EVALUACIÓN DEL MANTENIMIENTO DE BACTERIAS POR TRES
TÉCNICAS DE CONGELACIÓN A MEDIANO PLAZO
MARTHA C. LOZANO T.
LUISA F. CLAVIJO.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS
PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA
SANTAFÉ DE BOGOTÁ
JULIO 2001
AGRADECIMIENTOSA Dios por guiarnos siempre y brindarnos su fortaleza y su paciencia que nos permitieron culminar otra meta.
A nuestros padres que nos apoyaron y nos llenaron de ánimo para no rendirnos en el camino.
A nuestras familias que creyeron en nosotras.
A Marcela Gómez por su entrega y su enseñanza a lo largo de nuestro estudio.
A nuestros profesores por guiarnos e ilustrarnos en nuestra formación profesional.
A nuestros compañeros y amigos que compartieron con nosotras y nos brindaron su alegría en cada momento.
TABLA DE CONTENIDO
1. Introducción 9
2. Marco teórico 10
2.1 Preservación 11
2.1.1 Mantenimiento de viabililidad: 12 2.1.2 Cambio en las características: 12 2.1.3 Cambio de la población a través de la selección: 12
2.1.4 Evaluación del cultivo: 13
2.1.5 Costos: 13
2.1.6 Tamaño de la colección: 13
2.1.7 Pureza: 14
2.2 Métodos de preservación de corta duración
15
2.2.1 Método de subcultivo
15
2.2.3 Mantenimiento de las cepas bacterianas en aceite de inmersión 15
2.2.4 Métodos de congelación 16
2.2.4.1 Congelación ordinaria (0ºc –20ºc) 17 2.2.4.2 Congelación a –20ºc con discos de gelatina y desecación con silica gel. 18 2.2.4.3 Congelación a –20ºc con el uso de leche descremada y glicerol. 19
2.2.4.4 Congelación baja (-70ºc) 19
2.2.4.5 Almacenaje por congelación en perlas de vidrio a –70ºc: 20
2.2.4.6 Almacenaje a – 196°c 20
2.3 Métodos de congelación y preservación a largo plazo 21
2.3.1 Método de liofilización 21
2.5 Generalidades de las cepas bacterianas en estudio
23
2.5.1 Bacterias gram positivas 23
2.5.1.1 staphylococcus aureus 24 2.5.1.2 staphylococcus epidermidis 24 2.5.1.3 streptococcus mutans 25 2.5.1.4 enterococcus faecium 25 2.5.1.5 bacillus subtillis 25 2.5.1.6 listeria monocytogenes 25
2.5.2 Cepas gram negativas 25
2.5.2.1 pseudomonas aeruginosas: 26 2.5.2.2 escherichia coli: 26 2.5.2.3 shigella sp 26 2.5.2.4 salmonella sp: 26 2.5.2.5 klebsiella sp: 26 2.5.2.6 pasteurella multocida 26 3. Justificación 27
4. Objetivos
29
4.1. General
29
4.2. Específicos 29 5. Materiales y métodos 305.1 Tipo de estudio
30
5.2 Hipótesis 30 5.3 Manejo de datos 30 5.4 Cepas bacterianas 31 5.5 Métodos a estudiar 31 5.6 Tiempo de evaluación 315.6.1 Congelación a – 20ºc en leche descremada al 10% (skim milk) 32 5.6.2 Congelación a –20ºc en caldo tripticasa soya con adición de glicerol al 3% 33
5.6.3 Congelación a –20ºc en discos de gelatina 10% sobre silica-gel 33
5.7 Descongelación de cepas 34
5.8 Determinación de viabilidad 35
5.9 Determinación de recuperación 36
5.10 Determinación de pureza 36
5.10.1 cepas gram positivas 36
5.10.1.1 cocos 36
5.10.1.2 bacilos 37
5.10.2 cepas gram negativas 37
5.10.2.1 bacilos 37
6. Resultados 38
6.1 Viabilidad bacteriana posterior a la conservación en cada técnica 38 6.2 Evaluación de cada técnica de mantenimiento en los grupos de bacterias evaluados 45 6.3 Determinación de viabilidad posterior a cada técnica 47 6.3.1 Determinación de viabilidad posterior a la aplicación de leche descremada al 10%: 47
6.3.2 Determinación de viabilidad posterior a la aplicación de caldo triptona soya con adición de
glicerol al 3%: 48
6.3.3 Determinación de viabilidad posterior a la aplicación de discos de gelatina al 10% desecados
sobre silica gel 49
6.4 Determinación de identidad y pureza bacteriana 50
7. Discusión 53
7.1 Evaluación de la viabilidad bacteriana posterior a la conservación en cada técnica. 54 7.2 Evaluación del porcentaje de muerte bacteriana 55
7.3 Evaluación de cada técnica de mantenimiento en los grupos bacterianos (Gram positivos y Gram
negativos) 57
7.4 Determinación de viabilidad posterior a una incubación de 24 horas a 37ºCna.
RESUMEN
En este estudio se buscó comparar tres métodos de congelación a –20· c para el
mantenimiento y preservación de cepas bacterianas Gram positivas y Gram
negativas a mediano plazo.
Se realizó este estudio con el fin de encontrar el método más eficaz para dicho propósito y de esta manera implementarlo en el laboratorio de Microbiología especial de la pontificia Universidad Javeriana ya que en este no se realiza n ada diferente a los repiques.
El estudio se realizó durante tres meses consecutivos en donde la evaluación de recuperación, viabilidad y pureza de las cepas bacterianas, se hizo mensualmente.
Por medio de la estadística _______________ se determinó que existe relación entre los métodos empleados, el tiempo de preservación y la concentración de cepas recuperadas.
1. INTRODUCCIÓN
Durante muchos años, en el área de la
microbiología se han desarrollado varios estudios
sobre los microorganismos, los cuales no sólo se
limitan al conocimiento de sus características físicas,
químicas o biológicas sino también al diseño de
métodos de mantenimiento y conservación con fines
de investigación.
La información sobre el mantenimiento y conservación de cepas bacterianas es muy
amplia y también es distinta en su fondo para los diferentes grupos de
microorganismos; una gran variedad de técnicas están disponibles para estos fines y
no es fácil escoger el método más adecuado ya que estos se eligen teniendo en cuenta
las ventajas y desventajas que estos proporcionan a los microorganismos en estudio y
al investigador, las necesidades del microorganismo para su desarrollo y los fines de
la investigación (Kirsop y Snell, 1983).
Algunos de estos métodos son, subcultivos, congelación, liofilización, desecación etc., y como se mencionó anteriormente cada método se emplea según las conveniencias de una necesidad en particular, no obstante, a veces se hace necesaria la conjugación de varios métodos para lograr los fines deseados (Alexander, 1980).
2. MARCO TEÓRICO
Se han descrito varios métodos eficaces para la preservación y ma ntenimiento de
cepas bacterianas, sin embargo no ha sido posible establecer un protocolo universal
para este propósito ya que los microorganismos difieren en su estructura y por
consiguiente en su tolerancia a los diferentes métodos.
La preservación de cultivos es extremadamente importante y debe dársele la misma atención que a la estandarización de equipos, ya que numerosos estudios han fracasado por la pérdida y la variación en las cepas como resultado de una preservación inadecuada (Gerhadt, 1994).
Algunos métodos de preservación han sido aplicados solo a un grupo estricto de microorganismos con excelentes resultados, pero esto no quiere decir que no se pueda ampliar la posibilidad de aplicarlos a otros grupos (Gherma, 1981); algunos de estos métodos son: Subcultivos en medios apropiados dependiendo del microorganismo, desecación y liofilización, congelación, congelación a –20ºC con discos de gelatina y silica gel, como crioprotector congelación –20ºC con el uso de leche descremada y glicerol (Stamp , 1947; Gherna, 1981; Kirsop et al, 1984; Gao et al, 1995).
