagocytophilum infection also inhibits apoptosis of tick cells. In this study we used the Ixodes ricinus-derived cell line IRE/CTVM20 and the Ixodes scapularis-derived cell line ISE6 and three different strains of A. phagocytophilum of human, canine and sheep origin to study the effect of early bacterial infection on the levels of apoptosis in tick cells.
Results from this study confirmed that early infection with different strains of A. phagocytophilum inhibits apoptosis of tick cells to facilitate invasion and multiplication.
RESUMEN
Anaplasma phagocytophilum es un patógeno intracelular transmitido por garrapatas, agente causal de la anaplasmosis granulocítica en ganado, animales de compañía y humanos. La bacteria infecta los neutrófilos del hospedador vertebrado donde se multiplica dentro de una vacuola parasitófora, evadiendo la defensa inmunitaria del hospedador, inhibiendo la apoptosis y promoviendo la reorganización del citoesqueleto para facilitar su infección y multiplicación.
Estudios previos han demostrado que la infección con A. phagocytophilum
también inhibe la apoptosis en células de garrapata. Para este trabajo utilizamos líneas celulares de garrapata de las especies Ixodes ricinus
ovino para estudiar el efecto de la infección bacteriana temprana en los niveles de apoptosis de las células de garrapata.
Los resultados confirmaron que la infección temprana con las tres cepas estudiadas inhiben los niveles de apoptosis en células de garrapata para facilitar la invasión y multiplicación bacteriana.
Palabras clave
Apoptosis, garrapata, Anaplasma phagocytophilum, Ixodes spp.
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Garrapatas como vectores de transmisión de enfermedades.
Las garrapatas son artrópodos ectoparásitos de vertebrados domésticos, silvestres y de humano. Entre las enfermedades que pueden transmitir se encuentran la encefalitis (Tick-borne encephalitis, TBE), la enfermedad de Lyme y la babesiosis (de la Fuente et al., 2008).
De las más de 800 especies diferentes de garrapatas que han sido identificadas en el mundo solo unas pocas han generado líneas celulares continuas hasta la fecha (Passos, 2012).
Las primeras líneas celulares de garrapata se establecieron en 1975 (Varma et al.) y desde entonces el número de líneas celulares ha incrementado hasta alrededor de 50, derivadas de las familias Ixodidae y Argasidae (Passos, 2012).
La mayor parte de líneas celulares de garrapata se establecieron a partir de células embrionarias y crecen de forma tridimensional en medios de cultivo diseñados específicamente bajo una atmósfera normal y temperaturas de incubación entre 28-34ºC.
Tanto bacterias (Anaplasma, Ehrlichia, Borrelia y Rickettsia) como arbovirus se pueden propagar en líneas celulares de garrapata (Bell-Sakyi et al., 2007) lo cual demuestra el gran potencial de estas células para el estudio de los mecanismos de infección y para proporcionar material antigénico sin la
necesidad de usar animales de experimentación.
Para este estudio se utilizaron dos líneas celulares diferentes derivadas de dos especies de garrapata del género Ixodes: Ixodes ricinus, garrapata más común en Europa e Ixodes scapularis más común en el este y medio oeste de EE.UU (Figuras 1 y 2).
Fig 1. Garrapatas Ixodes scapularis
(larva, ninfa, macho y hembra) (Fuente: www.tickencounter.org/tick_identification/ deer_tick).
Fig 2. Garrapatas Ixodes ricinus
(larva, ninfa, macho y hembra) (Fuente:
www.fsbio_hannover.de/oftheweek /65.htm).
1.2 Anaplasma phagocytophilum.
Las bacterias del género Anaplasma (orden Rickettsiales, familia
Anaplasmataceae) son Gram negativas y se caracterizan por ser parásitos intracelulares obligados de leucocitos neutrófilos. Todas ellas se encuentran filogenética e inmunológicamente estrechamente relacionadas. Anaplasma phagocytophilum es el patógeno que afecta a ganado ovino y vacuno en Europa (Gordon et al., 1932) y humanos en Estados Unidos (Aguero-Rosenfeld et al., 1996), transmitido por garrapatas Ixodes ricinus e I. scapularis respectivamente (Figura 3). La familia de garrapatas Ixodidae, además de diversas especies de Ixodes incluye otras tales como
Rhipicephalus y Boophilus, distribuidas mundialmente y responsables de la transmisión de diversas enfermedades tales como Babesiosis, Lyme
borreliosis o encefalitis viral tanto en animales como en humanos (Stuen, 2007).
A. phagocytophilum es una pequeña bacteria cocobacilar Gram-negativa de 0,2-2 micras de diámetro; que se replica dentro de una vacuola de la célula huésped para formar una microcolonia llamada mórula (Carlyon y Fikrig., 2003).
Las bacterias dentro de este endosoma temprano, obtienen los nutrientes para la fisión binaria y crecen en este clúster llamado mórula; aquí la bacteria se divide hasta que ocurre la lisis celular y la bacteria se libera para infectar otras células (Dumler et al., 2005).
Las microcolonias, que aparecen como inclusiones redondas de 2-7 micras de diámetro, se pueden detectar mediante tinciones de Romanowsky. La mórula, cuyo término en latín significa 'mora', a menudo puede presentar una apariencia punteada, similar a una mancha oscura dentro del citoplasma de la célula huésped (Carlyon y Fikrig., 2003).
