ICA – PERÚ 2010 ICA – PERÚ 2010
INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS
PRÁCTICA N°3 DE BIOTECNOLOGÍA D DOOCCEENNTTEE::DRA. ROSA ALTAMIRANO DÍAZ P
PRREESSEENNTTAADDOO PPOORR::
BRAVO ROMERO, ANGELA FABIOLA. LOPEZ MONTOYA, VICTOR W. HUAMÁN CAICHYHUA, NADIA. RAMOS BURGOS, ALFREDO. VALVERDE LUNA, KATHERINE. X CICLO
PRÁCTICA N°3:
INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS
I. INTRODUCCIÓN
En la actualidad los países desarrollados experimentan grandes avances en el campo científico y particularmente en el campo de la biotecnología. En el Perú existen pocos trabajos al respecto. No obstante, el interés de muchos investigadores en el estudio de inmovilización celular como técnica de aplicación de la biotecnología ha permitido desarrollar nuevos métodos que han vuelto rentables a muchos procesos y productos industriales por su simpleza y rendimiento (3).
Dentro de la industria alimentaria, la inmovilización de microorganismos en soportes naturales o sintéticos proporciona estabilidad a las funciones celulares. Esta técnica permite alcanzar altas concentraciones celulares en volúmenes reducidos, así como la reutilización como biocatalizador y la implantación de sistemas de continuos de producción (1).
En este caso, el uso de células inmovilizadas dentro de procesos continuos para la producción de bebidas fermentadas representa una línea de investigación de elevado interés debido a las ventajas económicas y técnicas que presenta en comparación a los sistemas discontinuos con células libres. En ese sentido, los procesos que utilizan levaduras inmovilizadas en soportes gelificantes, proporcionan la oportunidad de superar los largos tiempos de fermentación y maduración encontrados en las industrias cerveceras tradicionales (2); dichos geles que contienen levaduras inmovilizadas en su estructura, se utilizan para controlar el pardeamiento de bebidas que se produce con el paso del tiempo. Los geles comprenden una matriz de polisacárido natural como base del gel, y células de levaduras inmovilizadas en la estructura de dicha matriz. Los geles así constituidos permiten tanto corregir el color de una bebida que ya ha pardeado, como para prevenir el desarrollo de color en una bebida susceptible de pardear con el paso del tiempo.
En el presente informe se desarrolla uno de los diversos métodos de inmovilizar levaduras con capacidad de reutilización, a fin de valorar su importancia en procesos industriales.
II. MATERIALES Material biológico: Cepa de Saccharomyces sp. Racimos de vid (2 kg.) Equipo: Balanza analítica Microscopio compuesto Baño María Refractómero Cristalería: Matraz Erlenmeyer de 500 y 2000 mL Pipetas de 5 y 10 mL Vaso de precipitados de 1000 mL 5 tubos de 18 x 150. Utensilios: Isopos Espátula Tubos Falcon.
Mechero o lámpara de alcohol Perlas de vidrio
Porta y cubre objetos. Cámara de Neubauer Varios: Colador Porrón de Pisco Papel aluminio Ligas Embudo. Insumos y Reactivos: Agar Agar Agua destilada Azúcar común Azul de metileno Glucosa Aceite casero Hielo picado NaCl III. PROCEDIMIENTO
3.1. Reactivación del cultivo Saccharomyces sp.
Se sembró por estría en tubos de agar Sabouraud la cepa de levadura. Incubar a temperatura ambiente por 3 a 4 días.
3.2. Proliferación celular.
A partir de la cepa reactivada se sembró por superficie en 1 placa de agar Sabouraud con la ayuda de un hisopo estéril. Incubar a temperatura ambiente por 3 a 4 días.
3.3. Cosecha de células y obtención del inóculo.
a. Se colocó 3 ml de solución salina fisiológica (al 0.85%) en la placa sembrada y 5 perlas de vidrio estéril, se movió suavemente la placa hasta obtener la suspensión celular, colocamos la suspensión en un tubo falcon estéril.
Cultivo proliferado
Remoción de células con las perlas de vidrio Remoción de células con
las perlas de vidrio Remoción de células con
b. Colocar en agitación a 200 rpm por 18 horas a temperatura ambiente (procedimiento no ejecutado)
c. Realizar el recuento celular utilizando la cámara de Neubauer (109 cél/ml).
3.4. Inmovilización de células.
a. Se tomó los 3.4 ml. del inóculo y se mezcló con 100 ml. de agar-agar fundido a 42ºC al 3%, (concentración celular final 108 cél/ml).
Calculo de la Concentración celular final: Ci = 5 x 109 cel/ml. Cf = ? Vi= 3.4 ml. Vf = 101 ml. Ci x V1 = CIF x V2 (5 x 109 cel/ml.) x (3.4 ml.) = (Cf)x(101 ml.) Cf = 1.7 x 108 cel/ml. Vista microscópica del Recuento
Recuento:
Conteo promedio: 20 células Factor de dilución: 10-3
Cálculo de Concentración del inóculo: Ci= 20 x 25 x 103 x 10 x 103
Conversión de 0.1 mm3 a 1 ml. Ci= 5 x 109 cel/ml.