Es importante tener en cuenta para asegurar el éxito en la preservación y mantenimiento de las cepas la edad del cultivo, la correcta identificación de estas y por supuesto trabajar bajo condiciones de esterilidad para evitar contratiempos de contaminación que perjudiquen el estudio (Gherna, 1991).
La preservación de las cepas bacterianas tiene como objetivo mantener al
microorganismo viable, no contaminado, sin cambios en sus características genéticas,
conservando sus propiedades morfológicas, taxonómicas y bioquímicas, logrando así
condiciones óptimas para que el microorganismo aislado sea igual a la cepa original
(Snell, J.J.S, 1984).
No todas las especies responden igual a los métodos de conservación y preservación, por esta razón diferentes laboratorios e instituciones, incluido el Laboratorio de Microbiología Especializada de la Pontificia Universidad Javeriana también varían los requerimientos necesarios para la conservación de las diferentes cepas bacterianas, empleando técnicas diferentes que pueda conservar el microorganismo de la mejor manera posible.
Todos los métodos ofrecen ventajas y desventajas, la elección del método para un uso particular debe ser compatible a las necesidades del usuario. Los rasgos a considerar se describen a continuación: 22.1.1 MANTENNIMIENTO DE VIABILILIDAD :
En la conservación de un cultivo de microorganismos, están implicados tanto el mantenimiento como la preservación de una cepa bacteriana. El mantenimiento de una cepa bacteriana significa que el cultivo debe permanecer vivo y puro en el procedimiento, mientras que la preservación significa mantener la cepa bacteriana con un potencial biológico constante por un periodo de tiempo prolongado. Para que esto pueda llevarse a cabo, las instalaciones, el material empleado en el laboratorio y su manipulación durante este proceso deben cumplir las normas de esterilidad; especialmente cuando se trabaja con un amplio stock de microorganismo s (Weiss, F.A, 1957).
2.1.2 CAMBIO EN LAS CARACTERÍSTICAS :
Durante el almacenamiento, los cambios genéticos pueden ocurrir como resultado de mutaciones por perdida de plásmidos. Por esta razón es importante que las cepas preservadas no pierdan sus características que las hacen importantes. Así que las técnicas de preservación deben evitar la ocurrencia de dichos eventos, se recomienda soluciones con bajas concentraciones de agentes selectivos, para mantener la presión selectiva uniforme en estado pre servado (Weiss, F.A, 1957).
2.1.3 CAMBIO DE LA POBLACIÓN A TRAVÉS DE LA SELECCIÓN:
Una proporción de las células en una población puede morir durante el proceso de preservación inicial y esto puede ser de poca importancia para el investigador si se usan inicialmente concentraciones altas en el número de células. Sin embargo, la reducción en el número de células viables puede producir la selección de una población sobreviviente de células resistentes y puede introducir la posibilidad de cambios en las características de la cepa en conservación. El método de preservación debe tener el mayor número de células viables para que la población sobreviviente se asemeje lo mas estrechamente posible a la población original (Kirsop et al, 1984).
2.1.4 EVALUACIÓN DEL CULTIVO:
La preservación por dos o más métodos de conservación y almacenamiento en diferentes lugares, es aconsejable, ya que asegura la duración por muchos años y evita costos elevados, y las perdidas serán mínimas con relación a las cepas bacterianas.
2.1.5 COSTOS:
Algunos métodos requieren inicialmente un gasto elevado generado por equipos, facilidades de almacenamiento, materiales y gasto en personal. El elevado costo de capital en equipos para algunos métodos como el liofilizador, pueden compensarse con los reducidos costos de personal, ya que la estabilidad por largo plazo de los cultivos disminuye la necesidad de una intervención por parte del personal de uso frecuente (Kirsop et al, 1984).
2.1.6 TAMAÑO DE LA COLECCIÓN:
El principal factor para ser considerado al escoger el método es el tiempo requerido en la preservación inicial y por consiguiente la manipulación, si se requiere una o más copias; encontrar un método apropiado para la preservación de cepas puede ser un proceso excesivo cuando el número de
cepas es elevado. El método para un gran stock debe estar relacionado con la cantidad de espacio disponible para su almacenamiento (Gerhardt, 1994).
2.1.7 PUREZA:
Los cultivos conservados para todas las aplicaciones deben permanecer puros, y el método de preservación debe minimizar el riesgo de contaminación, este evento perjudica cualquier estudio y aumenta el riesgo de perder la cepa inicial (Kirsop et al, 1984).
Los métodos de conservación más utilizados se clasifican en métodos de corta y larga duración:
CORTA DURACIÓN: Los métodos de corta duración son: Método de Subcultivo, Mantenimiento de cepas bacterianas en Aceite de Inmersión, Métodos de Congelación (a -20°C por Congelación ordinaria, -20°C con Discos de Gelatina y Desecación sobre Silica Gel, -20°C con el uso de Leche Descremada y Glicerol, -70°C en Perlas de Vidrio, -70°C por Congelación, -196°C).
2.2 MÉTODOS DE PRESERVACIÓN DE
CORTA DURACIÓN
2.2.1 MÉTODO DE SUBCULTIVO
Consiste en la inoculación de cepas puras en medios de cultivo específicos seguido de una incubación a una temperatura conveniente, generalmente a 37ºC, para obtener el crecimiento del microorganismo, y posteriormente almacenarlo en condiciones adecuadas como la refrigeración, pero si hay inconveniente, el almacenamiento puede hacerse a temperatura ambiente (18ºC – 20ºC); el proceso se repite a intervalos cortos de tiempo que aseguren la preservación de un cultivo fresco antes de que el viejo muera. El tiempo que puede permitirse pasar entre los subcultivos sin riesgo de perder las cepas depende del microorganismo en particular, los aislamientos deben realizarse por duplicado para evitar la perdida de las cepas y por supuesto verificar la pureza de las cepas antes de realizar el aislamiento (Kirsop et al, 1984).
2.2.3 MANTENIMIENTO DE LAS CEPAS BACTERIANAS EN ACEITE DE INMERSIÓN
Mediante este método se ha logrado preservar gran variedad de cepas bacterianas a mediano plazo (Perkins, 1962). El microorganismo se siembra en un medio adecuado, ya sea en caldo, agar inclinado o medio semisólido, y una vez el microorganismo se halle en fase de crecimiento (18 -20 horas), se adiciona 2ml del aceite mineral estéril, se sella o se almacena en refrigeración ó al medio ambiente (Perkins, 1962). El aceite se esteriliza por calor seco (horno) a 180ºC por dos horas, en tubos tapa rosca colocando 5ml por tubo; generalmente la contaminación de los cultivos se debe a la mala esterilización del aceite por esta razón es necesario hacer un control de esterilidad al aceite, sembrando en agar nutritivo (Perkins, 1962). Este método es económico y se emplea con frecuencia, sin embargo, presenta desventajas como la contaminación y la perdida de viabilidad (Bank, 1995).
2.2.4 MÉTODOS DE CONGELACIÓN
En la preservación por congelación, se forman cristales de agua, que por esta razón perjudican la integridad de los
microorganismos. Los microorganismos deben ser deshidratados para ser almacenados a bajas temperaturas. El daño puede causarse durante la fase refrescante y el deshelar subsecuente, esto puede ser causado por la concentración de electrolitos a través del levantamiento de agua como hielo o por la formación de los cristales de hielo que pueden dañar la integridad y la morfología del microorganismo (Snell, J.J.S, 1984).
Los esfuerzos por limitar este daño pueden lograrse por el ajuste del proceso de descongelar y la adición de crioprotectores como el glicerol o leche descremada a la suspención celular (Gao et al, 1995).