A. phagocytophilum es una bacteria intracelular que infecta los neutrófilos del hospedador vertebrado donde se multiplica en el interior de una vacuola parasitófora, evadiendo de esta manera la respuesta inmune del hospedador e inhibiendo procesos tales como la apoptosis a la vez que promoviendo la reorganización del citoesqueleto para favorecer su infección y multiplicación en el citoplasma de las células (Ayllon et al., 2013).
Se ha observado que diferentes aislamientos de A. phagocytophilum
derivados de diversos hospedadores vertebrados pueden crecer in vitro en líneas celulares de garrapata derivadas de I. ricinus e I. scapularis
(Dyachenko et al., 2012) lo cual sugiere que el patógeno emplea mecanismos similares de invasión y propagación en ambas especies de garrapata (Pedra et al., 2010).
La interacción garrapata-Anaplasma no está tan bien caracterizada como la que se produce entre la bacteria y su hospedador vertebrado. El conocimiento de los mecanismos de infección y multiplicación de Anaplasma dentro de su
vector, las garrapatas, es esencial para poder diseñar nuevas estrategias para el control de la infección por el patógeno.
1.3 Presentación clínica de la Anaplasmosis
La presentación de esta enfermedad febril varía desde la forma subclínica hasta las infecciones severas e incluso fatales (Dumler et al., 2005).
Las manifestaciones típicas de esta enfermedad son similares a la gripe acompañados de leucopenia, trombocitopenia y anemia (Al-Khedery et al., 2012). La clínica de la enfermedad asociada a infecciones humanas es
Fig 3. Los diferentes aislamientos de A. phagocytophilum difieren en su capacidad para producir la enfermedad dependiendo del mamífero hospedador que infecten. Cuando las ovejas se inoculan experimentalmente con cepas de Anaplasma de origen humano (NY-18), los animals no presentan síntomas clínicos ni se observan neutrófilos circulantes infectados. Sin embargo, son capaces de infectar a garrapatas que se alimenten de ellas actuando así como reservorios de la bacteria.
de salud a largo plazo tales como fiebre recurrente incluso después del tratamiento con el antibiótico. Las infecciones en roedores y rumiantes pueden ser persistentes (Barbet et al., 2003).
En Europa, las manifestaciones clínicas debidas a A. phagocytophilum han sido registradas principalmente en el ganado ovino, caprino, caballo, perro, gato, corzos, renos y humanos. La infección por A. phagocytophilum puede causar fiebre alta, inclusiones citoplasmáticas en los fagocitos y neutropenia severa, pero rara vez es mortal, pero si puede complicarse por otras infecciones secundarias (Stuen et al., 2011). Las complicaciones pueden incluir abortos y alteración de la espermatogénesis durante varios meses. Sin embargo, el aspecto más importante de la infección, al menos en el ganado ovino, es su implicación como un factor que predispone otras infecciones (Stuen, 2007).
El análisis de las secuencias de DNA bacteriano indica que existe variación genética entre los diferentes aislamientos dependiendo de su origen geográfico y del hospedador del que se ha aislado. Por ejemplo, las cepas de
A. phagocytophilum aisladas de ciervo en EE.UU. poseen una secuencia de 16s rRNA ligeramente diferente y parecen ser no infectivas para ratones y humanos (Al-Khedery et al., 2012).
1.4 Importancia zoonótica
La Anaplasmosis Granulocítica Humana (HGA) se identificó por primera vez en 1990 en un paciente de Wisconsin, que murió de una enfermedad febril grave dos semanas después de la picadura de garrapata. Durante las fases terminales de la infección, se observaron agrupaciones de pequeñas bacterias dentro de los neutrófilos en la sangre periférica (Dumler et al., 2005). A partir de los años 90 se observó un incremento en la prevalencia de la HGA causada por A. phagocytophilum en los EE.UU. y desde entonces el número de casos de esta enfermedad ha seguido crecido anualmente (Massung et al.,
2007).
Al contrario de lo que sucede en América del Norte, en Europa la anaplamosis granulocítica causada por A. phagocythopilum es la enfermedad transmitida por garrapata más frecuente en animales (Galindo et al., 2008) pero la prevalencia de infección en humanos es mucho más baja lo cual sugiere que estas infecciones están provocadas por aislamientos de Anaplasma genética y fenotípicamente diferentes y especializadas en infectar hospedadores vertebrados diferentes (Figura 4).
1.5 Mecanismo de Apoptosis
La apoptosis es un proceso regulado de muerte celular esencial para el mantenimiento de la homeostasis de los tejidos. Los procesos de enfermedad,
Fig 4. Diferentes cepas de Anaplasma phagocytophilum difieren en su capacidad para infectar mamíferos hospedadores. En América del Norte, la prevalencia de la Anaplasmosis granulocítica humana predomina sobre la clásica fiebre transmitida por garrapatas que afecta principalmente a ovejas en Europa.
incluidas las infecciones bacterianas, pueden provocar una regulación inadecuada de la apoptosis.
A pesar de que ciertos componentes del concepto de apoptosis fueron descritos explícitamente algunos años antes (Elmore., 2007), el término apoptosis (a-po-toe-sis) fue usado por primera vez por Kerr, Wyllie y Currie en 1972 para describir una forma morfológicamente distinta de muerte celular. La apoptosis ocurre normalmente durante el desarrollo y envejecimiento y es un mecanismo homeostático de mantenimiento de las poblaciones celulares en los tejidos. La apoptosis también ocurre como mecanismo de defensa, como reacción inmune o cuando la célula está dañada por una enfermedad o un agente nocivo (Elmore., 2007).
