Tema IV. Genética Bacteriana. Bacterial Genetics. La Genética Bacteriana ha contribuido al desarrollo de conceptos en Genética y Biología Molecular:

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Texto completo

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Bacterial Genetics

La Genética Bacteriana ha contribuido al desarrollo de

conceptos en Genética y Biología Molecular:

- El DNA contiene la información genética.

- Desciframiento del código genético

- La naturaleza de las mutaciones como cambios en

secuencias de nucleótidos en el DNA

- Estudio de los procesos de replicación del DNA, de

transcripción y traducción

- Regulación de la expresión genética (represores,

activadores)

Tema IV.

Genética Bacteriana

Tema IV.

Genética Bacteriana

¿Por qué podemos hablar de Genética Bacteriana?

• Las bacterias son haploides (Un cromosoma)

– No hay alelos dominantes y recesivos.

• Se reproducen de manera asexual

Sin embargo, hay una alta diversidad genética:

Se encuentra en una población resistencia a antibióticos, resistencia a bacteriófagos, diversidad metabólica (síntesis de aminoácidos, vitaminas etc.)

La principal fuente de variabilidad genética en bacterias es la

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Cadena de DNA molde Cadena de DNA “nueva” Corrección del error Sin corrección del error Siguiente ronda de replicación

Mutación “espontánea”: cambios que ocurren durante duplicación del DNA

Mutación inducida: cambios que ocurren por daño al DNA

Desaminación oxidativa del DNA Una hipoxantina se aparea con una citosina

Escherichia coli

Genoma: 4.4 x 106pares de bases. La replicación del genoma implica la polimerización de 8.8 x 106nts

La DNA polimerasa que replica el genoma de E. coli, en

cooperación con otros mecanismos, comete un error cada 1010 nucleótidos incorporados.

Si cada genoma implica la incorporación de 8.8 x 106 nts, habría

un error aprox. cada 1136 divisiones (1010/ 8.8 x 106)

Tasa de mutación en E. coli

Un mL de un cultivo de bacterias en fase exponencial tiene: 1 x 109 células. Como habría un error cada 1136 replicaciones,

si se dividen todas las células, 1 x 109 / 1136 = 8.8 x 105 mutaciones en una generación.

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Escherichia coli sensible a bacteriófagos Diluir el cultivo Inocular el cultivo con el fago Determinar el número de colonias resistentes al fago: 142/ 146/ 155/ 140/ 132/ 123/138/149 Inocular y determinar el # de colonias resistentes al fago: 67/ 159/ 117/ 291/75/ 135/ 220/ 0

Experimento de Luria y Delbrück. Prueba de fluctuación

Muchos subcultivos

Experimento de Luria y Delbrück. Prueba de fluctuación

La resistencia al bacteriófago se debe a mutaciones en algún(os) gen(es) de la bacteria.

Se observa mayor variabilidad en el número de colonias

resistentes al fago en los cultivos independientes: las mutaciones ocurren espontáneamente, en ausencia del bacteriófago.

La alta variabilidad se explica porque en cada cultivo, la mutante resistente se dio en distintas generaciones.

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Genética Bacteriana.

Análisis fenotípico en bacterias. AUXOTROFÍA

Las cepas silvestres son protótrofas (crecimiento en medio mínimo), se pueden identificar mutantes incapaces de sintetizar algún metabolito esencial, por lo que este debe ser añadido al medio (bio-, arg-, met-, ad-)

FUENTE DE ENERGÍA

Capacidad de las bacterias para utilizar determinados sustratos como fuentes de energía, generalmente carbohidratos (galactosa; gal-/gal+, lactosa; lac-/lac+, melobiosa,

RESISTENCIA/SUSCEPTIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS Capacidad de crecen en presencia de inhibidores, como antibióticos (estreptomicina, ampicilina, kanamicina, etc. strR/strS; ampR/ampS

Otras características como morfología colonial y pruebas bioquímicas también se emplean.

Experimento de Lederberg y Tatum

E. coli E. coli

Medio mínimo

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Experimento de Lederberg y Tatum

Medio mínimo

Se requiere contacto físico entre las bacterias para que ocurra este intercambio

Mecanismos mediante los cuales las bacterias

adquieren nueva información genética

• Transformación

• Conjugación

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1. TRANSFORMACIÓN En la transformación, DNA exógeno es introducido a la célula e incorporado al DNA cromosomal por recombinación. . El DNA se une a un receptor en la superficie de la célula

Una nucleasa extracelular corta el DNA en fragmentos más pequeños.

Una de las cadenas es degradada y la otra cadena es transportada al interior de la célula

La cadena de DNA se alinea con una región homóloga en el cromosoma bacteriano. La cadena de DNA se incorpora al cromosoma bacteriano por recombinación homóloga. Reparación de DNA. Célula transformada

El transporte del DNA del medio extracelular al citoplasma es un proceso muy complejo que todavía no está bien entendido.

Se requieren proteínas que están involucradas en los sistemas de secreción, así como de una translocasa de DNA en la membrana.