Los métodos descritos anteriormente presentan algunas ventajas y desventajas, sin embargo, siempre debe buscarse y emplearse el método que se ajuste a las necesidades del microorganismo o microorganismos en estudio, por estas razones no se descarta la posibilidad de conjugar dos o más métodos para lograr los fines deseados (Alexander, 1980).
Los métodos de conservación por congelación pueden ser extensos y son clasificados de acuerdo a la temperatura de almacenaje, estos son: -20ºC, -30ºC, -40ºC, -70ºC, -140ºC, y –196ºC; en general la temperatura sobre los –30ºC genera mejores resultados, la conversión a –70ºC ha sido empleada para una variedad de microorganismos incluyendo bacterias, hongos, Mycoplasma y virus; la conservación a –140ºC (Vapor de nitrógeno) y –196ºC (nitrógeno líquido) son empleados para microorganismos que no pueden ser preservados en otras condiciones (Snell, J.J.S, 1984).
2.2.4.1 CONGELACIÓN ORDINARIA (0ºC –20ºC)
Este proceso no es muy recomendado para la preservación de cepas debido a que la congelación daña las células. Cuando la temperatura de cualquier suspensión celular se halla bajo 0ºC, el agua del líquido extracelular comienza a congelarse y se forman cristales de hielo que aumentan la
concentración del soluto y el agua intracelular migra al exterior por diferencia en la presión osmótica, al removerse el agua del interior se produce daños celulares y por consiguiente la perdida de las mismas (Kirsop et al, 1984).
2.2.4.2 CONGELACIÓN A –20ºC EN DISCOS DE GELATINA Y DESECACIÓN SOBRE SILICA GEL.
En este método originalmente descrito por Stamp (1974), los microorganismos son suspendidos en una gelatina nutritiva, esta se sirve en cajas de Petri hasta que se solidifiquen, luego de esto se sacan los discos los cuales son puestos a desecación almacenados sobre silica-gel y congelados a –20ºC.
El propósito de este, es lograr que pare el metabolismo celular lo cual se logra con la congelación, requisito para la preservación y almacenamiento a largo plazo de las cepas bacterianas en un estado esencialmente natural sin variantes morfológicas ni fisiológicas (Reusser, 1963). La función que ejerce la silica-gel en el proceso de congelación es atrapar la mayor cantidad de moléculas de agua para que los cristales junto con la acumulación de electrolitos no causen daños celulares irremediables (Kirsop et al, 1984).
La contaminación por este método es menor en comparación con el uso de subcultivos en serie; la viabilidad a largo plazo parece ligeramente buena, por otra parte es un método donde se puede preservar las cepas bacterianas sin que sufran cambios genéticos aparentes que modifiquen la cepa inicial (Reinhard, 1966).
La desecación en silica gel es un procedimiento fácil, rápido y económico, los tubos con silica son esterilizados a 180ºC por 2 horas ; se agrega la suspención bacteriana en leche descremada al 10% o los discos de gelatina con una concentración bacteriana conocida. Se cubre y se llevan a refrigeración.
La silica es un absorbente que tiene la capacidad de resistir altas y bajas temperaturas y controlar la humedad sin alterar su estructura (Jackson, 1969; Kirsop y Snell, 1984).
2.2.4.3 CONGELACIÓN A –20ºC CON EL USO DE LECHE DESCREMADA Y GLICEROL.
El glicerol y la leche descremada son agentes crioprotectores eficaces, empleados ampliamente en criopreservación de microorganismos, y su función es prevenir el daño celular. El glicerol como crioprotector tiene la capacidad de actuar como un radical hidroxilo, lo cual le permite estabilizar la estructura de la membrana celular, penetrar a la célula y también actúa como nutriente, tiene una baja toxicidad biológica para la célula y la capacidad de atrapar los fragmentos de agua descongelada a cualquier temperatura baja (Miura, 1994). La leche descremada funciona disminuyendo la tensión termal causada principalmente por la expansión del volumen del agua durante la formación del hielo (Gao et al, 1995).
2.2.4.4 CONGELACIÓN BAJA ( -70ºC)
En este proceso se hace el mantenimiento de las cepas a –70ºC, este involucra la congelación bacteriana en presencia de sustancias crioprotectoras. Estos crioprotectores pasan a través de la membrana celular y producen una protección intra y extra celular contra la congelación (Gao et al, 1995).
Una vez las bacterias han crecido en un medio apropiado, se hace una suspensión de estas en un caldo con el crioprotector y se dispensan en los viales para llevarlos a congelación, para la recuperación se debe realizar una recuperación rápida colocando las suspensiones a 37ºC (Gherna, 1991).
Este método de almacenamiento en pequeñas perlas de vidrio en glicerol ha sido empleado exitosamente para gran variedad de bacterias, el método es muy fácil y rápido y no requiere de una subsecuente manipulación durante el almacenaje. La desventaja que presenta este método de conservación es el elevado costo del congelador a –70ºC (Jones et al, 1978).
2.2.4.6 ALMACENAJE A –196°C (Nitrógeno líquido)
El almacenaje en líquido o vapor de nitrógeno es el método universal más aplicable de todos los métodos de conservación. Es utilizado para hongos, bacterias, virus, algas, protozoos y cultivos celulares que son preservados exitosamente mediante este método. El método tiene como principal desventaja que el nitrógeno líquido se evapora y requiere ser reemplazado regularmente, por consiguiente, los costos de equipos y materiales son elevados (Straws; Kirsop; James, 1984).
2.3 MÉTODOS DE CONGELACIÓN Y PRESERVACIÓN A LARGO PLAZO
2.3.1 MÉTODO DE LIOFILIZACIÓN.
Se suspenden organismos en un medio especifico, helado y expuesto al vacío. El vapor de agua se entrapa en un condensador refrigerado o con pentóxido de fósforo, después del secado los microorganismos son almacenados al vacío o en gas inerte en viales individuales o ampollas (kirsop et al, 1984).
Para este proceso los microorganismos se suspenden en un medio apropiado que le sirva de soporte, almacenados en viales, congelados y expuestos a un sistema de vacío, donde el agua es removida y convertida en vapor, sin pasar por el estado líquido. El resultado es un producto soluble en agua que puede ser fácilmente rehidratado (Kirsop et al, 1984).
Este sistema se ha empleado por muchos años para preservar una gran variedad de materiales biológicos que son sensibles al calor. La naturaleza no destructiva de este proceso se ha demostrado por la viabilidad observada en estudios realizados en virus y otros microorganismos (Bank, 1995).
Generalmente todas las cepas bacterianas se pueden someter a este proceso utilizando como medio de soporte leche descremada al 20%. Para este proceso las cepas deben ser puras de un cultivo de 18-24 horas, y debe hacerse control de viabilidad y esterilidad para poder determinar la efectividad del proceso, para ello se toman más o menos del 10% de los viales, y se reconstituyen en caldo nutritivo estéril y se siembra en un medio adecuado de acuerdo a la cepa e incuban por 18 horas, transcurrido ese tiempo se espera observar crecimiento de las cepas con las mis mas características de las que se aislaron inicialmente (Gao et al, 1995).
Las desventajas que se pueden presentar en este tipo de conservación bacteriana son los altos costos por la adquisición de equipos comerciales y los cambios que pueden sufrir algunas cepas bacterianas durante el proceso de recuperación, como cambios en la morfología, características físicas, perdida de plásmidos y algunas veces cambios en la población (Snell, J.J.S, 1984).
2.4 PAPEL PROTECTOR DE LOS CRIOPROTECTORES
La función principal de los crioprotectores es prevenir el daño ocasionado a las células por la criopreservación, tienen la capacidad de actuar como radical hidroxilo y estabilizar la estructura de las membranas de las células, presentan habilidades de penetrar las memb ranas de las células y producen una protección intra y extra celular contra la congelación (Miura, 1994).