La apoptosis está coordinada y a menudo depende energéticamente de procesos que envuelven la activación de una familia de cisteínas proteasas llamadas "caspasas" y una compleja cascada de eventos que vincula el estímulo de iniciación al final de la desaparición de la célula (Elmore., 2007). Las caspasas desempeñan un papel fundamental durante la apoptosis en muchas células nucleadas. Se clasifican en caspasas iniciadoras y caspasas efectoras. Caspasa 3 es el principal efector caspasa en muchos procesos apoptóticos, y rompe varios sustratos proteicos celulares, incluidos los que participan en el montaje, la regulación del citoesqueleto del ciclo celular y la replicación y reparación del ADN (Ge et al., 2005).
Los neutrófilos son los principales mediadores de la inflamación y la respuesta a la infección, por lo cual resulta paradójico que A. phagocytophilum sea capaz de establecer una infección en el entorno hostil intracelular de los neutrófilos (Carlyon y Fikrig, 2003). Debido a que los neutrófilos tienen una vida media muy corta y típicamente experimentan apoptosis 6-12 h después de su liberación de la médula ósea, la modulación de la evolución en el tiempo de apoptosis por agentes patógenos ha sido implicado como un factor crítico en la gravedad y la duración de infecciones sistémicas y locales (Ge et al., 2005).
Teniendo en cuenta la baja tasa de crecimiento de la bacteria, la prolongación de la vida útil de los neutrófilos sería beneficiosa para la supervivencia de A. phagocytophilum y su patogénesis. En efecto, esta bacteria parece retrasar la apoptosis de neutrófilos, tanto in vitro como in vivo. Después de 24 h de un cultivo in vitro, casi el 100% de los neutrófilos de sangre periférica humana son apoptóticos. En contraste, más del 50% de neutrófilos que se incubaron con A. phagocytophilum permanecen no apoptóticos durante un máximo de 48 h y un 10-20% a las 96 h, tal como se determina por la morfología de neutrófilos (Carlyon y Fikrig, 2003).A. phagocytophilum es capaz de inhibir la vía intrínseca de la apoptosis de los neutrófilos mediante la protección de la integridad de la membrana mitocondrial (Ge y Rikihisa., 2006).
Estudios realizados en células de garrapata indican que en estas también se inhibe el mecanismo de apoptosis tras la infección con Anaplasma (Ayllón et al., 2013). Esta aparece mediada por la porina T2 que es la proteína más abundante en la membrana externa de la mitocondria y se encarga de regular el flujo de los metabolitos principalmente aniónicos a través de la membrana mitocondrial externa (Figura 5).
1.6 Objetivos.
Con los antecedentes expuestos, surge este trabajo que tiene como objetivo estudiar el efecto de la infección producida por el patógeno A. phagocytophilum sobre los niveles de apoptosis en células de garrapata, comparando para ello dos líneas celulares de garrapata Ixodes ricinus
(IRE/CTVM20) de origen Europeo e Ixodes scapularis (ISE6) de origen Americano infectadas con tres aislamientos diferentes de Anaplasma phagocytophilum de origen humano (NY-18), canino y ovino.
La cepa de Anaplasma NY-18 fue aislada de un paciente humano en los EEUU (Aguero-Rosenfeld et al., 1996) mientras que las cepas aisladas de oveja y perro tienen origen Europeo que se escogieron para observar posibles diferencias en los mecanismos de interacción patógeno-vector.
Para comprobar que se estaba inhibiendo el mecanismo de la apoptosis Fig 5. Mecanismo de la apoptosis de tipo mitocondrial. La infección con A. phagocytophilum reduce los niveles de la porina T2 lo cual inhibe la apoptosis en células de garrapata. La Hexoquinasa regula la proteína T2 que a su vez regula la actividad de las caspasas por lo que en células infectadas se espera una reducción tanto de la actividad de las enzimas Hexoquinasa y caspasa 9. La infección con Anaplasma manipula la inmunidad innata de las células resultando en inhibición de su apoptosis. Fuente: Ayllón et al., 2013.
intrínseca de tipo mitocondrial se midió también la actividad de las enzimas hexoquinasa y caspasa-9, ya que durante la infección A. phagocytophilum
reduce la expresión de T2, lo que resulta en la inhibición de la apoptosis celular (Ayllon et al., 2013).
1.7 Hipótesis
Las hipótesis de este estudio fueron:
Hipotesis nula: La infección producida por el patógeno A. phagocytophilum en las líneas celulares de garrapata ISE6 e IRE/CTVM20 inhibe la apoptosis como mecanismo favorecedor de la infección temprana.
Hipotesis alternativa: La infección producida por el patógeno A. phagocytophilum en las líneas celulares de garrapata ISE6 e IRE/CTVM20 no inhibe la apoptosis.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Cultivos celulares.