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Escherichia coli tiene dos tipos de células: donadores/machos y

receptoras/hembras. La diferencia radica en la presencia del plásmido F (plásmido sexual/ factor de Fertilidad) F+/F

-El plásmido F contiene unos 100 genes, algunos de ellos codifican proteínas involucradas en la replicación del DNA. Otros genes codifican proteínas tubulares que forman el pilus.

CONJUGACIÓN

Conjugación es el proceso de apareamiento de bacterias mediante el cual se transfiere información genética. Involucra el contacto físico entre bacterias (F+ y F-)

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La célula F+

sintetiza el pilus

El pilus entra en contacto con la célula F

-El plásmido es activado para transferencia cuando una endonucleasa corta una cadena en el origen de transferencia

El pilus se retrae causando que las céls. donadora y receptora se unan. El plasmido F se transfiere como DNA de cadena sencilla La cadena complementaria de ambos plásmidos se sintetiza Conjugación

Conjugación. Apareamiento entre bacterias (F+ y F-)

La célula F+inicia la conjugación al

sintetizar y extender el pilus que se adhiere a la superficie de la célula F

-El pilus se retrae y acerca a las dos células.

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Una de las cadenas del DNA F es cortada y se separa de la otra cadena. Se transfiere esa cadena a la otra célula, mientras que se comienza a replicar el DNA de la cadena que se quedó en la célula F+

La cadena de DNA recién transferida también se replica. Las dos células contienen un plásmido F integro, por lo que ambas son F+

• Las cepas Hfr resultan de la integración del factor F al cromosoma.

Células Hfr (high frequency recombination).

Cepas de Escherichia coli que son muy eficientes en transferir genes cromosomales.

Episoma. Fragmento de DNA que

puede existir como plásmido y que se puede integrar al cromosoma.

Integración del Factor F al cromosoma

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Células Hfr (high frequency recombination). Otra propiedad que tiene el plásmido F es su capacidad de integrarse al cromosoma bacteriano, incrementando el tamaño de éste.

La célula Hfr mantiene su

capacidad de conjugación,

por lo que se puede aparear con una célula F

-Ocurre transferencia de material genético, sin embargo, no se transfiere el cromosoma completo pues las células se separan. La

secuencia correspondiente al plásmido F no se transfiere.

Como se transfirió un fragmento del DNA cromosomal, hay homología con el cromosoma de la célula receptora y ocurre recombinación con alta frecuencia (Hfr)

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Figure 6.5b

order of transfer is lac+ pro+

F–nowlac+pro

F–nowlac+pro+

Hfr Conjugation

CONJUGACIÓN F’

En células Hfr ocurre con baja frecuencia que F se escinda del cromosoma y forme un plásmido circular nuevamente. Cuando esto ocurre, F acarrea consigo genes adyacentes del cromosoma que ahora se encuentran formando parte del plásmido F.

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Con esta transferencia se pueden crear células diploides parciales (merocigotos).

Los plásmidos F’ también pueden ser transferidos por conjugación CONJUGACIÓN F’

Una característica importante del apareamiento Hfr / F-es que la

transferencia del cromosoma Hfr ocurre a una tasa constante a partir de un punto fijo determinado por el sitio donde está insertado el episoma F.

Esta propiedad permite controlar la cantidad de información genética transferida y mapear la posición de los genes

transferidos con respecto a la secuencia F de acuerdo al tiempo de conjugación.

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Mapeo de genes en E. coli por conjugación

• El tiempo que se requiere para que los genes entren en la célula receptora está asociado con el ordenamiento en el cromosoma bacteriano.

• El cromosoma Hfr es transferido linealmente a la célula F -receptora.

• Si se interrumpe la conjugación a distintos tiempos ocurrirán transferencias parciales de los genes.

• El orden de los genes a lo largo del cromosoma se puede deducir al determinar los genes transferidos durante

apareamientos cortos y comparados con apareamientos largos.

Cepa Donadora Hfr:thr+; leu+; azis; tons;

lac+; gal+; strs

Cepa receptora (F-):thr-; leu-; azir; tonr;

lac-; gal-; strr

1. Poner en contacto a las dos cepas 2. Interrumpir por agitación la

conjugación a distintos tiempos 3. Sembrar en medio con streptomicina

(elimina a la cepa donadora)

4. Evaluar el fenotipo de las bacterias conjugantes

Experimento de Conjugación a tiempos controlados.

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Tiempo de conjugación

(min)

% de colonias que sobreviven con los genotipos indicados

thr+leu+ azis tons lac+ gal+

Resultados del Experimento

Punto de inicio

Las unidades son minutos. Se refiere al tiempo que tardan los genes en entrar a una bacteria F- receptora durante el experimento de conjugación

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TRANSDUCCIÓN.Transferencia de material genético entre bacterias a través de un bacteriofago.

Se adsorbe a la superficie de una bacteria susceptible, penetra el ácido nucleico del fago, se replica su DNA, se expresan los genes del fago, se sintetizan las proteínas y se ensamblan nuevas partículas virales.

Clasificación de fagos por su estructura.

Icosahédricos sin cola (φX174) Icosahédricos con cola (λ)

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1. El bacteriófago se adhiere a la superficie de la bacteria.