Los agentes crioprotectores funcionan disminuyendo la “Tensión termal” fuerza que causa el rompimiento de células y fractura de órganos helados, causada principalmente por la expansión del volumen de agua durante la formación de hielo (Gao et al, 1995).
Algunos agentes crioprotectores empleados en procesos de congelación y liofilización son el glicerol, y la leche descremada respectivamente. Sin emb argo, se emplean para estos procesos otras sustancias
como el dextran, la gelatina, la glucosa, lactosa, el manitol, el sorbitol y la sacarosa que también protegen la membrana extracelular (Miura, 1994).
2.5 GENERALIDADES DE LAS CEPAS BACTERIANAS EN ES TUDIO
2.5.1 BACTERIAS GRAM POSITIVAS
Las bacterias Gram positivas poseen varias características que ayudan a diferenciarlas de los microorganismos Gram negativos, estas son el elevado contenido de glucopéptidos y bajo contenido lipídico de sus paredes celulares, lo cual les permite retener el colorante de cristal violeta de la tinción de Gram (Desarrollada por el médico Danés Hans, Cristian Gram; de aquí su nombre) debido a que los alcoholes y otros solventes orgánicos no penetran en las paredes celulares , deficientes en lípidos. Son en general más resistentes a los efectos de la desecación, el calor y la luz solar, así como la acción de sustancias químicas (Mattar y Melo, 1998). Las paredes celulares son las capas más externas de estos microorganismos (Incluyendo las cápsulas), esencialmente gruesas(20-80nm) y consisten en un 50-60% de péptido glicano, extensivamente entrecruzado en tres dimensiones, para formar una red polimérica gruesa; el restante esta compuesto de ácidos teicóicos, ácidos teicurónicos y lipopolisacáridos en bajas proporciones. Todas las células Gram positivas poseen un polímero lineal de ácido N- acetilmurámico que cruza hacia el polímero adyacente. Los ácidos teicóicos, están unidos al ácido murámico de la cepa de peptidoglicano y se presentan en dos formas principales: ácido ribitol teicóico y ácido glicerol teicóico. En general hay polímeros largos ya sea de ribitol (Un alcohol azúcar de cinco carbonos) o un glicerol (alcohol azúcar de tres carbonos) unidos entre sí a través de puentes fosfodiester. Sin embargo, los grupos hidroxil de ribitol o subunidades de glicerol están unidos a diferentes azucares o aminoácidos. Debido a que estos ácidos teicóicos son altamente antigénicos (Inducen en el huésped la producción de anticuerpos que reaccionan contra estos) parece que se extienden a través de la capa de peptidoglicano, y por lo tanto brindan determinantes antigénicos utilizados en la identificación serológica de muchos grupos y especies de bacterias Gram positivas
(Howard, 1983; Wesley, 1993). Para la mayor parte de las proteínas no se encuentran como constituyentes de la pared celular de este grupo, una excepción es la proteína M del Streptococcus del grupo A .
2.5.1.1 Staphylococcus aureus: Aerobio facultativo, que convierte el peróxido de hidrógeno en agua
por poseer la enzima catalasa, fermenta azucares, a las pruebas de manitol y coagulasa positivo (Brock, 1982).
2.5.1.2 Staphylococcus epidermidis: Aeorbio facultativo, catalasa positivo, coagulasa negativo,
sensible a novobiocina (Brock, 1982).
2.5.1.3 Streptococcus mutans: Coco que se adhiere a los dientes, catalasa negativa, hemólisis alfa,
pertenece al Streptococcus del grupo viridans (Brock 1982).
2.5.1.4 Enterococcus faecium: Cocos en cadena que se caracterizan por la producción de ácido
láctico, no forman gas a partir de glucosa, catalasa negativa (Brock, 1982).
2.5.1.5 Bacillus subtilis: Bacilos con endosporas que principalmente ocupan posición central,
aerobios facultativos, catalasa positivos (Brock, 1982).
2.5.1.6 Listeria monocytogenes: Catalasa positivo, motilidad positiva de 20-25ºC por 48-72 horas,
Beta-hemolítico (Brock, 1982).
2.5.2 CEPAS GRAM NEGATIVAS
La pared celular de las bacterias Gram negativas es más compleja desde el punto de vista químico, estructuralmente poseen una membrana citoplasmática fosfolipídica, rodeada por una capa de peptidoglicano que delimitan el espacio periplasmático, así como una pared externa que contiene elementos intercalados como lipopolisacáridos (LPS), moléculas construidas sobre la región core y una cadena lateral. El LPS es un complejo lipídico en el que intervienen, un lípido A (Disacárido de glucosamina) un polisacárido, de extrema importancia por su toxicidad para los animales, recibiendo el nombre de endotoxina; aunque esta se encuentra asociada principalmente con el lípido A, mientras que
el polisacárido constituye el antígeno O somático. Otros elementos de la membrana son lipoproteínas, porinas y otras proteínas las cuales son bastante complejas e irradian los flagelos, las fimbrias o pilis. Al microscopio con la tinción de Gram estos microorganismos se observan rosados por tomar el colorante de fucsina de la técnica debido a que el colorante en estas bacterias actúa como un solvente de los lípidos presentes, los poros de la pared se aumentan de tamaño y el complejo cristal violeta menos yodo se libera (Howard, 1983; Wesley 1993).
2.5.2.1 Pseudomonas aeruginosa: Bacilos con flagelos polares, no forman gas a partir de glucosa,
oxidasa positivos, no fermentadores, poseen cápsula (Brock, 1982).
2.5.2.2 Escherichia coli: Habitante de vía intestinal, sintetiza vitamina K en el intestino, aerobio
facultativo, produce ácido a partir de glucosa, catalasa positivo, oxidasa negativa (Brock, 1982).
2.5.2.3 Shigella sp: Bacilo, oxidasa negativa, catalasa positiva, muy relacionado con E. coli (Brock,
1982).
2.5.2.4 Salmonella sp: Son mótiles, forman gas a partir de glucosa, son bacilos Gram negativos
(Brock, 1982).
2.5.2.5 Klebsiella sp: Bacilos con cápsula, forma gas a partir de glucosa, oxidasa negativo (Brock,
1982).
2.5.2.6 Pasteurella multocida: Son bacilos pleomórficos presentan gránulos bipolares, oxidasa
3. JUSTIFICACIÓN
En todos los laboratorios de microbiología se hace necesaria la preservación de
microorganismos ya sea para fines docentes, de información, o de investigación,
características que hacen que se estudie diversas técnicas y mecanismos para la
preservación de estas.
Para el estudio hay que tener en cuenta que las bacterias poseen diversas
composiciones estructurales y bioquímicas, propiedades que indican que no se podrá
establecer un protocolo universal.
En los ensayos de los diversos métodos de preservación ocurren varios eventos como
la muerte de una proporción de células de una población y aunque este fenómeno no
sea muy significativo cuando se emplean altas concentraciones celulares, la reducción
de estas puede producir la selección de una población resistente de células
supervivientes y se puede introducir la posibilidad de cambio en las características de
la cepa en conservación (Kirsop et al, 1984). El método de preservación debe retener
el mayor número de células viables para que la población superviviente se asemeje lo
más estrechamente posible a la población original.
La muerte de las células durante estos procesos en el futuro produce inaceptables
niveles de viabilidad, para evitar pérdidas, la cepa debe ser sometida a un proceso que
minimice estas, por ejemplo, el empleo de sustancias crioprotectoras que eviten el
daño celular causado por la formación de cristales y aumento de electrolitos durante
la congelación y la temperatura final de almacenamiento (Feltham et al, 1978), para
que una vez las cepas en conservación sobrevivan largos periodos.