La línea celular de I. ricinus derivada de embriones de garrapata IRE/CTVM20 (Bell-Sakyi et al., 2007) se mantuvo en una mezcla 1:1 de medio L-15 (Leibovitz) y medio L-15B (Munderloh y Kurtti, 1989) suplementado con suero fetal bovino (FCS) al 10%, 10% tryptose phosphate broth (TPB, Sigma–Aldrich), 0.05% lipoproteína bovina (MP Biomedicals) y 1% Glutamax (Life Technologies) (L-15/L-15B). La línea celular de I. scapularis derivada de embriones de garrapata ISE6 (Kurtti et al., 1996) se mantuvo también a 31°C pero en medio L-15B300 (Munderloh et al., 1999) suplementado con 5% FCS, 10% TPB, 0.1% lipoproteína bovina y 1% Glutamax (Life Technologies). Las células se cultivaron a una densidad aproximada de 106 células en un volumen de 2 ml en tubos sellados a 31°C.
2.2 Inhibición/inducción de la apoptosis
Las líneas celulares de garrapata ISE6 y IRE/CTVM20 se inocularon con tres aislamientos diferentes de Anaplasma phagocytophilum de origen humano NY-18, canino (donado por Eric Zweygarth), y ovino (Stuen et al., 1992). Aproximadamente 5x105-1x106células se recogieron inmediatamente después de la infección (0h) y a las 7h, 24h y 48h tras la infección.
También se realizó el experimento a diferentes temperaturas incubando las células de I. ricinus e I. scapularis con los tres aislamientos bacterianos a 4ºC y 37ºC durante 24 h.
Como controles se utilizaron células no infectadas recogidas a los mismos tiempos y procesadas de la misma manera que las infectadas. Todos los tratamientos se realizaron por triplicado. La apoptosis celular se midió mediante citometría de flujo con el kit Annexin V-FITC apoptosis detection kit (Immunostep, Salamanca, Spain) en un FAC-Scalibur equipado con el software CellQuest Pro (BD Bio- sciences, Madrid, Spain) (Ver material suplementario, página 34).
El kit usado nombrado anteriormente detecta cambios en la simetría de los fosfolípidos que se mide con la unión de la Anexina V (etiquetada con FITC) a la fosfatidilserina la cual se encuentra expuesta en la superficie externa de la membrana celular en células apoptóticas. Las células se tiñeron también con la tinción no vital de ioduro de propidio (PI) para discriminar las células intactas (negativas para Annexin V-FITC y PI) de las apoptóticas tempranas (positivas para Annexin V-FITC pero negativas para PI).
Con esta técnica se generaron citogramas o dot-plots consistentes en la representación de los parámetros Anexina V (FL1) en el eje horizontal e ioduro de propidio (FL2) en el eje vertical.
2.3 Extracción de ADN y ARN
Se utilizaron 200 μl de los cultivos celulares conteniendo aproximadamente 105 células para extraer ADN y ARN. Se centrifugaron las células a 200 x g durante 5 min y el pellet se reconstituyó en 100 μl de Tri-reagent. Se añadieron 10 μl de cloroformo y se agitó vigorosamente durante 15 segundos; se centrifugó a 12000 rpm durante 15 min a 2-8ºC y se aspiró la fase acuosa donde se encuentra el ARN. Esta fase se mezcló con 50 μl de isopropanol y se agitó, dejándolo reposar durante 5-10 minutos a temperatura ambiente (RT). Se centrifugó a 12000 rpm durante 10 min para precipitar el ARN en el fondo. Se aspiró el sobrenadante y se lavó con 100 μl de etanol al 75%, se aplicó vórtex durante varios segundos y se centrifugó a 7500 rpm durante 5 min a 2-8ºC. Finalmente, se dejó secar hasta que se evaporó el etanol y el ARN se disolvió en 20 μl con agua libre de nucleasas. El RNA extraído se almacenó a -80ºC hasta su siguiente uso. La interfase que contiene el ADN se aisló con el conjunto de productos y utensilios (kit) Blood and Tissue de QIAGEN. La concentración de ARN y ADN se determinó mediante el uso de sistema Nanodrop ND-1000 V3.5 (NanoDrop Technologies.Inc, Wilmington, United States)
2.4 Ensayos de actividad de la enzima Hexoquinasa
La actividad de la Hexoquinasa se midió utilizando un kit colorimétrico (BioVision, CA). Este ensayo se basa en la detección de un producto coloreado generado por la coenzima nicotinamida adenina dinucleótido
(NADH) producida por la actividad de la enzima Hexoquinasa. Se midió la actividad de la Hexoquinasa en células de garrapata ISE6 e IRE/CTVM20 no infectadas e infectadas con tres aislamientos diferentes de A. phagocytophilum a las 24 h de la infección (1x106 células; 1-2% células infectadas; n=3). Las células se dispusieron en placas de 24 pocillos y se procesaron siguiendo las recomendaciones del fabricante. El producto coloreado se cuantificó a 450 nm con un espectrofotómetro. La actividad de la Hexoquinasa se calculó y expresó en mU/ml. Los análisis estadísticos se realizaron con el test t-Student no pareado y con un nivel de significación fijado en p<0,05.
2.5 Ensayos de actividad de la enzima de apoptosis Caspasa 9 (CAS9) Se realizaron ensayos de apoptosis utilizando el kit colorimétrico de la caspasa 9 (CASP9, GenScript, Piscataway, NJ). Este ensayo se basa en la detección espectofotométrica del cromóforo p-nitroanilide (pNA) tras su excisión del sustrato LEHD-pNA. Se midió la actividad de CASP9 en células de garrapata ISE6 e IRE/CTVM20 no infectadas e infectadas con tres cepas diferentes de A. phagocytophilum a las 24 h de la infección (1x106 células; 1-2% células infectadas; n=3). Las células se dispusieron en placas de 24 pocillos y tras 24h de incubación con la bacteria se procesaron siguiendo las instrucciones recomendadas por el fabricante. La emisión de luz de pNA se cuantificó a 405 nm con un espectrofotómetro. La actividad relativa de CASP9 se determinó comparando la absorbancia de pNA de las células infectadas y no infectadas con la del control. Los análisis estadísticos de los resultados obtenidos se realizaron con el test t-Student no pareado y el nivel de significación se fijó en p<0,05.