2. El DNA del bacteriófago penetra a la célula. 3. Se sintetiza el DNA y proteínas del bacteriófago. 4. Se ensamblan los componentes del bacteriófago formando nuevas partículas.

Ciclo lítico de un bacteriófago.

5. La célula se lisa y se liberan las

partículas virales

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Integración del DNA del fago al cromosoma bacteriano

El cromosoma del bacteriófago lambda (λ) en estado libre es circular. El sitio de integración λ es una región del cromosoma que se alinea en un sitio del cromosoma bacteriano (entre los genes gal y bio).

Ocurre un entrecruzamiento recíproco entre el fago circular y el cromosoma bacteriano resultando en la

integración. Esta integración es mediada por los genes del

bacteriofago y no por el sistema de recombinación de la bacteria. Al DNA del fago integrado al cromosoma se le llama profago.

Inducción del ciclo lítico

La escición del DNA del fago acarrea DNA cromosomal

TRANSDUCCIÓN

Replicación del fago

Lísis celular y liberación del fago

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Los fagos virulentos solamente

siguen el ciclo lítico Los fagos atemperados pueden alternar el ciclo lítico y el lisogénico El profago puede permanecer en estado dormante por mucho tiempo (generaciones) Cromosoma bacteriano El fago inyecta DNA al citosol Síntesis de muchos fagos nuevos Lisis celular y liberación de nuevos fagos Los fagos se adhieren a la superficie celular El DNA del fago se integra al cromosoma

El DNA del fago se escinde del cromosoma CICLO LÍTICO CICLO LISOGÉNICO

Plásmidos.

Son moléculas de DNA circulares extracromosomales que se encuentran en la mayoría de las bacterias y en algunas células de eucariontes.

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Muchos plásmidos usan la misma maquinaria de replicación del DNA cromosomal y contienen un origen de replicación que es reconocido.

En general, los plásmidos se clasifican en aquellos que se encuentran en un bajo número de copias por célula (1-10) y los que están presentes en un alto número de copias (10-100).

Los plásmidos autoregulan su número de copias a través de un represor (proteína o RNA) que impide que se repliquen muchas copias del plásmido.

Estos represores también pueden actuar sobre otros plásmidos relacionados, excluyéndolos así de la célula.

Los plásmidos codifican una diversidad importante de funciones que le permiten a la bacteria que los contiene sobrevivir en

tipos de habitats muy variables. 1. Propiedades de Resistencia.

• Antibióticos (aminoglicósidos, cloramfenicol, β-lactamas) • Metáles pesados (Hg, Ni, Co, Pb, Cd, Bi)

• Aniones tóxicos (arsenato, arsenito, boratos, cromatos) 2. Propiedades metabólicas.

• Producción de bacteriocinas • Metabolismo de carbohidratos

• Metabolismo de compuestos carbonados

3. Factores que intervienen en la interacción con hospedero. • Enterotoxina y hemolisinas (Escherichia coli)

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Mecansimos de resistencia a antibióticos y su

transmisión

Impermeabilidad y eflujo. Gram+ (peptidoglicano); Gram- (capa de LPS). Proteínas de eflujo. Los genes responsables pueden estar en plásmido o en cromosoma.

Modificación e inactivación del antibiótico. β-lactamasa, enzimas modificadoras de aminoglicósidos, cloramfenicol acetil transferasa.

Modificación del blanco.Dominios de transpeptidasa con menor afinidad por las β-lactamas.

Vías alternativas de síntesis. Síntesis de tetrahidrofolato insensible a sulfonamidas.

Transposones

• La transposición es otro tipo de recombinación de

DNA en el cual un elemento transponible o

transposón se mueve de una molécula de DNA a

otra.

Fueron descubiertos originalmente en maíz por

Barbara Mc Clintock, y su presencia se ha

documentado también en otras especies, desde

bacterias a humanos.

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Transposones

El tamaño de los transposones varía entre 103 a 104 pb

dependiendo del tipo de transposón.

La secuencia integra del transposón se puede insertar en un sitio particular del cromosoma.

La transposición involucra recombinación entre secuencias no relacionadas que son los extremos flanqueantes del transposón y el sitio del cromosoma donde se insertó.

Transposasa.

Enzima que corta al DNA blanco en sitios al azar y une los extremos del transposón.

Secuencias repetidas invertidas.Funcionan como el sitio de reconocimiento de la transposasa. Como las secuencias son invertidas, son idénticas.

Marcador de selección.La inserción del transposón confiere una ventaja ecológica a la célula, que puede ser la resistencia a algún antibiótico. KanSÆ KanR

Transposón Tn5:5,800 pb y regiones flanqueantes de 1,530 pb. Genes de resistencia a Kan, Bleo, Strp.

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Mecanismo de Transposición (Tn5)

Unión de la transposasa a la región flanqueante Formación del asa (complejo sináptico). Los extremos del transposón se acercan. Corte del DNA y escición del transposón

Unión del transposón al DNA blanco La transposasa cataliza la inserción del transposón al DNA blanco.

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