En este estudio se evaluara el uso de algunos métodos de conservación para cepas
bacterianas como Silica-Gel + Gelatina al 10%, Glicerol al 3% y Leche Descremada
al 10%, y teniendo en cuenta el estudio realizado en el laboratorio de Microbiología
especial de la Pontificia Universidad Javeriana
“ COMPARACIÓN DE TRES TÉCNICAS DEPRESERVACIÓN POR CONGELACIÓN A –20 ºC PARA EL MANTENIMIENTO DE BACTERIAS
GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS”
, se evaluarán durante un tiempo mayor a 4
semanas, en este caso 3 meses para determinar el tiempo máximo de conservación de
cada técnica y la concentración celular será mayor.
4. OBJETIVOS
4.1. GENERAL
Establecer un método eficaz para el mantenimiento y conservación de cepas
bacterianas a mediano plazo.
4.2. ESPECÍFICOS
Comparar la viabilidad de bacterias Gram positivas y Gram negativas sometidas a
Congelación en Glicerol al 3%, Leche Descremada al 10% y Silica Gel + Gelatina al
10% durante tres meses.
Determinar cual de los tres métodos es más apropiado para el mantenimiento y
conservación de cepas bacterianas.
Implementar estos métodos en el laboratorio de Microbiología especial de la
Pontificia Universidad Javeriana debido a que en este no se practica nada diferente a
los repiques.
Mantener cepas bacterianas viables en el laboratorio de microbiología de la Pontificia
Universidad Javeriana para que se puedan establecer como un recurso de
información y de apoyo para la investigación.
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 TIPO DE ESTUDIO
Este estudio fue realizado en el laboratorio de Microbiología Especializada de la Pontificia Universidad Javeriana, como modelo experimental de tipo comparativo, en el que se evaluó el uso de Caldo Tripticasa Soya con adición de glicerol al 3%, leche descremada al 10% y Discos de Gelatina al 10% sobre Silica-Gel como métodos de mantenimiento a mediano plazo y de preservación de cepas bacterianas Gram positivas y Gram negativas.
5.2 HIPÓTESIS
Ø Hipótesis nula (Hn): No existe relación entre las variables concentración bacteriana recuperada, el tipo de sistema de preservación empleado y el tiempo de preservación según la cepa bacteriana, es decir, el resultado se debe al azar.
Ø Hipótesis alterna (Ha): Plantea que existe una relación entre la concentración de cada cepa bacteriana recuperada, la técnica empleada y el tiempo de preservación.
5.3 MANEJO DE DATOS
El manejo de datos se realizo por medio del programa Start View 4.0. En el que se evaluaron las variables: Tiempo vs. Concentración de bacterias, Evaluación de recuperación de cepas bacterianas en cada técnica vs. Tiempo, Viabilidad vs Tiempo, y evaluación de recuperación de cepas bacterianas en cada técnica vs. Pureza.
5.4 CEPAS BACTERIANAS
Las cepas usadas en este estudio proceden del Cepario de Microbiología Especializada de la Pontificia Universidad Javeriana mantenidas normalmente por repiques consecutivos.
Ø Cocos Gram positivos: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecium,
Streptococcus mutans.
Ø Bacilos Gram negativos: Escherichia coli, Shigella sp, Salmonella sp, Klebsiella sp, Pseudomonas
aeruginosa, Pasteurella multocida.
5.5 MÉTODOS A ESTUDIAR
Ø Congelación a –20ºC en Leche Descremada al 10% (Skim Milk)
Ø Congelación a –20ºC en Caldo Tripticasa Soya con adición de Glicerol al 3% Ø Congelación a –20ºC en Discos de Gelatina al 10% sobre Silica-Gel
5.6 TIEMPO DE EVALUACIÓN
Las cepas se preservaron por un periodo de tres meses y las evaluaciones de viabilidad y recuperaciones respectivas se realizaron mensualmente y por duplicado.
Para el ensayo se tomó una colonia de cada una de las cepas bacterianas a partir de cultivos jóvenes previamente incubados a 37ºC durante 24 horas, y se suspendieron en Caldo Eugebion, estas fueron llevadas a escala 2 de turb idez de Mc. Farland correspondiente a 6x10^8 UFC/ml.
Posteriormente se procedió a montar cada uno de los métodos de preservación para evaluar viabilidad bacteriana:
5.6.1 CONGELACIÓN A –20ºC EN LECHE DESCREMADA AL 10% (SKIM
MILK)
El polvo de leche desnatada se emplea como aditivo que mejora las condiciones de crecimiento de los microorganismos presentes, y el uso de esta ofrece un soporte sólido para la congelación (Gibson y Khoury, 1986), por la presencia de sustancias conocidas como osmoprotectoras, osmolitos o solutos compatibles. Los osmolitos son acumulados usualmente en las células durante periodos de estrés
osmótica y pueden estabilizar funciones fisiológicas inestables de proteínas citoplasmáticas u otras estructuras bajo estas condiciones (Ryser y Marth, 1999). El medio fue basado en la fórmula descrita por Gibson y Khoury (1986) y Gherna (1994) con las siguientes modificaciones.
Ø El ensayo se montó por duplicado para cada cepa, dispensando 9ml de Leche Descremada al 10% (Anexo No 1) en tubos tapa rosca (16x150 mm) y 1ml de cada una de las suspensiones bacterianas, llevando a diluciones de 1/10, a continuación de estas diluciones se tomaron alicuotas de 1ml y se dispensaron en viales plásticos.
Ø Los viales fueron llevados a congelación a –20ºC.
5.6.2 CONGELACIÓN A –20ºC EN CALDO TRIPTICASA SOYA CON ADICIÓN DE GICEROL AL 3%
El caldo Tripticasa Soya es un medio altamente nutritivo que se emplea para cultivar gran variedad de cepas bacterianas; el glicerol se adiciona como crioprotector que pasa a través de la membrana celular y produce una protección intra y extracelular contra la congelación (Gao et al, 1995).
Ø Al igual que con la Leche Descremada, cada cepa bacteriana se montó por duplicado dispensando 9ml de Caldo Tripticasa Soya con adición de Glicerol al 3% (Anexo No 2) en tubos tapa rosca (16x150mm) y 1ml de las suspensiones para llevar a diluciones de 1/10 y se alicuotó de 1ml en viales plásticos y se congelaron a –20ºC.
5.6.3 CONGELACIÓN A –20ºC EN DISCOS DE GELATINA 10% SOBRE
SILICA-GEL
El método originalmente descrito por Stamp (1947), se basa en que los microorganismos son suspendidos en una Gelatina nutritiva, esta se pone en cajas de Petri hasta que solidifique, luego de esto se sacan los discos los cuales son puestos a des ecación almacenados sobre Silica-Gel, cuya
función es atrapar la mayor cantidad de moléculas de agua para evitar la formación de cristales de hielo que afecten la integridad celular.
Ø El ensayo se montó por duplicado para cada cepa dispensando 9ml de gelatina líquida (Anexo No 3) en tubos tapa rosca (16x150mm) y 1ml de cada suspensión bacteriana llevando a diluciones de 1/10 cuya concentración corresponde a 6x10^7 UFC/ml.
Ø Luego estas suspensiones, se dispensaron en cajas de Petri pequeñas y se llevaron a refrigerar (4ºC) para su solidificación.
Ø Posteriormente se perforaron los medios con una pipeta Paster estéril para extraer discos de 6mm de diámetro, para una concentración final de 7,408x10^6 UFC por disco, que se colocaron sobre el algodón en los tubos con Silica-Gel previamente activados a 180º C durante dos horas en calor seco; por último los tubos fueron sellados con parafilm y se llevaron a congelación a –20ºC.