2.6PCR a tiempo real
Para estudiar la cinética de crecimiento bacteriano se realizó PCR a tiempo real con el kit QuantiFast SYBR Green RT-PCR de QIAGEN empleando los protocolos recomendados por el fabricante para el termociclador Rotor-Gene Q de QIAGEN. Se utilizaron los oligos MSP4-L y MSP4-R del gen msp4 de A. phagocytophilum (Tabla 1). Los valores de Ct obtenidos se normalizaron con el gen 16S rRNA de garrapata (Tabla 1) utilizando el método delta delta Ct (Livak y Schmittgen, 2001). Las condiciones de los ciclos fueron 5 min a 95°C seguido de 40 ciclos de 10s a 95°C,30s a 55°C, y 30s a 60°C.
Tabla 1. Oligonucleótidos utilizados en este estudio
Gen Especie Nombre Secuencia
16S rRNA A. ph.* 16SANA-F CAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACG
16SANA-R GAGTTTGCCGGGACTTCTTCTGTA
16S rRNA Ixodes T16S5 GACAAGAAGACCCTA
T16S3 ATCCAACATCGAGGT
msp4 A. ph. MAP4AP5 ATGAATTACAGAGAATTGCTTGTAGG
MAP4AP3 TTAATTGAAAGCAAATCTTGCTCCTATG
MSP4-L CCTTGGCTGCAGCACCACCTG
MSP4-R TGCTGTGGGTCGTGACGCG
gltA A. ph. gtA1 GTAATAAATTGTATTATCAGAG
gtA2 AATACGTGAGTTTGAAACCA
GroEL A. ph GroEL1 AAATGGCGAATGTTGTWGTYAC
GroEL2 TTARAANCCNCCCATNCCNCCCATGCC
* Anaplasma phagocytophilum
2.7 Immunofluorescencia con células de garrapata
de los anticuerpos a una molécula específica y que al estar marcados con un fluorocromo pueden ser detectados. En nuestro caso realizamos una inmunofluorescencia secundaria haciendo uso de dos anticuerpos, el primario fueron anticuerpos policlonales generados en conejo frente a la proteína de superficie de A. phagocytophilum msp4 (major surface protein 4, de la Fuente et al., 2005), y como secundario se utilizaron anticuerpos anti-conejo generados en cabra y marcados con FITC (Sigma). Finalmente se empleó DAPI como marcador fluorescente de DNA.
Para los ensayos de inmunofluorescencia se utilizaron 200 μl de células de garrapata recogidas a las 0, 7, 24 y 48h tras la inoculación bacteriana. Las células se fijaron con paraformaldehído al 10% durante 1 h, después se lavaron con PBS (1 lavado durante 5 minutos) y se permeabilizaron con Tritón X-100/PBS durante 30 min. Se eliminó el Tritón X-100/PBS y se cubrieron las células con 0.1% SDS/PBS durante 10 min. Las células se lavaron de nuevo con PBS (3 lavados de 5 minutos cada uno) y se bloquearon con BSA (Invitrogen, Paisley, UK) durante 60 min tras lo cual se incubaron durante toda la noche a 4° C con inmunoglobulinas G purificadas (IgG) diluidas 1:100 en BSA. Después de tres lavados de 10 min con PBS, se incubaron en BSA durante 1 h a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con FITC (diluido 1:500 en PBS/BSA) durante 1 h. Finalmente se hicieron tres lavados de 10 minutos con PBS y se procedió al montaje de los portaobjetos, añadiendo una gota de DAPI en cada muestra y un cubreobjetos. Las imágenes fueron adquiridas con un microscopio Nikon Eclipse Ti-U con un objetivo de 60 aumentos y una cámara Nikon Digital Sight DS Vi1.
2.8 Análisis filogenético
Para confirmar la identidad de los tres aislamientos de A. phagocytophilum se amplificaron mediante PCR fragmentos de la secuencia de cuatro genes diferentes: 16S rRNA, msp4, GroEL, y gltA. Los productos de PCR se purificaron con el kit QIAquick PCR purification de QIAGEN y se enviaron a
secuenciar en ambas direcciones a Secugen (Madrid). Las secuencias obtenidas se analizaron mediante estudios bioinformáticos tales como BLAST para observar la similitud de dichas secuencias con otras ya presentes en la bases de datos de Genbank. Se seleccionaron varias secuencias homólogas que se alinearon con las obtenidas a través de este estudio mediante el programa Clustal Omega disponible en el European Bioinformatics Institute (EBI). Con estos resultados se procedió a construir un árbol filogenético basado en el programa ClustalW2.