Mezcla de los 3.4 ml del inóculo en Agar-Agar. Captura de los 3.4 ml del inóculo.
b. Con ayuda de pipetas estériles se tomó agar-agar con levaduras (mantenido en baño maría a 42ºC) se deja caer gota a gota en forma rápida en aceite vegetal, contenido en un frasco de vidrio sumergido en un recipiente con hielo en forma permanente.
Calculo de la Concentración celular por cada perla: Número de perlas por ml: 6 perlas
Concentración de células del Agar-Agar: 1.7 x 108
cel/ml. 1 ml. --- 6 perlas X --- 1 perla X = 0.17 ml. 1 ml. --- 1.7 x 108 cel/ml. 0.17 ml. --- Cp Cp = 2.8 x 107 cel/ml.
Captura del Agar-Agar Inmovilizando células
Células (Saccharomyces sp) Inmovilizadas.
c. Las perlas son lavaron con agua corriente y destilada estéril en forma sucesiva para desprender el aceite de su superficie.
3.5. Producción de alcohol utilizando las células inmovilizadas.
a. Se preparó un mosto de fruta de 2000 ml. A este se le agregó las células de levaduras inmovilizadas en agar – agar y se dejó fermentar por espacio de una semana. Se realizaronr las evaluaciones diarias determinando consumo de sustrato (azúcar) utilizando un refractómetro (realizar la curva consumo de sustrato/tiempo).
Extrayendo el aceite
Extrayendo el aceite Enjuagando con agua destilada
Agregando las células inmovilizadas al mosto
Midiendo Azúcares Reductores al tiempo “O”
b. Posteriormente, una vez terminada la fermentación, las perlas o células inmovilizadas fueron recuperadas del fermento y colocadas en una solución de glucosa al 20% (utilizamos agua pasteurizada a 85°C).
Células inmovilizadas con capacidad de reutilización
IV. RESULTADOS
4.1. Evaluación de la Determinación de Azúcares Reductores.
TABLA N° 1
Medición del Consumo de Azúcares Reductores por día mediante Refractómero
Tiempo (días) Consumo de Azúcares Reductores (% Brix) 0 19 1 16 2 14.5 3 12 4 8* 9* 9.4 4.5 4
*: Días posteriores a los tres días no laborables del curso.
GRÁFICO N° 1
Medidas del Refractómero al inicio y al término de la fermentación
GRÁFICO N° 2
Consumo de Azúcares Reductores vs Tiempo (días)
4.2. Análisis Organoléptico del Fermento 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 TIEMPO (días) CONSUMO DE AZÚCARES REDUCTORES (% BRIX) Características Obtenidas: Sabor: Seco Acidez: Elevada
Aspecto: Más turbio que al inicio Color: Guinda
V. DISCUSIÓN
La inmovilización de levaduras disminuye la mayoría de los problemas que plantea la fermentación utilizando células libres. Este sistema tiene la ventaja de poder manejar la densidad celular, previa al inicio de la fermentación. Además, facilita el sistema de operación del proceso de fermentación continua, evitando el paso de eliminar las levaduras del fermentador. La inmovilización celular desacopla el crecimiento microbiano de los procesos metabólicos de interés industrial. Es así, que diversos grupos de investigación han empleado este sistema de levaduras inmovilizadas especialmente del género Saccharomyces para la obtención de variados productos de interés industrial como el vino por ejemplo.
En el laboratorio tras reactivar e inmovilizar el cultivo de Saccharomyces y ver su capacidad fermentativa, logramos determinar que los azúcares (glucosa y fructosa) del mosto disminuyeron en un 80%, los cuales han sido empleados por las células y esto debido a que ellas necesitan fuentes carbonadas para su desarrollo.
Durante el proceso de fermentación, hubo la conversión de los azúcares a etanol, que es el metabolito esperado en estos bioprocesos, sin embargo no se pudo medir los grados generados en durante el desarrollo de la práctica.
Por otro lado no todas las levaduras se inmovilizaron, ya que hubieron brotes que se filtraron del agar-agar (debido derrepente a su concentración) y se consolidaron como células libres.
Por último, la gran ventaja de este bioproceso es que se pueden reutilizar las levaduras inmovilizadas en el agar-agar, siempre y cuando se le suministre una fuente carbonada que les permita estar viables para una próxima fermentación.
VI. CONCLUSIONES
Existe viabilidad de las levaduras inoculadas en el mosto, ya que hubo una considerable reducción de azúcares y aumento de acidez.
Adicionalmente se registró la presencia de Etanol, característica descubierta en el análisis organoléptico.
El Agar-Agar al 3% resultó ser un eficaz inmovilizador celular.
El tiempo es un factor importante cuando se maneja fermentaciones con células inmovilizadas. La concentración celular de cada perla fue adecuada para la cantidad de mosto empleado. EL aceite común utilizado fue un buen formador de perlas de agar-agar, debido a su propiedad
hidrofóbica.
VII. REFERENCIAS
1. DURAN-PARAMO. PhD. thesis, Universite de Thecnologie de Compiegne, France. 1997.
2. DEBOURG, A. The developments of brewery fermentations. The impact of new technologies. Cerevisia and Biotechnology, v.18, p.25-30, 1993.
3. EDWIN BALDEON CH, VICTOR MEZA C, JULIO GIRALDO H. Evaluación de un fermentador con levaduras (S. cerevisiae) inmovilizadas en perlas de cerámica. Anales Científicos. UNALM. 2004. Vol LVIII.