5.7 DESCONGELACIÓN DE CEPAS
Cuando las cepas bacterianas van a ser recuperaradas, d ebe realizarse una descongelación rápida, colocando las suspensiones a 37ºC en baño María o incubadora durante media hora (Gerhardt, 1994); en nustro ensayo, después de transcurrido cada mes de preservación para cada cepa bacteriana en las técnicas de Leche Descremada al 10% y Caldo Tripticasa Soya con adición de Glicerol al 3%, se retiraron dos viales de cada cepa y se sometieron a descongelación rápida en incubadora en el tiempo y la temperatura ya mencionadas; en el caso de los tubos con los Discos de gelatina sobre Silica – Gel, primero se retiraron los discos y se suspendieron en 9ml de Caldo Eugebion y posteriormente se incubaron a 37ºC durante 30 minutos.
5.8 DETERMINACIÓN DE VIABILIDAD
Después de la descongelación, las cepas dispuestas en los viale s con Leche Descremada al 10% y Caldo Tripticasa Soya con adición de Glicerol al 3% se resuspendieron en 9ml de Caldo Eugebion y se obtuvo nuevas diluciones de 1/100 para cada cepa en los distintos métodos; de estas suspensiones se
tomaron 100λ y se montaron en microplacas con pozos de fondo redondo y se leyeron en un MultiSkan (Ref 340 Labsystem) a 540nm, con el fin de comparar la viabilidad de cada cepa bacteriana en los métodos ya mencionados en intervalos mensuales durante tres meses; se continuo la incubación durante 24 horas y se realizó una segunda lectura de la manera descrita anteriormente, para establecer la viabilidad posterior a la aplicación de cada técnica y de igual forma se realizaron lecturas mensuales durante tres meses.
Con los datos arrojados de las lecturas se realizaron una serie de promedios con el propósito de comparar el comportamiento de las cepas bacterianas en estudio, separadas por grupos con respecto a su pared en Cocos Gram Positivos, Bacilos Gram Positivos y Bacilos Gram negativos en los métodos estudiados en intervalos mensuales durante tres meses.
5.9 DETERMINACIÓN DE RECUPERACIÓN
En este proceso, después de montar las últimas diluciones de 1/100 para cada una de las cepas en los distintos métodos y antes de montar las placas donde se evalúo la viabilidad, se tomaron 10λ de cada suspensión y se sembraron en Agar Columbia las cepas Gram positivas y en Agar MacConkey las cepas Gram negativas excepto la cepa de Pasteurella multocida que se sembró en Agar Columbia porque en MacConkey no crece. Se incubaron a 37ºC durante 24 horas con el fin de obtener el crecimiento típico para cada cepa bacteriana, en donde se estableció la integridad celular, la capacidad metabólica, y la viabilidad posterior a la aplicación de cada técnica.
5.10 DETERMINACIÓN DE PUREZA
En esta etapa, la pureza se verificó sobre las cajas mediante la realización de pruebas
bioquímicas a las cepas bacterianas utilizando las guías de identificación de Koneman
(1999), así:
5.10.1 CEPAS GRAM POSITIVAS
5.10.1.1 COCOS: Coloración de Gram, Catalasa, Coagulasa, Sensibilidad a la
novobiocina, DNasa, Hemólisis en Agar Sangre de Cordero, Sensibilidad a la
optoquina, Solubilidad en bilis, Bilis esculina, Crecimiento en NaCl 6.5%.
5.10.1.2 BACILOS: Coloración de Gram, Catalasa, Hemólisis en Agar Sangre de
Cordero, Crecimiento en NaCl 6.5%, Movilidad a 25ºC y a 37ºC, Bilis esculina.
5.10.2 CEPAS GRAM NEGATIVAS
5.10.2.1 BACILOS: Aislamiento en Agar EMB, Lactosa, Coloración de Gram,
Oxidasa, TSI, H2S/Gas, LIA, Citrato, Urea, Indol, Motilidad, RM, VP.
Nota: Cualquier contaminación con otros microorganismos en estos ensayos arrojaría
lecturas falsas y no se podría determinar la efectividad de los métodos empleados
(Kirsop et al, 1984).
6. RESULTADOS
6.1 VIABILDAD BACTERIANA POSTERIOR A LA CONSERVACIÓN EN
CADA TECNICA: Se evaluó la recuperación de las bacterias en intervalos
mensuales durante 3 meses, después de aplicados los métodos de conservación por
congelación a –20º C, en cepas bacterianas Gram positivas y Gram negativas
(fig.1,2,3,4,5,6,7,8,9,19,11 y 12)
FIGURA 1. C O N S E R V A C I Ó N D E S t . a u r e u s E N L E C H E D E S C R E M A D A A L 1 0 % , C A L D O T R I P T O N A S O Y A C O N G L I C E R O L A L 3 % Y D I S C O S D E G E L A T I N A A L 1 0 % S O B R E S I L I C A G E L 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 0 0 0 M e s 0 1 M e s 0 2 M e s 0 3 T I E M P O E N M E S E SCONCENTRACIÒN DE BACTERIAS RECUPERADAS (UFC/cc)
L e c h e 1 0 % G l i c e r o l 3 % G e l a t i n a 1 0 %
FIGURA 2. FIGURA 3. C O N S E R V A C I Ó N D E S t . e p i d e r m i d i s E N L E C H E D E S C R E M A D A A L 1 0 % , C A L D O T R I P T O N A S O Y A C O N G L I C E R O L A L 3 % Y D I S C O S D E G E L A T I N A A L 1 0 % S O B R E S I L I C A G E L 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 M e s 0 1 M e s 0 2 M e s 0 3 T I E M P O E N M E S E S
CONCENTRACIÒN DE BACTERIAS RECUPERADAS (UFC/cc)
L e c h e 1 0 % G l i c e r o l 3 % G e l a t i n a 1 0 % C O N S E R V A C I Ó N D E E . f a e c i u m E N L E C H E D E S C R E M A D A A L 1 0 % , C A L D O T R I P T O N A S O Y A C O N G L I C E R O L A L 3 % Y D I S C O S D E G E L A T I N A A L 1 0 % S O B R E S I L I C A G E L 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 0 0 0 M e s 0 1 M e s 0 2 M e s 0 3 T I E M P O E N M E S E S
CONCENTRACIÒN DE BACTERIAS RECUPERADAS (UFC/cc)
L e c h e 1 0 % G l i c e r o l 3 % G e l a t i n a 1 0 %
FIGURA 4. FIGURA 5. C O N S E R V A C I Ó N D E S t . m u t a n s E N L E C H E D E S C R E M A D A A L 1 0 % , C A L D O T R I P T O N A S O Y A C O N G L I C E R O L A L 3 % Y D I S C O S D E G E L A T I N A A L 1 0 % S O B R E S I L I C A G E L 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 0 0 0 M e s 0 1 M e s 0 2 M e s 0 3 T I E M P O E N M E S E S
CONCENTRACIÒN DE BACTERIAS RECUPERADAS (UFC/cc)
L e c h e 1 0 % G l i c e r o l 3 % G e l a t i n a 1 0 % C O N S E R V A C I Ó N D E L i s t e r i a m o n o c y t o g e n e s E N L E C H E D E S C R E M A D A A L 1 0 % , C A L D O T R I P T O N A S O Y A C O N G L I C E R O L A L 3 % Y D I S C O S D E G E L A T I N A A L 1 0 % S O B R E S I L I C A G E L 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 M e s 0 1 M e s 0 2 M e s 0 3 T I E M P O E N M E S E S
CONCENTRACIÒN DE BACTERIAS RECUPERADAS (UFC/cc)
L e c h e 1 0 % G l i c e r o l 3 % G e l a t i n a 1 0 %
FIGURA 6. FIGURA 7. C O N S E R V A C I Ó N D E B . s u b t i l i s E N L E C H E D E S C R E M A D A A L 1 0 % , C A L D O T R I P T O N A S O Y A C O N G L I C E R O L A L 3 % Y D I S C O S D E G E L A T I N A A L 1 0 % S O B R E S I L I C A G E L 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 0 0 0 M e s 0 1 M e s 0 2 M e s 0 3 T I E M P O E N M E S E S
CONCENTRACIÒN DE BACTERIAS RECUPERADAS (UFC/cc)
L e c h e 1 0 % G l i c e r o l 3 % G e l a t i n a 1 0 %
CONSERVACIÓN DE E .coli EN LECHE DESCREMADA AL 10 %, CALDO TRIPTONA SOYA CON GLICEROL AL 3 % Y DISCOS DE GELATINA AL 10 % SOBRE SILICA GEL
0 100000000 200000000 300000000 400000000 500000000 600000000
Mes 01 Mes 02 Mes 03
TIEMPO EN MESES
CONCENTRACIÒN DE BACTERIAS RECUPERADAS (UFC/cc)
Leche 10% Glicerol 3% Gelatina 10%
FIGURA 8.