3.RESULTADOS
3.1 A. phagocytophilum inhibe la apoptosis para favorecer la infección de células de garrapatas ISE6 e IRE/CTVM20
Se observó inhibición de la apoptosis tras la infección con A. phagocytophilum
en las dos líneas celulares de garrapata estudiadas. En las células de garrapata ISE6 los resultados mostraron una reducción del número de células apoptóticas sobre todo a partir de las 24 horas de la infección en las tres cepas, siendo esta aún mayor en la cepa de oveja. Entre las 0 y 7 horas se produjo un aumento de la apoptosis que se inhibió de forma acusada a las 24 horas. El crecimiento bacteriano aumentó desde las 0 a las 48 horas lo cual fue estadísticamente significativo para la cepa ovina a las 24 horas y para todas las cepas a las 48 horas (Fig. 6)
En las células de garrapata I. ricinus IRE/CTVM20 se observó de manera similar una disminución de la apoptosis a las 24 horas tras la infección en las tres cepas siendo esta aún mayor en la cepa de perro, a diferencia de las ISE6 en la que se observa mayor inhibición en la cepa de oveja. Se observó multiplicación bacteriana a partir de las 24-48h tras la infección, lo cual es estadísticamente significativo para las cepas de perro y oveja a las 24 horas y para todas las cepas a las 48 horas comparado con el tiempo 0 (Fig. 7).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 h 7 h 24 h 48 h P o rc e n ta je cé lu la s ap o p tó ca s No infectadas Humano Perro Oveja 0 10 20 30 40 50 60 70 80
Humano Perro Oveja No infectadas
In h ib ic ió n d e la ap o p to si s (% ) a la s 2 4 h tr as la in fe cc ió n 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0 h 7 h 24 h 48 h N iv e le s d e in fe cc ió n co n A . p h a g o cy to p h ilu m (u n id ad e s ar b it ra ri as ) No infectadas Humano Perro Oveja 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Humano Perro Oveja
C re ci m ie n to b ac te ri an o tr as la in fe cc ió n (% ) A las 24 h A las 48 h A B C D * * * * * * *
Fig 6. Efecto de la infección con A. phagocytophilum sobre los niveles de apoptosis en
células de garrapata Ixodes scapularis ISE6. A: Tras la infección con la bacteria se produce un incremento en los niveles de apoptosis celular que se inhibe a las 24h. B: La reducción en los niveles de apoptosis a las 24h es estadísticamente significativa comparada con el tiempo 0 h. C: Cinética de crecimiento bacteriano. D: El crecimiento bacteriano es estadísticamente significativo a las 24h para la cepa ovina y a las 48h para todas las cepas comparado con el tiempo 0 h.
3.2 Efecto de la temperatura de incubación en la infección con A. phagocytophilum sobre los niveles de apoptosis en células de garrapata de las líneas celulares ISE6 e IRE/CTVM20.
El rango fisiológico para el crecimiento de células de garrapata ISE6 e IRE/CTVM20 se sitúa entre los 28-31ºC. Para estudiar el efecto de temperaturas extremas en el crecimiento celular y bacteriano y su efecto sobre la apoptosis celular, se incubaron células infectadas y no infectadas a 4 y 37ºC durante 24 h. En el caso de las células ISE6, la infección con la bacteria no inhibió la apoptosis celular pero en el caso de las células IRE/CTVM20 se observó inhibición de la apoptosis que fue estadísticamente
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0h 7h 24h 48h P o rc e n ta je cé lu la s ap o p tó ca s No infectadas Humano Perro Oveja A 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0h 7h 24h 48h N iv e le s d e in fe cc ió n co n A . p h a g o cy to p h ilu m (u n id ad e s ar b it ra ri as ) No infectadas Humano Perro Oveja C 0 20 40 60 80 100 120
Humano Perro Oveja
C re ci m ie n to b ac te ri an o tr as la in fe cc ió n (% ) A las 24 h A las 48 h D * * * * * 0 10 20 30 40 50 60 70 80
Humano Perro Oveja No
infectadas In h ib ic ió n d e la ap o p to si s (% ) a la s 2 4 h tr as la in fe cc ió n * B
Fig 7. Efecto de la infección con A. phagocytophilum en los niveles de apoptosis en
células de garrapata Ixodes ricinus IRE/CTVM20.
A: Tras la infección con la bacteria se produce un incremento en los niveles de apoptosis celular que se inhibe a las 24h. B: La reducción en los niveles de apoptosis a las 24h es estadísticamente significativa comparada con el tiempo 0 h para el aislamiento de perro. C: Cinética de crecimiento bacteriano. D: El crecimiento bacteriano es estadísticamente significativo a las 24h para la cepa ovina y de perro y a las 48h para todas las cepas comparado con el tiempo 0 h.
ovino comparadas con las células no infectadas. A 4ºC para ambas líneas celulares infectadas con las tres cepas se observó el efecto contrario, un incremento de la apoptosis celular (Fig. 8).
3.3 La infección con A. phagocytophilum inhibe la actividad de la enzima
Hexoquinasa
La actividad de la enzima Hexoquinasa se ve reducida en las células de
0 10 20 30 40 50 60 70
Humano Perro Oveja
In h ib ic ió n d e la ap o p to si s a 3 7 °C ISE6 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 No infectadas
Humano Perro Oveja
P o rc e n ta je d e cé lu la s ap o p tó ca s (2 4 h ) ISE6 4°C 37°C 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 No infectadas
Humano Perro Oveja
P o rc e n ta je d e cé lu la s ap o p tó ca s (2 4 h ) IRE/CTVM20 4°C 37°C 0 10 20 30 40 50 60 70
Humano Perro Oveja
In h ib ic ió n d e la ap o p to si s a 3 7 °C IRE/CTVM20
*
*
A
B
C
D
Fig 8. Efecto de la temperatura y la infección con A. phagocytophilum sobre los niveles de apoptosis en células de garrapata (24 h).
A: A 37°C se produce inhibición de la apoptosis en células de garrapata I. scapularis
que no es estadísticamente significativa comparada con células no infectadas (B).
C: En las células de garrapata I. ricinus IRE/CTVM20, se produce una inhibición de la
apoptosis a 37°C que es estadísticamente significativa para las cepas de perro y
ovino de A. phagocytophilum comparada con células no infectadas (D).
En ambas líneas celulares se observa un incremento de la apoptosis cuando las células infectadas se incuban a 4°C.
garrapata de Ixodes ricinus infectadas con las cepas canina y ovina comparadas con las células no infectadas, mientras que para la cepa de humano no se observa una reducción significativa de la actividad enzimática. En el caso de las células de garrapata de Ixodes scapularis no se observó una reducción significativa de la actividad de la Hexoquinasa en células infectadas comparadas con las no infectadas (Fig 9).
3.4 La infección con A.phagocytophilum inhibe la actividad de la enzima
caspasa 9
La actividad de la caspasa 9 se ve reducida en las células de garrapata de
Ixodes ricinus infectadas con las tres cepas de Anaplasma con respecto a las células no infectadas. En el caso de las células de garrapata de Ixodes scapularis infectadas con la cepa humana se observa una ligera reducción en la actividad de la caspasa 9 que no es estadísticamente significativa (Figura 10). 2.5 3.5 4.5 5.5 6.5 7.5 8.5 9.5 No infectadas
Humano Perro Oveja
Ac vi da d de la He xo qu in as a (m U/ m l) IRE/CTVM20 * 2.5 3.5 4.5 5.5 6.5 7.5 8.5 9.5 No infectadas
Humano Perro Oveja
Ac vi da d de la He xo qu in as a (m U/ m l) ISE6 *
Fig 9. La infección con A. phagocytophilum inhibe la actividad de la enzima
Hexoquinasa a las 24 h únicamente en células de garrapata Ixodes ricinus
IRE/CTVM20. Los resultados son estadísticamente significativos (p<0.05) cuando se comparan células no infectadas de I. ricinus con células infectadas con las
2 2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 No infectadas
Humano Perro Oveja
N Iv e le s d e C A SP 9 O .D .4 0 5 n m ISE6 2 2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 No infectadas
Humano Perro Oveja
N Iv e le s d e C A SP 9 O .D .4 0 5 n m IRE/CTVM20
*
*
*
Fig 10. La infección con A. phagocytophilum inhibe la actividad de la caspasa 9 a
las 24 h tras la infección en células de garrapata Ixodes ricinus IRE/CTVM20. Los
resultados son estadísticamente significativos (p<0.05) únicamente cuando se comparan células no infectadas de I. ricinus con células infectadas con las tres
3.5 Inmunofluorescencia.
Tanto en las células de ISE6 como en las de IRE/CTVM20 se observaron mórulas bacterianas a partir de las 24 y 48 horas tras la infección con las tres cepas de origen humano, canino y ovino. A las 7 tras la infección y en las células no infectadas no se observaron mórulas bacterianas (Fig 9 y 10).
No infectadas Humano Perro Oveja 24 h 48 h
Fig 11. Células de garrapata Ixodes scapularis ISE6 teñidas con el anticuerpo frente
a la proteína msp4 de A. phagocytophilum. Se observaron mórulas bacterianas en
el citoplasma de las células a las 24 y 48h tras la infección con las tres cepas de A. phagocytophilum. De cada tiempo, la línea de la derecha representa las células teñidas con el anticuerpo frente a msp4 (verde) y la línea de la izquierda representa las mismas células teñidas con DAPI que tiñe el ADN tanto de la célula como de la bacteria (azul)
3.6 Análisis filogenético
Los análisis filogenéticos de los tres aislamientos de A phagocytophilum
usados en este estudio basados en secuencias de los genes msp4, GroEL y gltA confirmaron su identidad cuando se compararon con secuencias depositadas en la base de datos GenBank (Figura 13).
24 h 48 h No infectadas Humano Perro Oveja
Fig 12. Células de garrapata Ixodes ricinus IRE/CTVM20 teñidas con el anticuerpo
frente a la proteína msp4 de A. phagocytophilum. Se observaron mórulas
bacterianas en el citoplasma de las células a las 24 y 48h tras la infección con las tres cepas de A. phagocytophilum.
4. DISCUSIÓN
Las garrapatas del género I. scapularis son vectores conocidos de varias enfermedades de los seres humanos en América del Norte, incluyendo la enfermedad de Lyme, la babesiosis, y HGA (Massung et al., 2007).