FIGURA 9.
CONSERVACIÓN DE Shigella sp EN LECHE DESCREMADA AL 10 %, CALDO TRIPTONA SOYA CON GLICEROL AL 3 % Y DISCOS DE GELATINA AL 10 % SOBRE SILICA GEL
0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 M e s 0 1 M e s 0 2 M e s 0 3 T I E M P O E N M E S E S
CONCENTRACIÒN DE BACTERIAS RECUPERADAS (UFC/cc)
L e c h e 1 0 % G l i c e r o l 3 % G e l a t i n a 1 0 %
CONSERVACIÓN DE Salmonella sp EN LECHE DESCREMADA AL 10 %, CALDO TRIPTONA SOYA CON GLICEROL AL 3 % Y DISCOS DE GELATINA AL 10 % SOBRE SILICA GEL
0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 M e s 0 1 M e s 0 2 M e s 0 3 T I E M P O E N M E S E S
CONCENTRACIÒN DE BACTERIAS RECUPERADAS (UFC/cc)
L e c h e 1 0 % G l i c e r o l 3 % G e l a t i n a 1 0 %
FIGURA 10. FIGURA 11. C O N S E R V A C I Ó N D E K l e b s i e l l a s p E N L E C H E D E S C R E M A D A A L 1 0 % , C A L D O T R I P T O N A S O Y A C O N G L I C E R O L A L 3 % Y D I S C O S D E G E L A T I N A A L 1 0 % S O B R E S I L I C A G E L 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 0 0 0 M e s 0 1 M e s 0 2 M e s 0 3 T I E M P O E N M E S E S
CONCENTRACIÒN DE BACTERIAS RECUPERADAS (UFC/cc)
L e c h e 1 0 % G l i c e r o l 3 % G e l a t i n a 1 0 % C O N S E R V A C I Ó N D E P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a E N L E C H E D E S C R E M A D A A L 1 0 % , C A L D O T R I P T O N A S O Y A C O N G L I C E R O L A L 3 % Y D I S C O S D E G E L A T I N A A L 1 0 % S O B R E S I L I C A G E L 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 M e s 0 1 M e s 0 2 M e s 0 3 T I E M P O E N M E S E S
CONCENTRACIÒN DE BACTERIAS RECUPERADAS (UFC/cc)
L e c h e 1 0 % G l i c e r o l 3 % G e l a t i n a 1 0 %
FIGURA 12.
CONSERVACIÓN DE Pasteurella multocida EN LECHE DESCREMADA AL 10 %, CALDO TRIPTONA SOYA CON GLICEROL AL 3 % Y DISCOS DE GELATINA AL 10 % SOBRE SILICA GEL
0 100000000 200000000 300000000 400000000 500000000 600000000
Mes 01 Mes 02 Mes 03
TIEMPO EN MESES
CONCENTRACIÒN DE BACTERIAS RECUPERADAS (UFC/cc)
Leche 10% Glicerol 3% Gelatina 10%
6.2 EVALUACIÓN DE CADA TÉCNICA DE MANTENIMIENTO EN LOS GRUPOS DE BACTERIAS EVALUADOS: Se realizó comparación en los grupos de Bacilos Gram+, Bacilos Gram- y Cocos Gram+ para cada una de las técnicas utilizadas (fig. 13,14 y 15).
FIGURA 13.
Concentración de Bacterias Recuperadas en los grupos de estudio mediante Congelación a -20ºC en Leche Descremada al 10% 0 100000000 200000000 300000000 400000000 500000000 600000000 1 2 3 TIEMPO EN MESES
Promedio de Concentración de Bacterias Recuperadas (6x10^8/UFC/cc)
Cocos G+ Bacilos G+ Bacilos
G-FIGURA 14.
FIGURA 15.
Concentración de Bacterias Recuperadas en los grupos de estudio mediante Congelación a -20ºC en Caldo Triptona Soya con adición de Glicerol al 3%
0 100000000 200000000 300000000 400000000 500000000 600000000 700000000 1 2 3 TIEMPO EN MESES
Promedio de Concentración de Bacterias Recuperadas (6x10^8 UFC/cc)
Cocos G+ Bacilos G+ Bacilos G-C o n c e n t r a c i ó n d e B a c t e r i a s R e c u p e r a d a s e n l o s g r u p o s d e e s t u d i o m e d i a n t e G-C o n g e l a c i ó n a - 2 0 º G-C p o s t e r i o r a l a D e s e c a c i ó n s o b r e S i l i c a G e l e n D i s c o s d e G e l a t i n a A L 1 0 % 0 5 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 2 5 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 3 5 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 4 5 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2 3 T I E M P O E N M E S E S
Promedio de Concentración de Bacterias Recuperadas (7.408x10^8 UFC/Disco)
C o c o s G + B a c i l o s G + B a c i l o s G
-.
6.3 DETERMINACIÓN DE VIABILIDAD POSTERIOR A CADA TÉCNICA
6.3.1 DETERMINACIÓN DE VIABILIDAD POSTERIOR A LA
APLICACIÓN DE LECHE DESCREMADA AL 10%: Se evaluó la recuperación
de las bacterias posterior a una incubación de 24 horas a 37º C en interva los
mensuales durante 3 meses, después de aplicados los métodos de conservación por
congelación a –20º C, en cepas bacterianas Gram+ y Gram- (fig. 16).
FIGURA 16.
Recuperación de Cepas Gram + y Gram - en Leche Descremada al 10 %
0 1000000000 2000000000 3000000000 4000000000 5000000000 6000000000 7000000000 8000000000 9000000000 St.aureus St.epidermidis E .faecium St.mutans Listeria monocytogenes B .subtilis E .coli Shigella sp Salmonella sp Klebsiella sp Pseudomonas aeruginosa Pasteurella multocida CEPAS BACTERIANAS
CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS (6 * 10^8 UFC/cc)
Promedios 30min 24 h mes 01 24 h mes 02 24 h mes 03
6.3.2 DETERMINACIÓN DE VIABILIDAD POSTERIOR A LA
APLICACIÓN DE CALDO TRIPTONA SOYA CON ADICIÓN DE
GLICEROL AL 3%: Se evaluó la recuperación de las bacterias posterior a una
incubación de 24 horas a 37º C en intervalos mensuales durante 3 meses, después de
aplicados los métodos de conservación por congelación a –20º C, en cepas
bacterianas Gram+ y Gram- (fig.17).
FIGURA 17.
6.3.3 DETERMINACIÓN DE VIABILIDAD POSTERIOR A LA APLICACIÓN DE DISCOS DE GELATINA AL 10% DESECADOS SOBRE SILICA GEL: Se evaluó la recuperación de las
Recuperación de Cepas Gram + y Gram - en Caldo Triptona Soya con Glicerol al 3%
0 1000000000 2000000000 3000000000 4000000000 5000000000 6000000000 7000000000 8000000000 St.aureus St.epidermidis E .faecium St.mutans Listeria monocytogenes B .subtilis E .coli Shigella sp Salmonella sp Klebsiella sp Pseudomonas aeruginosa Pasteurella multocida CEPAS BACTERIANAS
CONCENTRACION DE BACTERIAS RECUPERADAS (6 * 10^8 UFC/cc)
Promedios 30min 24 h mes 01 24 h mes 02 24 h mes 03
bacterias posterior a una incubación de 24 horas a 37º C en intervalos mensuales durante 3 meses, después de aplicados los métodos de conservación por congelación a –20º C, en cepas bacterianas Gram+ y Gram- (fig.18).
FIGURA 18.
Recuperación de Cepas Gram + y Gram - en Discos de Gelatina al 10% Desecados sobre Silica Gel
0 500000000 1000000000 1500000000 2000000000 2500000000 3000000000 3500000000 4000000000 4500000000 5000000000 St.aureus St.epidermidis E .faecium St.mutans Listeria monocytogenes B .subtilis E .coli Shigella sp Salmonella sp Klebsiella sp Pseudomonas aeruginosa Pasteurella multocida CEPAS BACTERIANAS
CONCENTRACION DE BACTERIAS RECUPERADAS (7.408 * 10 ^6 UFC/Disco)
Promedios 30min 24 h mes 01 24 h mes 02 24 h mes 03
6.4 DETERMINACIÓN DE IDENTIDAD Y PUREZA BACTERIANA: para este
procedimiento se siguieron las guías de identificación de Koneman (1999); los
resultados obtenidos son presentados en las tablas No 1, 2 y 3 y fueron constantes a
lo largo del estudio, demostrando así la pureza de cada una de las cepas en los
diversos métodos de preservación y mantenimiento bacterianos aplicados.
TABLA No 1. RESULTADOS EN LAS PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN DE
COCOS GRAM POSITIVOS
St.aureus
St. epidermidis
St.mutans
E. faecium
Colonias
características
en Agar
Columbia
Colonias elevadas
redond as con
borde continuo,
lisas brillantes con
pigmento beis.
Colonias
redondas de
borde continuo,
lisas, mucoides,
brillantes.
Colonias
redondas de
borde continuo,
lisas, mucoides
con superficie
granulosa.
Colonias
redondas,
lisas,
cremosas
de color
blanco
Morfología en
tinción de
Gram
Cocos Gram
positivos
Cocos Gram
positivos
Cocos Gram
positivos
Cocos
Gram
positivos
Catalasa
Positiva
Positiva
Negativa
Negativa
Coagulasa
Positiva
Negativa
NR
NR
Sensibilidad a
la novobiocina
NR
Sensible
NR
NR
Dnasa
Positiva
Negativa
NR
NR
Hemólisis en
Agar Sangre de
Cordero
Beta
Gamma
Gamma
Gamma
Sensibilidad a
la optoquina
NR
NR
Resistente
NR
bilis
Bilis esculina
NR
NR
Positiva
Positiva
Crecimiento en
NaCl 6.5%
NR
NR
Positivo
Positivo
NR: No se realizó
TABLA No 2. RESULTADOS EN LAS PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN DE
BACILOS GRAM POSITIVOS
Listeria monocytogenes
B. subtilis
Colonias características en
Agar Columbia
Colonias pequeñas
redondas, elevadas,
levemente convexas.
Colonias altamente
irregulares, brillantes.
Morfología en tinción de
Gram
Bacilo corto delgado Gram
positivo
Bacilo Gram positivo
esporulado
Catalasa
Positiva
Positiva
Hemólisis en Agar Sangre
de Cordero
Beta
Beta
Crecimiento en NaCl 6.5%
Negativo
Positivo
Movilidad
25ºC
37ºC
Positiva
Negativa
Negativa
Positiva
TABLA No 3. RESULTADOS EN LAS PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAM NEGATIVOS
E. coli
Salmonella spp
Shigella spp
Klebsiella spp
Pseudomonas
aeruginosa
Pasteurella
multocida
Colonias
características
en medio EMB
Colonias
circulares,
convexas de borde
continuo o
ligeramente
ondulado, con
brillo verde
metálico, lactosa
positivas.
Colonias
mucosas
circulares,
planas, convexas
de borde
continuo, color
púrpura claro o
semitranslúcidas,
lactosa negativas.
Colonias
redondas
brillantes de
borde continuo,
mucosas de color
púrpura claro o
semitranslúcidas,
lactosa negativas.
Colonias
circulares, de
borde continuo o
ligeramente
ondulado, con
brillo verde
metálico, lactosa
positivas.
Colonias
mucosas,
brillantes, de
borde continuo,
color púrpura
claro, lactosa
negativas.
No crece
Morfología en
tinción de Gram
Bacilos Gram
negativos
Bacilos Gram
negativos
Bacilos Gram
negativos
Bacilos Gram
negativos
Bacilos Gram
negativos
Bacilos Gram
negativos
OXIDASA
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
TSI
A/A
K/A
K/A
A/A
K/K
K/K
H2S/GAS
(-) / (+)
(+) / (+)
(-) / (-)
(-) / (+)
(-)/(-)
(-)/(-)
LIA
K/K
K/K
K/A
K/K
K/K
K/K
CITRATO
Negativo
Positivo
Negativo
Posit ivo
Positivo
Negativo
UREA
Negativa
Negativa
Negativa
Positiva
Positiva
Negativo
MOTILIDAD
(+) / (-)
(+)
(-)
(-)
(+)
(-)
RM
Positivo
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
LOS MÉTODOS EMPLEADOS POSTERIOR A UNA INCUBACIÓN DE 24 HORAS A 37ºC.
LECHE 10% GLICEROL 3% GELATINA 10% Mes 01 Me s 02 Mes 03 Mes 01 Mes 02 Mes 03 Mes 01 Mes 02 Mes 03 St.aureus 13.80% 15.85% 40.70% 7.72% 5.64% 3.32% 7.10% 8.23% 14.50% St.epidermidis 14% 22.40% 58.76% 7.59% 6.65% 4.37% 6.76% 9.67% 10.96% E.faecium 12.71% 14.26% 33.94% 8.08% 7.46% 8.12% 7.43% 9.87% 15.16% St.mutans 13.77% 14.62% 24.30% 9.51% 8.66% 8.26% 8.24% 8.60% 10.99% L.monocytogenes 15.64% 20.62% 73.75% 8.69% 8.15% 7.22% 4.87% 6.91% 2.89% B.subtilis 11.84% 12.21% 14.13% 6.91% 7.40% 8.88% 5.82% 6.30% 2.31% E.coli 14.49% 14.65% 46.52% 9.69% 9 .39% 8.53% 6.34% 26.42% 30.99% Shigella sp 16.12% 46.98% 74.84% 12.19% 10.69% 9.015 7.18% 23.60% 29.41% Salmonella sp 15.40% 27.33% 46.93% 12.49% 9.08% 8.44% 5.81% 17.26% 14.34% Klebsiella sp 11.02% 10.71% 10.17% 9.03% 8.585 8.41% 6.21% 6.33% 3.00% Ps a eruginosa 16.18% 19.62% 25.79% 8.70% 8.67% 6.76% 10.57% 26.00% 1.76% P multocida 12.83% 20.97% 40.21% 9.09% 8.00% 7.32% 8.58% 26.05% 2.66%