Hay una comprensión limitada de cómo las bacterias patógenas evaden la
A
B
C
Fig 13. Análisis filogenético de diferentes cepas de A. phagocytophilum basado en
secuencias de A. msp4; B. GroEL; C. gltA. Las secuencias derivadas de este trabajo se han resaltado en rojo (NY-18), verde (perro) y azul (oveja).
defensa innata del huésped humano para causar la enfermedad. Puesto que los neutrófilos son la célula efectora de la respuesta inmunitaria innata más prominente en los seres humanos, la capacidad de los microorganismos para evadir los mecanismos de defensa es esencial para la patogénesis. A. phagocytophilum inhibe la apoptosis promoviendo así la supervivencia del patógeno dentro de granulocitos. Aunque se ha avanzado, no se conoce la base molecular de la patogénesis A. phagocytophilum (Borjesson et al., 2005). El uso de la citometría de flujo en nuestro estudio nos permitió detectar modificaciones en los niveles de apoptosis en células de garrapata no infectadas e infectadas con A. phagocytophilum de manera temprana (0-48h). Tanto en células ISE6 como IRE/CTVM20 infectadas con las tres cepas de humano, perro y oveja se observó una rápida inhibición de la apoptosis a las 24 horas tras la infección para favorecer la invasión y multiplicación bacteriana en el interior de las células. Cuando se analizó el crecimiento bacteriano tanto por PCR a tiempo real como por inmunofluorescencia, se observó que en la mayoría de los casos la bacteria no comenzaba a multiplicarse de manera significativa hasta las 24-48 h tras la infección lo cual sugiere que la marcada inhibición de la apoptosis celular favorece el establecimiento bacteriano dentro de las células y facilita su multiplicación a partir de las 24-48 h.
Entre las 0 y 7 horas no se observó una significativa inhibición de la apoptosis, quizás debido a que se trata de una infección muy temprana y las células se encuentran todavía estresadas debido a la infección. Cuando se compararon las dos líneas celulares se observó que la inhibición de la apoptosis fue más acusada en I. scapularis que en I. ricinus.
Cuando las células se incubaron a temperaturas de 4 y 37ºC se observó una inhibición de la apoptosis a las 24 h que solo fue estadísticamente significativa en el caso de las células de I. ricinus de origen europeo infectadas con las cepas de oveja y perro también de origen europeo, lo cual sugiere una mejor adaptación del patógeno al vector. De manera interesante se observó que la apoptosis se incrementó a 4ºC en todos los casos indicando que dicha
temperatura se encuentra fuera del rango fisiológico del patógeno.
Los ensayos de actividad de las enzimas involucradas en el mecanismo de la apoptosis, Hexoquinasa y caspasa 9, confirmaron resultados previos en los que se observó una inhibición de su actividad comparada con células no infectadas. Sin embargo, dicho efecto solo fue significativo a las 24 h en el caso de las células de I. ricinus y solo para las cepas de origen europeo en el caso de la enzima Hexoquinasa lo cual apunta a una diferencia importante entre las dos líneas celulares y su interacción con las diferentes cepas bacterianas.
Los resultados del análisis filogenético confirmaron las identidad de las tres cepas de A. phagocytophilum utilizadas en este estudio.
En este trabajo se describe el efecto de la infección temprana con un patógeno intracelular, A. phagocytophilum, sobre la apoptosis en células de garrapata. Los resultados demuestran que, efectivamente, la bacteria manipula este proceso biológico para su propio beneficio ya que la inhibición de la apoptosis facilita la invasión y posterior multiplicación intracelular de la bacteria.
Este estudio ha demostrado la utilidad de las líneas celulares de garrapata para el estudio de las interacciones patógeno-vector. Sería conveniente continuar con los experimentos para comprobar el efecto de la infección tardía con las diferentes cepas bacterianas sobre la apoptosis celular e incluso incluir células promielocíticas o endoteliales de hospedadores vertebrados para establecer una comparación con las células del vector.
5. CONCLUSIONES
Los experimentos descritos en este estudio refuerzan y confirman resultados de otros trabajos demostrando que la infección con A. phagocytophilum inhibe la apoptosis en dos líneas diferentes de células de garrapata ISE6 e IRE/CTVM20, lo cual sugiere la existencia de similares mecanismos de
Se observaron diferencias en el comportamiento de las dos especies de garrapata cuando se infectaron con las diferentes cepas bacterianas, lo cual aparece como un hallazgo interesante, pero que requiere una mayor información y profundidad en su análisis, dejando abierta la interrogante para futuros estudios.
La anaplasmosis granulocítica es una enfermedad zoonótica emergente y la más frecuentemente transmitida por garrapatas en animales de Europa por lo que es esencial seguir investigando para aumentar nuestro conocimiento de los mecanismos de interacción patógeno-vector-hospedador, aspecto fundamental para el desarrollo de vacunas.
6. AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quiero agradecer al Profesor José de la Fuente el haberme dado esta oportunidad, de la que he aprendido muchísimo y con la que me encantaría seguir en el futuro.
En segundo lugar al equipo del laboratorio de genética, a mis compañeros de máster, al Dr Mario Durán Prado (Facultad de Medicina, UCLM) por permitirme utilizar el microscopio y a la Dra Lesley Bell-Sakyi (Pirbright Institute, UK) por proporcionar los cultivos celulares de garrapata.
Y en tercer lugar y más importante a mi tutora Pilar Alberdi Vélez, por ser la doctora más paciente, inteligente y compasiva que he conocido en el IREC, sin ella este trabajo no hubiera sido posible.
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MATERIAL SUPLEMENTARIO 0 h ISE6 24h 0 h IRE/CTVM20 24h No infectadas Humano Perro Oveja
Citometría de flujo realizada con células de garrrapata ISE6 e IRE/CTVM20 teñidas para la deteccion de Annexin V (FL1, eje horizontal) e ioduro de propidio PI (FL2, eje vertical). Las celulas apoptóticas son positivas para la tinción de Annexin V pero negativas para el PI (cuadrante de abajo a la derecha).